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DE102008062136B4 - Pharmazeutische Zusammensetzung auf Basis von Peptid aus Kamelmilch - Google Patents

Pharmazeutische Zusammensetzung auf Basis von Peptid aus Kamelmilch Download PDF

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peptide
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Dr. Al Zoubi Khaled
Dr. Al Falah Marwan
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KAMAMED GMBH, DE
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KAMAMED UG
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Abstract

Verwendung eines Peptids, das eine der Sequenzen SEQ-ID Nr. 1 (Lactophorin A), SEQ-ID Nr. 2 (Lactophorin B) oder SEQ-ID Nr. 7 aufweist, zur Behandlung einer Krankheit, die durch Hemmung der humanen DPP4 therapierbar ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Diabetes mellitus oder Fettleibigkeit besteht.

Description

  • Die Erfindung betrifft Peptide, die z. B. aus Kamelmilch isolierbar sind, und als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, insbesondere zur Verwendung bei medizinischen Indikationen, die durch Hemmung der humanen DPP4, zAAP und/oder DPP8 und/oder DPP9 therapiert werden können, insbesondere Diabetes mellitus Typ 2 und/oder Fettleibigkeit.
  • Stand der Technik
  • Drucker et al. (Nature Reviews 109–110 (2007)) beschreiben die Wirkung von Sitagliptinphosphat, das als Medikament bei Typ 2 Diabetes mellitus eingesetzt wird. Der Wirkungsmechanismus von Sitagliptin beruht auf der Inhibition von menschlicher Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4), die das die Insulinsekretion von beta-Inselzellen fördernde Glukagon-like Peptid 1 (GLP1) und das Glucose-abhängige insulinotrophe Polypeptid (GIP) durch Proteolyse inaktiviert. Die Hemmung der proteolytischen Aktivität von DPP4 führt daher zu einer länger anhaltenden Aktivität der endogenen glucoregulatorischen Inkretine GIP und GLP1.
  • Traditionelle Heilverfahren im arabischen Raum und Afrika setzen Kamelmilch als Nahrungsmittel zur Bekämpfung von Herz-Kreislauf-Krankheiten und Diabetes ein. Shabo et al. (Journal of Camel Practice and Research, 2008, 15(1): 55–59) offenbart, dass die orale Gabe unpasteurisierter Kamelmilch vorteilhaft gegen Infektionen des Verdauungstraktes wirkt. Wernery (Journal of Camel Practice and Research, 2006, 13: 15–26) lehrt, dass Kameltreiber die Wirkung von Kamelmilch in der Behandlung von Bauchwassersucht, Typhus und Arthritis schätzen.
  • Kappeler et al. (J. Dairy Science 2084–2093 (1999)) beschreiben die Klonierung und Aminosäuresequenzierung von Lactophorin A und dessen Variante Lactophorin B aus Kamelmilch. Für Lactophorin wurden gute emulgierende Eigenschaften und die Inhibition der spontanen Lipolyse durch Lipoproteinlipase gefunden. Das Lactophorin war nicht glykosyliert und zeigte Sequenzähnlichkeiten zu Glykosylierungs-abhängigen Zelladhäsionsmolekül-1-Proteinen (GlyCAM-1). Die Aminosäuresequenzen von Lactophorin A und B sind unter der Zugangsnummer AJ131714 bei EMBL bzw. GenBank hinterlegt.
  • Deacon (Diabetes, 2181–2189 (2004)) beschreibt, dass die Inhibierung von DPP4 aufgrund der verminderten Proteolyse von GLP1 antidiabetische Wirkung haben kann. Als Inhibitoren von DPP4 werden Valin-pyrrolidid und Isoleucin-thiazolidid genannt. Da der DPP4-Inhibitor Valin-pyrrolidid auch in Mausmutanten ohne GLP1-Rezeptor die Glucosetoleranz verbesserte, wird vermutet, dass die Inhibierung von DPP4 auch die Proteolyse exogenen GIPs vermindert. Bei Verabreichung des DPP4 – Inhibitors Isoleucin-thiazolidid an Vancouver-Zucker-diabetische fette Ratten wird neben der Verbesserung der Glucosetoleranz und der verbesserten Reaktion von β-Zellen auch eine Verminderung des gesamten Körpergewichts beobachtet.
  • Die EP 0 995 440 A1 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Hemmstoff der DPP4 enthalten, zur Erhöhung des Blutzuckerspiegels. Als Hemmstoff der DPP4 werden allgemein Inhibitoren, Substrate, Pseudosubstrate, Expressionsinhibitoren, Bindeproteine und Antikörper genannt, insbesondere Alanyl-pyrrolidid und Isoleucyl-thiazolidid, N-Valyl-Prolyl sowie O-Benzoylhydroxylamin, insbesondere als Fumarat.
  • Die WO 99/67 278 A1 beschreibt Vorläufersubstanzen von Isoleucylthiazolidid zur Verwendung als Inhibitor der DPP4.
  • Die WO 99/38 501 A2 beschreibt die Verwendung von Dipeptiden, nämlich von Pro-Pro, Ala-Pro und D-Ala-L-Ala, als Hemmstoff der DPP4 oder von GLP1.
  • Die WO 01/68 603 A2 beschreibt Inhibitoren der DPP4, die eine Pyrrolidingruppe mit einem gebundenen Cyclopropylrest aufweisen.
  • WO 01/40 180 A1 beschreibt Verbindungen, die einen mit einer Nitrilgruppe sub- stituierten Pyrrolidinrest aufweisen, zu Verwendung als Inhibitor der DPP4.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Gegenüber dem vorgenannten Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, einen alternativen Hemmstoff für die humane DPP4 bereitzustellen. Ferner liegt die Aufgabe in der Bereitstellung eines Hemmstoffs der humanen DPP4 für die medizinische Anwendung bei Diabetes, insbesondere Diabetes mellitus (Typ 2 Diabetes), sowie Fettleibigkeit.
  • Allgemeine Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung löst die vorgenannte Aufgabe durch die Bereitstellung von Peptiden, die aus Kamelmilch isolierbar sind und eine der Sequenzen aus SEQ-ID Nr. 1 (Lactophorin A), SEQ-ID Nr. 2 (Lactophorin B) oder SEQ-ID Nr. 7 aufweisen zur medizinischen Verwendung zur Inhibierung der DPP4 und DPP4-analoger Peptidasen, vorzugsweise in Kombination mit der Inhibierung von APN, zAAP und/oder DPP8 und DPP9, insbesondere bei der medizinischen Indikation Diabetes mellitus und/oder Fettleibigkeit. Als DPP4-ähnliche Enzyme und Peptidasen oder, gleichbedeutend verwendet, DPP4-analoge Enzyme und Peptidasen, werden vorliegend insbesondere Peptidasen mit regulatorischer Funktion bezeichnet, die vorzugsweise eine mit der DPP4 ähnliche Aminosäuresequenz aufweisen, z. B. eine zu mindestens 80 bis 90% identische Sequenz umfassen oder daraus bestehen. DPP4-analoge Peptidasen wirken vorzugsweise in vivo auf die selben Substrate wie DPP4, und sind insbesondere solche Peptidasen, die in vivo GLP-1, GLP-2 und/oder GIP und/oder NPY und/oder PYY spalten. Besonders bevorzugt sind DPP4-analoge Peptidasen solche, bei denen die Hemmung ihrer proteolytischen Aktivität eine der erfindungsgemäßen medizinischen Indikationen positiv beeinflusst.
  • Die Analyse und Identifikation einzelner Substanzen aus Kamelmilch hat überraschenderweise gezeigt, dass daraus isoliertes Lactophorin A und/oder Lactophorin B, sowie daraus abgeleitete Peptide mit bestimmter Aminosäuresequenz inhibitorische Wirkung gegen die humane DPP4 und DPP4-analoge Peptidasen, und vorzugsweise auch gegen die humane Aminopeptidase N (APN) und/oder gegen die humane zytosolische Alanylaminopeptidase (zAAP) und/oder gegen humane Dipeptidpeptidase 8 (DPP8) und/oder Dipeptidpeptidase 9 (DPP9) haben. Diese inhibitorische Wirkung gegenüber den vorgenannten Peptidasen, insbesondere gegenüber DPP4, wurde sowohl in in vitro Tests und in vitro in Zellkultur nachgewiesen, als auch im Versuchstier. Die pharmazeutische Wirksamkeit von Lactophorin A und Lactophorin B aus Kamelmilch und daraus abgeleiteten Peptiden, insbesondere solchen, die eine der Sequenzen aus SEQ-ID Nr. 1 (Lactophorin A), SEQ-ID Nr. 2 (Lactophorin B) oder SEQ-ID Nr. 7 aufweisen, kannte im Tierversuch für die Indikationen Diabetes mellitus Typ 2 gezeigt werden, sowie für die Indikation Fettleibigkeit. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Peptide neben der Wirkung gegen DPP4 auch eine signifikante inhibitorische Wirkung gegen eine oder mehrere aus der Gruppe, die humane APN, humane zAAP, humane DPP8 und/oder DPP9 umfasst, so dass eine Verstärkung der pharmazeutischen Wirkung der Peptide durch deren Hemmung von mindestens zwei Peptidasen aus der vorgenannten Gruppe erzielt wird.
  • Insbesondere konnte im Tierversuch gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide auch bei oraler Verabreichung gegen den Aufbau von Speicherfettgewebe, z. B. gegen Fettleibigkeit wirksam sind.
  • Es wird vermutet, dass die Wirksamkeit erfindungsgemäßer Peptide gegen Fettleibigkeit neben der Reduktion der Proteolyse von Insulin auch darauf beruht, dass Neuropeptid Y (NPY) und/oder Peptid YY (PYY) bei Hemmung der Aktivität von DPP4 und deren membrangebundener Formen weniger stark abgebaut werden bzw. länger vorliegen. Als Folge ist ein durch NPY und/oder PYY erzeugtes Sättigungsgefühl stärker oder bleibt länger erhalten.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können durch orale Verabreichung oder durch Verabreichung per Injektion, z. B. i. m. oder i. v., von Fusionspeptiden, insbesondere in pharmazeutisch akzeptabler Formulierung appliziert werden, wobei Fusionspeptide zumindest eine der Sequenzen aus SEQ-ID Nr. 1 (Lactophorin A), SEQ-ID Nr. 2 (Lactophorin B) oder SEQ-ID Nr. 7 aufweisen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide, die deren Fusionspeptide einschließen können, sind gegenüber bekannten Inhibitoren der DPP4 deshalb vorteilhaft, weil ihre Wirkung im Organismus nach Verabreichung von begrenzter Dauer ist, z. B. auf eine Hauptwirkungsdauer von ca. 1 bis 4 h. Diese begrenzte bzw. im Vergleich zu z. B. Sitagliptinphosphat signifikant kürzere Hauptwirkungsdauer bzw. Halbwertszeit führt dazu, dass die unerwünschte Reduktion der natürlichen Zell-Zell-Adhäsion signifikant geringer bzw. vermindert ist. Daher wird die zeitlich begrenzte Hauptwirkungsdauer der erfindungsgemäßen Peptide als Inhibitoren der DPP4 derzeit als Grund dafür angesehen, dass die Nebenwirkung der erfindungsgemäßen Peptide zur Erzeugung von Neoplasmen und insbesondere die Nebenwirkung einer Verstärkung der Metastasierung bestehender Tumore signifikant geringer ist, als bei bekannten DPP4-Inhibitoren.
  • Die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen gegen Diabetes mellitus und/oder Fettleibigkeit hat daher den Vorteil geringer Nebenwirkungen, insbesondere ein geringeres Risiko neoplastischer Neuerkrankungen und/oder insbesondere ein geringeres Risiko der Metastasierung bestehender Neoplasmen, z. B. bei endometrialem Adenokarzinom, Melanomen, Prostatakarzinom, hämatologischen Tumoren, z. B. akute lymphatischer Leukämie und Hogdekin-Syndrom, gastrointestinalem Karzinom, humanem hepatozellulären Karzinom, Lungen-Adenokarzinom, Schilddrüsenkarzinom, papillärem und follikulärem Schilddrüsenkarzinom und Ovarialkarzinom. Als Ursache für die geringe Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide zur Verstärkung bzw. Metastasierung von zumindest diesen Neoplasmen wird derzeit angenommen, dass die verminderte Expression von DPP4/CD26 auf neoplastischen Zellen durch Anwesenheit eines Inhibitors der DPP4 günstig beeinflusst wird. So führt z. B. die Anwesenheit erfindungsgemäßer Peptide zur Minderung der Aktivität zur Migration und Invasion, bzw. der Malignität neoplastischer Zellen im Vergleich zur Wirkung von z. B. Sitagliptinphosphat, da die Minderung der Zell-Zell-Adhäsion durch Inhibition der DPP4 durch erfindungsgemäße Peptide reduziert bzw. zeitlich begrenzt auftritt.
  • Die zeitlich begrenzte Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide wird derzeit darauf zurückgeführt, dass die Wirkstoffe keine synthetischen Derivatisierungen aufweisen und vom Organismus abgebaut werden können. Daher sind unerwünschte Nebenwirkungen bei Verabreichung der Verbindungen zu medizinischen Zwecken auch an Menschen im wesentlichen nicht zu beobachten bzw. im Vergleich mit bekannten Hemmstoffen der DPP4 signifikant reduziert.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide und Fusionspeptide, deren proteolytische Spaltprodukte erfindungsgemäße Peptide enthalten, können durch übliche Syntheseverfahren oder aus natürlichen Quellen, insbesondere aus Kamelmilch isoliert werden. Peptide, die nicht die vollständige Sequenz von Lactophorin A oder Lactophorin B umfassen, können z. B. durch proteolytische Spaltung von Lactophorin A oder Lactophorin B, optional mit anschließender Aufreinigung hergestellt werden. Als Syntheseverfahren können chemische Peptidsynthesen verwendet werden, oder die heterologe Expression der Peptide von einer diese kodierenden DNA-Sequenz, die z. B. aus der Aminosäuresequenz abgeleitet ist und funktional zwischen einem Promotor und einem Terminator als Expressionskassette angeordnet ist und in einem Wirtsorganismus exprimiert wird.
  • Aminosäuresequenzen von Peptiden sind in dieser Anmeldung vom N-Terminus zum C-Terminus angegeben.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Grundlage der vorliegenden Erfindung ist, dass die menschliche GPP4 in vitro und in vivo durch Peptide gehemmt wird, die eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3), KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen.
  • Erfindungsgemäße Peptide weisen die Aminosäuresequenz von Lactophorin A MKFFAVLLLASLAATSLASLNEPKDEIYMESQPTDTSAQVIMSNHQVSS EDLSMEPSISREDLVSKDDVVIKSARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTA TQSEETKELTPGAATTLEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPH ASEVVKPQ (Seq.-ID Nr. 1), die Aminosäuresequenz von Lactophorin B MKFFAVLLLASLAATSLASLNAAQVIMSNHQVSSEDLSMEPSISREDLV SKDDVVIKSARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTATQSEETKELTPGAAT TLEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ (Seq.-ID Nr. 2) oder die Aminosäuresequenz eines bestimmten Spaltprodukts von Lactophorin A, nämlich EPKDEIYMESQPTDTS, auf.
  • Erfindungsgemäße Peptide umfassen daher neben Lactophorin A und/oder Lactophorin B auch Fusionsproteine natürlicher oder künstlicher Aminosäuresequenz, die ohne Umsetzung oder nach proteolytischer Spaltung zumindest eine der Sequenzen SEQ-ID Nr. 1 (Lactophorin A), SEQ-ID Nr. 2 (Lactophorin B) oder SEQ-ID Nr. 7 (EPKDEIYMESQPTDTS) aufweisen, um eine solche dreidimensionale Struktur anzunehmen, dass sie die proteolytische Aktivität von DPP4 signifikant inhibieren.
  • Für das proteolytische Spaltprodukt von Lactophorin A wurde ebenfalls bei oraler Verabreichung eine inhibitorische Wirkung auf DPP4 gefunden. Dieses Spaltprodukt, das die Aminosäuresequenz EPKDEIYMESQPTDTS (Seq.-ID Nr. 7) hat und ein Abschnitt der Aminosäuresequenz von Lactophorin A mit dem N-terminalen Tripeptid EPK (Seq.-ID Nr. 6) ist, zeigt in vitro und in vivo eine inhibierende Wirkung gegenüber APN. Entsprechend weisen erfindungsgemäße Zusammensetzungen vorzugsweise ein Peptid mit der Sequenz EPKDEIYMESQPTDTS (SEQ-ID Nr. 7) auf.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen auch solche Varianten und Abwandlungen ihrer Aminosäuresequenzen, die die inhibitorische Wirkung gegen DPP4 bzw. CD26 nicht signifikant beeinträchtigen. Insbesondere haben Varianten eine oder mehrere Austäusche, Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren, insbesondere konservative Austausche.
  • Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren näher erläutert, bei denen
  • 1 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt,
  • 2 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt,
  • 3 die relative Hemmung von APN1 durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt,
  • 4 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid und von Actinonin als Vergleichssubstanz zeigt,
  • 5 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP8 und DPP9 durch erfindungsgemäßes Peptid und des DPP4-Inhibitors Actinonin als Vergleichssubstanz zeigt,
  • 6 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von zAAP durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt,
  • 7 eine grafische Darstellung der Wirkung erfindungsgemäßen Peptids auf die mitochondriale Aktivität zeigt,
  • 8 die Hemmung der DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid in vivo zeigt, und
  • 9 die Wirkung erfindungsgemäßer Peptide auf die Reduktion der Zunahme des Gesamtgewichts bei Mäusen als Versuchstieren zeigt.
  • Beispiel 1: Hemmung der DPP4 durch Fusionspeptid
  • Bei der Fraktionierung von Peptiden aus Kamelmilch wurde für Lactophorin A und B gefunden, dass sie eine inhibitorische Wirkung auf die humane DPP4 haben. Ein erster in vitro Versuch, bei dem aufgereinigte humane rekombinante DPP4, die nach Korom (Transplantation 63, 1495–1500 (1997)) durch Expression in Zellkultur hergestellt und isoliert wurde, zeigt, dass Lactophorin A bei 100 ng/mL (Konz1), 200 ng/mL (Konz2), 500 ng/mL (Konz3), 1 μg/mL (Konz4) und 10 μg/mL (Konz5) die DPP4 inhibiert. Das Ergebnis ist in 1 dargestellt und zeigt, dass Lactophorin in den eingesetzten Konzentrationen die proteolytische Aktivität von DPP4 signifikant inhibiert. Zum Vergleich (control) ist die Aktivität von DPP4 ohne Zusatz eines Peptids im ansonsten identischen Versuch gezeigt. Die proteolytische Aktivität wurde als Umsetzung eines der Substrate GlyPro-AMC (Gly-Pro-Aminomethylcourmarin) oder Ala-Pro-Rhodamin110 (R110) bestimmt.
  • Generell wurden erfindungsgemäße Peptide in aufgereinigter Form in HEPES-Puffer (100 mM HEPES, pH 7,5) gelagert, vorzugsweise bei –20°C, was auch die Lagerstabilität der Peptide in Lösung bei Temperaturen unterhalb von 0°C, vorzugsweise bei –5 bis –70°C zeigt. Tests wurden bei 37°C durchgeführt. Die Messung der Hydrolyse von zugesetztem Substrat erfolgte nach Inkubation zusetzten Substrats für 2 min bei 37°C mit Enzym und Hemmstoff.
  • Für Lactophorin A wurden für das Substrat GlyPro-AMC in vitro die folgenden Parameter bestimmt:
    Wert SA
    Vmax 6,59349 × 103 1,566 × 103
    km 1,70005 × 104 4,829 × 10–5
    ki 1,23528 × 10–3 7,461 × 10–5
  • Der Ki-Wert wurde zu 1,235 × 10–3 mg/mL berechnet. Ähnliche Werte kannten für Lactophorin B bestimmt werden.
  • Ein Vergleich der inhibitorischen Wirkung von Lactophorin A auf isolierte rekombinante humane DPP4 im in vitro Versuch ist in 2 im Vergleich zum bekannten DPP4-Inhibitor Lys-Z(nitro)-Pyrrolidid gezeigt. Zur Messung der Aktivität wurde nach Inkubation mit Lactophorin A bzw. Lys-Z(nitro)-Pyrrolidid über 2 h die Hydrolyse von anschließend zugesetztem Ala-Pro-Rhodamin110 (R110) fluorimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt und machen deutlich, dass Lactophorin A die humane DPP4 inhibiert. Die IC50 für Lactophorin A wurde für GlyPro-AMC zu 1,77 μM bestimmt, für Lys-Z(nitro)-Pyrrolidid zu 0,143 μM.
  • Bei Messung der inhibitorischen Wirkung von Lactophorin A mit dem Hydrolysesubstrat Gly-Pro-Aminomethylcoumarin (GlyPro-AMC) wurde eine IC50 = 6,9 μM für Lactophorin A gefunden, und von 0,39 μM für den bekannten DPP4-Inhibitor Actinonin. Die Daten sind in 4 gezeigt.
  • Durch proteolytische Fragmentierung von Lactophorin A und Lactophorin B erhaltene Peptide wurden ebenfalls auf die Inhibition von DPP4 analysiert. Dabei wurde gefunden, dass die inhibitorische Wirkung von Lactophorin im Wesentlichen durch Peptide ausgeübt wird, die N-terminal eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) aufweisen. Diese Peptide können als proteolytische Spaltprodukte aus Fusionspeptiden entstehen, die eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) enthalten.
  • Anhand der folgenden isolierten Peptide konnte gezeigt werden, dass Peptide, die eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3), KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) N-terminal enthalten, die erfindungsgemäße inhibitorische Wirkung auf DPP4 und/oder Aminopeptidase N haben:
    VPQ (Seq.-ID Nr. 3) und das natürliche proteolytische Spaltprodukt aus Lactophorin A mit N-terminaler Seq.-ID Nr. 6, nämlich Seq.-ID Nr. 7.
  • Beispiel 2: Inhibierung von APN durch Lactophorin A
  • Die Aktivität von Lactophorin A auf APN konnte im in vitro Test nachgewiesen werden.
  • Humane rekombinante APN, die nach Lendecke et al. (BioChem. 384 (2003)) hergestellt und isoliert war, wurde im Puffer von Beispiel 1 mit Lactophorin A zu 10 μg/mL (2 in 3), 5 μg/mL (3 in 3) oder 100 ng/mL (4 in 3) inkubiert. Zum Vergleich ist die Aktivität von APN ohne Zusatz gezeigt (1 in 3). Die Aktivität von APN wurde als Umsetzung des Substrats AMC spektrophotometrisch zu 0 min und 90 min bestimmt, die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst: Hemmung der APN durch Lactophorin A
    Konz. 0 min 90 min Aktivität über 90 min
    10 μg/mL 0,0437 0,0594 0,017
    5 μg/mL 0,0506 0,0688 0,0132
    0,1 μg/mL 0,0456 0,6066 0,556
  • Die Werte zeigen, dass Lactophorin A die Aktivität von APN mit zunehmender Konzentration zunehmend inhibiert. Als Positivkontrolle für die Inhibierung wurde Actinonin verwendet.
  • Beispiel 3: Inhibierung von DPP8/DPP9 durch Lactophorin A
  • DPP8/DPP9 wurde aus Lebern von CD26-K.O.-Mäusen (Black6, nach Marguet et al., PNAS (2000)), solubilisiert in PBS mit 1% Triton X100 teilgereinigt. Die Mischung aus DPP8/DPP9 wurde in HEPES-Puffer mit Lactophorin A bei 37°C für 2 h inkubiert. Anschließend wurde das Substrat Gly-Pro-AMC zugesetzt und als Kontrolle der DPP4-spezifische Inhibitor 3 und der für DPPB/DPP9 spezifische Inhibitor 4, wie von Lankas et al. (Diabetes 54 (10), 2988–2994 (2005)) beschrieben.
  • Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt und machen deutlich, dass Lactophorin A DPP8 und/oder DPP9 inhibiert. Für DPP8/DPP9 wurde hier für Lactophorin A eine IC50 von 21 μM bestimmt, für den DPP8/DPP9-Inhibitor eine IC50 von 0,009 μM und für den DPP4-Inhibitor eine IC50 > 31,25 μM.
  • Die Hemmung von DPP8/DPP9 konnte auch für die Peptide der Seq.-ID Nrn. 3 bis 6 und erfindungsgemäße Fusionspeptide gezeigt werden, deren Aminosäuresequenz N-terminal eine Sequenz der Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 6 aufwies.
  • Beispiel 4: Inhibierung von zAAP durch Lactophorin A
  • zAAP wurde aus kultivierten Jurkat-Zellen aufgereinigt. zAAP wurde in HEPES-Puffer mit 0,25 mM DTT mit Lactophorin A bei 37°C für 2 h inkubiert. Anschließend wurde das Substrat Ala-Rhodamin110 (R110) zugesetzt und die Hydrolyse nach 60 min spektrometrisch bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt und machen deutlich, dass Lactophorin A zAAP inhibiert. Für Lactophorin A wurde unter diesen Versuchsbedingungen gegenüber zAAP eine IC50 von > 62,5 μM bestimmt.
  • Die Hemmung von zAAP konnte auch für die Peptide der Seq.-ID Nrn 3 bis 6 und erfindungsgemäße Fusionspeptide gezeigt werden, deren Aminosäuresequenz N-terminal eine Sequenz der Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 6 aufwies.
  • Beispiel 5: Zytotoxizität von Peptiden
  • Zur Bestimmung der Zytotoxizität erfindungsgemäßer Peptide wurde stellvertretend Lactophorin A in der Lebendfärbung mit Trypanblau (Celltiter-Blue-Test) mit kultivierten U937-Zellen eingesetzt. Die Ergebnisse sind in 7A für Zellen ohne Zusatz gezeigt, für Zellen mit Zusatz von Lactophorin A oder zur Kontrolle mit Natriumazid (Na-Azid) in 7B, jeweils in log 2-Verdünnungsschritten. Das Ergebnis zeigt am Beispiel von Lactophorin A, dass erfindungsgemäße Peptide keine wesentliche zytotoxische Wirkung haben.
  • Beispiel 6: inhibitorische Wirkung der Peptide auf DPP4 in vivo
  • Die inhibitorische Wirkung erfindungsgemäßer Peptide gegen DPP4 wurde in Blutplasma einer Ratte, der zuvor ein erfindungsgemäßes Peptid verabreicht worden war, anhand der Hydrolyse eines Substrats der DPP4 gemessen. Als Beispiel für erfindungsgemäße Peptide wurde Lactophorin A in Salzlösung (0,154 M, 0,1% RSA (Rinderserumalbumin)) verwendet. Blutplasma wurde aus einer katheterisierten Ratte nach Fasten über Nacht injiziert (Zeitpunkt 0). Zu den in 8 angegebenen Zeitpunkten wurden Blutproben genommen und heparinisiert. Für die Analyse der Aktivität von DPP4 wurden 100 μL heparinisiertes Blut mit 10 μL 1 M Citratpuffer, pH 3,0 versetzt, zentrifugiert und gekühlt, oder bis zur Analyse bei –20°C gelagert.
  • 25 mg Lactophorin A wurden in 5 mL 0,1% RSA in der Salzlösung gelöst und zu Aliquots von 500 μL bei –20°C eingefroren. Von dieser Lösung von Lactophorin A wurden 10 μL (0,05 mg) zu den Plasmaproben (ca. 50 μL) zugesetzt. Für den Test wurden 20 μL des mit Lactophorin A versetzten Plasmas mit 80 μL HEPES-Puffer und dem Substrat Gly-Pro-pNA versetzt und nach einer Inkubation von 2 min bei 30°C über 1 min bei 30°C spektrophotometrisch vermessen. Das Ergebnis dieses Tests ist in 8 gezeigt. Es wird deutlich, dass ausgehend von der ursprünglichen Aktivität von 12,28 mU/mL (–10 min und 0 min) DPP4 im Plasma der Ratte die Aktivität von DPP4 durch Injektion von Lactophorin A im Plasma auf 7,46 mU/mL bei 5 und 10 min nach der Injektion vermindert wurde, gefolgt von einem leichten Anstieg auf etwa 9 mU/mL. Die ursprüngliche Aktivität von DPP4 wurde in den 120 min der Beobachtung nicht wieder erreicht. Insgesamt zeigt daher dieses Experiment, dass Lactophorin A DPP4 im Serum um etwa 40% während der ersten 10 min nach der Verabreichung der Injektion inhibierte, gefolgt von einer anschließenden Inhibierung um etwa 25% für die nächsten 110 min. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Die Langzeituntersuchung ergab, dass ca. 4 h nach Verabreichung des Peptids die ursprüngliche Aktivität der DPP4 wieder vorhanden war. Daher kann diesem Versuch entnommen werden, dass zumindest in diesen Konzentrationen erfindungsgemäße Peptide die proteolytische Aktivität von DPP4 in vivo innerhalb kurzer Zeit nach Verabreichung, z. B. innerhalb von ca. 10 min hemmen, diese Hemmwirkung für mindestens ca. 110 min effektiv ist, und nach ca. 4 h die Hemmwirkung auf DPP4 beendet ist. Dieses Ergebnis belegt den Vorteil der erfindungsgemäßen Peptide, dass die Hemmwirkung auf die proteolytische Aktivität zumindest von DPP4 zeitlich begrenzt bzw. im Säugerorganismus reversibel ist.
  • Die inhibitorische Wirkung erfindungsgemäßer Peptide konnte am Beispiel von Lactophorin A auch im Plasma einer gesunden Ratte nachgewiesen werden, wenn mit Citratpuffer stabilisiertem Plasma Lactophorin A und Substrat für die DPP4 zugesetzt wurde. Im Einzelnen wurden Blutproben von einer gesunden katheterisierten Ratte genommen, der noch kein erfindungsgemäßes Peptid verabreicht worden war. Aus den Proben wurde wie oben beschrieben Plasma hergestellt und mit Citratpuffer stabilisiert. Als Substrat für die DPP4-Aktivität wurde Gly-Pro-pNA in HEPES-Puffer eingesetzt. Zu einzelnen Serumproben wurde 0,05 mg Lactophorin A zugesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass Lactophorin A im Serum die Aktivität von DPP4 von etwa 11,4 mU/mL auf 3,51 mU/mL inhibierte.
  • Vergleichsversuche, bei denen nur Puffer zugesetzt wurde, oder Lactophorin A ohne Citratpuffer zeigten, dass die inhibierende Wirkung von Lactophorin A im Wesentlichen von den Puffersubstanzen unabhängig war.
  • In der nachfolgenden Tabelle sind die Versuchsansätze im Einzelnen gezeigt:
    Aktivität Plasma + 10 μL Citratpuffer Plasma + 10 μL Citratpuffer + 10 μL HEPES-Puffer Plasma + 10 μL Citratpuffer + 0,05 mg Lactophorin A in HEPES-Puffer Plasma + 0,05 mg Lactophorin A ohne Citratpuffer
    DPP4 (mU/mL) 11,40 10,53 3,51 4,39
    ΔE/min 0,013 0,12 0,004 0,005
  • Dieser Versuch zeigt, dass erfindungsgemäße Peptide die Aktivität von DPP4 in Plasma von Säugern, denen kein DPP4-Inhibitor verabreicht wurde, inhibiert.
  • Beispiel 7: Wirkung der Peptide gegen Fettleibigkeit bei Säugern
  • Die Wirkung von erfindungsgemäßen Peptiden gegen Fettleibigkeit von Säugern wurde am Beispiel von Lactophorin A gezeigt, das 6 von 12 Mäusen (Balb6) mit einem anfänglichen Gewicht von 20 g oral mit dem Futter verabreicht wurde. Die Mäuse wurden mit Standardfutter und Wasser ad libitum gefüttert. Eine Gewichtskontrolle der Mäuse vor dem Versuch und nach 3 Wochen zeigte, dass die orale Verabreichung von erfindungsgemäßem Peptid das Körpergewicht und vor allem den Teil an Körperfett reduzierte. Für den Versuch wurde 6 Tieren 0,5 mg/kg Lactophorin A pro Tag ins Futter gemischt, 6 Kontrolltiere erhielten keine weiteren Zusätze zum Futter.
  • Das Ergebnis ist in 9 gezeigt und belegt, dass die Verabreichung von erfindungsgemäßem Peptid unter ansonsten gleichen Fütterungs- und Bewegungsbedingungen zu einer signifikant reduzierten Gewichtszunahme führt, hier am Beispiel von Lactophorin A. Bei den jeweils paarweise angeordneten Balken in 9 steht der jeweils linke Balken für das Endgewicht der Mäuse, denen Lactophorin A verabreicht wurde, und der jeweils rechte Balken für unbehandelte Mäuse.
  • Die Verminderung der Gesamtgewichtszunahme bei mit erfindungsgemäßem Peptid behandelten Mäusen betrug im Vergleich zu unbehandelten Mäusen unter ansonsten gleichen Bedingungen betrug ca. jeweils 5 g. Anatomische Analysen zeigten, dass die mit erfindungsgemäßem Peptid behandelten Mäuse einen signifikant reduzierten Anteil an Speicherfett aufwiesen, während im übrigen keine wesentlichen anatomischen oder histologischen Veränderungen gegenüber unbehandelten Mäusen festzustellen waren.
  • Eine detaillierte histologische Analyse der Versuchstiere ergab, dass die Verabreichung des erfindungsgemäßen Peptids keine Gewebsanomalien, insbesondere keine Neoplasmen zur Folge hatte.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001

Claims (4)

  1. Verwendung eines Peptids, das eine der Sequenzen SEQ-ID Nr. 1 (Lactophorin A), SEQ-ID Nr. 2 (Lactophorin B) oder SEQ-ID Nr. 7 aufweist, zur Behandlung einer Krankheit, die durch Hemmung der humanen DPP4 therapierbar ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Diabetes mellitus oder Fettleibigkeit besteht.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid auch die Aktivität der humanen APN, der humanen zAAP und/oder der humanen DPP8 und/oder die DPP9 hemmt.
  3. Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zur oralen Verabreichung oder zur Injektion formuliert ist.
  4. Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit durch Hemmung der humanen DPP8 und/oder DPP9 behandelbar ist.
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