DE60020347T2

DE60020347T2 - Verfahren zur herstellung einer matrize von chemischen oder biologischen molekülsequenzen für eine chemische oder biologische analysevorrichtung

Info

Publication number: DE60020347T2
Application number: DE60020347T
Authority: DE
Inventors: Charles Rosilio; Françoise Vinet; Claude Vauchier; Jean-Frederic Clerc
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1999-03-08
Filing date: 2000-03-06
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-03-07
Also published as: FR2790766A1; EP1163049A1; JP2002537869A; DE60020347D1; WO2000053310A1; EP1163049B1; FR2790766B1; JP3808313B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung hat ein Parallelherstellungsverfahren einer Matrix aus chemischen oder biologischen Molekülsequenzen für eine chemische oder biologische Analysevorrichtung zum Gegenstand.
Die chemischen oder biologischen Moleküle können insbesondere Aminosäuren oder Nukloetide sein, wobei die Sequenzen dann Peptide oder Oligonukloetide sind.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Realisierung einer Matrix von Oligonukloetiden unterschiedlicher Sequenzen für die Analyse oder die Diagnostik oder die genetische Forschung (Mutationen, Polymorphismen, Transkriptome).
Stand der Technik
Zur Sequenzierung und Untersuchung der Gen-Expression werden neue chemische oder biologische Analysesysteme oder -vorrichtungen verwendet. Sie werden gebildet durch ein System von Molekularsonden (Oligonukloetiden), fixiert auf der minaturisierten Oberfläche eines Substrats, um einen Biochip oder DNA-Chip zu realisieren.
Im Laufe der Analyse einer Probe werden die extrahierten Zielnukleinsäuren markiert und auf der Sondenmatrix abgeschieden. Die Hybridisierung (Paarung zwischen den komplementären Strängen der DNA-Doppelhelix) zwischen den Sonden und den markierten Zielen ermöglicht, die Sequenzen der DNA-Probe zu orten und zu identifizieren.
Zahlreiche Realisierungsverfahren wurden beschrieben und entwickelt, um die Miniaturisierung und die Dichtekapazität der Analyseplätze auf dem Chip zu verbessern.
Diverse Techniken zur Pfropfung und Immobilisierung der Sonden (durch kovalente oder elektrostatische Bindung) auf verschiedenen Substraten (Silicium, Glas, Polymer, Goldelektroden ...) waren Gegenstand industrieller Forschungen und Entwicklungen.
Die Sondenmatrizen werden demnach realisiert:

– entweder durch Immobilisierung von vorsynthetisierten Oligonukloetiden durch Pfropfung von diesen auf einem funktionalisierten Substrat oder auf einem leitfähigen Polymer,
– oder durch In-situ-Synthese der Sonden-Oligonukloetide auf einem Substrat.

Die bis heute angewendeten In-situ-Syntheseverfahren greifen auf zwei unterschiedliche Adressierungsarten der Analyseplätze zurück, nämlich die manuelle Adressierung durch Mikroroboter, wie beschrieben in US-A-5 474 796 [1], und die photochemische Adressierung, wie beschrieben in WO-A-97/39 151 [2].
In dem Dokument US-A-5 474 796 [1] bildet man zunächst auf dem Substrat funktionalisierte Plätze aus, indem man Photoresists oder Masken verwendet, um die verschiedenen Analyseplätze des Substrats zu definieren. Dann bildet man die Oligonukloetidsequenzen auf den funktionalisierten Plätzen durch Injektion der Reagenzien in die gewünschten Plätze mittels einer piezoelektrischen Pumpe.
In dem Dokument WO-A-97/39151 [2] unterzieht man das Substrat zunächst einer Behandlung, um es mit Funktionsgruppen, geschützt durch eine photolabile Schutzgruppe, auszustatten, und befreit dann durch selektive Bestrahlung durch eine Maske hindurch bestimmte Gruppen des Substrats, um die Plätze zu definieren, und lässt anschließend in diesen Plätzen ein Nukloetid reagieren, um die erwünschte Sequenz zu konstruieren.
In beiden Fällen greift die In-situ-Synthese auf die klassischen Kupplungsreaktionen mittels der Phosphoramidite, der Phosphite oder der Phosphonate zurück, zur sukzessiven Kondensation der vernünftig bzw. gut geschützten Nukloetide. Der Synthesezyklus umfasst die Befreiungs-, Kupplungs-, Blockierungs- und Oxidierungsschritte und ermöglicht das Wachstum der Oligonukloetide auf der Oberfläche jedes Analyseplatzes.
Bei der photochemischen Adressierung realisiert man die Befreiungsschritte der Nukloetide durch das Licht. Die Adressierung der Plätze erfolgt durch einen Lithographieschritt (Bestrahlung durch eine Maske hindurch). Die photolabile Schutzgruppe wird durch das Licht eliminiert, was dann durch das Eintauchen des Substrats in eine Lösung eines aktivierten Nukloetids das spätere Koppeln (zum Beispiel eines Phosphoramidits) unter Präsenz eines Katalysators, zum Beispiel Tetrazol, ermöglicht.
Dieses kombinatorische Analyseverfahren, gesteuert durch Licht, erfordert die Realisierung einer Anzahl von Masken gleich der Anzahl der das Oligonukloetid bildenden Nukloetide und ist eine teure und langwierige Operation. Zwar hat dieses Verfahren den Vorteil, Chips mit sehr hoher Dichte zu ermöglichen (Auflösung des Photolithographieverfahrens), jedoch erreicht der Wirkungsgrad der photochemischen Reaktionen (Eliminierung der photolabilen Gruppen) niemals 100%, und die Reinheit der auf dem Chip realisierten Oligonukloetidsequenz ist nicht gewährleistet.
Im Falle des Dokuments US-A-5 474 796 [1], wo die Strahldrucktechnik angewendet wird (piezoelektrische Köpfe), um die 4 aktivierten DNA-Basisnukloetide sowie die Kupplungsreagenzien auf den verschiedenen Plätzen des Chips anzubringen, erfordert die Festphasensynthese auf Plätzen von ungefähr 100 μm2 mit Reagenzienmengen von ungefähr einem Nanoliter kontrollierte atmosphärische Bedingungen (Empfindlichkeit gegenüber Feuchtigkeit und Sauerstoff), die in der Umgebung einer Mikrospendevorrichtung und der dazugehörenden Geräte nur schwer zu verwirklichen sind. Sie erfordert außerdem Lösungsmittel mit hohem Siedepunkt und nur wenig flüchtige Reagenzien.
Bekannt sind noch Verfahren zur In-situ-Oligonukleotidsynthese, in denen Masken benutzt werden, um die Zonen des Substrats zu definieren, die den sukzessiven Synthesezyklen ausgesetzt werden müssen.
So beschreibt das Dokument EP-A-0 728 520 [3] ein Verfahren zur Herstellung von Matrizen aus Oligonukleotid-Sonden, bei dem ein Substrat verwendet wird, das auf seiner gesamten Oberfläche geschützte Funktionsgruppen, die zur Befestigung der Nukloetide bestimmt sind, und ein Barrierematerial zur Definition der Zonen des Substrats umfasst, die zu modifizieren sind. Dieses Material kann ausgewählt werden unter den Lacken, den flüssigen Ölen, den Polyestern, den Polyurethanen und den Expoxydharzen, die generell flüssige Prepolymere sind. Sie werden mittels diverser Drucktechniken abgeschieden. Nach der Abscheidung der Barriere schreitet man zur Dampfphasenbefreiung der nicht mit Barrierematerial überzogenen Funktionsgruppen. Die Benutzung einer Dampfphase ist notwendig, denn das verwendete Barrierematerial ist löslich oder fortschwemmbar in den Befreiungslösungsmitteln. Aber der Dampfphasenschutz verursacht Umgebungstoxizitäts- und -angriffsprobleme durch Materialdiffusion.
Das Dokument US-A-5 658 734 [4] beschreibt ein vollständig funktionalisiertes Substrat und die Lithographietechniken mit Anwendung eines Photoresists zur Definition der zu modifizierenden Zonen des Substrats, wobei zwischen dem Substrat und dem Photoresist ein Polymer eingefügt wird, das die Rolle des Puffers spielt. Dieses Verfahren benutzt also ein Photoresist, das bei jedem zusätzlichen Zyklus eines Nukloetids mit der Schleuder auf die auf dem Substrat abgeschiedene Polymerschicht aufgebracht wird, was bei jedem Zyklus einen Lithographieschritt erforderlich macht (zwei Abscheidungen mit der Schleuder, Tempern, Bestrahlung durch eine Maske, Entwicklung des Resists, sodann Entwicklung des Pufferpolymers). Nach den Schritten zur Befreiung der Funktionsgruppen des Substrats und Hinzufügung eines Nukloetids durch die in dem Polymer angebrachten Öffnungen hindurch, werden die beiden Schichten in einem Lösungsmittel eliminiert. Bei diesem Verfahren ermöglicht das Polymer, den Photoresist von der biologischen Nukloetidschicht zu isolieren. Dieses System erfordert also zusätzlich zu den Abscheidungsschritten mittels Schleuder und Lithographie die Realisierung einer großen Anzahl von Masken.
Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens beruht auf der Gefahr des "lift off" der Schutzschicht im Laufe der Entwicklung des Schutzpolymers. Durch Diffusion des Lösungsmittels unter die Photoresistschicht kann es nämlich zu einer Ablösung des Polymers auf den geschützten Plätzen kommen.
Die vorliegende Erfindung hat genau ein Verfahren zur Herstellung einer Matrix aus chemischen oder biologischen Molekülsequenzen wie zum Beispiel Oligonukloetiden zum Gegenstand, das ermöglicht, die Nachteile der oben beschriebenen Verfahren zu beseitigen.
Darstellung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt eine selektive lokalisierte Abscheidung eines Schutzpolymers auf einem mit funktionalisierten Mikroküvetten strukturierten Substrat. Das Schutzpolymer kann die ausgewählten Mikroküvetten momentan schützen während einer chemischen Reaktion, die zur Kupplung mit dem nächsten Verkettungsmolekühl führt. Eine mechanische Adressierung durch Mikroabscheidung auf den ausgewählten Mikroküvetten ersetzt die photochemische oder elektrische Adressierung und die Lithographie- oder Drucktechniken, die in den anderen kombinatorischen Syntheseverfahren benutzt werden, zum Beispiel zur Herstellung von Oligonukleotid-Sonden.
Nach der Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Matrix aus chemischen oder biologischen Molekülsequenzen, gebildet durch verschiedene Verkettungen von chemischen Molekülen – oder M1, M2, ... Mn – durch In-situ-Synthese auf einem mit Mikroküvetten strukturierten Substrat, die folgenden Schritte:

1) Funktionalisierung der Mikroküvetten des Substrats durch Funktionsgruppen, die mit den Molekülen M1, M2, ... Mn eine kovalente Bindung bilden können;
2) Abscheidung eines Schutzpolymers auf mindestens einer der Mikroküvetten durch Mikroabscheidung von Tropfen des Polymers zur Bildung von Abdeckungen (Überzügen) aus dem festen Polymer in der (den) ausgewählten Mikroküvette(n);
3) Durchführung einer oder mehrerer chemischer Reaktionen in flüssiger Phase, um die Kupplung eines ersten Moleküls M1 an die Funktionsgruppen der Mikroküvetten, die nicht von dem Schutzpolymer bedeckt sind, zu gewährleisten;
4) Eliminierung des Schutzpolymers auf den Mikroküvetten, die von diesem Polymer bedeckt sind, nach der ersten Reaktion oder einer der nachfolgenden Reaktionen, die in dem Schritt 3) durchgeführt werden; und
5) Wiederholung der Schritte 2), 3) und 4) zur Erzielung der gewünschten Verkettungssequenzen in jeder der funktionalisierten Mikroküvetten,

a) die gesamte Oberfläche des Substrats und der Mikroküvetten mit Funktionsgruppen funktionalisiert, dann diese Funktionsgruppen durch eine labile Schutzgruppe schützt;
b) ein Schutzpolymer auf allen Mikroküvetten durch Mikroabscheidung von Tropfen des Polymers abscheidet zur Bildung von Überzügen aus dem festen Polymer auf allen Mikroküvetten;
c) die auf dem Substrat um die Mikroküvetten herum vorhandenen Funktionsgruppen von der Schutzgruppe befreit, dann mit einer nicht-labilen blockierenden Gruppe reagieren lässt unter den Bedingungen, wie sie für die chemischen Reaktionen zur Kupplung und zur Eliminierung des Schutzpolymers angewendet worden sind; und
d) das Schutz-Polymer aus allen Mikroküvetten eliminiert;

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also, durch eine gute Wahl des Schutzpolymers und eines Lösungsmittels zur Auflösung des Polymers, das kompatibel ist mit den Protokollen eines Syntheseautomaten, die Synthese von Oligonukleotid-Matrizen in den in ein Substrat geätzten Mikroküvetten oder Mikroreaktoren durchzuführen. Zu diesem Zweck ordnet man einer mechanischen Adressierungsvorrichtung (Mikroabscheidungsroboter oder Tintenstrahldruck) eines Schutzpolymers einen automatischen Oligonukleotid-Synthetisator zu.
Die mechanische Adressierung besteht dann, selektiv eine Polymerabscheidung auf den ausgewählten Mikroküvetten durchzuführen, die auf den Mikroküvetten eine angepasst feste und dichte Abdeckung bilden, um Zonen abzugrenzen und zu selektieren, die aktiv sind gegenüber Reagenzien, die benutzt werden für die Addition der monomeren Einheiten der nächsten Verkettung.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die Möglichkeit einer Auswahl von Schutzpolymeren, deren Schutz-, Unlöslichkeits-, Dichtheits- und Abscheidungseigenschaften (kontrollierte Form und Dicke) kompatibel und angepasst sind bezüglich eines oder mehrerer Schritte des Synthesezyklus.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, das Schutzpolymer zu eliminieren, entweder nach der ersten Reaktion des Kupplungszyklus oder nach einem vollständigen Kupplungszyklus.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, die Eliminierung dieser Polymerabdeckung einzuschließen in den klassischen automatischen Oligonukleotid-Synthesezyklus, entweder in einem zusätzlichen Spülschritt in einem Lösungsmittel, das kompatibel ist mit den üblicherweise in dem automatischen Oligonukleotid-Synthetisator verwendeten (Acetonnitril, Dichlormethan, Tetrahydrofuran).
Vorzugsweise realisiert man während der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens einen Schutz der Funktionsgruppen der Mikroküvetten. In diesem Fall schützt man die Funktionsgruppen der Mikroküvetten durch eine labile Schutzgruppe, und der Schritt 3) umfasst eine erste Befreiungsreaktion der Funktionsgruppen.
Nach der Erfindung können die Moleküle M1, M2, ..., Mn von verschiedener Art sein. Es kann sich zum Beispiel um natürliche oder synthetische Aminosäuren handeln, L- oder D-, um Nukleotide (RNA oder DNA), um Pentose oder Hexose. Im Falle der Aminosäuren kann die Anzahl der Moleküle M1, M2, ..., Mn groß sein. Im Falle der Nukleotide ist die Anzahl der Moleküle beschränkter, da sie A, T (oder U), G und C einschließt.
In diesem Fall können die Nukleotide die Form von Phosphoramiditen, von Phosphotriestern oder von H-Phosphonaten haben, je nach Art der angewendeten Nukleotid-Synthese. Diese Moleküle umfassen zwei reaktive Funktionen (mit Hydroxyl und mit Phosphor), von denen eine, nämlich die Hydroxylfunktion durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die vorzugsweise identisch ist mit der Schutzgruppe der funktionalisierten Analyseplätze.
Eine entsprechende Schutzgruppe kann insbesondere eine Trytil- oder Tritylderivatgruppe sein, zum Beispiel eine Dimethoxytritylgruppe.
Wenn man das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotidsequenzen durch Phosphoramiditsynthese anwendet, entspricht der Schritt 3) einem Synthesezyklus und umfasst die Eliminierung der Trityl-Schutzgruppen, die Kupplung mit einem Nukleotid, die Reaktion der Funktionsgruppen, die nicht mit dem Nukleotid gekuppelt worden sind, mit einer blockierenden Gruppe, und die Oxidation der Phosphoramidit-Gruppe des Nukleotids zu einem Phosphat.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgen die Schritte zur Befreiung (Detritylierung), Kupplung, Blockierung, Oxidierung und Eliminierung des Schutzpolymers in einem automatischen Oligonukleotid-Synthetisator, wobei die Reaktionskammer so modifiziert wurde, dass Substrate unterschiedlicher Größe behandelt werden können.
Die in dem Blockierungsschritt verwendete blockierende Gruppe ist nicht-labile Gruppe unter den Eliminierungsbedingungen der Schutzgruppen der Funktionsgruppen der Mikroküvetten.
Zum Beispiel kann man für diese Blockierungsreaktion eine Lösung aus Dimethylaminopyridin (DMPA) in Tetrahydrofuran und Lutidin benutzen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Befreiungs-, Kupplungs-, Schutzmaterialeliminierungs- und eventuell Oxidationsschritte durch Eintauchen des Substrats in entweder der Reaktionskammer des Synthetisators oder in die entsprechenden Reagenzienbäder durchgeführt. Nur der Adressierungsschritt der Mikroküvetten, der einem selektiven Schutz der ausgewählten Mikroküvetten durch das Schutzpolymer entspricht, wird mit Hilfe der Mikroabscheidungstechnik durchgeführt.
Vorteilhafterweise wird das Schutzpolymer in den ausgewählten Mikroküvetten durch mechanische Adressierung im flüssigen Zustand abgeschieden, indem man selektive Mikroabscheidungstechniken des Typs piezoelektrischer Aktor, "pin and ring", Tintenstrahldruck, Archimedesschnecke und Mikropipettierung benutzt.
Die Adressierung des Polymers durch Mikroabscheidung ermöglicht, Mikroküvetten während einer oder mehrerer der vier Synthesereaktionen selektiv zu schützen, die der Kupplung einer Nukleotid-Einheit entsprechen. Sie ermöglicht, lokal auf die ausgewählten Mikroküvetten kalibrierte Tröpfchen eines Polymers im gelösten Zustand zu verteilen. Nach Verdampfung des Lösungsmittels bildet es auf den Mikroküvetten angepasste dichte Abdeckungen. Diese Adressierung erfolgt vorzugsweise vor dem Detritylierungsschritt oder vor dem Kupplungsschritt, in dem Oligonukleotid-Syntheseschritt.
Die Neuartigkeit des Verfahrens beruht auf den großen Möglichkeiten, die Wahl des Polymers und seiner Schutzrolle an die verschiedenen Schritte der Oligonukleotidsynthese anzupassen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Wahl des Schutzpolymers sehr wichtig und muss einer bestimmten Anzahl von Kriterien entsprechen.
Zunächst muss es möglich sein, dieses Polymer, aufgelöst in einem Lösungsmittel, mit den weiter oben erwähnten Mikroabscheidungstechniken abzuscheiden, um in den Mikroküvetten kalibrierte und justierte Tröpfchen zu bilden. Generell ist ein Tempern bei einer Temperatur von 50 bis 80°C notwendig, um das Lösungsmittel zu eliminieren und die Haftung auf dem Substrat zu verbessern.
Im Idealfall, wo das Polymer während der vier Synthesezyklen schützt, muss es inert sein und vorzugsweise ohne reaktive Funktionen, fähig zur Kupplung mit den Synthesemolekülen und -reagenzien. Es darf nicht löslich sein in den in den Zyklusschritten verwendeten Lösungsmitteln und muss gegenüber diesen Lösungsmitteln eine Impermeabilität aufweisen.
In Wirklichkeit genügt es, wenn das Polymer seine Rolle als Schutzabdeckung im Wesentlichen in dem Detritylierungsschritt oder in dem Kupplungsschritt spielt. Es ist dann möglich, das Polymer-Lösungsmittel-Paar für den gewählten Schritt anzupassen und zu optimieren.
Es ist vorzuziehen, wenn das Schutzpolymer keine Funktionen mit freien Wasserstoffen des Typs OH, NH2 oder COOH umfasst, die fähig wären, sich mit den Molekülen M1, M2, ..., Mn – zum Beispiel Nukleotiden – zu koppeln, um zu vermeiden, nutzlos Reagenzien zu verbrauchen, die anschließend mit dem Schutzpolymer eliminiert werden.
Das Polymer muss eliminiert werden mit einem gegenüber den Nukleotiden inerten Lösungsmittel und es muss in Lösung zudem physikalisch-chemische Eigenschaften wie etwa eine Viskosität und eine Oberflächenspannung aufweisen, die seine Abscheidung in den Mikroküvetten durch die gewählte Mikroabscheidungstechnik ermöglicht.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Wahl des Schutzpolymers in Abhängigkeit von dem (den) Schritt(en), in denen es die Mikroküvetten schützen muss, wobei seine Löslichkeit in den Lösungsmitteln berücksichtigt werden muss, die für die Oligonukleotidsynthese benutzt werden können.
Wenn man den Schutz durch das Polymer nur während des Eliminierungsschritts der Schutzgruppen der Funktionsgruppen sicherstellen will, etwa während des Detritylierungsschritts, genügt es, ein Polymer zu wählen, das unlöslich ist in den Detritylierungsreagenzien, die im Allgemeinen gebildet werden durch Dichloressigsäure oder Trichloressigsäure oder Lewis-Säure des Typs ZnBr2 mit ungefähr 2–5% in einem Lösungsmittel wie Dichlormethan, Acetonitril oder Toluol.
Als Beispiele solcher Polymere kann nennen: die in Dichlormethan unlöslichen Polyvinylalkohole, das Acetonnitril und das Toluol; die in Dichlormethan unlöslichen Polyhydroxystyrole; die Polystyrole, die in Acetonitrile unlösbaren Polyvinylcarbazole und Polyimide; und die in Toluol unlöslichen Polyethylenoxide.
Wenn man einen Schutz der Mikroküvetten durch das Polymer nur während des Kupplungsschritts sicherstellen will, eignet sich ein Polymer, das unlöslich ist in dem zur Kupplung gewählten Lösungsmittel, im Allgemeinen Acetonitril.
Zu diesem Zweck kann man ein Polymer verwenden, das ausgewählt wird aus der Gruppe, die gebildet durch Polymere und ihre Derivate vom Typ der Polyvinylalkohole, der Polystryrole, der Polyvinylcarbazole und der Polyimide, die in diesem Lösungsmittel löslich sind.
Das Schutzpolymer wird ebenfalls in Abhängigkeit von Lösungsmitteln ausgewählt, die seine Eliminierung durch Auflösung gewährleisten können. Vorzugsweise wählt man Polymere, die löslich sind in Lösungsmitteln, die kompatibel sind mit denen, die üblicherweise in den automatischen Oligonukleotid-Synthetisatoren verwendet werden, etwa Dichlormethan (für die Detritylisierung), Acetonitril (für die eigentliche Kupplung) und Tetrahydrofuran (für die Blockierung und die Oxidation). Jedoch können für die Detritylierung anstelle des Dichlormethan andere Lösungsmittel verwendet werden, zum Beispiel Acetonitril oder Toluol, ohne Leistungsverlust.
In der nachfolgenden Tabelle 1 werden verwendbare Polymere angegeben, die geeignet sind aufgrund ihrer Eigenschaften der Löslichkeit in diversen Lösungsmitteln, ihrer Verwendbarkeit in einem oder mehreren Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Art ihrer Eliminierung.
Tabelle 1
Unter den Polymeren der Tabelle 1 ist der Polyvinylalkohol interessant bzw. vorteilhaft, denn er kann in allen Schritten der Oligonukleotidsynthese einen Schutz der Mikroküvetten sicherstellen. Zudem ist er leicht verwendbar in den Mikroabscheidungsrobotern. Jedoch ist seine Eliminierung weniger leicht, denn das Wasser und das DMSO sind nicht Teil der Synthese-Lösungsmittel und erfordern daher einen zusätzlichen Schritt sowie eine Trocknung.
Im Falle der Herstellung der Sonden mittels eines Synthetisatorautomaten (angepasster Probenträger), gekoppelt mit einem Mikrospenderoboter (durch Kapillarität, piezo-elektrisch oder vom "pin and ring"-Typ, ist es vorzuziehen, kein in Wasser lösliches Polymer zu verwenden, das zugleich eine Abscheidung und einen Eliminierungsschritt im gasförmigen Milieu erfordern würde; dies kann störend sein für die Fortsetzung der Synthese, die im wasserfreien Milieu durchgeführt wird.
Um jede zusätzliche Trocknungsbehandlung zu vermeiden, ist es vernünftiger, zum selektiven Schutze der Mikroküvetten ein Polymer zu wählen, das in einem wasserfreien Lösungsmittel eliminierbar und mit dem Zyklus der in dem Synthetisatorautomaten verwendeten Lösungsmittel kompatibel ist.
Das Polystyrol kann zum Beispiel als selektives Schutzpolymer dienen in dem in Acetonitrile (TCA 2%) durchgeführten Detritylierungsschritt, in dem es unlöslich ist; der nachfolgende bzw. nächste Kupplungsschritt erfolgt in Acetonitril (Tetrazol); das Polymer kann dann durch einen Spülzyklus in Dichlormethan eliminiert werden, in dem es sehr löslich ist. Zudem ist das Polystyrol inert und hat keine OH-Funktionen, fähig aktive Nukleotide zu fixieren, und es kann auch seine Schutzrolle in dem Kupplungsschritt spielen (in Acetonitil).
Das Polyhydrostyrol ist auch interessant bzw. vorteilhaft, denn es ist leichter abzuscheiden als das Polystyrol und in einem klassischen Lösungsmittel des Synthetisators leicht zu eliminieren. Es kann jedoch nur den Schutz in dem Detritylierungsschritt in Dichlormethan sicherstellen, kann aber durch einen Spülzyklus in Acetonitril vor dem Kupplungsschritt in diesem Lösungsmittel eliminiert werden.
Das Polyethyloxid eignet sich auch nur zur Detritylierung unter der Bedingung, dass diese in Toluol stattfindet, aber ist ist leicht in CH₃CN oder CH₃Cl₂ eliminierbar.
Das Polyvinylcarbazol und das Polyimid können einen Schutz während der Detritylierungs- und Kupplungsschritte in CH₃CN sicherstellen und dann mittels CJ₂Cl₂ eliminiert werden, das eines der in dem Synthetisator verwendeten Lösungsmittel ist. Jedoch ist die Abscheidung dieser Polymere schwieriger.
Die Eliminierung des Schutzpolymers kann direkt in dem Synthetisator erfolgen, in einem in das Protokoll des Zyklus des Synthetisatorautomaten integrierten Spülschritt.
Zum Beispiel kann das in dem Detritylierungsschritt verwendete klassische Lösungsmittel, das Dichlormethan, ersetzt werden durch Lösungsmittel wie Acetonitril, Toluol, Xylen oder auch ein halogeniertes aromatisches Lösungsmittel, ohne Wirksamkeitsverlust bei der Detritylierungsreaktion durch das üblicherweise benutzte saure Reagenz (TCA oder DCA).
Das erfindungsgemäße Verfahren hat zahlreiche Vorteile im Verhältnis zu den Verfahren aus dem Stand der Technik.
In Bezug auf das Verfahren der Referenz [2], in dem für die In-situ-Synthese eine photochemische Adressierung benutzt wird, oder der Referenz [4], in dem ein Lithographieverfahren benutzt wird, vermeidet das erfindungsgemäße Verfahren die Notwendigkeit, Masken herzustellen, das heißt viele teure und langwierige Operationen, denn die Anzahl der Masken ist gleich der Anzahl der Moleküle M1, M2, ..., Mn, welche die Sequenzen bilden. Zudem – im Falle der photochemischen Adressierung – ist die Befreiung nicht total, und je länger die Sequenz ist, umso kleiner ist die Wahrscheinlichkeit, die gewünschte Sequenz zu erhalten. Daher bildet man auf dem Substrat redundante Sequenzen, was bei der Erfindung, in der die Befreiung total ist, nicht notwendig ist.
Im Verhältnis zu dem Verfahren der Referenz [1] ist das erfindungsgemäße Verfahren leichter anwendbar, denn die Kupplungsreaktionen können mit einem Überschuss an Reagenzien durchgeführt werden, während gemäß Referenz [1] die Kupplungsreaktionen mit einigen nl Reagenzien direkt auf dem zu modifizierenden Analyseplatz unter speziellen Bedingungen durchgeführt werden, nämlich in einer Stickstoff- oder Argonatmosphäre.
Im Verhältnis zu der Referenz [3] ist das erfindungsgemäße Verfahren leichter anwendbar, da die Mikroküvetten oder Syntheseplätze vorher definiert werden, der Schutz dichter ist durch das Anbringen von festen Polymerabdeckungen, und die Befreiungsreaktionen nicht in einer Dampfphase sondern einer flüssigen Phase direkt in einem automatischen Synthetisator durchgeführt werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfordert die Polymer-Schutzabscheidung in Form einer Mikroabscheidung auf den ausgewählten Mikroküvetten keine speziellen Vorkehrungen. Die einzige Bedingung besteht darin, dass das Polymertröpfchen die zu schützende Mikroküvette überdeckt.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen besser aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, die selbstverständlich rein erläuternd und keinesfalls einschränkend ist und sich auf die beigefügten Zeichnungen bezieht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die 1A bis 1G zeigen die verschiedenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer Matrix aus Oligonukleotid-Sonden.
Die 2 zeigt das Profil einer mit Polymer gefüllten Mikroküvette (650 × 650 × 24 μm³).
Die 3 und 4 sind Draufsichten von Mikroküvetten, mit Polymer gefüllt oder nicht.
Detaillierte Darstellung der Realisierungsarten
Um das erfindungsgemäße Verfahren anzuwenden, geht man von einem Substrat aus Glas oder vorzugsweise Silicium aus, strukturiert durch Mikroküvetten mit einer Teilung von 150 μm bis mehrere mm aber vorzugsweise einigen hundert μm, und einer Tiefe von ungefähr 10 μm. Diese kalibrierten Mikroküvetten werden durch klassische Methoden der Photolithographie und Ätzung hergestellt.
In der 1A sieht man das Substrat 1 mit den Mikroküvetten 3. Die Mikroküvetten 3 werden funktionalisiert durch hydrophile Funktionsgruppen 5 wie etwa Hydroxylgruppen, die durch Schutzgruppen 7 geschützt werden. Diese Schutzgruppen können Dimethoxytritylgruppen sein, wie sie üblicherweise bei der Oligonukleotidsynthese benutzt werden.
Wenn das Substrat eine Siliciumscheibe ist, kann die Funktionalisierung der Analyseplätze wie folgt realisiert werden.
Die Oberfläche der Siliciumscheibe wird zunächst auf thermischem Wege – zum Beispiel über eine Dicke von 5000 Å – zu SiO₂ oxidiert, dann durch oxidierende Reinigung im alkalischen oder sauren Milieu zu Si-OH aktiviert. Anschließend bewirkt man eine Funktionalisierung der Gesamtoberfläche des Substrats durch Behandlung mit einem funktionalisierten Silanisierungsmittel des Typs Aminosilan oder Epoxysilan mit einem Bindungsmolekül oder Abstandhalter des Typs Glykol, zum Beispiel ein Silan mit einer N(Bishydroxylmethyl)-Gruppe und einen Abstandshalter zum Beispiel des Typs Polyethylengglycol. Die Einführung eines solchen Abstandhalters zwischen dem Silan des Substrats und dem Oligonukleotid, das in der Folge synthetisiert wird, ist vorteilhaft, denn es ermöglicht, während der Verwendung die Hybridisierungsleistung zu erhöhen. Man schützt die reaktiven Funktionen durch eine Gruppe wie die Dimethoxytrityl-Gruppe (DMT).
Man realisiert dann einen Schutz der gesamten Mikroküvetten durch Polymer- Abdeckungen, die man durch einen Mikroabscheidungsroboter in Form eines Strahls kalibrierter Tröpfchen abscheidet.
Nach dem Trocknen der Tröpfen befreit man die ODMT-Funktionen der nicht durch das Polymer geschützten Oberfläche des Substrats durch Detritylierung im sauren Milieu. Man blockiert (capping) diese reaktiven Funktionen der Oberfläche außerhalb der Mikroküvetten, um die In-situ-Synthese der Oligonukleotide nur auf die Mikroküvetten zu beschränken und eliminiert dann das Polymer auf dem gesamten Substrat durch Spülung in einem Lösungsmittel.
Anschließend führt man Schritt 2) durch, bestehend aus dem Abscheiden eines Schutzpolymers 9 auf wenigstens einer der funktionalisierten Mikroküvetten der Scheibe mit Hilfe einer Mikropipette 11, etwa eines Spenderoboters oder durch Druck mittels Strahl, wie dargestellt in der 1A.
In der 1B ist der nächste Schritt dargestellt, darin bestehend, die Schutzgruppen 7 der Funktionsgruppen 5 in den Mikroküvetten 3 der nicht durch Schutzpolymer 9 geschützten Mikroküvetten zu eliminieren. Man erhält dann eine Scheibe, deren nicht durch das Schutzpolymer 9 geschützten Mikroküvetten 3 befreite funktionelle Hydroxylgruppen 5 enthalten. Dieser Schritt kann durchgeführt werden, indem man die Scheibe in eine saure Lösung taucht, zum Beispiel eine Lösung aus Trichloracetonsäure (acide trichloroacétique) in Dichlormethan CH₂Cl₂, um die Tritylgruppen zu eliminieren.
In der 1C ist der nächste Schritt 3) dargestellt, nämlich die Kupplung eines Moleküls M1 mit den funktionellen Hydroxylgruppen 5 in den nicht durch das Schutzpolymer 9 geschützten Mikroküvetten 3 durch Reaktion. Falls man eine Matrix aus Oligonukleotidsonden realisieren will, werden die Moleküle M1 durch Nukleotide wie Phosphoramidite, Phosphonate oder Phosphite gebildet, je nach Art der zur Herstellung der Sonde benutzten Synthese. In diesem Schritt realisiert man die Kupplung des ersten Nukleotids M1-(Phosphoramidit) mit den Hydroxylgruppen 5, indem man die Scheibe eintaucht in eine Lösung des aktivierten Nukleotids M1 in Acetonitril unter Präsenz von Tetrazol. Auf diese Weise erhält man die in der 1C dargestellte Struktur.
In der 1D ist der nächste Schritt dargestellt, in dem man die restlichen freien Hydroxylgruppen blockiert, die nicht mit dem Molekül M1 reagiert haben, damit sie nicht anschließend mit den anderen Nukleotiden reagieren können, die für die verschiedenen sukzessiven Kupplungen verwendet werden. Diese Reaktion kann bewirkt werden durch das Anbringen einer blockierenden Gruppe 11, zum Beispiel durch das Eintauchen der Scheibe in eine Lösung aus Demethylaminopyridin (DMPA) in Tetrahydrofuran THF.
Im Falle der Herstellung einer Oligonukleotidsequenz durch die Phosphoramidite benutzende Methode, schreitet man anschließend zu einer Oxidierung des während der Kupplung des vorhergehenden Schritts (1C) eingeführten dreiwertigen Phosphors in stabileren fünfwertigen Phosphor. Dies kann realisiert werden durch das Eintauchen der Scheibe in eine oxidierende Lösung aus Jod in einer Mischung aus Wasser, Pyridin und Tetrahydrofuran (THF).
Nach diesem Oxidierschritt führt man den Schritt 4) durch, in dem das Schutzpolymer 9 auf den nicht-modifizierten Mikroküvetten eliminiert wird. So erhält man die in der 1E dargestellte Struktur. Diese Eliminierung des Schutzpolymers 9 kann durch Auflösung in einem entsprechenden Lösungsmittel realisiert werden, indem man die Scheibe in dieses Lösungsmittel eintaucht.
Die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens werden also mit Ausnahme des Schritts zum Aufbringen des Schutzpolymers durch das Eintauchen der Scheibe in die entsprechenden Reagenzien und Lösungsmittel gebildet, wenn notwendig gefolgt von Spülungen in verschiedenen Lösungsmitteln. Diese Operationen können in Rezipienten mit kontrollierter Atmosphäre stattfinden. Diese verschiedenen Schritte des Eintauchens in die Bäder mit den verschiedenen Reagenzien können vorteilhaft in einer Reaktionszelle durchgeführt werden, die mit einem automatischen Oligonukleotid-Synthetisator verbunden ist.
Zudem ist ein großer Überschuss an Reagenzien in Bezug auf die Moleküle auf dem festen Substrat vorhanden, was den Vorteil hat, dass Reaktionen mit einem Umwandlungsgrad von praktisch 100% erzielt werden, was bei dem Verfahren der Referenz [1] nicht der Fall ist, bei dem die Reaktionen durch Mikropipettierung der Reagenzien auf die ausgewählten Analyseplätze bewirkt werden.
Nach diesem ersten Schritt zur Modifizierung der ausgewählten Mikroküvetten durch das Nukleotid M1 kann man andere Mikroküvetten mit einem Molekül M2, ... oder Mn modifizieren. In diesem Fall schützt man zunächst die schon modifizierten Mikroküvetten mit dem Schutzpolymer 9. So erhält man in der 1F dargestellte Struktur. Selbstverständlich können weitere Mikroküvetten des Substrats ebenfalls mit Schutzpolymer 9 überdeckt werden, auch dann, wenn sie in den vorhergehenden Schritten nicht durch das Molekül M1 modifiziert worden sind. Nach dieser Operation eliminiert man die Schutzgruppen 7 der hydrophilen Funktionsgruppen 5 der nicht mit Schutzpolymer 9 überdeckten Mikroküvetten und kuppelt mit diesen Funktionsgruppen 5 ein anderes Nukleotid M2, indem man in gleicher Weise wie weiter oben vorgeht (1B und 1C). Die 1G zeigt die hergestellte Struktur. Nach dieser Operation kann man die Blockierung der Hydroxylgruppen, die nicht reagiert haben, und dann eine Oxidierung des dreiwertigen Phosphors in fünfwertigen Phosphor durchführen. Danach eliminiert man das Schutzpolymer in den nicht durch das Molekül M2 modifizierten Mikroküvetten.
Anschließend wiederholt man diese verschiedenen Operationen bei den ausgewählten Mikroküvetten, um die erwünschte Verkettung der Moleküle M1, M2, ..., Mn herzustellen, also Oligonukleotide verschiedener Verkettungen in verschiedenen Mikroküvetten des Substrats 1.
Zum Beispiel stellt man eine Matrix aus Oligonukleotidsonden auf einem Siliciumsubstrat her, das Mikroküvetten mit 100 × 100 × 30 μm umfasst, eingeätzt in das Silicium. Die Funktionalisierung der Mikroküvetten erfolgte mit einem Silanierungsmittel, gebildet durch N,N-(Bis-hydroxyethyl)aminopropyltrimethoxysilan, dessen OH-Gruppen geschützt werden durch Dimethoxy- oder Monomethoxytritylgruppe.
In der Folge wird ein Realisierungsbeispiel einer Matrix aus zwei Oligonukleotidsequenzen beschrieben.
Man geht von einem Substrat aus, das strukturiert wurde durch die Anwendung klassischer Methoden der Mikroelektronik, nämlich Abscheidung, Photolithographie und Ätzung. Die 2 zeigt ein Mikroküvettenprofil 3.
Nach dem Zerschneiden des Siliciumsubstrats in Chips mit 2 × 2 cm² werden die Protokolle zur Reinigung (1), Silanisierung (2) und Bildung eines Hexaethylenglycolzweigs (3) folgendermaßen ausgeführt:

– 1) Das Substrat wird 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur in einer NaOh-Lösung (1 g NaOH, 3 ml entionisiertes DI-Wasser, 4 ml EtOH 95%) inkubiert, dann mit DI-Wasser gespült und mittels Gebläse bzw. Luftstrahl getrocknet.
– 2) Das Substrat wird eine Nacht lang bei 80°C in einer Lösung inkubiert, die 1 ml 3-Glycidoxypropyltrimethoxisilan, 3,5 ml Toluol und 0,3 ml Triethylamin umfasst. Es wird mit Aceton gespült, mittels Gebläse bzw. Luftstrahl getrocknet und dann für 3 Stunden auf 110°C gebracht.
– 3) Das Substrat wird eine Nacht bei 80°C in einer Lösung inkubiert, die 15 μl Schwefelsäure enthält, dann in Aceton gespült und mittels Gebläse bzw. Luftstrahl getrocknet.

Das Substrat wird anschließend in einem speziellen Raum positioniert, das mit einem automatischen Oligonukleotid-Synthetisator EXPEDITE 8909 verbunden ist. Das Syntheseprotokoll benutzt die Phosphoramidit-Chemie und umfasst vier Schritte:
Detritylierung, Kupplung, Capping, Oxidation. Das benutzte Protokoll arbeitet mit der 1 μmol-Skala.
Die sieben ersten Mütter erfolgen in dem automatischen Synthetisator 3' ATC TCA C 5'. Das Substrat wird aus dem Synthetisator genommen und in einen Polymerabscheidungsroboter gegeben (Cam/alot) oder das Polymer wird auf der Hälfte der Küvetten aufgebracht bzw. wo das Polymer auf der Hälfte der Küvetten aufgebracht wird. Das Füllprofil des Polymers 9 in der Mikroküvette 3 ist in der 2 dargestellt. Eine Draufsicht der Mikroküvetten 3 im optischen Mikroskop zeigt die 3 für Größen von 300 μm mit einer Teilung von 600 μm und die 4 für Größen von 200 μm mit einer Teilung von 400 μm. Einige Mikroküvetten sind leer.
Das Substrat wird bei 85°C neunzig Sekunden lang auf einer Heizplatte getempert. Das Substrat wird wieder in den Synthetisator gegeben, um die Kupplung einer Base C in der nicht mit Polymer bedeckten Hälfte der Küvetten zu bewirken. Das Polymer wird in Wasser mit 85°C eliminiert. Auf diesen letzteren Küvetten erfolgt eine neue Polymerabscheidung. Nach dem Tempern wird das Substrat in dem Synthetisator positioniert, um die Kupplung einer Base T in den anderen Küvetten zu bewirken. Nach dieser Kupplung wird das Polymer eliminiert und das Substrat wird in dem Synthetisator positioniert, wo die Gesamtheit der Küvetten die folgenden Kupplungen erhält: C AAA TAG. Am Ende dieses Schritts enthält die Hälfte der Mikroküvetten die Sequenz NO 1: -3' ATC TCA CTC AAA TAG 5'- und die andere Hälfte die Sequenz NO 2: -3' ATC TCA CCC AAA TAG 5'-.
Diese beiden Sequenzen unterscheiden sich nur durch eine einzige Base. Das Substrat wird aus dem Synthetisator entnommen und in während 45 min bei 60°C in einer NH₄OH-Lösung inkubiert, dann mit DI-Wasser gespült und mittels Gebläse bzw. Luftstrahl getrocknet, um die Schutzgruppen der Nukleotidbasen zu eliminieren.
Die Hybridisierung erfolgt mit dem komplementären Ziel der Sonde Nr.2: -3'CA TAG AGT GGG TTT ATC CA 5' mit einer Biotingruppe in 5'. Das Substrat wird in eine Lösung gegeben, die 690 μl Hybridisierungspuffer H-7140 von Sigma und 10 μl des Ziels mit 1 OD (Menge der Oligonukleotie, die – wenn aufgelöst in 1 ml Wasser – einen Absorptionskoeffizienten von 1 aufweist, gemessen bei 260 nm in einem Behälter mit einem optischen Weg gleich 1 cm) enthält, und es wird bei 40°C während einer Stunde mit leichtem Umrühren inkubiert, dann zwei Spülungen in einem Pufferbad SCC 2 × während 1 Minute und einem Pufferbad SCC 0,2 × während 1 Minute unterzogen, um die nicht-hybridisierten Ziele zu eliminieren. Dann wird das Substrat mittels Gebläse bzw. Luftstrahl getrocknet. Die Kupplung des Biotins mit der die Fluorophor-Gruppe Cy3 umfassenden Streptavidin-Gruppe erfolgt 10 bis 15 Minuten lang in einer Lösung mit 5 μl Streptavidin-Puffer Cy3 und 700 μl Puffer PBS, TW, NaCl 0,5 M bei Umgebungstemperatur und Dunkelheit. Das Substrat wird anschließend in einem PBS, TW, NaCl 0,5 M umfassenden Pufferbad und dann in einem PBS-Pufferbad gespült und mittels Gebläse bzw. Luftstrahl getrocknet.
Das nach der Hybridisierung in dem Fluoreszenz-Konfokal-Mikroskop-System GS 3000 erhaltene Fluoreszenzbild zeigt, dass die Hybridisierung nur mit der komplementären Sonde stattfindet.
Genannte Referenzen

[1]: US-A-5 474 796
[2]: WO-A-97/39 151
[3]: EP-A-0 728 520
[4]: US-A-5 658 734

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Matrix aus chemischen oder biologischen Molekülsequenzen, die durch Verkettung verschiedener Moleküle M1, M2, ... Mn gebildet worden sind, durch in situ-Synthese auf einem strukturierten Substrat mit Mikroküvetten, das die folgenden Stufen umfasst: 1) Funktionalisierung der Mikroküvetten des Substrats durch funktionelle Gruppen, die mit den Molekülen M1, M2, ... Mn eine kovalente Bindung bilden können; 2) Abscheidung eines Schutzpolymers in mindestens einer der Mikroküvetten durch Mikroabscheidung von Tropfen des Polymers zur Bildung von Abdeckungen (Überzügen) aus dem festen Polymer in der (den) ausgewählten Mikroküvette(n); 3) Durchführung einer oder mehrerer chemischer Reaktionen in flüssiger Phase, um die Kupplung eines ersten Moleküls M1 an die funktionellen Gruppen der Mikroküvetten, die nicht von dem Schutzpolymer bedeckt sind, zu gewährleisten; 4) Eliminierung des Schutzpolymers auf den Mikroküvetten, die von diesem Polymer bedeckt sind, nach der ersten Reaktion oder einer der nachfolgenden Reaktionen, die in der Stufe (3) durchgeführt werden; und 5) Wiederholung der Stufen (2), (3) und (4) zur Erzielung der gewünschten Verkettungssquenzen an jeder der funktionalisierten Mikroküvetten, wobei in dem Verfahren die Stufe (1) dann besteht, dass man: a) die gesamte Oberfläche des Substrats und der Mikroküvetten mit funktionellen Gruppen funktionalisiert, dann diese funktionellen Gruppen durch eine labile Schutzgruppe schützt; b) ein Schutzpolymer auf allen Mikroküvetten durch Mikroabscheidung von Tropfen des Polymers abscheidet zur Bildung von Überzügen aus dem festen Polymer auf allen Mikroküvetten; c) die auf dem Substrat um die Mikroküvetten herum vorhandenen funktionellen Gruppen von der Schutzgruppe befreit, dann mit einer nicht-labilen blockierenden Gruppe reagieren lässt unter den Bedingungen, wie sie für die chemischen Reaktionen zur Kupplung und zur Eliminierung des Schutzpolymers angewendet worden sind, und d) das Schutz-Polymer aus allen Mikroküvetten eliminiert; und bei dem Schutz-Polymer, das ausgehend von einer Lösung in einem Lösungsmittel abgeschieden worden ist, den gebildeten Polymer-Film tempert durch Erwärmen des Substrats auf eine Temperatur von 50 bis 100°C, bevor die Stufe (3) oder die Stufe (c) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die funktionellen Gruppen der Mikroküvetten durch eine labile Schutzgruppe schützt und bei dem die Stufe (3) als erste Reaktion eine Reaktion zur Entfernung der funktionellen Schutzgruppen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Schutzgruppe eine Tritylgruppe oder ein Tritylderivat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Molekülsequenzen Oligonucleotide sind.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, bei dem die Stufe(3) ein Phosphoramidit-Zyklus zur Synthese von Oligonucleotiden ist, der die Eliminierung der Tritylgruppen, das Kuppeln mit einem Nucleotid, die Reaktion der funktionellen Gruppen, die nicht an das Nucleotid gekoppelt worden sind, mit einer blockierenden Gruppe und die Oxidation der Phosphoramidit-Gruppe des Nucleotids zu einem Phosphat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man die Stufe (4) zur Eliminierung des Schutz-Polymers nach dem Kuppeln des Nucleotids durchführt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man das Schutz-Polymer auswählt aus der Gruppe, die besteht aus Polymeren und ihren Derivaten vom Polyvinylalkohol-Typ, Polystyrolen, Polyvinylcarbazolen und Polyimiden.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man die Stufe (4) zur Eliminierung des Schutz-Polymers nach der Stufe (3) zur Eliminierung der Tritylgruppen durchführt.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Schutz-Polymer ein Polyhydroxystyrol ist und die Detritylierung in Dichlormethan durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Schutz-Polymer ein Polystyrol oder ein Polyvinylcarbazol ist und die Detritylierung in Acetonitril durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Schutz-Polymer ein Poly(oxyethylen) ist und die Detritylierung in Toluol durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Schutz-Polymer ein Polyvinylalkohol ist und die Detritylierung in Dichlormethan durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, bei dem die Stufe (4) zur Eliminierung des Schutz-Polymers durch Spülen mit einem Lösungsmittel für das Polymer durchgeführt wird, indem man diese Spülstufe in den Zyklus eines automatischen Oligonucleotid-Synthetisators einfügt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man das Schutz-Polymer unter Verwendung eines Mikroabscheidungs-Roboters durchführt durch Tintenstrahldrucken oder Ausgabe von geeichten Mikrotropfen.