DE60032226T2

DE60032226T2 - Verfahren zur induktion von krebszellentod und tumorregression

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Publication number: DE60032226T2
Application number: DE60032226T
Authority: DE
Inventors: Walter R. Pompton Plains BISHOP; Diana L. Union BRASSARD; Tattanahalli L. Parsippany NAGABHUSHAN
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2020-04-07
Also published as: HK1038512B; CA2364675A1; HUP0200773A3; HUP0200773A2; AR023400A1; NO20014897L; AU4204100A; PT1165078E; NO20014897D0; DK1165078T3; ZA200108258B; TWI255184B; HK1038512A1; BR0009670A; DE60032226D1; CY1107545T1; MY120841A; US6316462B1; WO2000061145A1; JP2003529540A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung liefert die Verwendung eines FPT-Inhibitors oder eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Subjekten, die von Krebserkrankungen einschließlich Tumoren und Metastasenerkrankung befallen sind, indem ein FPT-Inhibitor und ein zusätzlicher Ras-Signalweg-Inhibitor verabreicht werden. Diese Erfindung liefert insbesondere die Verwendung eines FPT-Inhibitors oder eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in Verfahren zur Behandlung von Krebs und beinhaltet die kombinierte Verwendung (1) eines Farnesylproteintransferase("FPT")-Inhibitors und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod (insbesondere Zelltod durch Apoptose) zu induzieren, wodurch Behandlungsschemata mit niedriger Dosis möglich sind.
Hintergrund der Erfindung
1 der vorliegenden Beschreibung zeigt eine vereinfachte lineare Abbildung eines Signalübertragungswegs, der zu Zellproliferation führt. Dieser Weg wird hier als der "Ras-Signalweg" bezeichnet, weil Ras in diesem Weg eine zentrale Schaltstelle ist, die Signale von stromaufwärts liegenden Elementen (z. B. Wachstumsfaktorrezeptoren) erhält und zu stromabwärts liegenden Elementen überträgt.
Die durch Wachstumsfaktorrezeptoren initiierten Signalwege, die zu Zellproliferation und in einigen Fällen bösartiger Transformation führen, werden derzeit aufgeklärt. Viele Wachstumsfaktorrezeptoren, wie jene für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und den aus Thrombozyten stammenden Wachstumsfak tor (PDGF) sowie mit EGF-Rezeptor verwandte Moleküle (z. B. Her-2/Neu/ErbB2) besitzen eine intrinsische Tyrosinkinaseaktivität, die durch ligandeninduzierte Rezeptordimerisierung aktiviert wird (Heldin, 1995). Dies führt zu Autophosphorylierung des Rezeptors an Tyrosinresten und zur Bindung von Proteinen, die Src-Homologie 2(SH2)-Domänen enthalten. Zwei derartige SH2-Proteine sind Grb2 und SHC, die das Plasmamembranassoziierte kleine GTP-Bindungsprotein Ras indirekt aktivieren. Ras-Aktivierung erfolgt auch als Reaktion auf Ligandenbindung an sieben Transmembrandomänen-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (z. B. Gutkind, 1998). Die Aktivierung von Ras und anderen Wachstumsfaktorrezeptor-regulierten Signalwegen führt letztendlich zu Veränderungen im Zytoskelett und zur Genexpression, die für Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Zelltransformation erforderlich sind (Übersicht in Campbell et al., 1998).
Die 3 ras-Gene des Menschen (Ha-Ras, N-Ras und Ki-Ras) kodieren (infolge von alternativem Spleißen der Ki-Ras-mRNA) 4 Proteine. Unter normalen Bedingungen wechseln Ras-Proteine zwischen einem aktiven (GTP-gebundenen) Zustand und einem inaktiven (GDP-gebundenen) Zustand. Ras-Aktivierung erfolgt durch Austausch des gebundenen GDP durch GTP, was durch eine Familie von Guaninnukleotidaustauschfaktoren unterstützt wird. Ras-Inaktivierung erfolgt durch Hydrolyse von gebundenem GTP zu GDP. Diese Reaktion wird durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) erleichtert (Trahey und McCormick, 1987). Bei vielen menschlichen Krebserkrankungen werden Ras-Proteine durch Mutationen, die ihre GTPase-Aktivität zerstören und somit die Ras-Signalgebung deregulieren, onkogen aktiviert (Übersicht in Campbell et al., 1998).
Es gibt mehrere in Frage kommende Ras-Effektoren, die stromabwärts von Ras zur Signalübertragung und onkogenen Transformation dienen können, einschließlich Mitgliedern der Rho-Familie der kleinen GTPasen, Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) und der Serin/Threonin-Proteinkinase c-Raf-1 (Übersicht in Campbell et al., 1998). Raf-vermittelte Signalgebung ist der am besten charakterisierte Ras-Effektorweg. Aktiviertes Ras rekrutiert Raf an die Membran, wo die Raf-Aktivierung erfolgt. Aktiviertes Raf ist die Anfangskomponente einer Kinasekaskade, der Mitogen-aktivierten Protein-Kinase (MAPK)-Kaskade (Übersicht in Lowy und Willumsen, 1993; Campbell et al., 1998). Raf phosphoryliert und aktiviert die MEK1- und MEK2-(MAPK/ERK-Kinase)-Proteinkinasen, die wiederum die extrazellulären signalregulierten Kinasen ERK1 und ERK2 (auch als MAPK1 und MAPK2 bekannt) phosphorylieren und aktivieren. Im Unterschied zu ihren stromabwärts liegenden Zielen, ERK1,2, sind die MEK1,2-Proteine hochspezifische Enzyme, deren einzige bekannte Substrate die ERK1,2-Proteine sind. Nach Aktivierung phosphorylieren (und somit regulieren) ERK1 und ERK2 eine Vielfalt von Zielproteinen einschließlich Kerntranskriptionsfaktoren, was zur letztendlichen zellulären Antwort führt. Dieser lineare Weg der Ras-Signalgebung ist schematisch in 1 dargestellt.
Die Bedeutung dieser Signalwege beim abnormalen Wachstum von Krebs wird durch die Erkenntnis gezeigt, dass Wachstumsfaktorrezeptor und Ras-Weg-Komponenten bei Krebs oft mutiert und/oder überexprimiert sind. Ras wird beispielsweise in etwa 30 % der menschlichen Krebserkrankungen einschließlich eines hohen Prozentsatzes an bedeutenden epithelialen Krebserkrankungen, wie Lungen-, Kolon- und Pankreaskrebserkrankungen, mutationsbedingt aktiviert. Bei zahlreichen Krebserkrankungen findet auch Überexpression von Wachstumsfaktorrezeptoren statt (z. B. erfolgt Überexpression des Her-2/Neu-Rezeptors bei etwa 30 % der menschlichen Brustkrebserkrankungen). Diese Beobachtungen haben zur Suche nach und Entwicklung von Mitteln geführt, die einzelne Komponenten von einem der Signalübertragungswege blockieren sollen. Obwohl derartige Mittel möglicherweise als neue Krebstherapeutika in Frage kommen, wird angenommen, dass viele Inhibitoren der Signalübertragung eher in zytostatischer als in zytotoxischer Weise wirken, indem die Progression der Zelle durch den Zellzyklus blockiert wird. Dies unterscheidet sie von traditionellen Krebs chemotherapiewirkstoffen, da sie weniger toxisch sind, jedoch auch weniger drastische Antitumoraktivität aufweisen.
WO 97/45412 offenbart die Verwendung eines MEK-Inhibitors und eines Farnesylproteintransferase(FPT)-Inhibitors zur Behandlung von Krebs. Die Lehre offenbart keine unerwarteten Vorteile durch die Verabreichung der beiden Wirkstoffe in Kombination. Potenzierungsmittel, wie die Benzocycloheptapyridinverbindungen mit kondensiertem Ringsystem, die die Wirksamkeit antineoplastischer Mittel erhöhen, sind in WO 92/11034 offenbart. In dem Dokument WO 97/23478 wird gezeigt, dass neue tricyclische Amidverbindungen, die Farnesylproteintransferase inhibieren können, bei der Behandlung proliferativer Erkrankungen brauchbar sind. Zu den neuen Verbindungen gehören SCH66336, von dem ferner von M. Liu et al. in (1998) Cancer Research, Band 58, Nr. 21, Seiten 4947–4956, gezeigt wurde, dass es Antitumoraktivität bei menschlichen Tumor-Zenograft-Modellen und Wap-ras-transgenen Mäusen hat. D. R. Alessi et al., (1995) J. Biol. Chem., Band 270, Nr. 46, Seiten 27489–27494, zeigten die Aktivität der Verbindung PD098059 als spezifischer Inhibitor der Aktivierung von Mitogen-aktivierter Proteinkinasekinase in vitro und in vivo.
Die Bereitstellung neuer und verbesserter Methoden zur Krebsbehandlung bleibt eine Herausforderung. Zur Behandlung tumorigener Krebszellen wäre beispielsweise die Bereitstellung neuer Methoden sehr erwünscht, die eine drastische und selektive Induktion des Krebszelltodes erreichen, während potentielle toxische Nebenwirkungen gegen normale, untransformierte Zellen minimiert werden. Die vorliegende Erfindung liefert genau solche Behandlungsmethoden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung eines Farnesylproteintransferase(FPT)-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten durch Verabreichung

(1) eines FPT-Inhibitors mit der folgenden Formel
(+)-Enantiomer und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors in Mengen, die wirksam sind, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner die Verwendung eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten durch Verabreichung

(1) eines FPT-Inhibitors mit der folgenden Formel
(+)-Enantiomer und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors in Mengen, die wirksam sind, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erreichen eine unerwartet drastische Induktion von Krebszelltod (insbesondere Zelltod durch Apoptose). Die Effekte sind synergistisch und hochselektiv gegen transformierte Zellen (insbesondere tumorigene Krebszellen), wodurch die Verwendung niedriger Dosen zur Minimierung potentieller toxischer Nebenwirkungen gegen norma le, untransformierte Zellen möglich wird. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine lang anhaltende, nachhaltige Wirkung auf die Blockierung der Zellsignalgebung haben, während wiederum potentielle toxische Nebenwirkungen gegen normale, untransformierte Zellen minimiert werden. Keine dieser Wirkungen und schon gar nicht ihre Größenordnung konnten vor der vorliegenden Erfindung vorausgesagt werden. Unter Ausnutzung des Vorteils der überraschenden Synergie und der nachhaltigen, lange anhaltenden Wirkungen dieser Erfindung werden zudem spezielle, niedrig dosierte Zusammensetzungen bereitgestellt, so dass effektiv Krebszelltod erreicht wird, während gleichzeitig ein niedriges Risiko potentiell toxischer Nebenwirkungen auf normale, untransformierte Zellen aufrechterhalten wird. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind besonders brauchbar zur Behandlung verschiedener tumorigener Krebserkrankungen, insbesondere epithelialer Krebserkrankungen (z. B. Pankreaskrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Kolorektalkrebs und Blasenkrebs) und Melanom.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die FPT-inhibierende Verbindung, die in den 1 bis 7 genannt ist, (mitunter als "SCH66336" bezeichnet) ist wie folgt:
(+)-Enantiomer
1: Ras-Signalübertragung: Schematische Darstellung der Komponenten des Ras/MAPK-Signalübertragungswegs. Dieser lineare Weg vom Wachstumsfaktorrezeptor bis zur. ERK- Aktivierung war der erste Ras-vermittelte Weg, der aufgeklärt wurde. Ebenfalls dargestellt sind Stufen, auf die verschiedene Inhibitoren zielen, zu denen der FPT-Inhibitor SCH66336 und die MEK-Inhibitoren PD098059 und U0126 gehören.
2: Die dosisabhängige Apoptosereaktion auf die Behandlung mit PD098059 wird durch Zusatz von SCH66336 verstärkt. H-Ras-CVLS-transformierte Rat2-Zellen wurden 36 Stunden lang mit den angegebenen Konzentrationen PD098059 (A385-023-M005; Alexis Corporation) entweder allein oder in Kombination mit SCH66336 behandelt. Die Zellen wurden durch Trypsin/EDTA-Behandlung geerntet, in Aceton/Methanol (50%:50%) bei. –20°C 30 Minuten lang fixiert, ausgedehnt mit PBS gewaschen und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit PBS markiert, das 75 μg/ml Propidiumiodid (PI; Calbiochem; La Jolla, CA, USA) und 500 μg/ml RNase (Sigma; St. Louis, MO, USA) enthielt. Die Apoptose wurde durch Propidiumiodid-Färbung chromosomaler DNA mit FACS-Analyse der Zellpopulation gemessen (FACS-Calibur, Becton-Dickinson; Mountain View, CA, USA). Die Konzentration von PD098059 wurde in Gegenwart
oder Abwesenheit
von 100 nM SCH66336 von 0,25 bis 20 μM variiert.
3: Die dosisabhängige Apoptosereaktion auf die Behandlung mit SCH66336 wird durch Zusatz von PD098059 verstärkt. H-Ras-CVLS-transformierte Rat2-Zellen wurden 36 Stunden lang mit den angegebenen Konzentrationen SCH66336 entweder allein oder in Kombination mit PD098059 behandelt. Die Analyse wurde wie in der Beschreibung der obigen 2 durch- geführt. Die Konzentration von SCH66336 wurde in Gegenwart
oder Abwesenheit
von 2,5 μM PD098059 von 0,0125 bis 0,75 μM variiert.
4: Wirkung von SCH66336 und U0126 auf die Apoptose, gemessen mit FACS. H-Ras-transformierte Rat2-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0 bis 10 μM U0126 (#V1121; Promega Corporation; Madison, WI, USA) in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,5 μM SCH66336 behandelt. Die Analyse wurde wie in der Legende von 2 beschrieben durchgeführt. 1 = unbehandelte Zellen, 2 = SCH66336; 3 = 1 μM U0126; 4 = 1 μM U0126 + SCH66336; 5 = 5 μM U0126; 6 = 5 μM U0126 + SCH66336; 7 = 10 μM U0126; 8 = 10 μM U0126 + SCH66336.
5: Wirkung von SCH66336 und PD098059 auf die Apoptose, gemessen mit Caspaseaktivierung. H-Ras-transformierte Rat2-Zellen und Eltern-Rat2-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 20 μM PD098059, 0,5 μM SCH66336 oder einer Kombination beider Wirkstoffe behandelt. Die Zellen wurden in einem von Clontech empfohlenen Detergenspuffer lysiert (Apo-Alert CPP32/Caspase-3 Assay) und mit 14 000 UpM 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Proteinkonzentration des resultierenden Überstands wurde mit einem BCA-Protein-Assay (Pierce; Rockford, IL, USA) bestimmt, wobei 175 μg von jedem Lysat unter Verwendung eines fluorogenen Peptidsubstrats (AC-DEVD-AMC; Clontech; Palo Alto, CA, USA) mittels Fluorometrie (CytoFluor Plattenleser; Perseptive Biosystems; Framingham, MA, USA) auf Caspase-3-Aktivität untersucht wurden. 1 = unbehandelte H-ras-Zellen; 2 = H-ras-Zellen + SCH66336; 3 = H-ras-Zellen + PD09059; 4 = H-ras-Zellen + SCH66336 + PD098959; 5 = unbehandelte Rat2-Zellen; 6 = Rat2-Zellen + SCH66336; 7 = Rat2-Zellen + PD09059; 8 = Rat2-Zellen + SCH66336 + PD098959.
6: Wirkung von SCH66336 und PD098059 auf ERK1- und ERK2-Phosphorylierung: H-Ras-transformierte Rat2-Zellen wurden 0 bis 36 Stunden mit 20 μM PD098059 oder 0, 5 μM SCH66336 behandelt. Die Zellen wurden in einem Detergenspuffer lysiert und 15 Minuten bei 4°C mit 14 000 UpM zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Proteinkonzentration des resultierenden Überstands wurde mit einem BCA-Proteinassay (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt. Zellproteine (20 μg) wurden mit 8–16% Tris-Glycin-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt (Novex; San Diego, CA, USA). Die Proteine wurden dann zur Western Blot-Analyse auf PVDF-Membranen überführt. Phosphoryliertes ERK1 und ERK2 wurden mit einem für die phosphorylierten p42/44 MAPK-Proteine spezifischen polyklonalen Kaninchen-Antikörper (phospho-Thr202/Tyr204 specific; #9101; New England Biolabs, Inc.; Beverly, MA, USA) detek tiert. Das gesamte ERK1 und ERK2 wurde mit einem für p42/44 MAPK-Proteine spezifischen polyklonalen Kaninchen-Antikörper (#9102; New England Biolabs, Inc.; Beverly, MA, USA) detektiert. Beide Antikörper wurden mit Anti-Maus-HRP-Antikörper der Ziege (Meerrettich-Peroxidase; Chemicon; Temecula, CA, USA) erkannt und durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate; Pierce; Rockford, IL, USA).
7: Intrazelluläre Signalübertragungswege: 1 zeigt diagrammartig einen linearen Weg, der von Wachstumsfaktorrezeptoren über Ras zur Aktivierung der MAPK-Kaskade führt. Es ist klar, dass Signalwege erheblich komplexer sind, mit mehreren Verzweigungen und Zwischenverbindungen. Ein Teil dieser Komplexität ist hier in 7 illustriert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert neue Methoden zur Behandlung von Krebs durch Kombinieren (1) eines Farnesylproteintransferase(FPT)-Inhibitors und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors.

(1) ein "Farnesylproteintransferase-Inhibitor" oder "FPT-Inhibitor" oder "FTI" ist hier definiert als eine Verbindung, die (i) FPT stark inhibiert (jedoch vorzugsweise nicht Geranylgeranylproteintransferase I, in vitro), (ii) die phänotypische Veränderung blockiert, die durch eine Form von transformierendem H-ras induziert wird, das ein Farnesylakzeptor ist (jedoch vorzugsweise nicht durch eine Form von transformierendem H-ras, das gentechnisch so verändert worden ist, dass es ein Geranylgeranylakzeptor ist), (iii) die intrazelluläre Farnesylierung von ras blockiert, und (iv) das abnormale Zellwachstum blockiert.
(2) Ein "Ras-Signalweginhibitor" ist hier definiert als ein Mittel, das die Aktivität eines beliebigen Proteins in dem in 1 gezeigten Signalübertragungsweg blockiert. Ein besonders bevorzugter Ras-Signalweg-Inhibitor ist ein "MEK-Inhibitor", der hier definiert ist als ein Mittel, das die in vitro-Enzymaktivität eines MEK(MAPK/ERK-Kinase)-Proteins blockiert (vorzugsweise MEK1 und MEK2 inhibiert) und somit die Aktivierung eines MAPK-Proteins blockiert, wie durch eine Blockierung der Phosphorylierung des MAPK-Proteins deutlich wird. Dies kann durch Western Blot-Analyse auf phosphorylierte MAPK detektiert werden, wie z. B. in Dudley et al., Proc Natl Acad Sci. 92: 7686–7689 (1995) und Favata et al., J Biol Chem. 273: 18623–32 (1998) beschrieben ist.

1. FPT-Inhibitoren
Als Einzelmittel oder in Kombination mit Chemotherapie (siehe z. B. Liu et al, 1998) stellen FPT-Inhibitoren einen führenden Ansatz zum Blockieren der Funktion von Ras-Onkoproteinen dar. FPT katalysiert die Addition einer Isoprenyl-Lipideinheit an einen Cysteinrest, der in der Nähe des Carboxy-Terminus des Ras-Proteins vorliegt. Dies ist die erste Stufe in einem posttranslationalen Verarbeitungsweg, der sowohl für Ras-Membranassoziierung als auch Ras-induzierte onkogene Transformation essentiell ist. Es ist über zahlreiche FPT-Inhibitoren, einschließlich einer Vielzahl peptidomimetischer Inhibitoren sowie anderer kleiner Moleküle als Inhibitoren berichtet worden, insbesondere die tricyclischen FPT-Inhibitoren, beispielsweise SCH66336. FPT-Inhibitoren greifen in die nach der Translation erfolgende Verarbeitung von Ras-Proteinen in Zellen ein und zeigen in einer breiten Vielfalt von in vitro- und in vivo-Krebsmodellen Antitumoraktivität (Bishop et al., 1995; Liu et al., 1998). Zu der Antitumoraktivität von SCH66336 gehören die Inhibierung des verankerungsunabhängigen Wachstums einer Vielzahl humaner Tumorzelllinien in vitro und ihres Wachstums als Xenografts in immunbeeinträchtigten Mäusen (Liu et al., 1998). Menschliche Tumorzelllinien unterscheiden sich signifikant hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber den Wachstumswirkungen von FPT-Inhibitoren. Empfindlichkeit oder Widerstandsfähigkeit korrelieren nicht mit dem Ras-Mutationsstatus.
In mehreren transgenen Maus-Tumormodellen (z. B. MMTV-H-Ras, WAP-H-Ras, TGFα und TGFα/neu) werden durch Behandlung mit FPT-Inhibitoren signifikante Tumorregressionen induziert. Diese Regressionen sind mit einem Anstieg der Apoptose assoziiert (Liu et al 1998; Barrington et al., 1998; Norgaard et al., 1999). FPT-Inhibitoren können auch Apoptose transformierter Zellen in Kultur induzieren. Es ist berichtet worden, dass die apoptotische Wirkung in vitro Wachstum in armem Serum oder erzwungenes Wachstum in Suspension erfordert (Hung and Chaung, 1998; Lebowitz et al., 1997; Suzuki et al., 1998).
Es ist auch gezeigt worden, dass FPT-Inhibitorbehandlung die Aktivität des MAPK-Wegs in Ha-Ras-transformierten Rat1-Zellen reduziert (z. B. James et al., 1994). Diese Abnahme der MAPK-Aktivität korreliert mit einer Abnahme des Zellwachstums. FPT-Inhibitoren reduzierten die MAPK-Aktivität bei untransformierten Rat1-Zellen nicht.
2. Mittel, die auf MEK zielen:
Der MAPK-Weg ist auch als Ziel für die Entwicklung von Antikrebstherapeutika untersucht worden, und die Wirkungen spezieller Inhibitoren dieses Wegs auf Tumorzelllinien sind beschrieben worden (Dudley et al., 1995; Favata et al., 1998). Der am besten charakterisierte MEK-Inhibitor ist PD098059, ein kleines Molekül, das die Aktivität von MEK1 und MEK2 über direkte Bindung in einer Weise inhibiert, die in Bezug auf beide Substrate (ATP oder ERK-Protein) nicht-kompetitiv ist. Dies führt zu verringerter MEK1- und MEK2-Phosphorylierung und verringerter Aktivierung der MEK-Substrate, ERK1 und ERK2. PD098059-Behandlung blockiert Wachstumfaktor-vermittelte Proliferation und verankerungsunabhängiges Wachstum Ras-transformierter Zellen (Alessi et al, 1995, J Biol Chem. 270: 27489–27494).
In jüngerer Zeit wurde über einen neuen MEK-Inhibitor, U0126, berichtet, der mit einer höheren Affinität als PD098059 an MEK bindet (Favata et al., 1998). Für detailliertere Informationen über MEK-Inhibitoren und Verfahren zur Herstellung von MEK-Inhibitoren kann z. B. auf die internationalen Patentveröffentlichungen WO 99/01421 (14. Januar 1999) und WO 99/01426 (14. Januar 1999) verwiesen werden.
3. Mittel, die auf Wachstumsfaktorrezeptoren zielen:
Es gibt zwei Hauptansätze zum Blockieren der Wachstumsrezeptor-Signalwege: (i) monoklonale Antikörper, die gegen den Rezeptor gerichtet sind; (ii) Inhibitoren der Rezeptor-Tyrosinkinase-Aktivität und (iii) Antisense-Nukleinsäuren zum Blockieren der Protein-Expression. Monoklonale Antikörper gegen den Rezeptor schließen jene ein, die auf den erbB2-Rezeptor zielen (z. B. HERCEPTIN^®/trastuzumab von Genentech) und jene, die auf den EGF-Rezeptor zielen. Der am besten charakterisierte Anti-EGF-Rezeptorantikörper ist der chimäre Antikörper C225 (Goldstein et al. (1995), Clin Cancer Res. 1: 1311–1318). Sowohl HERCEPTIN^® als auch C225 haben Wirksamkeit in präklinischen Tumormodellen gezeigt, in denen ihre verwandten Rezeptoren exprimiert werden.
Es ist auch über kleine. Moleküle als Inhibitoren der Tyrosinkinaseaktivität berichtet worden, wobei sich mindestens zwei dieser Verbindungen bereits in klinischen Studien am Menschen befinden: der PDGF-Rezeptorinhibitor von Sugen, SU101, der sich in Phase III der klinischen Prüfung auf Gliom und in früheren Stadien von Studien für andere Krebsindikationen befindet, und der EGF-Rezeptorinhibitor von Pfizer, CP-358,774, der sich in einer frühen Phase der klinischen Prüfung befindet (Moyer et al. (1997), Cancer Res. 57: 4838–4848).
4. Andere Signalantagonisten:
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Ansätzen ist für die Entdeckung von Krebswirkstoffen auf andere Elemente des Ras-Signalwegs und anderer Signalübertragungswege gezielt worden. Die SH2-Proteine (SHC und Grb2), die Wachstumsfaktorrezeptoren mit der Ras-Aktivierung verknüpfen, sind Ziele von peptidomimetischen Mitteln, die die Bindung der SH2-Domänen an Phosphotyrosin enthaltende Proteinsequenzen blockieren.
Die Proteinkinase Raf, die Ras mit MEK1,2-Aktivierung verknüpft, war auch das Ziel sowohl der kleinen Moleküle als Kinase-Inhibitoren als auch der Antisense-Ansätze. Der letztere Ansatz (ISIS-5132) befindet sich in der Phase II der klinischen Prüfung (Monia et al., 1996).
Zu anderen relevanten Zielen der intrazellulären Signalgebung gehören die Phospholipid-Kinase PI3K (Phosphatidylinositol-3-Kinase) und Protein-Kinase C.
In bevorzugten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung tumorigener Krebszellen verwendet werden, indem sie eine signifikante Wirkung auf den Zelltod (z. B. durch Apoptose) im Falle der Krebszellen haben (d. h. indem sie eine signifikante Wirkung auf den Zelltod haben, die über bloße Arretierung des Wachstums hinausgeht), während die Wirkstoffe zugleich in relativ niedrigen Dosen (und/oder weniger häufig) verabreicht werden können, um potentielle toxische Nebenwirkungen gegen normale, untransformierte Zellen zu minimieren. Die vorliegende Erfindung liefert zudem neue Verfahren zur Behandlung von Krebs, indem eine längere, nachhaltigere Wirkung auf das Blockieren der Zellsignalgebung bereitgestellt wird, während zugleich das Risiko potentieller toxischer Nebenwirkungen gegen normale Zellen minimiert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert somit auch Verfahren, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod (z. B. Apoptose) bei einem Krebspatienten zu induzieren, bei dem gleichzeitig oder sequentiell wirksame Mengen (1) eines FPT-Inhibitors und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors verabreicht werden (d. h. in Mengen, die ausreichen, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren, wie z. B. durch den Propidiumiodid-Fluoreszenz-Assay gemessen wird, der in Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs. 6: 522–32, beschrieben wurde. In ähnlicher Weise werden hier Verfahren zum Abtöten von Krebszellen bei einem Krebspatienten bereitgestellt (gemessen durch den Assay von Dengler et al., 1995), bei dem wirksame Mengen (1) eines FPT-Inhibitors und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors verabreicht werden.
In bevorzugten Ausführungsformen beinhalten die erfindungsgemäßen Verfahren zudem Verfahren zur Behandlung von Tumoren und für die Regression des Tumorvolumens (z. B. gemessen mittels CAT-Scan) bei einem Patienten, der dieser Behandlung bedarf (z. B. einem Säuger, wie einem Menschen), indem gleichzeitig oder sequentiell (1) ein FPT-Inhibitor und (2) ein zusätzlicher Ras-Signalweg-Inhibitor in Mengen verabreicht werden, um dies zu erreichen. Beispiele für Tumoren, die behandelt werden können, schließen epitheliale Krebserkrankungen, z. B. Prostatakrebs, Lungenkrebs (z. B. Lungen-Adenokarzinom), Pankreaskrebse (z. B. Pankreaskarzinom, wie beispielsweise exokrines Pankreaskarzinom), Brustkrebserkrankungen, Kolonkrebserkrankungen (z. B. kolorektale Karzinome, wie beispielsweise Kolon-Adenokarzinom und Kolon-Adenom), Eierstockkrebs, Blasenkarzinom und Krebserkrankungen der Leber ein, sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Melanom, myeloide Leukämien (beispielsweise akute myelogene Leukämie), Sarkome, Schilddrüsenfollikelkrebs und myelodysplastisches Syndrom gehören zu anderen Krebserkrankungen, die behandelt werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen FPT-Inhibitor und einen zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitor enthalten, zur Behandlung von Krebs (einschließlich Induktion von Krebszelltod und Tumorregression) und die Herstellung derartiger Zusammensetzungen zur Verfügung.
Die folgenden Begriffe haben hier die folgenden Bedeutungen, wenn nicht anders angegeben:

"Wachstumsfaktorrezeptor-Inhibitor": ein Mittel, das die Signalübertragungseigenschaften eines Wachstumsfaktorrezeptors blockiert. Diese können als direkte Inhibitoren der Tyrosinkinase-Aktivität des Rezeptors oder durch Inhibierung der ligandenstimulierten Aktivierung der Kinaseaktivität des Rezeptors wirken, wie in Levitzki und Gazit, 1995 (Science. 267: 1782–1788) beschrieben wurde.
"Tyrosinkinase-Inhibitor": ein Mittel, das die Tyrosin-Phosphorylierungsaktivität blockiert, indem es entweder mit ATP konkurriert oder über eine allosterische Wechselwirkung mit dem Enzym, wie in Levitzki und Gazit, 1995, beschrieben wurde.
"Proteinkinase-Inhibitor": ein Mittel, das die Protein-Phosphorylierungsaktivität an Serin-, Threonin- oder Tyrosinresten blockiert, wie in Levitzki und Gazit, 1995, beschrieben wurde.
"p185 erbB2/HER2/neu-Rezeptor-Inhibitor" oder "erbB2-Rezeptorinhibitor": ein Mittel, das die Signalübertragungseigenschaften des erbB2-Rezeptors blockiert, indem es entweder die Tyrosinkinase-Aktivität des Rezeptors inhibiert oder die Ligandenstimulation der Kinaseaktivität des Rezeptors blockiert, wie in Levitzki und Gazit, 1995 beschrieben wurde.
"PDGF-Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor": ein Mittel, das die Signalübertragungseigenschaften des von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktor(PDFG)-Rezeptors blockiert, indem es entweder die Tyrosinkinase-Aktivität des Rezeptors inhibiert oder die PDGF-Stimulation der Kinaseaktivität des Rezeptors blockiert, wie in M. Kovalenko et. al. (1994). Cancer Res. 54: 6106–6114 beschrieben wurde.
"EGF-Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor": ein Mittel, das die Signalübertragungseigenschaften des epidermalen Wachstumsfaktor(EGF)-Rezeptors blockiert, indem es entweder die Tyrosinkinase-Aktivität des Rezeptors inhibiert oder die EGF-Stimulation der Kinaseaktivität des Rezeptors blockiert, wie in Fry et. al. (1994). Science 9: 1093–1095 beschrieben wurde.
"Ein Antikörper, der gegen die extrazelluläre Domäne eines Wachstumsfaktorrezeptors gerichtet ist": Ein solcher Antikörper blockiert die biologische Aktivität des Wachstumsfaktorrezeptors, indem die Bindung des Liganden inhibiert wird und/oder ligandenstimulierte Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinase verhindert wird, wie in J. Mendelsohn, (1992) J Natl Cancer Inst Monogr 13: 125–131 beschrieben wurde.
"Ein monoklonaler Antikörper, der auf den p185 erbB2/HER2/neu-Rezeptor zielt" oder "ein monoklonaler Antikörper, der auf den erbB2-Rezeptor zielt": Ein solcher Antikörper blockiert die biologische Aktivität des HER2-Rezeptors, was sich durch Inhibierung der Bindung des Liganden und/oder Verhinderung der ligandenstimulierten Aktivierung der Wachstumsfaktorrezeptor-Kinase äußert, wie in Pegram et al., 1998, beschrieben wurde; siehe auch Carter et al. (1992), Proc. Natl Acad. Sci. 89: 4285–4289.
"Ein monoklonaler Antikörper, der auf den EGF-Rezeptor zielt": Gezeigt durch einen monoklonalen Antikörper, der die EGF-Bindung und/oder EGF-stimulierte Kinaseaktivität inhibiert, wie in J. Mendelsohn, (1992) J Natl Cancer Inst Monogr 13: 125–131 beschrieben wurde.
"Ein Antisense-Molekül, das gegen einen Wachstumsfaktorrezeptor oder eine andere Komponente im Ras-Signalweg gerichtet ist": Ein modifiziertes Oligonukleotid, das in die Messenger-RNA-Translation (und somit die Protein-Expression) einer beliebigen Proteinkomponente in dem Weg eingreift, wie in Wang et al., 1998 oder Resnicoff, 1998, beschrieben wurde. Für eine allgemeine Erörterung der Antisense-Technologie siehe z. B. Antisense DNA and RNA, (Cold Spring Harbor Laboratory, Herausgeber D. Melton, 1988)
"gleichzeitig": (1) zeitlich simultan oder (2) zu unterschiedlichen Zeiten während des Verlaufs eines gemeinsamen Be- handlungsschemas, und
"sequentiell": (1) Verabreichung einer Komponente des Verfahrens ((a) FPT-Inhibitor oder (b) eines zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitors), gefolgt von Verabreichung der anderen Komponente; nach Verabreichung von einer Komponente kann die zweite Komponente im Wesentlichen unmittelbar nach der ersten Komponente verabreicht werden, oder die zweite Komponente kann nach einem effektiven Zeitraum nach der ersten Komponente verabreicht werden, wobei der effektive Zeitraum die Zeitdauer ist, die zur Realisierung des maximalen Nutzens aus der Verabreichung der ersten Komponente zur Verfügung gestellt wird.
"Stromabwärts" ist hier als eine Proteinaktivität (innerhalb des Ras-Signalgebungswegs) definiert, die durch Ras entweder direkt über Protein:Protein-Bindung oder indirekt durch ein Ras-reguliertes Effektorprotein reguliert wird. In Bezug auf 1 kann somit ein "Element stromabwärts von Ras" z. B. Mek1,2 oder Erk1,2 sein.
"Stromaufwärts" ist hier als eine Proteinaktivität (innerhalb des Ras-Signalgebungswegs) definiert, die die Aktivität von Ras entweder direkt über Protein:Protein-Bindung oder indirekt durch Regulierung eines anderen Proteins reguliert, welches direkt an Ras bindet und die Ras-Aktivität reguliert. Ein "Element stromaufwärts von Ras" kann somit z. B. erbB2, PDGF-Rezeptor, IGF-Rezeptor oder EGF-Rezeptor sein
"Zelltod" ist hier der Tod einer Zelle, der entweder unter physiologischen Bedingungen oder durch akute Verletzung induziert wurde und aus der Zerlegung der Zellorganellen und -proteine und Aufhebung der metabolischen Prozesse resultiert, wie in M. Raff, (1998). Nature. 396: 119–122, besprochen wurde. Der Zelltod kann z. B. durch den Propidiumiodid-Durchflusszytometrie-Assay gemessen werden, der in Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs. 6: 522–32, beschrieben wurde.
"Apoptose" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung eine Form des Zelltods (programmierter Zelltod), die stereotype morphologische Veränderungen zeigt, wie in M. Raff (1998) Nature. 396: 119–122, besprochen wurde. Die Apoptose kann z. B. durch den Propidiumiodid-Durchflusszytometrie-Assay gemessen werden, der in Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs. 6: 522–32, beschrieben wurde, oder durch den in situ-Assay mit terminaler Deoxynukleotidyltransferase und Nick-Translation (TUNEL-Analyse), beschrieben in Gorczyca, (1993) Cancer Res 53: 1945–51.
"Synergistisch" oder "synergistischer Grad" ist hier als eine Wirkung definiert, die durch die Kombination zweier Kom ponenten erreicht wird und größer als die Summe der Wirkungen von jeweils einer der beiden Komponenten allein ist (wobei die Menge der Komponente konstant gehalten wird). Die Formulierung "Mengen, die wirksam sind, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren" bezieht sich somit beispielsweise auf Mengen zweier Komponenten, die einen Grad des Krebszelltods (z. B. Zelltod durch Apoptose, gemessen durch den Propidiumiodid-Durchflusszytometrie-Assay, beschrieben in Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs. 6: 522–32, oder durch den in situ-Assay mit terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase und Nick-Translation (TUNEL-Analyse), beschrieben in Gorczyca, (1993) Cancer Res 53: 1945–51.) erreichen, der größer als die Summe der Wirkungen von jeweils einer der beiden Komponenten allein ist.
"Nachhaltige Wirkung" ist hier definiert als verlängerte/verstärkte Apoptosereaktion auf die Kombinationsbehandlung mit einem FPT I und einem MEK1,2-Inhibitor, verglichen mit einer Einzelbehandlung allein. Die Folgen einer "nachhaltigen Wirkung" können entweder durch Messung der MAPK-Aktivität oder des Zelltods oder der Apoptose überwacht werden, wie zuvor beschrieben wurde. Der effektive Zeitverlauf zur Inhibierung des MAPK-Wegs durch die individuellen Wirkstoffe ist dosisabhängig. Die Experimente hier zeigen jedoch, dass die MEK1,2-Inhibitoren den MAPK-Weg bei Ablauf oder vor Ablauf einer 6 Stunden dauernden Behandlung optimal inhibieren, während SCH66336 optimale MAPK-Weg-Inhibition 12 bis 18 Stunden nach der Behandlung zeigt. Es ist gezeigt worden, dass die MAPK-inhibierende Wirkung von SCH66336 bis zu 72 Stunden nach der Behandlung anhält. Die Kombination der beiden Wirkstoffe kann somit zu einer "nachhaltigen" Inhibierung des MAPK-Weges für einen langen Zeitraum führen, vorzugsweise für einen Zeitraum, der mit dem Ablauf von oder unmittelbar vor dem Ablauf von 6 Stunden nach Behandlung beginnt, und vorzugsweise fortlaufend bis 36 Stunden, insbesondere 72 Stunden nach der Behandlung. (Siehe z. B. 6).

Der Begriff "Abtöten von Krebszellen" bedeutet Induktion des Krebszelltodes von transformierten tumorigenen Krebszellen.
Verwendung von Chemotherapie und/oder Strahlungstherapie als zusätzliche Mittel in den erfindungsgemäßen Behandlungen
Chemotherapeutika und/oder Strahlung können den erfindungsgemäßen Behandlungsschemata (zusätzlich zu der Kombination (1) eines Farnesylproteintransferase(FPT)-Inhibitors und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors) hinzuzugefügt werden. Zur Verwendung von Chemotherapie und/oder Strahlungstherapie in Kombination mit nur einem FPT-Inhibitor kann auf M. Liu et al. Cancer Res. 58: 4947–4956 (1998) und die US-Patentanmeldung USSN 09/217,335 verwiesen werden, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Zu Verbindungsklassen, die als chemotherapeutisches Mittel verwendet werden können, gehören: Alkylierungsmittel, Antimetabolite, natürliche Produkte und ihre Derivate, Hormone und Steroide (einschließlich synthetischer Analoga) und synthetische Substanzen. Nachfolgend werden Beispiele für Verbindungen in diesen Klassen gegeben.
Alkylierungsmittel (einschließlich Stickstoff-Lost-Verbindungen, Ethyleniminderivaten, Alkylsulfonaten, Nitrosoharnstoffen und Triazenen): Uracil-Lost, Chlormethin, Cyclophosphamid (Cytoxan^®), Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylen-melamin, Triethylenthiophosphoramin, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Streptozocin, Dacarbazin und Temozolomid.
Antimetabolite (einschließlich Folsäureantagonisten, Pyrimidinanaloga, Purinanaloga und Adenosindeaminaseinhibitoren): Methotrexat, 5-Fluoruracil, Floxuridin, Cytarabin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Fludarabinphosphat, Pentostatin und Gemcitabin.
Naturprodukte und ihre Derivate (einschließlich Vinca-Alkaloiden, Antitumorantibiotika, Enzymen, Lymphokinen und Epi podophyllotoxinen): Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Paclitaxel (Paclitaxel ist im Handel als Taxol^® erhältlich), Mithramycin, Desoxycoformycin, Mitomycin-C, L-Asparaginase, Interferone (insbesondere IFN-α), Etoposid und Teniposid.
Hormone und Steroide (einschließlich synthetischer Analoga): 17α-Ethinylestradiol, Diethylstilbestrol, Testosteron, Prednison, Fluoxymesteron, Dromostanolonpropionat, Testolacton, Megestrolacetat, Tamoxifen, Methylprednisolon, Methyltestosteron, Prednisolon, Triamcinolon, Chlortrianisen, Hydroxyprogesteron, Aminoglutethimid, Estramustin, Medroxyprogesteronacetat, Leuprolid, Flutamid, Toremifen, Zoladex.
Synthetische Substanzen (einschließlich anorganischer Komplexe wie Platinkoordinationskomplexe): Cisplatin, Carboplatin, Hydroxyharnstoff, Amsacrin, Procarbazin, Mitotan, Mitoxantron, Levamisol und Hexamethylmelamin.
Verfahren zur sicheren und wirksamen Verabreichung der meisten dieser chemotherapeutischen Mittel sind Fachleuten bekannt. Ihre Verabreichung ist darüber hinaus in der Standardliteratur beschrieben. Beispielweise ist die Verabreichung von vielen der chemotherapeutischen Mitteln in der "Physicians' Desk Reference" (PDR), z. B. Ausgabe 1996 (Medical Economics Company, Montvale, NJ 07645-1742, USA) beschrieben, auf deren Offenbarung hier Bezug genommen wird.
Beispiele
Die nachfolgend gegebenen Beispiele beschreiben die Wirkung der Kombination eines FPT-Inhibitors (SCH66336) mit einem MEK-Inhibitor (entweder PD098059 oder U0126) auf den programmierten Zelltod (Apoptose) in H-Ras-transformierten Rat2-Zellen. Ähnlich Tumorzelllinien zeigen diese Zellen einen vollständig transformierten Phänotyp einschließlich der Fähigkeit, verankerungsunabhängig in Weichagar und als Xenografts in Nacktmäusen zu wachsen.
Die in den folgenden Beispielen verwendete FPT-inhibierende Verbindung (SCH66336, Schering-Plough Research Institute) hat die folgende Formel:
(+)-Enantiomer
"PD098059", ein spezieller MEK-Inhibitor, hat die folgende chemische Struktur:
PD098059 ist detaillierter in Dudley et al., 1995 beschrieben. Die Druckschrift von Dudley et al. erwähnt, dass der lyophilisierte Feststoff in den in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten Reagenzkonzentrationen in DMSO wiederaufgelöst werden muss.
"U0126", ein weiteres Beispiel für einen MEK-Inhibitor, hat die folgende chemische Struktur:
U0126 ist detaillierter in Favata et al., 1998, beschrieben. Die Druckschrift von Favata et al. erwähnt auch, dass der lyophilisierte Feststoff in den in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten Reagenzkonzentrationen in DMSO wiederaufgelöst werden muss.
Materialien und Verfahren
Zelllinien und Behandlungen
In allen Fällen enthielten die Ras-Sequenzen eine Gly¹² zu Val-Aktivierungsmutation. H-ras (G12V; CVLL) steht für eine Ser¹⁸⁹ zu Leu-Mutation, die eine geranylgeranylierte Form des H-ras-Proteins erzeugt. Die cDNAs, die diese H-ras-Proteine repräsentieren, wurden zur Erzeugung stabiler Ras-exprimierender Rat2-Zelllinien durch retrovirale Transduktion und Selektion mit dem Neomycin-Gen (Kirschmeier et al., 1988) in das pMV7-Plasmid subkloniert. Die hier präsentierten stabilen Zelllinien repräsentieren individuelle Klone von Ras-exprimierenden, Neomycin-selektierten Zellen. H-ras (G12V)/Rat2, H-ras (G12V; CVLL)/Rat2 und Eltern-Rat2-Zellen wurden in DMEM wachsen gelassen, das 10 % fötales Kälberserum, Penicillin, Streptomycin, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin, und für die Ras-Transformanten 200 μg/ml Geneticin (Gibco/BRL; Gaithersburg, MD, USA) enthielt. Alle ras-transformierten Zellen zeigten einen vollständig transformierten Phänotyp einschließlich verankerungsunabhängigem Wachstum und tumorigenen Fähigkeiten.
PD098059 (A385-023-M005; Alexis Corporation; San Diego, CA, USA) und U0126 (#V1121; Promega Corporation; Madison, WI, USA) wurden gemäß Dudley et al. (1995) und Favata et al. (1998) verwendet.
FACS-Analyse
FACS-Analyse wurde unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt. Die Zellen wurden durch Trypsin/EDTA-Behandlung geerntet, das Trypsin wurde mit DMEM neutralisiert, das 10 % FCS enthielt, und die Zellen wurden bei 500 × g 5 Minuten lang pelletiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, pelletiert, in 0,5 ml PBS resuspendiert und mit 2 ml eiskaltem Aceton:Methanol (1:1) 30 Minuten bei –20°C fixiert. Um chromosomale DNA mit Propidiumiodid (PI) zu markieren, wurden die fixierten Zellen zweimal mit PBS gewaschen, bevor 1 × 10⁶ Zellen/ml in PBS, 75 μg/ml PI (Calbiochem; La Jolla, CA, USA), 500 μg/ml RNase (Sigma; St. Louis, MO, USA) erneut suspendiert wurden und 30 Min bei RT inkubiert wurden. Die Zellen wurden durch eine 35 μm Strainer Cap (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) filtriert und vor der FACS-Analyse mit einem FACS-Calibur (Becton Dickinson; Mountain View, CA, USA) bei 4°C gelagert. Die Quantifizierung wurde mit CellQuest (Becton Dickinson; Mountain View, CA, USA) durchgeführt.
Caspase-Aktivitäts-Assay
H-Ras-transformierte Rat2-Zellen und Eltern-Rat2-Zellen wurden 36 Stunden lang bei 37°C mit 20 μM PD098059, 0,5 μM SCH66336 oder einer Kombination beider Wirkstoffe behandelt. Die Zellen wurden mit Trypsin/EDTA geerntet, 5 Minuten lang bei 500 × g pelletiert, mit PBS gewaschen und erneut pelletiert. Die Zellen wurden in einem Lysepuffer (ApoAlert CPP32/Caspase-3 Assay Kit; Clontech Laboratories; Palo Alto, CA, USA) resuspendiert/lysiert, der "Complete"-Proteaseinhibitoren (Boehringer Mannheim; Deutschland) enthielt, 10 Minuten auf Eis inkubiert und 3 Minuten lang bei 4°C bei 12 000 UpM zentrifugiert, wie in dem Clontech-Protokoll empfohlen wird. Die Proteinkonzentration der Zelllysate wurde mit dem BCA-Protein-Assay (Pierce; Rockford, IL, USA) bestimmt und ungefähr 30 μg von jedem Lysat unter Verwendung eines fluorogenen Peptidsubstrats (Ac-DEVD-AFC; Clontech; Palo Alto, CA, USA) mittels Fluorometrie (CytoFluor Plattenleser; Perseptive Biosystems; Framingham, MA, USA) auf Caspase-3-Aktivität untersucht wurden.
Western Blot Analyse des ERK1,2-Phosphorylierungsstatus
Die Zellen wurden in einem Detergenspuffer lysiert (mitgeliefert im ApoAlert CPP32/Caspase-3-Assay-Kit; Clontech; Palo Alto, CA, USA) und bei 14 000 UpM 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Proteinkonzentration des resultierenden Überstands wurde mit einem BCA-Proteinassay (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt. Zellproteine (20 μg) wurden an 8–16 %igen Tris-Glycin-Polyacrylamid-Gelen (Novex; San Diego, CA, USA) getrennt und zur Western Blot-Analyse auf PVDF-Membranen überführt. Die phosphorylierten ERK1- und ERK2-Proteine wurden mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper detektiert, der für die phosphorylierte Form der p42/44 MAPK-Proteine spezifisch ist (phospho-Thr202/Tyr204 specific; New England Biolabs, Inc.; Beverly, MA, USA). Das gesamte ERK1 und ERK2 wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper detektiert, der für p42/44 MAPK-Proteine spezifisch ist (New England Biolabs, Inc.; Beverly, MA, USA). Ein sekundärer Anti-Kaninchen-HRP-Antikörper der Ziege (Chemicon; Temecula, CA, USA) ermöglichte die Visualisierung durch verstärkte Chemilumineszenz (SuperSignal, West Pico Chemiluminescent Substrate; Pierce; Rockford, IL, USA).
Ergebnisse:
1. Wirkungen auf die Apoptose; fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
Zelluläre Apoptosereaktionen können auf verschiedene Weise überwacht werden, einschließlich Analyse der chromosomalen DNA-Fragmentierung, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) von Propidiumiodid-gefärbten Zellen und Messung der Caspase-Aktivierung. Zur Bewertung der Apoptosereaktion auf Behandlung mit einem der Wirkstoffe haben wir die chromosomale DNA der behandelten Zellen mit Propidiumiodid gefärbt und die individuellen Zellen mittels FACS analysiert. Typische Zellkulturpopulationen zeigen einen großen Peak der Zellen in der G1/G0-Phase des Zellzyklus, wobei ein kleinerer Peak für G2/M-Phasenzellen repräsentiert. Zwischen diesen zwei Peaks sind Zellen in der S-Phase des Zellzyklus. Zellen, die DNA-Markierung zeigen, die vor dem G1/G0-Peak liegt, stehen für Zellen mit fragmentierter DNA, die weniger als die diploide Menge chromosomaler DNA enthalten und somit Zelltod erleiden (Dengler et al., 1995). Diese Messung ergibt eine relative Quantifizierung der Apoptose, die mit anderen Apoptose-Assays vergleichbar ist, einschließlich TdT-vermittelter dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL-Analyse); Gorczyca et al., (1993) Cancer Res. 53: 1945–51. In den nachfolgenden Experimenten haben wir den Prozentsatz der Gesamtzellpopulation im Sub-G0/G1-Peak als Grad der prozentualen Apoptose bestimmt.
Die Behandlung von H-ras-transformierten Rat2-Zellen mit PD098059 allein für 36 Stunden führte zu einem dosisabhängigen Anstieg des Prozentsatzes der apoptotischen Zellen (2). Bei einer Konzentration von 20 μM PD098059 waren 50 % der Zellen apoptotisch. Wenn die PD098059-Dosisreaktion in Anwesenheit von 100 nM SCH66336 wiederholt wurde, war ein ganz anderes Ergebnis zu beobachten. In Gegenwart von 100 nM SCH66366 allein waren 30 % der Zellen apoptotisch. Bei Behandlung mit der Kombination wurden mit lediglich 2,5 μM PD098059 mehr als 60 % der Zellen in die Apoptose getrieben. Die PD098059- Konzentration, die erforderlich war, um 50 % Apoptose zu erreichen, betrug 20 μM, wenn diese Verbindung allein verwendet wurde, jedoch ≤ 1 μM bei Verwendung in Kombination mit dem FPT-Inhibitor. Dies zeigt, dass SCH66336 Zellen gegenüber den pro-apoptotischen Wirkungen von PD098059 signifikant sensibilisiert.
Das Umkehrexperiment wurde ebenfalls durchgeführt. Behandlung mit SCH66336 allein für 36 Stunden induzierte eine dosisabhängige apoptotische Reaktion (3). Bei Verwendung von 0,75 μM SCH66336 waren 70 % der Zellen apoptotisch. Bei alleiniger Verwendung lag die Konzentration an SCH66336, die zum Induzieren von 50 % Apoptose erforderlich war, zwischen 0,25 und 0,5 μM. In Gegenwart von 2,5 μM PD098059 zeigte die Dosis-Reaktions-Kurve für SCH66336 eine Linksverschiebung, was eine verstärkte apoptotische Reaktion bedeutet. Wenn PD098059 vorhanden war, betrug die Konzentration an SCH66336, die zum Induzieren von 50 % Apoptose erforderlich war, 50 nM.
Eine ähnliche Reihe von Experimenten wurde mit einem strukturell verschiedenen MEK-Inhibitor, U0126, durchgeführt (4). Ähnlich PD098059 ist U0126 ein sehr selektiver Inhibitor der MEK1,2-Proteine, der eine starke Inhibition ihrer Kinaseaktivität zeigt (Farata et al., 1990). Die Behandlung mit U0126 allein führte zu einer dosisabhängigen Induktion der Apoptose in H-ras-transformierten Rat2-Zellen, wobei mit einer Konzentration von 10 μM 17 % apoptotische Zellen beobachtet wurden. Wenn dieses Experiment in Gegenwart von 0,5 μM SCH66336 wiederholt wurde (eine Konzentration, die für sich genommen 14 % Apoptose induzierte), wurde mit der Kombination eine stärker als additive Reaktion beobachtet. Die Kombination von 10 μM U0126 und 0,5 μM SCH66336 führte dazu, dass über 50 der Zellen apoptotisch waren.
Diese Daten zeigen einen signifikanten Anstieg der proapoptotischen Wirksamkeit in H-ras-transformierten Rat2-Zellen von MEK-Inhibitoren und SCH66336, wenn sie in Kombination ge- testet wurden. Im Unterschied zu diesen Ergebnissen waren untransformierte Eltern-Rat2-Zellen oder mit aktivierter Ki-Ras transformierte Rat2-Zellen unempfindlich gegenüber Apoptose, die durch eines der Wirkstoffe allein oder durch die Kombination von SCH66336 und PD098059 induziert wurde (Daten nicht gezeigt). Fehlende Wirkung in den Ki-Ras-transformierten Rat2-Zellen kann teilweise durch neuere Beobachtungen erklärt werden, dass einige Ras-Isoformen (Ki-Ras und N-Ras) sowohl in vitro als auch in Zellen, die mit FPT-Inhibitoren behandelt wurden, durch Geranylgeranyltransferase 1 alternativ prenyliert werden (Zhang et al., 1997; Whyte et al., 1997).
2. Wirkungen auf die Apoptose: Caspase-Aktivierung:
Caspasen sind eine evolutionär konservierte Familie von Enzymen, die als Antwort auf proapoptotische Signale die Zelle proteolytisch abbauen und zerlegen (Übersicht in Thornberry und Lazebnik, 1998). Um Apoptose mit diesem eigenständigen biochemischen Endpunkt zu bestimmen, haben wir die Caspase-Aktivität in Zelllysaten, die aus H-Ras-transformierten Rat2-Zellen präpariert wurden, unter Verwendung eines fluorometrischen Assays auf Caspase 3-Aktivität gemessen (Apo-Alert CPP32/Caspase-3 Assay; Clontech). Behandlung der H-Ras-transformierten Zellen für 24 Stunden mit entweder 0,5 μM SCH66336 oder 20 μM PD098059 allein erhöhte die Caspase-Aktivität über das Hintergrundniveau unbehandelter Zellen (5). Diese Ergebnisse stehen mit den proapoptotischen Wirkungen von jedem der Wirkstoffe in Einklang, die mittels FACS-Analyse beobachtet wurden (2 nach 36 Stunden). Wenn H-Ras-transformierte Rat2-Zellen mit der Kombination beider Wirkstoffe behandelt wurden, wurde eine mehr als additive Caspase-3-Reaktion beobachtet, was wiederum die FACS-Ergebnisse bestätigt.
Bei den Eltern-Rat2-Zellen wurde wenig oder keine Caspase-Aktivierung beobachtet, wenn sie mit einem der Einzelmittel oder einer Kombination beider Wirkstoffe behandelt wurden (5).
3. Auswirkungen auf die MAPK-Phosphorylierung:
Wir haben die Fähigkeit des FPT-Inhibitors SCH66336 und des MEK-Inhibitors PD098059 untersucht, die MEK-Aktivierung in H-ras-transformierten Rat2-Zellen zu blockieren, indem wir den Phosphorylierungszustand ihrer Substrate ERK1 und ERK2 (44 beziehungsweise 42 Kd) gemessen haben. Behandlung der Zellen mit 20 μM Pd098059 verminderte die Phosphorylierung beider Proteine (6). Die maximale Inhibierung wurde am ersten untersuchten Zeitpunkt (6 Stunden) beobachtet, und die Phosphorylierung blieb im Zeitverlauf von 36 Stunden erniedrigt. Behandlung von Zellen mit 0,5 μM SCH66336 verringerte die Phosphorylierung beider Proteine in einer zeit- (6) und dosisabhängigen (Daten nicht gezeigt) Weise, wobei 0,5 μm SCH66336 zwischen 24 und 36 Stunden Behandlungsdauer maximale Inhibition zeigten. In beiden Fällen war die Inhibition der Phosphorylierung bei dem 44 kDa-ERK1-Protein stärker ausgeprägt. Während ihr Phosphorylierungsstatus herabgesetzt war, blieb die Gesamtmenge dieser Proteine durch die Wirkstoffbehandlung im Wesentlichen unbeeinflusst (6, untere Felder).
Diskussion
FPT-Inhibitoren, wie SCH66336, und MEK Inhibitoren, wie PD098059 oder U0126, zielen auf unterschiedliche Stufen in einem gemeinsamen Signalübertragungsweg. Wenn beide Mittel kombiniert werden, haben sie überraschenderweise eine mehr als additive Wirkung auf die Apoptose in H-Ras-transformierten Rat2-Zellen, gemessen entweder durch FACS-Analyse der SubG0/G1-Population oder durch Caspase-Aktivierung. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, gibt es für diese Beobachtung zwei mögliche Erklärungen. Es ist erstens möglich, dass diese Kombination zu einer vollständigeren oder länger anhaltenden (nachhaltigen) Inhibierung des in 1 skizzierten linearen Wegs führt. Alternativ kann die Wirksamkeit der Kombination durch die Tatsache erklärt werden, dass intrazelluläre Signalwege erheblich komplexer und stärker miteinander verbunden sind als der in 1 abgebildete Weg. Ein komplexeres Verschaltungsdiagramm ist in 7 gezeigt. Wie bereits erwähnt, ist es klar, dass diese Wege sich an mehreren Stufen entlang des Weges verzweigen. Wachstumsfaktorrezeptoren aktivieren mehrere Signalwege über SH2-vermittelte Wechselwirkungen. In ähnlicher Weise sind unter Verwendung von Yeast-2-Hybrid und anderen biochemischen Ansätzen mehrere Ras-Effektoren identifiziert worden. Die kombinierte Wirksamkeit eines FPT-Inhibitors und eines MEK-Inhibitors können. durch ihre Auswirkungen auf unterschiedliche Zweige dieser Wege erklärt werden. Zusätzlich zu dem Blockieren der H-Ras-vermittelten Aktivierung von MEK blockieren FPT-Inhibitoren beispielsweise auch andere Ras-Effektorwege (z. B. die PI3K und Rho-Wege). In ähnlicher Weise gibt es Anzeichen für Ras-unabhängige Aktivierung des MEK/MAPK-Wegs (Duckworth and Cantley, 1997; Morrison and Cutler, 1997). Obwohl die molekularen Komponenten dieses Ras-unabhängigen Weges noch vollständig aufgeklärt werden müssen, legt dies nahe, dass ein FPT-Inhibitor allein nicht alle Wege ausschalten kann, die zur MEK/MAPK-Aktivierung führen. Die Kombination dieser beiden Klassen von Inhibitoren allein kann zu einer vollständigeren Blockade führen.
Unabhängig von dem Mechanismus zeigen die ex vivo-Daten mit der Kombination von SCH66336 und PD098059 eine beeindruckende Potenzierung der Apoptose induzierenden Aktivität. Dieser Typ von erhöhter Wirksamkeit in Kombination ist zudem erweiterbar, so dass andere Mittel, die auf Signalübertragungswege zielen, eingeschlossen sind (z. B. Mittel, die Wachstumsfaktorrezeptoren blockieren). Diese Wirkungen können, wie oben gesagt, aus (i) einer vollständigeren Inhibierung des Wachstumsfaktor-Ras-Signalwegs, als durch die Behandlung mit einem einzelnen Mittel erreicht wird, oder (ii) aus simultaner Inhibierung mehrerer Signalwege resultieren. Viele Tumoren können beispielsweise durch die Wirkung mehrerer Wachstumsfaktoren gesteuert werden, die jeweils in autokriner oder parakriner Weise wirken, um die Proliferation über ihre verwandten Rezep toren zu steuern. Die Blockierung eines dieser Rezeptorwege unter Verwendung von Antikörpern oder Tyrosinkinase-Inhibitoren kann eine Antitumorwirkung ausüben, indem dieser Signalweg blockiert wird, andere Rezeptor-gesteuerte Wege jedoch unbeeinflusst bleiben. Die Zugabe eines FPT-Inhibitors kann die Signalgebung von diesen anderen Wegen ausschalten, was zu einer vollständigeren Inhibierung der Signalübertragung führt und somit eine synergistische Antitumorwirkung zeigt. Weil Wachstumsfaktorrezeptoren zudem bekanntermaßen mehrere Signalgebungskaskaden initiieren (z. B. Ras/MEK, Phospholipase Cγ und PI3K), kann die Inhibition des Ras-Wegs mit einem FPT-Inhibitor oder einem MEK-Inhibitor möglicherweise ohne Einfluss auf die Signalgebungsfunktion dieser anderen Wege bleiben. Die Zugabe eines Wachstumsfaktorrezeptor-Antikörpers oder Tyrosinkinase-Inhibitors zu einer mit einem FPT-Inhibitor behandelten Tumorzelle kann somit zu einer vollständigeren Inhibition der Signalgebung führen und eine synergistische Antitumorwirkung haben, indem diejenigen Wege ausgeschaltet werden, die von dem FPT-Inhibitor nicht beeinflusst werden.
Ähnliche Arten von Synergie können auch beobachtet werden, indem FPT-Inhibitoren mit Mitteln kombiniert werden, die auf andere Stufen in diesen Signalgebungswegen zielen (z. B. Raf-Inhibitoren, SH2-Inhibitoren, PI3K-Inhibitoren usw.).
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Inerte, pharmazeutisch annehmbare Träger, die zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen der hier beschriebenen FPT-Inhibitoren und Ras-Signalweginhibitoren verwendet werden, können fest oder flüssig sein. Feste Zubereitungen schließen Pulver, Tabletten, dispergierbare Granalien, Kapseln, Medizinalkapseln und Zäpfchen ein. Die Pulver und Tabletten können etwa 5 bis etwa 70 % aktiven Bestandteil enthalten. Geeignete feste Träger sind in der Technik bekannt, z. B. Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Zucker und/oder Lactose. Tabletten, Pulver, Kapseln und Medizinalkapseln kön nen als feste Dosierungsformen verwendet werden, die für die orale Verabreichung geeignet sind.
Zur Herstellung von Zäpfchen wird ein niedrig schmelzendes Wachs, wie eine Mischung von Fettsäureglyceriden oder Kakaobutter, zuerst geschmolzen und der aktive Bestandteil darin homogen dispergiert, wie durch Rühren. Die geschmolzene homogene Mischung wird dann in zweckmäßig bemessene Formen gegossen, abkühlen und dadurch verfestigen gelassen.
Zubereitungen in flüssiger Form schließen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Als Beispiel können Wasser oder Wasser-Propylenglykol-Lösungen für die parenterale Injektion genannt werden. Flüssige Zubereitungen können auch Lösungen für intranasale Verabreichung einschließen.
Aerosolzubereitungen, die zur Inhalation geeignet sind, können Lösungen und Feststoffe in Pulverform einschließen, die in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger wie einem inerten komprimierten Gas vorliegen können.
Ebenfalls eingeschlossen sind feste Zubereitungen, die dazu vorgesehen sind, kurz vor Gebrauch in Zubereitungen in flüssiger Form für orale oder parenterale Verabreichung über- führt zu werden. Solche flüssigen Formen schließen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein.
Die hier beschriebenen FPT-Inhibitoren und Ras-Weg-Inhibitoren können auch transdermal zuführbar sein. Die transdermalen Zusammensetzungen können die Form von Cremes, Lotionen, Aerosolen und/oder Emulsionen annehmen und können in einem Transdermalpflaster vom Matrix- oder Reservoirtyp enthalten sein, wie in der Technik zu diesem Zweck üblich ist.
Die Verbindungen werden vorzugsweise oral verabreicht.
Die pharmazeutische Zubereitung liegt vorzugsweise in Einheitsdosisform vor. In einer solchen Form wird die Zubereitung in Einheitsdosen unterteilt, die geeignete Mengen der aktiven Komponente enthalten, z. B. eine wirksame Menge, um den gewünschten Zweck zu erreichen.
Die Menge an aktiver Verbindung in einer Einheitszubereitungsdosis kann entsprechend der jeweiligen Anwendung zwischen etwa 0,5 mg bis 1000 mg, vorzugsweise etwa 1 mg bis 300 mg, insbesondere 5 mg bis 200 mg variiert oder eingestellt werden.
Die tatsächlich verwendete Dosis kann gemäß den Erfordernissen des Patienten und dem Schweregrad des behandelten Zustands variiert werden. Die Bestimmung der richtigen Dosierung für eine bestimmte Situation liegt innerhalb des Wissens des Fachmanns. Die Behandlung wird allgemein mit geringeren Dosierungen begonnen, die unter der optimalen Dosis der Verbindung liegen. Nachfolgend wird die Dosierung in kleinen Mengen erhöht, bis die optimale Wirkung unter den Bedingungen erreicht wird. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit kann die Gesamttagesdosis auf Wunsch aufgeteilt und portionsweise über den Tag verabreicht werden.
Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung der FPT-Inhibitoren und der zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitoren werden aufgrund der Beurteilung des behandelnden Klinikers (Arztes) unter Berücksichtigung von Faktoren wie Alter, Zustand und Größe des Patienten sowie des Schweregrads der behandelten Erkrankung festgelegt. Die Dosis eines FPT-Inhibitors kann allgemein (bei Verwendung als Einzelmittel) einen oberen Bereich von 2000 mg/Tag haben, vorzugsweise im Bereich von 50 bis 400 mg/Tag in Fällen, in denen der FPT-Inhibitor ein tricyclisches Benzocycloheptapyridin mit kondensiertem Ringsystem ist. In der erfindungsgemäßen Kombinationstherapie ist hingegen ein bevorzugtes Schema mit niedriger Dosierung der FPT-Inhibitoren z. B. orale Verabreichung einer Menge im Bereich von 1,4 bis 400 mg/Tag, insbesondere 1,4 bis 350 mg/Tag, besonders bevorzugt 3,5 bis 70 mg/Tag, vorzugsweise mit einem B.I.D.-Dosierschema. Ein besonders niedriger Dosierbereich kann 1,4 bis 70 mg/Tag sein.
Die zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitoren können nach therapeutischen Protokollen verabreicht werden, die in der Technik wohlbekannt sind. Siehe z. B. M. D. Pegram et al. (1998). J Clin Oncol. 16: 2659–2671. Es ist für Fachleute offensichtlich, dass die Verabreichung des zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitors in Abhängigkeit von der behandelten Erkrankung und den bekannten Wirkungen des zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitors auf diese Erkrankung variiert werden kann. Gemäß dem Wissen des Klinikers können die therapeutischen Protokolle (z. B. Dosismengen und Verabreichungszeiten) unter Berücksichtigung der beobachteten Wirkungen der verabreichten therapeutischen Mittel (d. h. zusätzlichem Ras-Weg-Inhibitor) auf den Patienten und unter Berücksichtigung der beobachteten Reaktionen der Erkrankung auf die verabreichten therapeutischen Mittel variiert werden. Allgemein kann die Dosis für einen zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitor (bei Verwendung als Einzelmittel) z. B. im Bereich von 5 bis 2000 mg/Tag liegen. In der Kombinationstherapie der vorliegenden Erfindung ist hingegen ein bevorzugtes Schema mit niedriger Dosierung für einen zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitor (z. B. eines MEK-Inhibitors) die Verabreichung einer Menge im Bereich von 1 bis 350 mg/Tag, insbesondere 3,5 bis 70 mg/Tag, vorzugsweise mit einem B.I.D.-Dosierschema. Ein besonders niedriger Dosierbereich kann 1 bis 70 mg/Tag sein.
Somit kann in einem bevorzugten Beispiel für Kombinationstherapie zur Behandlung von Krebserkrankungen (z. B. Pankreas-, Lungen- oder Blasenkrebs) der FPT-Inhibitor beispielsweise das oben identifizierte SCH66336 sein, das oral in einer Menge von 70 mg/Tag in zwei aufgeteilten Dosen nach einem kontinuierlichen Dosierungsschema verabreicht wird, und der zusätzliche Ras-Signalweg-Inhibitor kann PD098059 (oder ein Analogon davon) sein, das in einer Menge von 350 mg/Tag in zwei aufgeteilten Dosen nach einem kontinuierlichen Dosierungsschema verabreicht wird.
In einem weiteren bevorzugten Beispiel für Kombinationstherapie zur Behandlung von Krebserkrankungen (z. B. Pankreas-, Lungen- oder Blasenkrebs) ist der FPT-Inhibitor das oben identifizierte SCH66336, das oral in einer Menge von 70 mg/Tag in zwei aufgeteilten Dosen nach einem kontinuierlichen Dosierungsschema verabreicht wird, und der zusätzliche Ras-Signalweg-Inhibitor ist U0126 (oder ein Analogon davon), das in einer Menge von 350 mg/Tag in zwei aufgeteilten Dosen nach einem kontinuierlichen Dosierungsschema verabreicht wird.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist ein FPT-Inhibitor gleichzeitig oder sequentiell mit einem zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitor zu verabreichen. Es ist somit beispielsweise nicht notwendig, dass der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor und der FPT-Inhibitor simultan oder im Wesentlichen simultan verabreicht werden. Der Vorteil einer simultanen oder im Wesentlichen simultanen Verabreichung lässt sich durch den Kliniker sicherlich ermitteln.
Der FPT-Inhibitor und der weitere Ras-Signalweg-Inhibitor müssen im Allgemeinen auch nicht in derselben pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden und müssen möglicherweise wegen der unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften auf unterschiedliche Weise verabreicht werden. Zum Beispiel kann der FPT-Inhibitor oral verabreicht werden, um gute Blutspiegel desselben zu erzeugen und aufrechtzuerhalten, während der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor intravenös verabreicht werden kann. Die Festlegung des Verabreichungsmodus und der Zweckmäßigkeit der Verabreichung in derselben pharmazeutischen Zusammensetzung, falls möglich, liegt innerhalb des Wissens des Klinikers. Die Erstverabreichung kann gemäß etablierten Protokollen erfolgen, die in der Technik bekannt sind, und danach können die Dosierung, Verabreichungsmodi und Verabreichungszeiten durch den Kliniker gemäß den beobachteten Wirkungen modifiziert werden.
Die jeweilige Wahl des FPT-Inhibitors und des zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitors hängt von der Diagnose der behandelnden Ärzte und ihrer Beurteilung des Zustands des Patienten und des geeigneten Behandlungsprotokolls ab.
Der FPT-Inhibitor und der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor können in Abhängigkeit von der Art der proliferierenden Krankheit, dem Zustand des Patienten und der tatsächlichen Wahl des zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitors, der zusammen (d. h. innerhalb eines einzigen Behandlungsprotokolls) mit dem FPT-Inhibitor verabreicht werden soll, gleichzeitig (z. B. simultan, im We- sentlichen simultan oder innerhalb desselben Behandlungsprotokolls) oder sequentiell verabreicht werden.
Wenn der FPT-Inhibitor und der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor nicht simultan oder im Wesentlichen simultan verabreicht werden, sind die anfängliche Reihenfolge der Verabreichung des FPT-Inhibitors und des zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitors möglicherweise nicht wichtig. Somit kann zuerst der FPT-Inhibitor verabreicht werden, gefolgt von der Verabreichung des zusätzlichen Ras-Weg-Inhibitors, oder der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor kann zuerst verabreicht werden, gefolgt von der Verabreichung des FPT-Inhibitors. Diese alternierende Verabreichung kann während eines einzigen Behandlungsprotokolls wiederholt werden. Die Festlegung der Verabreichungsreihenfolge und der Anzahl der Wiederholungen der Verabreichungen von jedem therapeutischen Mittel während eines Behandlungsprotokolls liegt innerhalb des Wissens des Arztes nach Beurteilung der zu behandelnden Erkrankung und des Zustands des Patienten. Beispielsweise kann zuerst der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor verabreicht werden und danach die Behandlung mit der Verabreichung des FPT-Inhibitors fortgeführt werden, gefolgt, wo dies als vorteilhaft ermittelt wurde, von der Verabreichung des zusätzlichen Ras-Weg-Inhihitors und so weiter, bis das Behandlungsprotokoll abgeschlossen ist.
Aufgrund von Erfahrung und Wissen kann der praktizierende Arzt somit jedes Protokoll zur Verabreichung einer Komponente (therapeutisches Mittel, d. h. FPT-Inhibitor, zusätzlicher Ras-Weg-Inhibitor) der Behandlung gemäß den Bedürfnissen des einzelnen Patienten modifizieren, während die Behandlung voranschreitet.
Der zuständige Kliniker wird bei der Beurteilung, ob die Behandlung bei der verabreichten Dosis wirksam ist, das allgemeine Wohlbefinden des Patienten sowie eindeutigere Anzeichen berücksichtigen, wie Linderung der mit der Krankheit zusammenhängenden Symptome, Inhibierung des Tumorwachstums, tatsächliches Schrumpfen des Tumors oder Inhibierung der Metastasenbildung. Die Größe des. Tumors kann nach Standardverfahren gemessen werden, wie radiologischen Untersuchungen, z. B. CAT- oder MRI-Aufnahme, und aufeinander folgende Messungen können verwendet werden, um zu beurteilen, ob das Wachstum des Tumors verzögert oder sogar umkehrt worden ist oder nicht. Linderung der mit der Krankheit zusammenhängenden Symptome, wie Schmerz, und Verbesserung des Gesamtzustands können auch verwendet werden, um die Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung zu unterstützen. (Wie bereits gesagt, führt die wirksame Behandlung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren natürlich vorzugsweise zu einem synergistischen Grad an Krebszelltod und/oder Tumorregression).
Es folgen Beispiele (Beispiele 1 bis 4) für Kapselformulierungen der FPT-Inhibitorverbindung:
(+)-Enantiomer
Beispiele 1 und 2 Kapselformulierung
Verfahren (Beispiele 1 und 2) Herstellung der festen Lösung
Kristalline FPT-Inhibitorverbindung und das Povidon wurden in Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittelsprühtrockner getrocknet. Der Rückstand wurde danach durch Mahlen zu feinen Partikeln zerkleinert. Das Pulver wurde danach durch ein 30 mesh Sieb gegeben. Gemäß Röntgenanalyse erwies sich das Pulver als amorph.
Die Feststoffe der festen Lösung, Siliciumdioxid⁽¹⁾ und Magnesiumstearat⁽²⁾, wurden in einem geeigneten Mischer 10 Minuten lang gemischt. Die Mischung wurde mit einem geeigneten Walzverdichter verdichtet und mit einer geeigneten Mühle gemahlen, die mit einem 30 mesh Sieb ausgestattet war. Der gemahlenen Mischung wurde Croscarmellose-Natrium, Pluronic F68 und Siliciumdioxid⁽³⁾ zugegeben und weitere 10 Minuten lang gemischt. Mit Magnesiumstearat⁽⁴⁾ und gleichen Anteilen der Mischung wurde eine Vormischung hergestellt. Die Vormischung wurde zu dem Rest der Mischung hinzugegeben und 5 Minuten lang gemischt. Die Mischung wurde in Hartschalen-Gelatinekapselschalen verkapselt. Beispiele 3 und 4 Kapselformulierung
Verfahren (Beispiele 3 und 4) Herstellung der festen Lösung
Kristalline FPT-Inhibitorverbindung und das Povidon wurden in einer Mischung aus Methylenchlorid und Methanol gelöst. Die Lösung wurde unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittelsprühtrockners getrocknet. Der Rückstand wurde danach durch Mahlen zu feinen Partikeln zerkleinert. Das Pulver wurde danach durch ein 30 mesh Sieb gegeben. Gemäß Röntgenanalyse erwies sich das Pulver als amorph.
Die Feststoffe der festen Lösung, Siliciumdioxid⁽¹⁾ und Magnesiumstearat⁽²⁾, wurden in einem geeigneten Mischer 10 Minuten lang gemischt. Die Mischung wurde mit einem geeigneten Walzverdichter verdichtet und mit einer geeigneten Mühle gemahlen, die mit einem 30 mesh Sieb ausgestattet war. Der ge- mahlenen Mischung wurde Croscarmellose-Natrium, Pluronic F68 und Siliciumdioxid⁽³⁾ zugegeben und weitere 10 Minuten lang gemischt. Mit Magnesiumstearat⁽⁴⁾ und gleichen Anteilen der Mischung wurde eine Vormischung hergestellt. Die Vormischung wurde zu dem Rest der Mischung hinzugegeben und 5 Minuten lang gemischt. Die Mischung wurde in Hartschalen-Gelatinekapselschalen verkapselt.
Für Informationen über Formulierungen kann auf die US-Patentanmeldungen mit den Aktenzeichen 08/997168 und 60/068387 (eingereicht am 22. Dezember 1997) verwiesen werden.
Der Bereich der Erfindung gemäß ihrem Aspekt der pharmazeutischen Zusammensetzung soll durch die angegebenen Beispiele nicht eingeschränkt werden.
Referenzen

D. R. Alessi et. al. (1995). J Biol Chem. 270: 27489–27494.
R. E. Barrington et. al. (1998). Mol Cell Biol. 75: 85–92.
W. R. Bishop et. al. (1995). J Biol Chem. 270: 30611–30618.
S. L. Campbell et. al. (1998). Oncogene. 17: 1395–1413.
W. A. Dengler et. al. (1995). Anticancer Drugs. 6: 522–32.
B. C. Duckworth und L. C. Cantley, (1997). J Biol Chem. 272: 27665–27670.
D. T. Dudley et. al. (1995). Proc Natl Acad Sci USA. 92: 7686–7689.
M. F. Favata et. al. (1998). J Biol Chem. 273: 18623–32. D. W. Fry et. al. (1994). Science. 9: 1093–1095.
N. I. Goldstein et al. (1995). Clin Cancer Res. 7: 1311–1318.
Gorczyca et al., (1993) Cancer Res. 53: 1945–51.
N. Graham (1995). Exp Opin Ther Patents. 5: 1269–1285.
J. S. Gutkind (1998). J Biol Chem. 273: 1839–1842.
C. H. Heldin, (1995). Celt. 80: 213–23.
W. C. Hung und L. Y. Chaung, (1998). Int J Oncol. 72: 137–140.
G. L. James et. al. (1994). J Biol Chem. 269: 27705–27714.
N. Kohl et. al. (1995). Nature Medicine. 7: 792.
M. Kovalenko, et. al. (1999). Cancer Res. 54: 6106–6114.
P. F. Lebowitz, et. al. (1997). J Biol Chem. 272.15591–15594.
A. Levitzki und A. Gazit. (1995). Science. 267: 1782–1788.
M. Liu et. al. (1998). Cancer Res. 58: 4947–4956.
D. R. Lowy und B. Willumsen, (1993) Annu Rev Biochem. 62: 851–8091.
J. Mendelsohn, (1992). J Nat'l Cancer Inst Monogr 73: 125–131.
M. M. Moasser et. al. (1998). Proc Natl Acad Sci. 95: 1369–1374.
B. P. Monia et. al. (1996). Nucleosides and Nucleotides Their Biological Applications-1. Supp 34.
D. K. Morrison und R. E. Cutler, (1997). Curr Opin Cell Biol. 9: 174–179.
J. D. Moyer et. al. (1997). Cancer Res. 57: 4838–4848.
P. Norgaard et. al. (1999). Clin Cancer Res. 5: 35–42.
M. D. Pegram et. al. (1998). J Clin Oncol. 76: 2659–2671.
M. Raff, (1998). Nature. 396: 119–122.
M. Resnicoff, (1998). Int J Mol Med. 7: 883–888.
N. Suzuki et. al. (1998). Proc Natl Acad Sci USA. 95: 15356–15361.
N. A. Thornberry und Y. Lazebnik, (1998). Science. 287: 1312–1316.
M. Trahey und F. McCormick, (1987). Science. 238: 542–5.
H. M. Wang et. al. (1998). Anticancer Res. 78: 2297–2300.
D. B. Whyte et. al. (1997). J Biol Chem. 272: 14459–14464.
F. L. Zhang, (1997). J Biol Chem. 272: 10232–10239.

Claims

Verwendung eines FPT-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten durch Verabreichung (1) eines FPT-Inhibitors mit der folgenden Formel:
(+)-Enantiomer und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors in Mengen, die wirksam sind, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren.
Verwendung eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten durch Verabreichung: (1) eines FPT-Inhibitors mit der folgenden Formel:
(+)-Enantiomer und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors in Mengen, die wirksam sind, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren.
Verwendung eines FPT-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Herbeiführen einer Regression des Tumorvolumens bei einem Krebspatienten durch Verabreichung: (1) eines FPT-Inhibitors mit der folgenden Formel:
(+)-Enantiomer und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors in Mengen, die wirksam sind, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren.
Verwendung eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Herbeiführen einer Regression des Tumorvolumens bei einem Krebspatienten durch Verabreichung: (1) eines FPT-Inhibitors mit der folgenden Formel:
(+)-Enantiomer und (2) eines zusätzlichen Ras-Signalweg-Inhibitors in Mengen, die wirksam sind, um einen synergistischen Grad an Krebszelltod zu induzieren.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der zusätzliche Ras-Signalweg-Inhibitor ein Kinase-Inhibitor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der der zusätzliche Ras-Signalweg-Inhibitor ein Ras-nachgeordnetes Element in dem Ras-Signalweg inhibiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der der zusätzliche Ras-Signalweg-Inhibitor ein MEK-Inhibitor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der der zusätzliche Ras-Signalweg-Inhibitor ein Wachstumsfaktorrezeptor-Inhibitor ist.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der der Wachstumsfaktorrezeptor-Inhibitor ein Tyrosinkinase-Inhibitor ist.
Verwendung nach Anspruch 9, bei der der Tyrosinkinase-Inhibitor ein kleines Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1) einem erbB2-Rezeptor-Inhibitor, (2) einem PDGF-Rezeptor-Inhibitor, (3) einem IGF-Rezeptor-Inhibitor und (4) einem EGF-Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor ist.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der der Wachstumsfaktorrezeptor-Inhibitor ein Antikörper ist, der gegen die extrazelluläre Domäne eines Wachstumsfaktor-Rezeptors gerichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 11, bei der der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der auf den erbB2-Rezeptor zielt, oder ein monoklonaler Antikörper ist, der auf den EGF-Rezeptor zielt.
Verwendung nach Anspruch 11, bei der der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der auf den erbB2-Rezeptor zielt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der FPT-Inhibitor in einer Menge von 1,4 bis 400 mg/Tag verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 14, bei der der FPT-Inhibitor in einer Menge von 3,5 bis 70 mg/Tag verabreicht wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor in einer Menge von 1 bis 350 mg/Tag verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 16, bei der der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor in einer Menge von 3,5 bis 70 mg/Tag verabreicht wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der FPT-Inhibitor und der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor gleichzeitig verabreicht werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei der der FPT-Inhibitor und der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor sequentiell verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 19, bei der der zusätzliche Ras-Weg-Inhibitor zuerst verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 19, bei der der FPT-Inhibitor zuerst verabreicht wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der Krebs Lungenkrebs, Pankreaskrebs, Kolonkrebs, Eierstockkrebs, Krebserkrankungen der Leber, myeloide Leukämie, Melanom, Schilddrüsenfollikelkrebs, Blasenkrebs, Gliom, myelodysplastisches Syndrom, Brustkrebs oder Prostatakrebs ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Behandlung ferner die Verabreichung eines Chemotherapeutikums beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 23, bei der das Chemotherapeutikum ausgewählt ist aus Uracil-Senfgas, Chlormethin, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylenmelamin, Triethylenthiophosphoramin, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Streptozocin, Dacarbazin, Temozolomid, Methotrexat, 5-Fluoruracil, Floxuridin, Cytarabin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Fludarabinphosphat, Pentostatin, Gemcitabin, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Paclitaxel, Mithramycin, Desoxycoformycin, Mitomycin-C, L-Asparaginase, Interferonen, Etoposid, Teniposid, 17-alpha-Ethinylestradiol, Diethylstilbestrol, Testosteron, Prednison, Fluoxymesteron, Dromostanolonpropionat, Testolacton, Megestrolacetat, Tamoxifen, Methylprednisolon, Methyltestosteron, Prednisolon, Triamcinolon, Chlortrianisen, Hydroxyprogesteron, Aminoglutethimid, Estramustin, Medroxyprogesteronacetat, Leuprolid, Flutamid, Toremifen, Goserelin, Cisplatin, Carboplatin, Hydroxyharnstoff, Amsacrin, Procarbazin, Mitotan, Mitoxantron, Levamisol, Navelben, CPT-11, Anastrazol, Letrazol, Capecitabin, Reloxafin, Droloxafin, Gemcitabin, Paclitaxel oder Hexamethylmelamin.
Verwendung nach Anspruch 23, bei der das antineoplastische Mittel Temozolomid ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Behandlung ferner die Verabreichung von Strahlung beinhaltet.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der Krebszelltod durch Apoptose erfolgt.