DE60008926T2

DE60008926T2 - Verfahren zur Weinstabilisierung

Info

Publication number: DE60008926T2
Application number: DE60008926T
Authority: DE
Inventors: Philip Peter LANKHORST; Jacques Patrice PELLERIN
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1999-12-21
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2020-12-21
Also published as: ES2217006T3; EP1240306B1; PT1240306E; UY26494A1; EP1240306A1; TNSN00249A1; DE60008926D1; AU2169601A; MXPA02006096A; CA2394855A1; AR027016A1; JP2003517832A; WO2001046380A1; ATE261490T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabilisierter Weine.
Hintergrund
Das Vorhandensein von Weinsäuresalzen, Kaliumhydrogentartrat (KHT) und Calciumtartrat (CaT), ist einer der Hauptgründe für die Instabilität von Weinen. Die Weinsäure ist die von der Weinbeere während ihrer Entwicklung hauptsächlich erzeugte organische Säure. Sie wird während der Beerenverarbeitung als Kalium- und Calciumsalze im Traubenmost gelöst. Während der Fermentation werden die Tartrat-Salze durch die Hefe konserviert, doch nimmt ihre Löslichkeit mit der Zunahme der Ethanolkonzentration infolge der Fermentation von Zuckern ab.
Bei jungen Weinen ist Kaliumhydrogentartrat immer in übersättigten Konzentrationen vorhanden und kristallisiert spontan aus. Nach dem Abfüllen der Weine in Flaschen kann die KHT-Instabilität infolge des nicht vorherzusagenden Charakters der Kristallisation zu einem wesentlichen Handelsproblem werden, und das Vorhandensein unansehnlicher Kristalle in einer Flasche wird häufig von den Konsumenten als mindere Qualität angesehen.
Physikalische Behandlungen können vor dem Abfüllen des Weines in Flaschen angewendet werden, um die Kristallisation von Tartrat-Salzen zu verhindern. Diese Behandlungen bestehen in der Förderung der Kristallisation durch Kühlen des Weines bei –4°C oder in der Eliminierung der Kalium- und Weinsäure-Ionen durch Elektrodialyse oder durch die Verwendung von Ionenaustauscher-Harzen. Diese Zeit- und Energie-aufwändigen Verfahren verändern aber vermutlich das kolloidale Gleichgewicht der Weine.
Die Alternative zu physikalischen Behandlungen von Weinen ist die Verwendung von Zusatzstoffen, die die Kristallisationskeimbildung und/oder das Wachstum von KHT-Kristallen verhindern. Ein Beispiel für Zusatzstoffe, die die Kristallisationskeimbildung verhindern, sind Mannoproteine, wie in der WO 96/13571 und in der WO 97/49794 beschrieben. Da sie jedoch keine Wirkung auf das Wachstum zugesetzter Kristalle haben, können sie nicht die vollständige Stabilisierung des Weines garantieren. Folglich sind die behandelten Weine tatsächlich instabil. Außerdem ist die durchschnittliche Mannoprotein-Konzentration im Wein nicht ausreichend, um eine vollständige Verhinderung der Kristallisation zu garantieren.
Die Carboxymethylcellulose und die Meta-Weinsäure gehören zur Gruppe von Zusatzstoffen, die das Wachstum von KHT-Kristallen hemmen. Leider wird die Carboxymethylcellulose von der Weingesellschaft wegen ihrer vermuteten negativen organoleptischen Wirkung auf behandelte Weine nicht akzeptiert, und die Metaweinsäure ist beim pH-Wert von Wein und bei der Lagertemperatur von Wein instabil. Im Laufe der Zeit kommt es zur Hydrolyse der Metaweinsäure, und ihre Schutzwirkung verschwindet. Daher ist ihre Verwendung auf Weine von geringer Qualität für den raschen Verbrauch beschränkt. Ein weiterer Nachteil ist, dass idealerweise ein Zusatzstoff ein natürlicher Bestandteil von Wein sein sollte. Dies ist bei Metaweinsäure oder Carboxymethylcellulose eindeutig nicht der Fall.
A. Vernhet et al. (Am. J. Enol. Vitic. (1999) 50, 391–397) beschreiben eine Untersuchung, bei welcher mehrere Polysaccharide und Phenolsäuren als natürliche Komponenten von Weißwein identifiziert werden, die die Kristallisation von Tartrat-Salzen hemmen. V. Gerbaud et al. (J. Int. Sci. Vigne Vin. (1997) 31, 65–83) beschreiben die Hemmwirkung von Mannoproteinen und Polyphenolen für die Kristallisation von Kaliumhydrogentartrat in Weiß- und Rotweinen. V. Moine-Ledoux & D. Dubordieu J. Sci. Food Agric. (1999) 79, 537–543, beschreiben die Verwendung von aus Hefe-Zellwänden extrahierten Mannoproteinen zur Stabilisierung von gereiftem Weißwein.
Natürliche Zusätze, die sowohl auf die Kristallisationskeimbildung als auch auf die Wachstumsgeschwindigkeit von Kristallen wirksam sind, sind bei weitem die beste Garantie für eine Langzeit-Stabilität. Bisher waren keine solchen Zusätze erhältlich.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Präparates zur Herstellung von stabilisertem Wein, ein Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältiges Präparat zur Stabilisierung von Wein und ein Verfahren zur Herstellung solcher Präparate, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisiertem Wein. Dieses Verfahren umfasst die Zugabe eines Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Präparats zum Wein. Im vorliegenden Zusammenhang ist stabilisierter Wein ein Wein, bei welchem die Kristallisation von Salzen der Weinsäure verhindert oder verzögert ist, entweder als Ergebnis der Verhinderung oder Verzögerung des Kristallisationskeimbildungsprozesses oder der Hemmung oder Verzögerung des Wachstums dieser Kristalle, oder von beidem. Instabiler Wein ist durch die rasche Kristallisation von Salzen der Weinsäure gekennzeichnet, die üblicherweise nicht vorhersagbarer Natur ist.
Überraschenderweise stellte man fest, dass die Zugabe eines Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Präparates eine stabilisierende Wirkung auf Wein hat, indem sie sowohl die Kristallisationskeimbildung als auch das Wachstum von KHT-Kristallen verhindert.
Im vorliegenden Zusammenhang besteht ein Oligonukleotid aus 2–10 Nukleotiden, ein Polynukleotid aus mehr als 10 Nukleotiden. Der Zuckeranteil im Oligonukleotid oder Polynukleotid kann Ribose, wie bei RNA, oder Desoxyribose, wie bei DNA, sein.
Das Oligonukleotid oder Polynukleotid im Präparat oder das vollständige Präparat kann aus Organismen, einschließlich Pflanzen, stammen oder synthetisiert sein, beispielsweise mit einem Nukleotid-Synthesizer. Geeignete Organismen inkludieren – ohne auf diese eingeschränkt zu sein – Mikroorganismen, Fische und Säuger. Vorzugsweise stammt das Oligonukleotid oder Polynukleotid von einem Mikroorganismus. Dies inkludiert – ohne Einschränkung darauf – Bakterien, Pilze und Hefe. Beispiele für geeignete Hefen sind Brettanomyces, Saccharomyces und Kluyveromyces, wie beispielsweise Brettanomyces bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis. Beispielsweise kann Hitze-inaktivierte Hefe zur Herstellung der Oligonukleotide oder Polynukleotide verwendet werden.
Die Oligonukleotide und Polynukleotide können gemäß zum Stand der Technik gehörender Verfahren hergestellt werden. Zu diesen Verfahren gehört das Züchten und Ernten der Zellen, das Aufbrechen der Zellen, um den Zellinhalt freizusetzen, und das Isolieren der Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Fraktion durch Präzipitationstechniken, Chromatographie u. dgl.
Sowohl RNA als auch DNA kann in Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Präparaten verwendet werden. Die RNA- und DNA-Oligonukleotide oder Polynukleotide können in jeder beliebigen Form vorliegen, sei es einzelsträngig oder doppelsträngig. Geeignete RNA- und DNA-Moleküle haben ein Molekulargewicht zwi schen 0,4 und 500 kDa. Wenn RNA verwendet wird, so wird vorzugsweise eine RNA mit einem Molekulargewicht zwischen 3 und 200 kDa, mehr bevorzugt, zwischen 10 und 100 kDa, verwendet. Wenn DNA verwendet wird, wird vorzugsweise eine DNA mit einem Molekulargewicht zwischen 1 und 340 kDa, mehr bevorzugt, eine DNA mit einem Molekulargewicht zwischen 1 und 100 kDa, verwendet. Die RNA und DNA kann separat oder in Kombination verwendet werden. Eine auf dem Gebiet wohlbekannte Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts der Oligonukleotid- oder Polynukleotid-Fraktion ist die Größenausschluss-Chromatographie (Size Exclusion Chromatography, SEC) unter Verwendung einer Säule, die mit Protein-Molekulargewicht-Standards kalibriert ist.
Das erfindungsgemäße Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat kann ausschließlich oder fast ausschließlich aus Nukleotiden bestehen, z.B. zu mehr als 80%. Es ist jedoch nicht notwendig, vollständig gereinigte oder fast vollständig gereinigte Nukleotide zu verwenden, jeder Anteil von Nukleotiden zwischen 0,1 und 100 des Präparates kann in einem erfindungsgemäßen Präparat verwendet werden. Beispielsweise ist es auch möglich, ein rohes Präparat zu verwenden, das z.B. aus Hefe stammt, welches 0,1 bis 50% Nukleinsäuren oder sogar 0,1 bis 20% Nukleinsäuren enthält. Wenn die Nukleotide nicht vollständig oder fast vollständig gereinigt sind, enthält das Nukleotid-hältige Präparat vorzugsweise 0,1 bis 15% Nukleotide, mehr bevorzugt, 1 bis 15% Nukleotide (alle % auf Basis des Trockensubstanzgewichts). Andere geeignete Bestandteile des Präparates, abgesehen von den Oligonukleotiden oder Polynukleotiden, sind z.B. Hefe-Zellwandkomponenten, wie beispielsweise Mannoproteine, oder Teile davon.
Das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat kann dem Traubenmost oder dem Wein zugesetzt werden. Es wird vorzugsweise dem Wein während der Reifung zugesetzt, d.h. nach der Fermentation, jedoch vor dem Abfüllen in Flaschen. Die Erfindung ist für Weißweine und Rosé-Weine ganz besonders geeignet.
Das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat wird in solchen Mengen zugesetzt, dass eine stabilisierende Wirkung erreicht wird. Im Allgemeinen wird man versuchen, mit möglichst geringen Mengen zu arbeiten. Gute Ergebnisse sind möglich, wenn so viel Präparat zugesetzt wird, dass eine endgültige Nukleinsäure-Konzentration im Wein von 1 bis 400 mg pro Liter Wein er reicht wird. Vorzugsweise wird so viel zugesetzt, dass eine Konzentration von 1 bis 200 mg pro Liter Wein erreicht wird, am meisten bevorzugt werden 1 bis 100 mg pro Liter Wein zugesetzt. Jegliche unlösliche Stoffe, die sich entwickeln, können danach unter Verwendung von Standard-Techniken entfernt werden. Der Fachmann wird verstehen, dass die zugesetzte Menge auch von der Zugabe oder dem Vorhandensein von beispielsweise anderen Stabilisatoren abhängt.
Die Kristallisationskeimbildung und das Kristallwachstum können mittels der folgenden Methoden gemessen und quantifiziert werden (Moutounet et al. In: Actualités Enologiques 1999 Vieme Symposium International d'Oenologie de Bordeaux (Lonvaud-Funel Hrsg.)
Das Verfahren 1, welches die Kristallkeimbildung anzeigt, misst die Zeit des Auftretens von Kristallen im Wein bei Lagerung bei –4°C. Eine visuelle Inspektion wird täglich durchgeführt, und die Zeit, die notwendig ist, um das Aufscheinen von Kristallen nachzuweisen (T_Kris), ist in der Anzahl von Tagen ausgedrückt. Instabiler Wein hat eine T_Kris, die zwischen 0,5 und 15 Tagen variieren kann. Stabilisierter Wein ist gekennzeichnet durch eine TT_Kris ^{stabilisierter
Wein}/T_Kris instabiler Wein von >2, vorzugsweise >5, mehr bevorzugt >10, und am meisten bevorzugt >40.
Das Verfahren 2, welches das Kristallwachstum anzeigt, misst den Grad der Weinsäure-Hemmung (Degree of Tartaric Inhibition, DTI) des Weines. Dazu werden die Weine bei –4°C gerührt, und die anfängliche Leitfähigkeit wird gemessen. Danach werden geeichte KHT-Kristalle zugesetzt, und die Leitfähigkeit wird dann nach Erreichen eines stabilen Werts gemessen. Der DTI ist als die prozentuelle Abnahme der anfänglichen Leitfähigkeit definiert. Stabiliserter Wein ist gekennzeichnet durch einen DTI^{stabilisierter Wein}/DTI^{instabiler
Wein} von <0,8, vorzugsweise <0,5 und mehr bevorzugt <0,30.
Das Verfahren 3, welches die KHT-Kristallkeimbildung anzeigt, misst die echte, gelöste Konzentration der Weinsäure. Ein exaktes Volumen des Weines wird in eine Glasphiole transferiert und mit dem selben exakten Volumen D₂O, das eine genau bekannte Konzentration von Maleinsäure enthält, gemischt. Das ¹H NMR-Spektrum wird unter den Bedingungen einer vollständigen Relaxation aufgenommen, und das Integral des internen Standards (Maleinsäure) wird mit dem Integral der Weinsäure verglichen. Auf diese Weise kann die Konzentration der gelösten Weinsäure mit sehr großer Präzision und Exaktheit bestimmt werden.
Weine, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren stabilisiert sind, sind gekennzeichnet durch eine T_Kris ^{stabilisierter Wein}/T_Kris ^{instabiler Wein} von >2, vorzugsweise >5, mehr bevorzugt >10 und am meisten bevorzugt >40, und durch einen DTI^{stabilisierter Wein}/DTI^{instabiler
Wein} von <0,8, vorzugsweise <0,5 und mehr bevorzugt <0,3, und sind biologisch stabilisiert. In diesem Zusammenhang bedeutet biologisch stabilisiert, dass die Stabilisierung durch die Zugabe eines Zusatzes erreicht wird, welcher im Allgemeinen als natürliche Komponente von Wein angesehen wird, beispielsweise, weil er von Hefe oder Trauben stammt. Beispiele für solche biologische Zusätze sind Mannoprotein, DNA und RNA.
BEISPIELE
Die Zeit des Aufscheinens von Kristallen (T_Kris), T_Kris ^{stabilisierter Wein}/T_Kris ^{instabiler Wein} der Grad der Weinsäurehemmung (DTI) des Weines und die Weinsäurekonzentrationen wurden, wie oben beschrieben, gemessen.
Die Konzentration der Nukleinsäuren wurde bestimmt, indem eine wohlbekannte Menge der Probe in D₂O gelöst wurde, die Nukleinsäuren wurden mittels RNase und DNase hydrolysiert, und die Konzentration der Mononukleotide wurde mittels 600 MHz NMR nach Zugabe eines geeigneten internen Standards, wie Maleinsäure, gemessen.
Bei allen Versuchen wurde ein instabiler Weißwein, Chardonnay der Ernte 2000, verwendet. Die Konzentration der Weinsäure betrug zu Beginn dieser Studie 1,92 g/l. Alle quantitativen Versuche wurden mittels NMR, wie oben beschrieben, durchgeführt. 0,500 ml Wein wurden zu 0,500 ml einer Stammlösung von D₂O zugegeben, welche etwa 5 g/l EDTA und 5,0637 g/l Maleinsäure-Dinatriumsalz als internen Standard für NMR-Messungen enthielt.
Beispiel 1a Wirkung von DNA auf die Kristallisierung von Kaliumhydrogentartrat in Wein.
Um die Auswirkung von DNA auf die Stabilisierung von Wein zu testen, wurde Herin-Sperma-DNA (Sigma) gekauft. Geringe Volumina wurden zu 10 ml von instabilem Weißwein zugegeben, um Endkonzentrationen von 0,4, 0,2, 0,1 und 0,05 g/l zu erreichen. Die Proben wurden 1 h lang bei +4°C gelagert. Nach dem Entfernen von unlöslichem Material durch 30 Minuten langes Zentrifugieren bei 3000 U/min wurden die Proben bei –4°C gelagert. Die Ergebnisse sind nachstehend dargelegt und zeigen, dass die DNA eine stabilisierende Wirkung auf diesen instabilen Weißwein hat, welcher Wein schon nach 16 Stunden bei –4°C Kristalle aufwies.
Die DNA wurde auch für Tests mit DNA-Fraktionen mit verschiedenem Molekulargewicht verwendet. 250 mg der DNA wurden in H₂O gelöst und über eine Ultra-Filtrationsmembran (Molekulargewichts-Ausschlussgrenze 10 kDA) geleitet, dem Retentat wurde zum vollständigen Entfernen von Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht zweimal Wasser zugesetzt. Das Retentat wurde gefriergetrocknet, und eine Ausbeute von 165 mg wurde erhalten, diese Fraktion wurde mit DNA-LS (large size (groß)) markiert. Das Permeat wurde über eine Membran mit einer Molekulargewicht-Ausschlussgrenze von 1 kDa geleitet. Dem Retentat wurde zweimal Wasser zugesetzt, und das Retentat wurde gefriergetrocknet. Die Ausbeute betrug 76 mg. Dieses Produkt wurde mit DNA-MS (medium size (mittelgroß)) markiert. Das Permeat wurde ebenfalls gefriergetrocknet, und eine Ausbeute von 9 mg wurde erhalten. Dieses Produkt wurde mit DNA-SS (small size (klein)) markiert. Die Niedrigmolekulargewicht-Fraktion wurde für diese Versuche nicht verwendet, weil die Ausbeute zu gering war.
Beispiel 1b DNA-MS-Fraktion (1 kDa<MW<10 kDa)
Gefriergetrocknete DNA mit einem Molekulargewicht zwischen 1 und 10 kDa wurde in Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Kleine Volumina wurden Wein, wie in Beispiel 1a beschrieben, zugesetzt.
Beispiel 1c DNA-LS-Fraktion (10 kDa < MW)
Gefriergetrocknete DNA mit einem Molekulargewicht >10 kDa wurde in Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Kleine Volumina wurden Wein, wie in Beispiel 1a beschrieben, zugesetzt.
Die Ergebnisse von Beispiel 1a–c zeigen, dass DNA eine stabilisierende Wirkung hat. Ausgezeichnete Ergebnisse werden mit DNA mit einem Molekulargewicht zwischen 1 und 10 kDa erzielt.
Beispiel 2 Wirkung von RNA auf die Kristallisation von Kaliumhydrogentartrat in Wein
Um die Wirkung von RNA bei der Stabilisierung von Wein weiter zu untersuchen, wurde RNA von Sigma gekauft (Bäckerhefe). RNA-Fraktionen wurden hergestellt, wie für DNA in Beispiel 1a beschrieben. Die Ausbeuten waren: Fraktion MW<1 kDa (RNA-SS): 30 mg, 1 kDa<MW<10 kDa (RNA-MS): 92 mg, 10 kDa<MW (RNA-LS): 105 mg.
Beispiel 2a RNA-SS-Fraktion (MW<1 kDa)
Die gefriergetrocknete RNA-Fraktion mit einem Molekulargewicht MW< 1kDa (RNA-SS) wurde in Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Die Proben wurden Wein wie in Beispiel 1a zugesetzt.
Beispiel 2b RNA-MS-Fraktion (1 kDa<MW<10 kDa)
Die gefriergetrocknete RNA-Fraktion mit einem Molekulargewicht MW<1 kDa (RNA-SS) wurde in Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Die Proben wurden Wein wie in Beispiel 1a zugesetzt.
Beispiel 2c RNA-LS-Fraktion (10 kDa<MW)
Die gefriergetrocknete RNA-Fraktion mit einem Molekulargewicht >10 kDa wurde in Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Die Proben wurden Wein wie in Beispiel 1a zugesetzt.
Die Ergebnisse von Beispiel 2a–c zeigen, dass RNA eine stabilisierende Wirkung hat. Die besten Ergebnisse werden mit RNA-Fraktionen von >10 kDa erhalten.
Beispiel 3 Herstellung und Charakterisierung eines Nukleotid-hältigen Präparates aus Hefe.
Hefezellen der Spezies Saccharomyces cerevisiae wurden aus der Nährlösung durch Zentrifugieren geerntet. Die konzentrierte Hefe-Creme wird durch Zugabe von 2% (Gew./Gew.) Natriumchlorid einer Autolyse unterzogen, wonach die Creme 40 h lang auf 52°C erhitzt wird. Während der Autolyse wird der pH-Wert durch Verwendung von Salzsäure und Natriumhydroxid auf 5,4 gehalten. Nach der Autolyse wird die übrige unlösliche Fraktion, die hauptsächlich aus der rohen Zellwandfraktion besteht, aus der Lösung durch die Verwendung einer 4-Stufen-Plattenstapel-Zentrifugen-Batterie (4-stage disk-stack centrifuge battery) getrennt. Während der Trennung wird die Feststoff-Fraktion im Gegenstrom gewaschen, um die Ausbeute der löslichen Fraktion zu optimieren. Die abgetrennte Zellwandfraktion mit einem Trockensubstanzgehalt von 12–15% Gew./Gew. wurde dem folgenden Extraktionsprozess unterzogen:

1. Die Zellwände werden in Wasser suspendiert (1:1, V/V) und zentrifugiert. Der resultierende "Kuchen" wird auf eine Konzentration von 12–15% (Gew./Vol.) in einer Lösung von 10 mM Kalium-metabisulfit und 20 mM Zitrat, das durch Zugabe von NaOH auf pH 7,0 eingestellt wird, resuspendiert.
2. Die so erhaltene Zellwand-Suspension wird 2 h lang auf 120°C erhitzt.
3. Nach dem Abkühlen wird die Suspension 10 min lang bei 10.000×g zentrifugiert.
4. Der resultierende Überstand wird auf einer Filterpresse nach Zugabe von 2% Clacel CBL3 (CECA, Frankreich) als Filterhilfe filtriert. Restliches unlösliches Material wird durch Filtern auf einer Ein-Platten-Seitz-Filterpresse, die mit einem Seitz- EKS-Filter (0,1–0,3 Mikron Ausschlussgrenze) ausgerüstet ist, entfernt.
5. Das EKS-Filtrat wird zwei aufeinander folgenden Ultra-Filtrationsschritten unterzogen, wobei zwei Membranen mit verschiedener Molekulargewicht-Ausschlussgrenze verwendet werden. Zuerst wird eine 100 kDa-Membran (Amicon, USA) verwendet, um Moleküle mit hohem Molekulargewicht zu entfernen, wobei das Retentat danach verworfen wird. Das von der 100 kDa-Membran erhaltene Filtrat wird dann auf einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 3 kDa (Amicon) konzentriert. Diafiltration mit Wasser wird verwendet, um Salze und Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht aus der Probe zu entfernen. Der endgültige Konzentrationsfaktor des Retentats ist typischerweise 10.
6. Das endgültige entsalzte Konzentrat wird lyophilisiert, um die Nukleotid-Präparat-Probe MDR1 zu ergeben. Dieses Präparat ist durch einen Gehalt von 1–1,5% RNA und 1,5–2% DNA charakterisiert.

Beispiel 3a Wirkung von MDR1 auf die Kristallisation von Kaliumhydrogentartrat in Wein.
Eine gefriergetrocknete Fraktion von MDR1 wurde in H₂O gelöst, um eine Stammlösung von 15 mg/ml zu erhalten. Kleine Volumina dieser Stammlösung wurden in 10 ml instabilen Weißwein transferiert. Auf diese Weise wurden MDR1-Endkonzentrationen von 0,6 g/l, 0,4 g/l und 0,2 g/l erhalten. Diese Proben wurden etwa 1 h lang bei +4°C gelagert, und alles unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren entfernt. Danach wurden die klaren Überstände in eine Glasphiole transferiert und bei –4°C gelagert. Die Temperatur wurde konstant zwischen –2 und –6°C gehalten. Die Proben wurden visuell auf Weinsäurekristalle überprüft. Die gelöste Weinsäurekonzentration wurde wie zuvor beschrieben bestimmt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass auch nicht vollständig gereinigte Nukleotide Wein stabilisieren.
Vergleichsbeispiel 4 Herstellung und Charakterisierung eines Nukleotid-freien Präparates
Aus MDR1 wurden auf folgende Weise alle Nukleotide entfernt: RNase wurde dem Produkt zugesetzt, der pH-Wert wurde auf 5,6 eingestellt, und die Lösung wurde 5 1/2 h lang auf 65°C erhitzt. Der pH-Wert wurde nach 2 h erneut auf 5,6 eingestellt. Die endgültige Lösung wurde über eine Ultra-Filtrationsmembran (Molekulargewicht-Ausschlussgrenze 2000) geleitet, um alle Mononukleotide zu entfernen. Das Retentat wurde gefriergetrocknet, und ein NMR-Spektrum wurde aufgezeichnet und mit dem NMR-Spektrum von MDR1 verglichen. Die Spektren zeigten, dass alle Nukleotide entfernt worden waren.
Vergleichsbeispiel 4a Wirkung eines Nukleotid-freien Präparates auf die Kristallisation von Kaliumhydrogentartrat in Wein.
Das gefriergetrocknete Produkt wurde instabilem Wein auf dieselbe Weise und in denselben Konzentrationen zugegeben, wie in Beispiel 3a beschrieben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Nukleotid-freie Präparat im Vergleich zum Nukleotid-hältigen Präparat kaum eine stabilisierende Wirkung auf Wein hat.
Beispiel 5. Langzeit-Stabilisierungs-Versuche
Eine Nukleotid-hältiges Präparat wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt. Die erhaltene Probe wurde mit MR1 bezeichnet.
Die Molekulargewichtsverteilung der Moleküle in MR1 wurde durch Größenausschluss-Chromatographie-Analyse auf einer TSK G3000SW-Säule bestimmt. Lösliche Moleküle in MR1 haben ein Molekulargewicht im Bereich von 5–50 kDa.
Der Trockensubstanzgehalt des gefriergetrockneten MR1 ist 98%. Die Analysen der nachstehend angeführten Verbindungen wurden mittels Standard-Verfahren oder wie beschrieben durchgeführt.
Der RNA-Gehalt wurde aus dem Ribose-Gehalt (6,76%) über die jeweiligen Molekulargewichte berechnet. Das Molekulargewicht eines Nukleotids in RNA ist 339 Da, und das von Ribose ist 150 Da. Daher ist der RNA-Gehalt 339/150 × 6,75 = 15%. Der Proteingehalt wurde aus dem Gesamt-Stickstoff (10,8%) berechnet, korrigiert auf den in RNA vorhandenen Stickstoff (2,2%) über (10,8–2,2)×6,25=54%.
Beispiel 5a Wirkung von MR1 auf die Kristallisation von Kaliumhydrogentartrat in einem sehr instabilen Weißwein.
Proben des Nukleotid-Präparates MR1 wurden Weinen mit unterschiedlicher Weinsäure-Instabilität (z.B. sehr instabil und instabil) zugesetzt.
Eine 75 g/l Lösung des MR1-Präparates in Wasser wurde hergestellt. Aliquots von 1, 2, 3 und 4 ml wurden zu 0,5 Liter Wein zugesetzt, um Endkonzentrationen von 150, 300, 450 bzw. 600 mg/l zu erhalten. Die Ergebnisse sind nachstehend angeführt.
Sie zeigen, dass der verwendete Weißwein sehr instabil ist (KHT-Kristalle sind schon nach eintägiger Lagerung bei –4°C beobachtbar). Nach Zugabe von 300 mg/l MR1 stieg die Zeit, die zur Detektion der Bildung von KHT-Kristallen notwendig ist, auf 43 Tage an.
Diese KHT-Instabilität dieses Weißweins ist durch eine DTI von 23% gekennzeichnet. Nach Zugabe von 450 und 600 mg/l MR1 nahm der DTI-Wert auf 16 bzw. 7% ab.
Die mit den beiden Methoden bei diesem sehr instabilen Weißwein erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass MR1 sowohl die Keimbildung von KHT-Kristallen verhindert als auch ihr Wachstum hemmt. Die behandelten Weine können als stabil angesehen werden.
Beispiel 5b Wirkung von MR1 auf die Kristallisation von Kaliumhydrogentartrat in einem instabilen Weißwein
Die Ergebnisse des instabilen Weißweines sind nachstehend angegeben.
Sie zeigen, dass dieser Weißwein instabil ist, da die KHT-Kristalle nach elftägiger Lagerung bei –4°C beobachtet werden können. Nach Zugabe von MR1 zu 450 mg/l konnten nach 120-tägiger Lagerung bei –4°C keine Kristalle nachgewiesen werden.
Die KHT-Instabilität dieses Weißweines ist durch einen DTI von 16,1 gekennzeichnet. Nach Zugabe von 450 mg/l MR1 nahm der DTI-Wert auf 4,1% ab, was zeigt, dass MR1 das Wachstum von KHT-Kristallen verhindert.
Die kombinierte Anwendung der beiden Methoden bei diesem instabilen Weißwein weist darauf hin, dass MR1 sowohl die Keimbildung von KHT-Kristallen verhindert als auch ihr Wachstum hemmt. Behandelte Weine können als stabil angesehen werden.

Claims

Verfahren zum Stabilisieren von Wein durch Verhindern oder Verzögern der Kristallisation von Salzen von Weinsäure, welches Verfahren die Zugabe eines Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Präparates zum Traubenmost oder zum Wein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat auch Hefe-Zellwand-Komponenten oder Teile davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Hefe-Zellwand-Komponente ein Mannoprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat von Bakterien, Pilzen oder Hefen stammt.
Verfahren nach den Ansprüche 1 bis 4, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat von den Hefen Saccharomyces oder Kluyveromyces stammt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat von Saccharomyces cerevisiae stammt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat zum Erhalt von Nukleinsäure-Endkonzentrationen zwischen 1 und 400 mg pro Liter Most oder Wein zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, wobei das Oligonukleotid oder Polynukleotid DNA, RNA oder eine Kombination von beiden ist.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, wobei das Oligonukleotid oder Polynukleotid ein Molekulargewicht zwischen 0,4 und 500 kDa hat, wie mittels Größenausschluss-Chromatographie (SEC) unter Verwendung einer Säule, die mit Protein-Molekulargewicht- Standards geeicht ist, bestimmt.
Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Präparates nach den Ansprüchen 1 bis 9, welches Verfahren umfasst: ❿ 40-stündige Autolyse von Hefezellen bei pH 5,4, 52°C, ❿ gefolgt von der Trennung der Zellwand-hältigen Fraktion durch Zentrifugieren derart, dass ein Trockensubstanzgehalt von 12–15% der Zellwand-hältigen Fraktion erreicht wird, ❿ gefolgt von der Zugabe von Puffer zum Erhalt einer Lösung mit einem pH-Wert von 7, ❿ gefolgt von einem zweistündigen Hitzeschock bei 120°C, ❿ gefolgt von Zentrifugieren, bei welchem der Großteil des unlöslichen Materials entfernt wird, ❿ gefolgt von Filtrieren zur Klärung der Flüssigkeit/Nährlösung, ❿ gefolgt von Ultra-Filtrieren der geklärten Flüssigkeit zum Erhalt einer Fraktion mit einem Molekulargewicht zwischen 3 und 100 kDa und einem Konzentrationsfaktor von etwa 10.
Verwendung eines Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältigen Präparates zur Stabilisierung von Wein.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat verwendet wird, um die Kristallisation von Weinsäure-Salzen zu verhindern oder zu verzögern.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat von Bakterien, Pilzen oder Hefen stammt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Hefe Brettanomyces, Saccharomyces oder Kluyveromyces ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 15, wobei das Oligonukleotid- oder Polynukleotid-hältige Präparat zwischen 0,1 und 100% Nukleinsäure enthält.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 16, wobei die Nukleinsäure DNA, RNA oder eine Kombination von beiden ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 17, wobei das Oligonukleotid oder Polynukleotid ein Molekulargewicht zwischen 0,4 und 500 kDa hat, wie mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung einer Säule, die mit Protein-Molekulargewicht-Standards geeicht ist, bestimmt.