DE60000796T2

DE60000796T2 - Reinigung von Lipstatin

Info

Publication number: DE60000796T2
Application number: DE60000796T
Authority: DE
Inventors: Stephan Doswald; Ernst Kupfer; Gerhard Steinbauer; Erich Steinwender
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2003-09-18
Anticipated expiration: 2020-01-22
Also published as: ES2185523T3; KR100336237B1; ATE228118T1; CA2296996C; CA2296996A1; KR20000076556A; DK1028115T3; EP1028115B1; CN1266058A; CN100363354C; US6156911A; JP3445209B2; EP1028115A1; JP2001039962A; DE60000796D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Lipstatin. Genauer betrifft diese Erfindung ein Verfahren, bei dem eine flüssig-flüssig Extraktion in Form einer Doppelstrom-Extraktion mit einer Rückextraktion in Form einer Gegenstrom-Extraktion kombiniert wird, um Lipstatin aus rohem Lipstatin in besonders hoher Ausbeute und Reinheit zu isolieren.
Lipstatin ist als wichtigstes Zwischenprodukt bei der Herstellung von Tetrahydrolipstatin (THL, Orlistat) von großer Bedeutung, das hilfreich ist bei der Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten, die mit Fettleibigkeit in Verbindung stehen.
Lipstatin, ein Fermentationsverfahren für seine Herstellung, ein Verfahren für seine Isolierung aus Mikroorganismen und ein Verfahren für seine Hydrierung zu Tetrahydrolipstatin sind bekannt und zum Beispiel im U.S. Patent Nr. 4,598,089 beschrieben.
Lipstatin wird durch folgende Formel veranschaulicht:
Ein Verfahren zur Herstellung von rohem Lipstatin wurde auch in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 96106598 beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die aerobe Kultivierung eines Mikroorganismus der Art Aktinomyzetes, zum Beispiel Streptomyces toxytricini, wobei Lipstatin in wässrigem Medium hergestellt wird, das im Wesentlichen frei ist von Fetten und Ölen und das geeignete Kohlenstoff und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, solange, bis die anfängliche Wachstumsphase im Wesentlichen beendet ist und genügend Zellmasse hergestellt wurde. Dann wird Linolsäure zusammen mit einem Antioxidationsmittel und gegebenenfalls zusammen mit Caprylsäure und N-Formyl-L-leucin oder bevorzugt L-Leucin zum Nährmedium gegeben. Nachdem die Fermentation abgeschlossen ist, wird das Fermentationsnährmedium extrahiert. Das hergestellte rohe Lipstatin kann weiter angereichert und gereinigt werden, zum Beispiel durch chromatographische Verfahren, wie in U.S. Patent Nr. 4,598,089 beschrieben.
Vorschriften für mehrstufige chromatographische Verfahren oder flüssig-flüssig Extraktionen, um Lipstatin anzureichern, in Kombination mit einer mehrstufigen Chromatographie, um reines Lipstatin zu erhalten, kennzeichnen den Stand der Technik bei den Verfahren zur Reinigung von rohem Lipstatin. Diese Verfahren werden normalerweise bei der Isolierung von Fermentationsmetaboliten im Labormaßstab angewendet. Jedoch sind diese Verfahren im Allgemeinen nicht für ein wissenschaftliches Verfahren im großem Maßstab geeignet.
Versuche, rohes Lipstatin durch Destillation zu reinigen, schlugen fehl. Lipstatin ist für einige Stunden bei 60ºC stabil, aber wegen seines niedrigen Dampfdrucks (7 · 10&supmin;&sup7; mbar) ist eine Vakuumdestillation (< 2 mbar) bei dieser Temperatur nicht durchführbar. Bei höherer Temperatur zersetzt sich Lipstatin unter Abgabe von Kohlendioxid.
Rohes Lipstatin kann auch durch Kristallisierung von Lipstatin bei Temperaturen unter -20ºC gereinigt werden. Jedoch ist dafür eine teure technische Ausrüstung zur Niedrigtemperatur-Kristallisierung notwendig und die Ausbeute dieser Kristallisierung hängt stark von der Qualität des rohen Lipstatins ab. Insbesondere bei rohem Lipstatin von niedriger Qualität ist die erhaltene Ausbeute von Lipstatin bei Kristallisierung niedrig.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues, einfaches und nicht teures Verfahren zur Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin in hoher Ausbeute und Reinheit bereit, sogar bei niedriger Qualität des Rohmaterials.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin umfasst eine
a) flüssig-flüssig Extraktion von Lipstatin aus einem nicht-polaren Lösungsmittel, ausgewählt aus einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, in ein polares Lösungsmittel, ausgewählt aus einer Carbonsäure, einem Alkohol, einem O-monosubstituierten Mono- oder Oligoethylenglycol, einem Diol oder einem dipolaren, aprotischen Lösungsmittel, gefolgt von
b) Verdünnen der polaren Lösungsmittelphase mit Wasser oder Ändern des Phasenverhältnisses und Rückextraktion von Lipstatin in ein frisches, nicht-polares Lösungsmittel.
Die folgenden Definitionen werden angegeben, um die Bedeutung und den Umfang der verschiedenen Ausdrücke, die hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet werden, zu veranschaulichen und zu definieren.
Der Ausdruck 'Doppelstrom-Extraktion' bedeutet eine Gegenstrom-Extraktion unter Verwendung von zwei Lösungsmitteln. Die Extraktion wird wie in der folgenden Abbildung gezeigt durchgeführt:
Zwei Lösungsmittel, deren gegenseitige Löslichkeit ineinander gering ist, werden am Kopf und am Boden der Extraktionseinheit eingefüllt. Das aufzutrennende Gemisch (Beschickung) kann irgendwo eingefüllt werden, außer in Kombination mit dem Waschlösungsmittel, bevorzugt in der Mitte der Extraktionseinheit. In der vorstehend aufgeführten Abbildung wird die Extraktion in der Form durchgeführt, dass das Extraktionslösungsmittel bzw. der Extrakt das Lösungsmittel mit der höheren Dichte (schwere Phase) und das Waschlösungsmittel bzw. das Raffinat das Lösungsmittel mit der niedrigeren Dichte (leichte Phase) enthalten.
Der Ausdruck 'Gegenstrom-Extraktion' bedeutet, dass der zu extrahierende Stoff (Beschickung) zusammen mit einem der verwendeten Lösungsmittel zugegeben wird. In diesem Fall ist die Abtrennung von Verunreinigungen von der zu reinigenden Verbindung nicht so effektiv, wie im Falle einer Doppelstrom-Extraktion, da der Waschbereich weggelassen wird.
Die Gegenstrom-Extraktion wird wie in der folgenden Abbildung gezeigt durchgeführt:
Ein Lösungsmittel, zusammen mit der Beschickung, und ein anderes Lösungsmittel, mit geringer gegenseitiger Löslichkeit ineinander, werden am Kopf und am Boden der Extraktionseinheit eingefüllt. An einem Ausgang verlässt das Extraktionslösungsmittel, das mit dem gewünschten Stoff angereichert ist, die Säule (Extrakt). Am anderen Ausgang verlässt das Lösungsmittel, das zum Einfüllen der Beschickung verwendet wurde und das an gewünschtem Stoff (Raffinat) verarmt ist, die Säule. In der vorstehend aufgeführten Abbildung ist die Extraktion in der Form dargestellt, dass die Beschickung bzw. das Raffinat das Lösungsmittel mit der höheren Dichte (schwere Phase) und das für die Extraktion verwendete Lösungsmittel bzw. der Extrakt das Lösungsmittel mit der niedrigeren Dichte (leichte Phase) enthalten.
Der Ausdruck 'rohes Lipstatin' bedeutet das Rohprodukt, das Lipstatin und Verunreinigungen enthält und das aus einem Fermentationsverfahren nach Abtrennen der Zellmasse, Extrahieren und Aufkonzentrieren erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem zwei flüssig-flüssig Extraktionen kombiniert werden, um Lipstatin aus rohem Lipstatin in hoher Reinheit und in praktisch quantitativer Ausbeute zu isolieren.
Im Allgemeinen umfasst das Verfahren zur Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin eine flüssig-flüssig Extraktion von Lipstatin aus einem nicht-polaren Lösungsmittel, ausgewählt aus einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, in ein polares Lösungsmittel, ausgewählt aus einer Carbonsäure, einem Alkohol, einem O-monosubstituierten Mono- oder Oligoethylenglycol, einem Diol oder einem dipolaren, aprotischen Lösungsmittel, gefolgt von Verdünnen der polaren Lösungsmittelphase mit Wasser oder Ändern des Phasenverhältnisses und Rückextraktion von Lipstatin in ein frisches, nicht-polares Lösungsmittel.
Die flüssig-flüssig Extraktionen werden in den folgenden Lösungsmittelsystemen durchgeführt: Das nicht-polare Lösungsmittel wird ausgewählt aus einem aliphatischen oder einem aromatischen Kohlenwasserstoff. Bevorzugte aliphatische Kohlenwasserstoffe sind C&sub5;-C&sub8; aliphatische Kohlenwasserstoffe; mehr bevorzugt sind C&sub6;-C&sub7; aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan oder Heptan. Aromatische Kohlenwasserstoffe können ausgewählt sein aus Benzol, gegebenenfalls substituiert mit 1 bis 3 Methylgruppen. Bevorzugte aromatische Kohlenwasserstoffe sind Benzol und Toluol.
Das polare Lösungsmittel kann ausgewählt sein aus Carbonsäuren, zum Beispiel Ameisensäure oder C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbonsäuren, wie Essigsäure oder Propionsäure, oder C&sub1;-C&sub3; Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol, oder O-monosubstituierten Mono- oder Oligoethylenglycolen, wie Ethylenglycolmonomethylether oder C&sub2;-C&sub3; Diolen, wie Ethandiol oder 1,3-Propandiol, oder Furfuryl- oder Tetrahydrofurfurylalkohol. Ein dipolares aprotisches Lösungsmittel umfasst Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Sulfolan, Nitromethan usw. Bevorzugte polare Lösungsmittel sind in Wasser lösliche organische Carbonsäuren, Alkohole oder O-monosubstituierte Mono- oder Polyethylenglycole, zum Beispiel Essigsäure, Methanol oder Ethylenglycolmonomethylether, besonders bevorzugt ist Essigsäure.
Das polare Lösungsmittel kann entweder direkt verwendet werden, oder als ein Gemisch mit Wasser.
Im ersten Extraktionsschritt werden die nicht-polaren Verunreinigungen und im zweiten Extraktionsschritt die polaren Verunreinigungen aus rohem Lipstatin entfernt. Eine Extraktion von Lipstatin in ein polares Lösungsmittel hat die Entfernung von nicht-polaren Verunreinigungen und eine Extraktion von Lipstatin in ein nicht-polares Lösungsmittel hat die Entfernung von polaren Verunreinigungen zur Folge.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die gleichen Lösungsmittel in beiden Extraktionen verwendet. Der ersten Extraktion folgt ein zweiter Schritt, umfassend Verdünnen des polaren Lösungsmittels mit Wasser oder Ändern des Phasenverhältnisses, um die Verteilung von Lipstatin zu verändern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erste Extraktion in einer Art und Weise durchgeführt, dass Lipstatin in ein polares Lösungsmittel extrahiert wird, gefolgt von Rückextraktion von Lipstatin aus diesem polaren Lösungsmittel mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, bevorzugt mit dem gleichen nicht-polaren Lösungsmittel, das im ersten Extraktionsschritt verwendet wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die flüssig-flüssig Extraktion des ersten Schritts dadurch gekennzeichnet, dass das polare Lösungsmittel etwa 1 bis etwa 20% Wasser, mehr bevorzugt etwa 5% Wasser enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das nicht-polare Lösungsmittel ein aliphatischer Kohlenwasserstoff. Besonders bevorzugt ist Heptan.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die flüssig-flüssig Extraktion des ersten Schritts als Doppelstrom-Extraktion durchgeführt und Lipstatin wird in das polare Lösungsmittel extrahiert. Die Beschickung ist rohes Lipstatin, das durch eines der verwendeten Lösungsmittel verdünnt werden kann. Lipstatin wird in die polare (schwere) Phase extrahiert; nicht-polare Verunreinigungen, wie Fettsäuren oder Glyceride verbleiben in der nicht-polaren (leichten) Phase. Da die Verteilungskoeffizienten von Lipstatin und den Verunreinigungen von den Konzentrationen abhängen, müssen das Phasenverhältnis der beiden Lösungsmittel, die Anzahl der theoretischen Stufen des Extraktionssystems und das Verhältnis von Beschickung zu den Lösungsmitteln in einer geeigneten Weise angepasst werden (Lo, TC, Bairds, MHI, Hafez, M, Hanson, C (1983): Handbook of solvent extraction. Wiley, New York). Die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten von der Konzentration variiert stark mit der Art des polaren Lösungsmittels, das in diesem Extraktionssystem verwendet wird. Mit wässriger Essigsäure erreicht man sehr gute Ergebnisse, wobei hohe Konzentrationen und deshalb ein hoher Durchsatz und ein Minimum an verwendetem Lösungsmittel erreicht werden können.
Die Extraktion kann entweder unter Verwendung einer kontinuierlichen Extraktionseinrichtung, wie eines Mischer-Abscheider-Systems, oder einer Extraktionssäule, wie einer Extraktionsvorrichtung mit Pulsationsboden oder einer Kolonne mit Rührvorrichtung, durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das polare Lösungsmittel vor der Rückextraktion (der zweite Schritt der Reinigung) durch Zugabe von Wasser auf ungefähr 70% bis 90%, bevorzugt auf etwa 80% verdünnt.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Rückextraktion im zweiten Reinigungsschritt als Gegenstrom-Extraktion durchgeführt und Lipstatin wird in ein nicht-polares Lösungsmittel extrahiert. In diesem Fall kann der Extrakt der ersten Extraktion direkt verwendet werden. Im Gegensatz zu einer Doppelstrom-Extraktion, bei der eine konzentrierte Lipstatin-Beschickung erforderlich ist, ist in diesem Fall, in dem die zweite Extraktion als eine Gegenstrom-Extraktion als ein kontinuierliches Verfahren durchgeführt wird, kein Aufkonzentrieren von Lipstatin nach der ersten Extraktion notwendig. Lipstatin wird in die nicht-polare (leichte) Phase extrahiert und die polaren Verunreinigungen verbleiben in der polaren (schweren) Phase.
Während der Fermentation werden mehrere Aminosäureanaloga von Lipstatin gebildet. Lipstatin selber enthält N-Formyl-(S)-leucin als eine Seitenkette, wogegen die Nebenprodukte andere N-Formyl-Aminosäuren enthalten. Eines dieser Nebenprodukte ist das methionin-analoge Lipstatin. Rohes Lipstatin enthält, relativ zu Lipstatin, bis zu 3% dieses Nebenproduktes. Bei der Reinigung von Lipstatin ist es von großer Bedeutung, diese Verunreinigung zu entfernen.
Ansonsten würde durch diese Schwefel enthaltende Verbindung eine später durchgeführte Hydrierung gehemmt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Reinigung von rohem Lipstatin weiter verbessert, wenn das methionin-analoge Lipstatin in rohem Lipstatin vor der Extraktion oxidiert wird. Es ist nicht möglich das methionin-analoge Lipstatin direkt durch Reinigung über Kristallisierung oder Extraktion aus Lipstatin zu entfernen, außer nach einer Oxidation zum entsprechenden Sulfoxid oder Sulfon. Diese Oxidation kann über ein herkömmliches Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel über die Verwendung von Peressigsäure in Essigsäure. Das methionin-analoge Lipstatin kann entweder zum Sulfoxid oder zum Sulfon oxidiert werden:
Das Oxidationsmittel wird in äquimolarer Menge, oder in einer Menge von bis zu 1,5 Äquivalenten zu methionin-analogem Lipstatin verwendet, wenn das Sulfoxid benötigt wird oder es wird in der doppelten Menge verwendet, wenn das Sulfon benötigt wird. Ein größerer Überschuss sollte vermieden werden, um Lipstatin vor oxidativem Abbau zu schützen. Die Oxidation wird bei 0º bis 50ºC durchgeführt, bevorzugt bei Raumtemperatur; die Umsetzung ist in wenigen Minuten abgeschlossen. Das bei der Oxidation verwendete Lösungsmittel ist nicht kritisch und bevorzugt wird auch bei der Oxidation eines der Lösungsmittel verwendet, die während des Extraktions-Reinigungsverfahrens verwendet werden. Das methionin-analoge Lipstatin kann entweder im rohen Lipstatin oder nach dem ersten Extraktions-Reinigungsschritt oxidiert werden. Bevorzugt wird die Oxidation mit rohem Lipstatin in einer Heptanlösung von hoher Konzentration durchgeführt und das dabei erhaltene Gemisch wird als Beschickung für den ersten Extraktions-Reinigungsschritt verwendet. Das oxidierte methionin-analoge Lipstatin ist eine polare Verunreinigung und wird während der zweiten Extraktion entfernt, wobei es in der polaren Phase verbleibt.
Gemäß dem Unterschied zwischen den Verteilungskoeffizienten von Lipstatin und oxidiertem methionin-analogem Lipstatin ist es ausreichend, dass der zweite Extraktionsschritt als eine Gegenstrom-Extraktion durchgeführt wird, bei der der Extrakt aus dem ersten Extraktionsschritt direkt nach der Zugabe von Wasser verwendet wird, wenn bei der Reinigung durch Extraktion das System 'wässrige Essigsäure/Heptan' verwendet wird. Deshalb wird in der am meisten bevorzugten Ausführungsform eine Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin durch Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan, gefolgt von Verdünnen der Lipstatinlösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure und Gegenstrom- Extraktion der Lösung mit Heptan erreicht. Gereinigtes Lipstatin kann dann aus Heptan durch Aufkonzentrieren oder Kristallisierung isoliert werden. Dieses bevorzugte Verfahren ist in der folgenden Figur veranschaulicht:
Wie vorstehend ausgedrückt, kann Lipstatin, das über jedes der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt worden sein kann, durch Hydrierung in Tetrahydrolipstatin (Orlistat) umgewandelt werden. Die Hydrierung von Lipstatin kann gemäß Verfahren durchgeführt werden, die an sich bekannt sind, zum Beispiel, in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, wie im U.S. Patent Nr. 4,598,089 beschrieben. Beispiele für Katalysatoren, die verwendet werden können, sind Palladium/Kohle, Platinoxid, Palladium und dergleichen. Das Lösungsmittel, das zur Hydrierung verwendet wird, ist nicht kritisch. Das am stärksten bevorzugte Lösungsmittel ist jenes, das im letzten Extraktionsschritt verwendet wurde. In diesem Fall wird der Lipstatin enthaltende Extrakt direkt oder nach Aufkonzentrieren zur Hydrierung verwendet.
Andere geeignete Lösungsmittel sind zum Beispiel niedere Alkohole, wie zum Beispiel Methanol und Ethanol, Ether, wie tert.-Butylmethylether oder Tetrahydrofuran, Essigsäure oder halogenierte Lösungsmittel, wie Dichlormethan. Die Hydrierung wird bevorzugt bei niedrigen Wasserstoffdrucken und bei Raumtemperatur durchgeführt. Dem entsprechend umfasst die vorliegende Erfindung auch die vorstehend aufgeführten Extraktionsverfahren, gefolgt von der Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin. Bevorzugt wird die Umsetzung mit einem Hydrierkatalysator, der ein Edelmetall enthält, bei 25ºC bei niedrigem Wasserstoffdruck, zum Beispiel 0,5 bis 5 bar, durchgeführt.
Tetrahydrolipstatin kann durch Kristallisierung gereinigt und isoliert werden. Bevorzugt wird ein nicht-polares Lösungsmittel, wie Hexan oder Heptan, zur Hydrierung und Kristallisierung verwendet.
Zusammengefasst bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, wie vorstehend definiert, umfassend
a) Oxidation von methionin-analogem Lipstatin
b) Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan;
c) Verdünnen der Lipstatinlösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure; und
d) Gegenstrom-Extraktion dieser Lösung mit Heptan.
Nach diesem Verfahren kann eine Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin durchgeführt werden, gegebenenfalls gefolgt von Kristallisierung von Tetrahydrolipstatin.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung von Tetrahydrolipstatin, umfassend
a) Oxidation von methionin-analogem Lipstatin
b) Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan;
c) Verdünnen der Lipstatinlösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure; und
d) Gegenstrom-Extraktion dieser Lösung mit Heptan, gefolgt von
e) Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin.
Außerdem bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der vorstehend aufgeführten Verfahren zur Herstellung von Lipstatin und Tetrahydrolipstatin.
Die folgenden Beispiele sollen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen, es ist aber nicht beabsichtigt mit diesen Beispielen den Bereich der Erfindung einzuschränken.

BEISPIELE

BEISPIEL 1:

Rohes Lipstatin aus einer Fermentation wurde nach der Abtrennung der Biomasse und nach der Extraktion aufkonzentriert. Das verwendete Material enthielt 58% (w/w) Lipstatin (HPLC- Analyse) und 0,9% (w/w) methionin-analoges Lipstatin (¹H-NMR-Analyse).
a. Oxidation von methionin-analogem Lipstatin: 55,7 g rohes Lipstatin werden mit 77 ml Heptan verdünnt. 212 ul einer 37%igen Lösung von Peressigsäure in Essigsäure wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt.
b. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/95% wässrige Essigsäure: Zur Simulierung einer Extraktionsvorrichtung mit 7 Trennstufen wurden 7 Scheidetrichter verwendet.
Das Gemisch das aus dem Oxidationsverfahren, das in a beschrieben wird, erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt und der vierte Scheidetrichter (sf-4, 4th separatory funnel) wurde mit jedem Anteil beschickt. Beginnend mit der sf-4-Beschickung, wurden 50 ml Heptan und 100 ml 95%ige wässrige Essigsäure zugegeben, was gleichbedeutend ist mit einem Phasenverhältnis von Heptan/wässrige Essigsäure von 1/2. Das Gemisch wurde geschüttelt und die Phasen voneinander getrennt. Die obere Phase wurde in den nächsten und die untere Phase in den vorherigen Scheidetrichter überführt. Am Anfang wurden frische Lösungsmittel verwendet, die Schritt für Schritt mit den Phasen aus dem vorherigen und dem nächsten Scheidetrichter ersetzt wurden. Als alle Scheidetrichter auf diese Art und Weise gefüllt worden waren, wurde Heptan nur in den ersten Scheidetrichter und wässrige Essigsäure nur in den siebten Scheidetrichter gegeben. Der Lipstatin enthaltende Extrakt wurde gesammelt. Im Raffinat wurde das Lipstatin über Dünnschichtchromatographie kontrolliert, um seinen Gehalt unter einem Gramm pro Liter zu halten, und um das vorher berechnete Phasenverhältnis und die Konzentration zu überwachen.
Als mit dem ganzen rohen Lipstatin beschickt worden war, wurden solange beide, unbeladene Lösungsmittel zugefügt, bis das ganze Lipstatin aus dem System ausgewaschen war. Die folgende Abbildung veranschaulicht diese Extraktion:
Der Extrakt wurde durch Abdestillieren von Lösungsmittel unter verringertem Druck auf ein Volumen von etwa 600 ml aufkonzentriert. Der Wassergehalt, bestimmt nach dem Karl-Fischer- Verfahren, war 3,5%.
c. Gegenstrom-Extraktion: Zur Simulierung einer Extraktionsvorrichtung mit 7 Trennstufen wurden wieder 7 Scheidetrichter verwendet.
Der Extrakt, der in b. (600 ml) erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt (jeweils 100 ml) und jeder Anteil wurde zusammen mit 30 ml Wasser in den siebten Scheidetrichter eingefüllt. 130 ml Heptan wurden in den ersten Scheidetrichter gegeben. Die Extraktion wurde als Simulierung eines kontinuierlichen Verfahrens, ähnlich wie unter Punkt b) durch Überführung der oberen Phase in den folgenden und der unteren Phase in den vorherigen Scheidetrichter, durchgeführt. Im Raffinat wurde das Lipstatin über Dünnschichtchromatographie kontrolliert, um seinen Gehalt unter einem Gramm pro Liter zu halten, und um das vorher berechnete Phasenverhältnis und die Konzentration zu überwachen. Als mit der ganzen Extraktlösung aus dem ersten Extraktionsschritt beschickt worden war, wurden solange beide Lösungsmittel zugefügt, bis das ganze Lipstatin aus dem System ausgewaschen war. Die folgende Abbildung veranschaulicht diese Extraktion:
Das gereinigte Lipstatin in Heptan (Extrakt) wurde gesammelt und unter verringertem Druck auf ein Volumen von 250 ml aufkonzentriert. Diese Lösung enthielt 35,3 g gereinigtes Lipstatin mit einer Reinheit von 90% (w/w) (HPLC). Dies ist gleichbedeutend mit 98% Ausbeute, berechnet auf den Gehalt von Lipstatin im gereinigten Produkt, in Bezug auf Lipstatin im Rohprodukt.
d. Hydrierung: Die 250-ml-Lösung von gereinigtem Lipstatin wurde in einem Edelstahlautoklaven bei 25ºC, bei einem Druck von 5 bar, für insgesamt 6 Stunden, mit 3,5 g 5% Palladium auf Aktivkohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde in 700 ml Heptan aufgelöst und das Tetrahydrolipstatin wurde bei 0ºC kristallisiert. Das Produkt wurde abfiltriert, mit kaltem Heptan gewaschen und im Vakuum bei 25ºC getrocknet. 28 g Tetrahydrolipstatin von 96%iger (w/w) Reinheit (HPLC) wurden erhalten. Dies ist gleichbedeutend mit 85% Ausbeute, bezogen auf Lipstatin im gereinigten Produkt. Die Reinheit von Tetrahydrolipstatin, nach Umkristallisierung in Hexan, war 97% (w/w, bestimmt über HPLC).

BEISPIEL 2:

Ein siebenstufiges Mischer-Abscheider-System wurde zur kontinuierlichen Extraktion mit den selben Lösungsmitteln, die in Beispiel 1 verwendet wurden, verwendet.
Das verwendete aufkonzentrierte, rohe Lipstatin hatte eine Reinheit von 65% (w/w) und enthielt 0,14% (w/w) methionin-analoges Lipstatin.
a. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/95% wässrige Essigsäure: 100 kg rohes Lipstatin wurden mit 100 kg Heptan verdünnt und diese Lösung wurde als Beschickung verwendet. Der Mischer-Abscheider wurde mit Heptan und 95%iger wässriger Essigsäure in einem Phasenverhältnis von 1/2 (v/v) gefüllt. Zur Reinigung durch Extraktion wurde mit 37,5 Liter Heptan pro Stunde, 75 Liter 95%ige wässrige Essigsäure pro Stunde und 15 Liter Lösung von rohem Lipstatin pro Stunde beschickt. Heptan wurde in den ersten, die Lipstatinlösung in den vierten und die wässrige Essigsäure in den siebten Mischer gegeben. Der Lipstatin enthaltende Extrakt und das die nicht-polaren Verunreinigungen enthaltende Raffinat wurden gesammelt. Der Gehalt von Lipstatin im Raffinat wurde über Dünnschichtchromatographie kontrolliert, um seine Menge unter einem Gramm pro Liter zu halten. Nach der Beschickung mit dem ganzen rohen Lipstatin, wurde mit der Beschickung mit den beiden Lösungsmitteln fortgefahren, bis alles Lipstatin ausgewaschen war. Eine Probe des Extrakts (untere Phase) wurde aufkonzentriert und hatte eine Reinheit an Lipstatin von 71% (w/w). Insgesamt wurden 1500 kg Extrakt erhalten, wobei der Wassergehalt 4,6% (Karl-Fischer-Verfahren) war.
b. Oxidation von methionin-analogem Lipstatin: Zur Extraktlösung der vorherigen Extraktion wurden 60 ml einer Lösung von 37%iger Peressigsäure in Essigsäure zugegeben und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
c. Gegenstrom-Extraktion: 280 Liter Wasser wurden zugegeben, um einen Wassergehalt von 20% einzustellen. Um eine ölige Phase von Lipstatin nach der Zugabe von Wasser abzutrennen, wurde diese Lösung mit 600 Liter Heptan extrahiert. Dieser Extrakt wurde abgetrennt und später zur Heptanphase der kontinuierlichen Extraktion zugegeben.
Für die später durchgeführte kontinuierliche Extraktion der verbleibenden Lösung von Lipstatin in wässriger Essigsäure wurde der selbe Mischer-Abscheider verwendet wie bei der ersten Extraktion. Die kontinuierliche Extraktion wurde durch Beschickung des ersten Mischers mit 50 Liter Heptan pro Stunde und durch Beschickung des siebten Mischers mit 50 Liter Lösung von Lipstatin in wässriger Essigsäure pro Stunde durchgeführt. Der Heptanextrakt wurde zu dem vorher erhaltenen Extrakt gegeben und diese Lösung wurde auf ein Volumen von ungefähr 1000 Liter, durch Abdestillieren von Lösungsmittel unter verringertem Druck, aufkonzentriert. Eine Probe wurde bis zur Trockene aufkonzentriert, wobei Lipstatin mit 86% (w/w) Reinheit erhalten wurde.
d. Hydrierung: Die erhaltene Lösung wurde in drei Chargen von gleicher Größe hydriert. Die Hydrierung wurde in einem Rührhydrierkessel mit Glasfutter durchgeführt. Für eine Charge wurden 2 kg 5% Palladium auf Aktivkohle verwendet. Die Hydrierung war nach einer Stunde abgeschlossen; Der Wasserstoffdruck erreichte 5 bar. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat wurde durch Abdestillieren des Lösungsmittels aufkonzentriert. Eine getrocknete Probe des Produkts enthielt 90% (w/w) Tetrahydrolipstatin (die Qualität ist höher, als die von gereinigtem Lipstatin, da Lipstatin 'umwandelbare' Nebenprodukte von Isomeren mit verschiedenen Stellungen von C=C Doppelbindungen oder mit nur einer C=C Doppelbindung enthält, die nach der Hydrierung auch in Tetrahydrolipstatin umgewandelt sind). 600 kg Heptan wurden zugefügt und Tetrahydrolipstatin wurde bei 0ºC kristallisiert. Das Produkt wurde abfiltriert, mit kaltem Heptan gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet.
In einer Charge erhielt man 17 kg Tetrahydrolipstatin mit 97%iger (w/w) Reinheit. Dies ist gleichbedeutend mit einer Ausbeute von 76% von Tetrahydrolipstatin, bezogen auf Lipstatin in rohem Lipstatin.

BEISPIEL 3:

Rohes Lipstatin aus einer Fermentation wurde nach der Abtrennung der Biomasse und nach der Extraktion aufkonzentriert. Das Material enthielt 62% (w/w) Lipstatin und 0,1% (w/w) methionin-analoges Lipstatin.
a. Oxidation von methionin-analogem Lipstatin: 53 g rohes Lipstatin wurden mit 75 ml Heptan verdünnt. 24 ul einer 37%igen Lösung von Peressigsäure in Essigsäure wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt.
b. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/10% wässrigem Methanol: Das selbe System, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestehend aus sieben Scheidtrichtern, wurde zur Simulierung einer kontinuierlichen Extraktion verwendet. Das Gemisch das aus dem Oxidationsverfahren, das in a beschrieben wird, erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt und der vierte Scheidetrichter wurde mit jedem Anteil beschickt. 100 ml Heptan wurden in den ersten und 10 ml 10%iges wässriges Methanol wurden in den siebten Scheidetrichter eingefüllt, was gleichbedeutend ist mit einem Phasenverhältnis von Heptan/wässrigem Methanol von 10/1. Der Extrakt (obere Phase, Lipstatin in Heptan) wurde gesammelt. Als mit dem ganzen rohen Lipstatin beschickt worden war, wurden solange die beiden, frischen Lösungsmittel zugegeben, bis das ganze Lipstatin ausgewaschen war. Der Extrakt wurde durch Abdestillieren des Lösungsmittels unter verringertem Druck auf ein Volumen von 110 ml aufkonzentriert.
c. Zusätzliche Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/10% wässrigem Methanol: Die Lösung, die aus der vorstehenden Extraktion erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt. Mit dem selben System von sieben Scheidetrichtern, wie zuvor verwendet, wurde die selbe Art der Extraktion durchgeführt, aber mit einem unterschiedlichen Phasenverhältnis. Jeder Anteil der Beschickung wurde in den vierten Scheidetrichter eingefüllt. 100 ml Heptan wurden in den ersten und 100 ml 10%iges wässriges Methanol wurden in den siebten Scheidetrichter eingefüllt, was gleichbedeutend ist mit einem Phasenverhältnis von Heptan/wässrigem Methanol von 1/1. Der Extrakt (untere Phase, Lipstatin in wässrigem Methanol) wurde gesammelt. Als mit dem ganzen rohen Lipstatin beschickt worden war, wurden solange die beiden, frischen Lösungsmittel zugegeben, bis das ganze Lipstatin ausgewaschen war. Der Extrakt wurde durch Abdestillieren von Lösungsmittel unter verringertem Druck auf ein Volumen von 250 ml aufkonzentriert.
d. Chargenweises Extrahieren von Lipstatin in Heptan: Wasser wurde zur Extraktlösung, die aus c) erhalten wurde, zugefügt, um einen Wassergehalt von 50% einzustellen. Das Gemisch wurde zweimal mit jeweils 600 ml Heptan extrahiert. Der Extrakt wurde durch Abdestillieren von Lösungsmittel aufkonzentriert. Es wurden 34 g Lipstatin mit 86%iger (w/w) Reinheit erhalten. Dies ist gleichbedeutend mit einer Ausbeute von 89%, berechnet auf den Gehalt von Lipstatin im gereinigten Produkt, bezogen auf Lipstatin im Rohprodukt.
e. Hydrierung: Die Hydrierung und die Kristallisierung wurden ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt. Tetrahydrolipstatin wurde mit 97%iger Reinheit (w/w) in einer Ausbeute, bezogen auf Lipstatin im gereinigten Produkt, von 90% erhalten.

BEISPIEL 4:

Unter Verwendung des selben Aufbaus einer siebenstufigen Extraktion, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde rohes Lipstatin, aus der selben Charge wie in Beispiel 3, gereinigt. Alternativ dazu wurden 10%iger wässriger Ethylenglycolmonomethylether und Heptan als Lösungsmittel verwendet. Die Konzentrationen und Phasenverhältnisse blieben, verglichen mit Beispiel 3, unverändert. Eine Probe von Lipstatin nach der Reinigung hatte einen Gehalt von 80% (w/w). Die Hydrierung und die Kristallisierung von Tetryhydrolipstatin wurden, wie in den früheren Beispielen beschrieben, durchgeführt. Tetrahydrolipstatin wurde mit einer Reinheit von 96% (w/w) erhalten.

BEISPIEL 5:

Rohes Lipstatin mit einem Gehalt von 55% (w/w) Lipstatin und 0,6% (w/w) methioninanalogem Lipstatin wurde an einer Rühr-Kuehni-Säule gereinigt.
a. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/95% wässrige Essigsäure: Für diese Extraktion wurde eine Kuehni-Säule E60 mit den folgenden Ausmaßen verwendet: Säulen I.D.: 6 cm, Säulenhöhe: 180 cm, Anzahl der wirklichen Stufen: 50, freie Querschnittsfläche der Leitplatten: 10%. Die Säule wurde mit 130 Umdrehungen pro Minute gerührt. Der Einlass am Kopf der Säule wurde mit 4,01/h frischer, 95%iger wässriger Essigsäure, als disperse Phase, beschickt. Der Einlass am Boden der Säule wurde mit 1,751/h frischem Heptan, als kontinuierliche Phase, beschickt. Die 27. wirkliche Stufe (gezählt ausgehend vom Boden) der Säule wurde mit 0,775 kg /h einer Lösung von 40% (w/w) rohem Lipstatin in Heptan beschickt. Im Gleichgewicht wurde eine Ausbeute von > 99% in der Extraktphase am Auslass am Boden der Säule und eine Reinheit von Lipstatin von 70% (w/w) erreicht. Der Gehalt an methionin-analogem Lipstatin war 0,6% (w/w).
b. Oxidation mit Peressigsäure: Das methionin-analoge Lipstatin im 95%igen wässrigen Essigsäureextrakt wurde durch Zugabe einer äquimolaren Menge von 37%iger Peressigsäure oxidiert.
c. Gegenstrom-Extraktion mit Heptan/75% wässrige Essigsäure: Für diese Extraktion wurde eine Kuehni-Säule mit den selben Ausmaßen, wie unter Punkt a) beschrieben, verwendet. Die Säule wurde mit 205 Umdrehungen pro Minute gerührt. Der Einlass am Kopf der Säule wurde mit 8,6 l/h Lipstatinextrakt in 95%iger wässriger Essigsäure (Vereinigung von einigen, angesammelten Extraktionschargen, mit einer Reinheit von 68% (w/w) Lipstatin, hergestellt gemäß Punkt a)), als disperse Phase, beschickt. Die 47. wirkliche Stufe (gezählt ausgehend vom Boden) der Säule wurde mit 2,1 l/h frischem, deionisiertem Wasser beschickt. Der Einlass am Boden der Säule wurde mit 6,0 l/h frischem Heptan, als kontinuierliche Phase, beschickt. Im Gleichgewicht wurde eine Ausbeute von 97% in der Extraktphase am Auslass am Kopf der Säule und eine Reinheit von Lipstatin von 88% (w/w) erreicht. Dies ist gleichbedeutend mit einer Ausbeute von 96-97%, berechnet auf den Gehalt von Lipstatin im gereinigten Produkt, bezogen auf Lipstatin im Rohprodukt.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin, umfassend

(a) flüssig-flüssig Extraktion von Lipstatin aus einem nicht-polaren Lösungsmittel, ausgewählt aus einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, in ein polares Lösungsmittel, ausgewählt aus einer Carbonsäure, einem Alkohol, einem Omonosubstituierten Mono- oder Polyethylenglycol, einem Diol oder einem dipolaren, aprotischen Lösungsmittel, gefolgt von

(b) Verdünnen der polaren Lösungsmittelphase mit Wasser oder Ändern des Phasenverhältnisses und Rückextraktion von Lipstatin in ein frisches, nicht-polares Lösungsmittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das polare Lösungsmittel von Schritt a) etwa 1 bis etwa 20 % Wasser enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das polare Lösungsmittel von Schritt a) etwa 5% Wasser enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das nicht-polare Lösungsmittel ein aliphatischer Kohlenwasserstoff ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das nicht-polare Lösungsmittel Heptan ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das polare Lösungsmittel eine wasserlösliche organische Carbonsäure, ein Alkohol oder ein O-monosubstituiertes Mono- oder Oligoethylenglycol ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das polare Lösungsmittel Essigsäure, Methanol oder Ethylenglycolmonomethylether ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die flüssig-flüssig Extraktion von Schritt a) wie in Anspruch 1 definiert eine Doppelstrom-Extraktion ist und Lipstatin in das polare Lösungsmittel extrahiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei vor der Rückextraktion das polare Lösungsmittel durch Zugabe von Wasser auf etwa 90 bis etwa 70% verdünnt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das polare Lösungsmittel durch Zugabe von Wasser auf etwa 80% verdünnt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Rückextraktion wie in Schritt b) von Anspruch 1 definiert eine Gegenstrom-Extraktion ist und Lipstatin in das nicht-polare Lösungsmittel extrahiert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das methionin-analoge Nebenprodukt von rohem Lipstatin vor der Extraktion oxidiert wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gefolgt von Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Hydrierungsreaktion mit einem Hydrierungskatalysator, der ein Edelmetall enthält, bei 25ºC, bei niedrigem Wasserstoffdruck durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend

(a) Oxidation von methionin-analogem Lipstatin;

(b) Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan;

(c) Verdünnen der Lipstatin-Lösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure; und

(d) Gegenstrom-Extraktion der Lösung mit Heptan.

16. Verfahren nach Anspruch 15, gefolgt von Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin.

17. Verfahren nach Anspruch 16, gefolgt von Kristallisierung von Tetrahydrolipstatin.

18. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung von Tetrahydrolipstatin, umfassend

(a) Oxidation von methionin-analogem Lipstatin;

(b) Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan;

(c) Verdünnen der Lipstatin-Lösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure;

(d) Gegenstrom-Extraktion der Lösung mit Heptan; gefolgt von

(e) Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin; und

(f) Kristallisierung von Tetrahydrolipstatin.

19. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Herstellung von Lipstatin oder Tetrahydrolipstatin.