DE3014582C2

DE3014582C2 -

Info

Publication number: DE3014582C2
Application number: DE3014582A
Authority: DE
Inventors: Bjoern Stockholm Se Luening
Original assignee: BONNIERFOERETAGEN STOCKHOLM SE AB
Current assignee: BONNIERFOERETAGEN STOCKHOLM SE AB
Priority date: 1979-04-20
Filing date: 1980-04-16
Publication date: 1990-11-08
Also published as: DE3014582A1; JPS6364440B2; IT8021411A0; GB2047713B; JPH0240986B2; CA1157465A; GB2047713A; JPS55141452A; FR2454436B1; FR2454436A1; IT1141277B; US4327075A; JPH01173871A; SE447263B; CH645880A5; SE8002726L

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung, gemäß den Patentansprüchen.

In der SE-OS 73-08 917-9 und in der US-PS 39 60 827 ist ein mit Cancer verbundenes Polypeptidantigen (CAPA), die Methode zu seiner Isolierung und seine Verwendung bei der Cancerdiagnose und bei der Herstellung von Antikörpern beschrieben. Das CAPA ist jetzt unter der Bezeichnung TPA im Handel, was "Gewebepolypeptidantigen" bedeutet. Wie aus den obigen Druckschriften ersichtlich ist, ist die Isolierung des natürlichen Antigens ein kompliziertes Verfahren, das selbst dann, wenn es zu einem praktisch brauchbaren Produkt führt, hohe Produktionskosten erfordert und außerdem Schwierigkeiten bezüglich der Bereitstellung erforderlicher Ausgangsmaterialien, wie von Tumorgewebe, ergeben kann. Vor diesem Hintergrund wäre ein synthetisch hergestelltes Antigen äußerst wünschenswert, das hinsichtlich seiner Zusammensetzung genau definiert ist und noch zu einem günstigeren Preis hergestellt werden kann.

Andere antigenaktive Polypeptide sind bereits aus der DE-OS 27 17 741 bekannt.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein synthetisches antigenaktives Polypeptid zu bekommen, das monospezifisch mit Antikörpern reagiert, welche mit Hilfe des Polypeptidantigens CAPA hergestellt wurden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit Polypeptiden gelöst, die die Aminosäuresequenz
H-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Le-u-Ser-Glu-Leu-Glu-Ala-Ala-
Leu-Gln-Arg-Ala-Lys-Gln-Asp-OH
oder
H-Ala-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala-Ile-Ala-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Al-a-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-
Leu-Ser-Glu-Leu-Glu-Leu-OH
haben. Beiden gemeinsam ist die Aminosäuresequenz
H-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Asg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Le-u-Ser-Glu-Leu-OH.

Die folgenden Abkürzungen werden hier für die fraglichen Aminosäuren verwendet:

Alanin
Ala
Arginin	Arg
Asparagin	Asn
Asparaginsäure	Asp
Glutamin	Gln
Glutaminsäure	Glu
Glycin	Gly
Isoleucin	Ile
Serin	Ser
Leucin	Leu
Tyrosin	Tyr
Valin	Val
Threonin	Thr
Phenylalanin	Phe
Lysin	Lys

Auch betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide. In diesem Verfahren wird jeweils in an sich bekannter Weise eine N-geschützte Aminosäure durch Veresterung an der C-Endposition an einen Träger gebunden, die N-Schutzgruppe wird entfernt, und eine zweite N-geschützte Aminogruppe wird an die Aminogruppe der trägergebundenen Aminosäure gebunden, die N-Schutzgruppe wird entfernt und die Kupplungs- oder Bindungsstufe mit einer dritten N-geschützten Aminosäure wiederholt. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis die erwünschte Aminosäuresequenz erreicht ist, worauf dann das Polypeptid von dem Träger abgespalten wird und die Schutzgruppen von ihm entfernt werden. Es ist bevorzugt, nach jeder Bindung einer N-geschützten Aminosäure an die trägergebundene Aminosäure alle Nebenprodukte und unumgesetzten löslichen Materialien wegzuwaschen.

Der Träger ist zweckmäßig ein Harz, wie ein Copolymeres von Styrol und Divinylbenzol, wobei das Styrol den Hauptteil des Copolymeren ausmacht, indem das Copolymere beispielsweise aus etwa 98 Gew.-% Styrol und etwa 2 Gew.-% Divinylbenzol besteht. Der Träger kann auch ein Protein, wie ein Albumin, sein.

Um eine reaktive Gruppe an dem Harz für die Bindung an die erste Aminosäure zu bekommen, werden die Benzolringe zweckmäßig teilweise chlormethyliert. Wenn dieses chlormethylierte Harz mit dem Triethylaminsalz einer N-geschützten Aminosäure behandelt wird, bildet sich eine Bindung vom Benzylestertyp. Eine solche Bindung ist bei den Synthesestufen beständig, kann aber mit HBr in Essigsäure oder Trifluoressigsäure gespalten werden, wobei die N-Schutzgruppe gleichzeitig entfernt und das Peptid von dem Träger getrennt wird.

Um das N-Ende einer Aminosäure zu schützen, kann zweckmäßig die Tertiärbutyloxycarbonylgruppe, worin gegebenenfalls eine oder zwei Methylgruppen durch Phenylreste ersetzt sind, verwendet werden, da sie mit Hilfe von HCl in Essigsäure bequem abgespalten werden kann. Es ist auch möglich, die Carbobenzoxygruppe für diesen Zweck zu benutzen, doch in diesem Fall muß HBr in Essigsäure zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet werden. Die Schutzgruppe kann auch die o-Nitrophenylsulfenylgruppe oder eine andere bekanntermaßen verwendete Gruppe sein.

Das Kupplungs- oder Bindungsmittel, das in der Synthese am häufigsten verwendet wird, ist Dicyclohexylcarbodiimid. Als Alternative hierzu kann man beim Binden von Glutamin- und Asparagineinheiten die Bindung oder Kupplung mit sogenannten aktiven Estern durchführen, wie beispielsweise Cyanomethyl-, Thiophenyl- oder Nitrophenylestern. Als ein Lösungsmittel in der Synthese sind sogenannte aprotische Lösungsmittel geeignet, besonders Lösungsmittel, die etwas hydrophil oder "semipolar" sind. Wenn Methylenchlorid als Lösungsmittel verwendet wird und ein etwa 50%iger Überschuß an Tertiärbutyloxycarbonylaminosäure und Dicyclohexylcarbodiimid benutzt wird, bekommt man eine quantitative Umsetzung innerhalb weniger Minuten. Auch Dimethylformamid kann als Lösungsmittel verwendet werden. Weitere Einzelheiten bezüglich des Syntheseverfahrens finden sich in "Protein Sequence Determination", herausgegeben von Saul B. Needleman, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1970, besonders auf den Seiten 308 bis 310.

In den in dem vorliegenden Präparat angegebenen Aminosäuresequenzen sind die Endgruppen (nach Entfernung der Schutzgruppen und des Harzteils) immer eine Aminogruppe bzw. Carboxylgruppe. Die Aminogruppe findet sich an dem linken Ende der Kette, während die Carboxylgruppe sich an dem entgegengesetzten Ende der Aminosäuresequenz findet.

Beispiel 1

Nach dem Verfahren in fester Phase gemäß Merrifield (siehe die obige Literaturstelle) wurde das folgende Produkt hergestellt:

worin R ein Harz bedeutet, Boc eine Tertiärbutyloxycarbonylgruppe ist,

Die Aminosäuresequenz zwischen der Tertiärbutyloxycarbonylgruppe und dem Harzteil kann in der folgenden Weise unter Verwendung der obigen Abkürzungen bezüglich der Aminosäuren ausgedrückt werden: (I)
Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Leu--Ser-Glu-Leu-Glu-Ala-Ala-Leu-Gln-Arg-
Ala-Lys-Gln-Asp.

0,4 mMol Boc-Asparaginsäure-β-benzylester [α-(Harzbenzylester)] wurde auf die Küvette in einer Beckmann-Peptidsyntheseeinrichtung übertragen und in Methylenchlorid (CH₂Cl₂) gequollen. Die schützende Boc-Gruppe wurde durch Behandlung mit Trifluoressigsäure im Überschuß in Methylenchlorid entfernt. Nach dem Waschen mit Methylenchlorid wurde das Harz mit Triäthylamin neutralisiert und wiederum mit Metylenchlorid gewaschen. N-Boc-Glutaminsäurebenzylester (Kupplungsstufe 1) und Cyclohexylcarbodiimid wurden in CH₂Cl₂ gelöst zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Das Harz wurde gewaschen und die Kupplungsstufe wiederholt. Dies beendet die Einführung von R₂ in der Stufe 1 nach den obigen Ausführungen.

Die Stufe 2 der Synthese beginnt mit der Entfernung von N-Boc von der Aminosäure mit N-Endgruppe und einer Wiederholung der Kupplungsstufe während eine andere N-Boc-Aminosäure verwendet wird. Um die obige Aminosäuresequenz aufzubauen, wurden die folgenden Reagentien in den aufeinanderfolgenden Stufen verwendet:

In Stufe 2: N-Boc-Glutaminxanthydrylderivat
In Stufe 3: α N-Boc-ε-(o-Chlorcarbobenzoxy)-lysin
In Stufe 4: N-Boc-Alanin
In Stufe 5: N-Boc-G-Tosylarginin
In Stufe 6: Wie in Stufe 2
In Stufe 7: N-Boc-Leucin
In Stufe 8: Wie in Stufe 4
In Stufe 9: Wie in Stufe 4
In Stufe 10: N-Boc-Glutaminsäure-γ-benzylester
In Stufe 11: Wie in Stufe 7
In Stufe 12: Wie in Stufe 10
In Stufe 13: N-Boc-Serinbenzyläther
In Stufe 14: Wie in Stufe 7
In Stufe 15: Wie in Stufe 5
In Stufe 16: Wie in Stufe 4
In Stufe 17: N-Boc-Asparaginxanthydrylderivat
In Stufe 18: Wie in Stufe 4
In Stufe 19: N-Boc-Asparaginsäure-β-benzylester
In Stufe 20: Wie in Stufe 5
In Stufe 21: N-Boc-Isoleucin
In Stufe 22: Wie in Stufe 4
In Stufe 23: Wie in Stufe 7
In Stufe 24: Wie in Stufe 10
In Stufe 25: N-Boc-Glycin
In Stufe 26: Wie in Stufe 5
In Stufe 27: Wie in Stufe 2
In Stufe 28: Wie in Stufe 10
In Stufe 29: Wie in Stufe 4
In Stufe 30: Wie in Stufe 19

Die Schutzgruppen wurden von dem geschützten harzgebundenen Peptid entfernt, das Harz wurde unter Verwendung von wasserfreier Fluorwasserstoffsäure bei 0°C während 30 Minuten abgespalten, und das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung einer 10gewichtsprozentigen wäßrigen Lösung von Essigsäure extrahiert. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand durch Gelfiltration auf Sephadex® G 25 Fine in 0,2 M NH₄HCO₃ gereinigt. Nach der Lyophilisierung des Peptids wurde eine zufriedenstellende Aminosäureanalyse erhalten, zusammen mit einem Molekulargewicht von etwa 3300, bestimmt durch Gelfiltration. Der theoretische Molekulargewichtswert liegt bei 3320,80.

Das nach den obigen Ausführungen hergestellte Polypeptid wurde bezüglich seiner Fähigkeit, die Hämagglutinationsreaktion zwischen gegerbten roten Blutkörperchen vom Schaf, markiert mit natürlichem Cancerantigen und Antikörpern, die unter Verwendung von natürlichem Cancerantigen (CAPA oder TPA) hergestellt wurden, zu hemmen, untersucht. Was diese Methode betrifft, so kann auf die oben genannte SE-OS 73-08 917-9 und die US-PS 39 60 827 hingewiesen werden. Die spezifische Aktivität des Polypeptids lag bei etwa 0,2 Einheiten je Milligramm (E/mg). Diese Einheit für die spezifische Aktivität ist definiert als ein Sechstel der Menge von aktivem Polypeptid, die erforderlich ist, um 10⁹ Blutkörperchen vom Schaf so zu markieren, daß sie vollständig mit der Mindestanzahl oder Mindestmenge an Antikörpern (maximale Verdünnung der Antikörper) agglutiniert sind.

Zum Zwecke der Untersuchung, welche Funktionen für die Aktivität des Polypeptids, dessen Grundstruktur oben angegeben ist, kritisch sind, wurden bestimmte Experimente durchgeführt. Die Arginine wurden dabei mit Cyclohexandion bei pH 13 blockiert, was zu einem fast vollständigen Aktivitätsverlust führte. Wenn jedoch das Polypeptid nur einer basischen Umgebung, deren pH-Wert 13 war, während der gleichen Zeit ausgesetzt wurde, ging nur ein kleinerer Teil der Aktivität verloren. Dies zeigt die Tatsache, daß die Anwesenheit von Arginin in dem Polypeptid nach der Erfindung von entscheidender Bedeutung für die Antigenaktivität ist. Aufgrund des Charakters der Struktur ist es klar, daß das Polypeptid einen sauren Charakter besitzt und somit in einer neutralen Lösung negativ geladen ist, während die positive Ladung des Argininteils des Polypeptids jedoch beibehalten wird.

Die chemische Grundlage für den Antigencharakter des Polypeptids wurde somit in der vorausgehenden Beschreibung dargelegt. Die bemerkenswerte spezifische Aktivität, die mit Hilfe eines synthetisch hergestellten Produktes erhalten wurde, dessen Aktivität als eine solche von Haptennatur infolge der kleinen bestimmenden Gruppe bezeichnet werden kann, stellt eine Pioniererfindung für das Gebiet der Immunologie und des Testens, d. h. der Diagnose, auf dem Cancerbereich dar.

Klar und gemäß dem, was in der Immunologie bekannt ist, ist die Antigenaktivität eine Funktion nicht nur der Struktur der bestimmten Haptengruppe, sondern auch der Größe des Polypeptids. Diese Größe bewirkt jedoch nicht die Spezifität des Peptids, sondern nur seinen Aktivitätsgrad insofern, als ein größeres Molekül dazu neigt, aktiver als ein kleineres zu sein. Daher bekommt man eine verbesserte Aktivität, wenn das Polypeptid auf einem geeigneten immunogen aktiven Träger, wie beispielsweise einem Protein, wie Albumin, beispielsweise Eiweiß, angeordnet ist. Bereits das Polypeptid in seiner Grundstrukturform, d. h. mit wenigstens 20 Aminosäureeinheiten, zeigt jedoch eine Antigenaktivität, die ausreicht, das Polypeptid in die Lage zu versetzen, mit entsprechenden Antikörpern zu reagieren. Außerdem kann das Polypeptid für die Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Dies spricht jedoch für eine Bindung des Polypeptids an ein geeignetes Protein, welches als ein Träger fungiert oder ein sogenanntes "Schlepperantigen", wie beispielsweise Schweineserum.

In dem obigen Beispiel 1 wird die antigene Aktivität des synthetisierten Polypeptids in folgender Weise bestimmt:

Für quantitative Bestimmung der Polypeptidmenge werden 7 mg des Peptids in 1,4 ml Pufferserum gelöst, d. h. in einer physiologischen Kochsalzlösung, die 2% inertes menschliches Serum enthält und mit einem Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von etwa 7,5 gepuffert ist. Unter Reihenverdünnung wird eine Reihe von Proben dieser Lösung mit einer abnehmenden Polypeptidkonzentration hergestellt, und jeder dieser Proben wird eine vorbestimmte Menge Antiserum zugesetzt, das gegen TPA spezifische Antikörper enthält. Jeder der resultierenden Proben wird dann nach der Inkubation eine vorbestimmte Menge des auf einem feinteiligen Träger gebundenen Polypeptids zugesetzt, wobei Hämagglutination bis zu einem Grad entsprechend der Menge der verfügbaren Antikörper stattfindet. Parallel hierzu wird eine entsprechende Reihe von Kontrollproben hergestellt, die bekannte abnehmende Mengen an TPA enthalten. Die Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen der Testproben werden visuell mit denen der Kontrollproben verglichen, um die Aktivität zu bestimmen.

Beispiel 2

Auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurde das folgende Polypeptid hergestellt und erwies sich als immunologisch etwa aktiv wie das Polypeptid des Beispiels 1:

worin R das Harz bedeutet, Boc eine Tertiärbutyloxycarbonylgruppe bedeutet,

Die Aminosäuresequenz zwischen der Tertiärbutyloxycarbonylgruppe und dem Harzteil kann in der folgenden Weise unter Verwendung der obigen Abkürzungen bezüglich der Aminosäuren ausgedrückt werden: (II)
Ala-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala-Ile-Ala-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala--Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Leu-
Ser-Glu-Leu.

0,4 mMol Boc-Leucin (Harzbenzylester)] wurden auf die Küvette einer Beckmann-Peptidsynthetisiereinrichtung überführt und in Methylenchlorid (CH₂Cl₂) gequollen. Die schützende Boc-Gruppe wurde durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in einem Überschuß in Methylenchlorid entfernt. Nach dem Waschen mit Methylenchlorid wurde das Harz mit Triäthylamin neutralisiert und wiederum mit Metylenchlorid gewaschen. N-Boc-Glutaminsäurebenzylester (Kupplungsstufe 1) und Cyclohexylcarbodiimid wurden in CH₂Cl₂ gelöst zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Das Harz wurde gewaschen und die Kupplungsstufe wiederholt. Dies beendete die Einführung von R₂ in Stufe 1 gemäß den obigen Ausführungen.

Stufe 2 der Synthese beginnt mit der Entfernung von N-Boc von der Aminosäure mit N-Endgruppe und einer Wiederholung der Kupplungsstufe während eine andere N-Boc-Aminosäure verwendet wurde. Um die obige Aminosäuresequenz aufzubauen, wurden in nacheinanderfolgenden Stufen die folgenden Reagentien verwendet:

In Stufe 2: N-Boc-Glutaminsäure-γ-benzylester
In Stufe 3: N-Boc-Serinbenzyläther
In Stufe 4: N-Boc-Leucin
In Stufe 5: N-Boc-G-Tosylarginin
In Stufe 6: N-Boc-Alanin
In Stufe 7: N-Boc-Asparaginxanthydrylderivat
In Stufe 8: Wie in Stufe 6
In Stufe 9: N-Boc-Asparaginsäure-β-benzylester
In Stufe 10: Wie in Stufe 5
In Stufe 11: N-Boc-Isoleucin
In Stufe 12: Wie in Stufe 6
In Stufe 13: Wie in Stufe 4
In Stufe 14: Wie in Stufe 2
In Stufe 15: N-Boc-Glycin
In Stufe 16: Wie in Stufe 5
In Stufe 17: N-Boc-Glutaminxanthydrylderivat
In Stufe 18: Wie in Stufe 2
In Stufe 19: Wie in Stufe 6
In Stufe 20: Wie in Stufe 9
In Stufe 21: Wie in Stufe 6
In Stufe 22: Wie in Stufe 11
In Stufe 23: Wie in Stufe 6
In Stufe 24: Wie in Stufe 6
In Stufe 25: Wie in Stufe 2
In Stufe 26: Wie in Stufe 4
In Stufe 27: Wie in Stufe 3
In Stufe 28: Wie in Stufe 6

Das resultierende geschützte harzgebundene Peptid wurde dann gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 behandelt und analysiert.

Das Molekulargewicht war gemäß Bestimmung durch Gelfiltration etwa 3000, während das theoretische Molekulargewicht bei 2936,38 liegt.

Die Ergebnisse der Aminosäureanalysen bei den Polypeptiden der obigen Beispiele 1 und 2 sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Die darin angegebenen Werte bezeichnen die Molprozente einer jeden Aminosäure, d. h. die Zahl der betreffenden Aminosäuren je 100 Aminosäuren des Peptids. Die Werte in der Tabelle entsprechen in zufriedenstellender Weise den theoretischen Werten.

Tabelle

Claims

1. Polypeptide der Aminosäuresequenzen
H-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Le-u-Ser-Glu-Leu-Glu-Ala-Ala-Leu-
Gln-Arg-Ala-Lys-Gln-Asp-OH und
H-Ala-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala-Ile-Ala-Asp-Ala-
Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Al-a-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Leu-Ser-Glu--Leu-OH

2. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise durch aufeinanderfolgenden Aufbau der Aminosäuresequenz eine N-geschützte Aminosäure durch Veresterung an der C-Endposition an einen Träger bindet, die N-Schutzgruppe entfernt, eine zweite N-geschützte Aminosäure der Sequenz an die Aminogruppe der trägergebundenen Aminosäure bindet, die N-Schutzgruppe entfernt, diese Stufe wiederholt und das so erhaltene Polypeptid von dem Träger abspaltet und die Schutzgruppe von ihm entfernt.

3. Verwendung der Polypeptide nach Anspruch 1 zur Bestimmung von gegen diese Polypeptide monospezifische Antikörper in einer biologischen Probe.