DE4328332A1 - Verfahren zur Synthese und Selektionierung von Sequenzen aus kovalent verbundenen Bausteinen - Google Patents

Description

Einleitung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Molekül-Sequenzbanken (Peptidbanken; peptide library); ein Verfahren zur Synthese und Selektionierung von Sequenzen aus kovalent verbundenen Bausteinen zur Bestimmung von Sequenzen; weiterhin Verfahren zur Herstellung von Sequenzen, die unter Verwendung des Synthese- und Selektionierungsverfahrens erhalten wurden und Peptide, deren Struktur unter Verwendung des Synthese- und Selektionierungsverfahrens bestimmt wurden.

Stand der Technik

Die Entwicklung und Erforschung von neuen Medikamente, die von Organischen Chemikern in traditioneller Methode vorgenommen wird, basiert auf der Synthese einer großen Anzahl von Substanzen. Die bisher bekannten Selek­ tionierungsverfahren sind arbeitsaufwendig und weisen pro Zeiteinheit nur eine begrenzte Vielfalt an Substanzen auf. Mehr und mehr gewinnt die theoreti­ sche Substanzgestaltung an Bedeutung, bei der mit Computermodellen Struktu­ ren von Molekülen ermittelt werden. Jedoch ist diese Methode noch nicht ausreichend ausgereift, so daß klassische Selektionierungs-Verfahren noch immer von großem Wert sind.

Unterschiedliche Ansätze sind gemacht worden, Substanzen herzustellen und zu selektionieren. Dabei werden generell Peptidbanken (peptide library) hergestellt, die anschließend ausgetestet werden.

Ein wesentlicher Durchbruch bei diesem Verfahren wurde durch eine Peptid- Bank (peptide library) auf Phagen-Oberflächen erzielt (J. SCOTT and G.P. SMITH, (1990) Science 249: 386). Die im Selektionierungs-Verfahren positi­ ven Phagen werden bezüglich ihrer DNA analysiert, wodurch die auf der Ober­ fläche exprimierte Aminosäure-Struktur ermittelt wird. Nachteilig ist, daß die Phagen in Wirtszellen vermehrt werden müssen und daß die Selektionierungs­ verfahren geeignet sein müssen, die Peptide an der Zelloberfläche zu erkennen. Das zu selektionierende Peptid ist auf den Zellen ein Peptid neben sehr vielen anderen exprimierten Proteinen. Diese Selektionierung hat dadurch eine systembedingte Unsicherheit. Weiterhin können lediglich die zwanzig natürli­ chen Aminosäuren bei dem Verfahren zur Herstellung und Selektionierung der gewünschten Sequenzen verwendet werden.

Bei einem weiteren bekannten Verfahren werden kugelförmige Trägermaterialien verwendet, auf denen die Peptide synthetisiert werden. (K.S. LAM et al. (1991) Nature 354: 82. Je zwanzig Ansätze werden gefahren, ein Ansatz pro Aminosäure. Nach jedem Syntheseschritt werden die Kugeln gemischt und erneut in zwanzig Reaktionsgefäße aufgeteilt. Bei der Selektionierung werden die positiven Kugeln ermittelt und die Sequenz der darauf befindlichen Peptide bestimmt. Nachteil dieser Methode ist die umständliche Handhabung nach der Synthese. Die Selektionierung von positiven Kugeln ist erschwert, eine Sequenzanalyse ist notwendig. Das bei einer Kugel vorliegende Material ist mengenmäßig sehr gering.

Eine Variante des zuvor beschriebenen Verfahrens wird in der Publikation HOUGHTEN et al. (1991) Natur 354: 84 dargestellt. Dabei wird eine kom­ binatorische Bibliothek angelegt. So werden zum Beispiel zwei Positionen in der Aminosäure-Sequenz festgelegt. Bei dem restlichen Koppeln weiterer Bausteine sind diese Ansätze getrennt voneinander zu halten. Zwar besitzen diese Ansätze definierte Bausteine in bestimmten Positionen und auch ist dieser Baustein bekannt, jedoch erfordert diese Methode eine Vielzahl an parallel zu behandelnden Reaktionsgefäßen. Es wird bei jeder Reaktion lediglich eine bestimmte Aminosäure gekoppelt. Cystein wird nicht als Baustein für die Er­ stellung der Sequenzen verwendet.

Eine weitere Methode besteht darin, daß auf einem festen planaren Träger Baustein-Kopplungsstellen angeordnet sind, die mit Hilfe von Lichtenergie zur Reaktion mit einem weiteren Baustein angeregt werden kann. Die Licht­ energie kann aus einem Laser stammen, der gezielt Punkte anstrahlt. Ebenso ist eine Verwendung von Lochblenden möglich, die ebenfalls das gezielte Belichten von einzelnen Punkten erlauben. (P.A. FODOR et al. (1991) Science 251: 767) Nachteilig an dieser Methode ist, daß ein hoher techni­ scher Aufwand erforderlich ist. So muß ein Laser oder ein Gerät zu gezielten Belichtung von einigen definierten Reaktionsorten vorhanden sein. Auch sind die Reaktionsmechanismen beschränkt, da unbedingt eine Photoreaktion bei dieser Methode angewendet werden muß.

Weiterhin ist bekannt Peptide auf einem Trägermaterial, so zum Beispiel Zellu­ lose, zu synthetisieren. Dadurch hat jedes Peptid einen definierten Platz auf dem Trägermaterial. (R. FRANK and R. DÖRING (1988) Tetrahedron 44: 6031) Aufgrund des anschließenden Selektionierungsverfahrens kann das bindende Molekül einer bestimmten Aminosäure-Sequenz zugeordnet werden. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, daß lediglich definierte Sequenzen synthetisiert werden können.

Ist erst einmal die gesuchte Sequenz ermittelt, ist die Synthese von Peptiden einfach zu bewerkstelligen. Eine Zusammenfassung dieser Techniken kann bei J.M. STEWART and J.D. YOUNG, San Francisco, 1969, and J. MEIERHOFER, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2 p. 46 Academic Press (New York), 1973 für Festphasen-Methode und E. SCHRODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1 Academic Press (New York) 1965 für die Flüssigphasen-Methode nachgelesen werden. Die Schritte der Synthese sind in der Publikation EP 0 097 031 beschrieben. Die allgemeinen Verfahrensschritte aus der euro­ päischen Publikation lassen sich analog auf die Synthese nahezu aller Peptid- Verbindungen übertragen.

Aufgabe

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren anzubieten, mit dem gezielt Se­ quenzen herzustellen werden können, die zur Selektionierung geeignet sind. Dabei sollen die Sequenzen bestimmte wünschenswerte Eigenschaften besitzen. Diese Eigenschaften ermöglichen ein gezieltes Selektionsverfahren wobei die gewünschten Eigenschaften aus der spezifischen Erkennung von vorgegebenen Molekülen, zum Beispiel Rezeptormolekülen, bestehen. Die nach diesem Verfahren erhaltenen Sequenzen sollen dann anschließend als Vorlage für Moleküle (pharmakologische Leitstrukturen) verwendet werden, die nach klassisch-chemischer Art hergestellt werden.

Lösung

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Synthese von Sequenzbanken gelöst, die Sequenzen besitzen, welche sich aus kovalent verbundenen Bausteinen, zusammensetzen, die je eine Sequenzposition in der Sequenz einnehmen, die unterschiedliche Reaktionskinetiken bei der Synthese aufweisen, die vor der Synthese zur Bildung der kovalenten Bindung aktivierte Bausteine sind, und die aus zwei Typen von Bausteinen bestehen, zum einen (i) Auswahl bausteinen und zum anderen (ii) Zufallsbausteinen, unter Verwendung einer Festphasen-Synthese auf oder in einem Trägermaterial, wobei die Sequenz

• i) wenigstens einen Auswahlbaustein besitzt, dessen Struktur und Sequenzposition bei der Synthese bestimmt ist, und
• ii) wenigstens einen statistisch bestimmbaren Zufallsbaustein besitzt der an einer bestimmten Sequenzposition nach dem Zufallsprinzip aus einem Bausteingemisch mit bestimmten Strukturen zur Reaktion gelangte,

wobei sich auf oder in dem Trägermaterial Auftragungsorte zur Auftragung der aktivierten Bausteine befinden, dabei besitzen die Auftragenungsorte Baustein-Kopplungsstellen für die Bindung des bei der Synthese aktivierten Bausteins, der der erste in der Sequenz ist,
wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht: fortlaufende Synthese der Sequenz, je eine eigene Vorgehensweise für die Synthese der Auswahlbausteine und der Zufallsbausteine,

• aa) wobei, wenn ein Auswahlbaustein an einer bestimmten Position synthetisiert werden soll, der aktivierte Auswahlbaustein an wenigstens einem definierten Auftragungsort auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Auswahlbausteine im Überschuß gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen, und
• bb) wobei wenn ein Zufallsbaustein an einer bestimmten Position der Sequenz synthetisiert werden soll, ein Gemisch aus aktivierten Zufallsbausteinen an allen Auftragungsorten auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Zufallsbausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens im 4fachen Überschuß, und dabei werden nach der Kopplungsreaktion weitere Bausteine hinzugegeben.

Bei dem Gemisch sind die Zufallsbausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens in einem 2facher Überschuß, mehr be­ vorzugt höchstens in einem 1,5facher Überschuß noch mehr bevorzugt höch­ stens in einem 1,2facher Überschuß und und am meisten bevorzugt höchstens in einem 0,9facher Überschuß.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens

Einer der Vorteile dieses erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß in sehr kurzer Zeit Strukturen von zum Beispiel Peptid-Liganden ermittelt werden können, die spezifisch an zum Beispiel die extrazellulären Domänen von Rezep­ toren binden können. Mit Hilfe dieses Zufallsprinzips liegen alle theoretisch denkbaren Strukturen während der schrittweisen Selektionierung vor. Sie können aufgrund des Verfahrensprotokolls für jede Baustein-Kopplungsstelle ermittelt werden.

Lediglich durch die Bestimmung, welche Bausteine in der Sequenzabfolge zuerst bestimmt und welche variabel sind, lassen sich die Ergebnisse unterschiedlich beeinflussen. Ansonsten zeichnet sich das Verfahren gerade dadurch aus daß die zu erhaltenden Peptide trotz Zufallsverfahrens bei den nicht Auswahlbausteinen durch voneinander getrennte Verfahrensansätze nach­ arbeitbar sind.

Ermöglicht wurde diese Erfindung durch Reaktionsbedingungen, die bei der Synthese der Zufallsbausteine vorliegt. Es ist üblich, das Gemisch der neu zu synthetisierenden Bausteine in seiner Summe im molaren Überschuß gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen anzubieten, da sonst nicht alle Sequenzketten zur Reaktion gelangen. Eine nicht um einen weiteren Baustein verlängerte Sequenz führt dazu, daß Defekte in der Sequenz entstehen.

Weiterhin ist ein molarer Überschuß an zu koppelnder Aminosäure (Acylierungsreagenz) notwendig, da die Kopplungskinetik der einzelnen Ami­ nosäuren unterschiedlich ist, sich aber die Kopplungsausbeute für einen be­ stimmten Kopplungsschritt und eine bestimmte Aminosäure nie voraussagen läßt. Ein deutlicher molarer Überschuß umgeht dieses Problem. Bei den Peptid-Chemikern sind zweifache bis achtfache Überschüsse Routine. Üblich ist ein sechsfacher Überschuß. Hierbei handelt es sich um den Überschuß bei der Kopplung einer Auswahlaminosäure.

Das Angebot von Gemischen ist bisher nicht erwähnt worden. Durch die Kopplung eines komplexen Aminosäure-Gemisches im molaren Unterschuß kann das Problem der unterschiedlichen Kinetik für einzelne Aminosäuren umgangen werden. Da diese im Verhältnis zur Amin-Komponente im Unterschuß vorliegen, müssen alle Aminosäuren im wesentlich an quantitative abreagieren. Durch mindestens eine weitere Kopplung im gleichen molaren Verhältnis wird die Amin-Komponente am Träger dann vollständig umgesetzt. Somit besteht in den Fachkreisen das Vorurteil, daß Reaktionen ohne Über­ schuß der neuen zu koppelnden Bausteine nicht erfolgreich ablaufen können.

Entgegen der vorherrschenden Vorurteile werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zufallsbausteine nicht im deutlichen Überschuß, bevorzugt höchstens äquimolar angeboten. Hierdurch werden fast alle Zufallsbausteine äquimolar mit der Sequenz reagieren. Zwar werden die einzelnen Bausteine aufgrund ihrer unterschiedlichen Kinetik zu unterschiedlichen Zeiten zu 99% reagiert haben, jedoch reagieren praktisch alle aktivierten Aminosäuren.

Weitere Ausführungsformen

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Zufallsbausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind. Wenn der Fachmann höhere Konzentrationen verwendet, wird er dennoch Resultate erhalten, die jedoch nicht mehr der statistischen Verteilung entsprechen. Eine Verschlechterung des Verfahrens wird dann in Kauf genommen. Dieses Verfahren arbeitet bezüglich der statistischen Verteilung dann am besten, wenn die Summe aller angebotenen Zufallsbausteine höchstens äquimolar ist. Wird der äquimolare Bereich deutlich unterschritten werden nur einige der Synthese-Ketten mit den Zufallsbausteinen gekoppelt, andere bleiben ohne Reaktionspartner.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz drei Auswahlbausteine an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzt, indem bei der Synthese drei Auswahlbausteine an je einer bestimmten Position synthetisiert werden. Die Affinität von Bindungsmolekülen steigt etwa exponentiell zur Anzahl der definierten Bausteine an. Drei definierte Bausteine erlauben eine bessere Vorselektion der Gesamtsequenz als die Verwendung von lediglich zwei definierten Bausteinen. Drei definierte Bausteine lassen sich auch auf einem im wesentlichen planaren Trägermaterial noch problemlos auftragen.

Auch kann die Sequenz vier oder fünf Auswahlbausteine an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzen, indem bei der Synthese entsprechend vier oder fünf Auswahlbausteine an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist. Das erfindungsgemäße Verfahren auf die lineare Synthese nicht beschränkt, Verzweigungen sind leicht möglich. Entsprechende Schutzgruppen sind dabei anzuwenden. Die verzweigten Moleküle haben den Vorteil, daß sie auch flächige Areale abdecken können. Hierdurch öffnet sich ein weiteres Anwendungsfeld des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ebenfalls sind zyklische Ausführungen möglich, die die Konformationsstabilität des Moleküls erhöhen.

Als Trägermaterial können verschiedene Substanzen dienen, besonders geeig­ net ist das Trägermaterial aus Zellulose. Es hat den Vorteil, daß ein für die Synthese brauchbarerer Träger vorliegt auf den leicht die Bausteine und deren Gemische aufgetragen werden können. Die ebene Fläche und die hohe Saugfähigkeit erleichtern die Handhabung.

Weitere Ausführungsformen als Peptidbanken

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Synthese von Peptidbanken aus natürlichen Aminosäuren und/oder deren Derivaten (Aminosäuren) unter Kopplung von Aminosäuren dient, wobei die Aminosäuren je eine Sequenzposition in der Sequenz einnehmen, vor der Kopplung zur Bildung der kovalenten Bindung am Carboxylende aktiviert sind, und die aus zwei Typen von Aminosäuren bestehen, zum einen (i) Auswahlaminosäure und zum anderen (ii) Zufallsaminosäure, unter Verwendung einer Festphasen-Synthese auf oder in einem Trägermaterial wobei die Sequenz

• i) wenigstens eine Auswahlaminosäure besitzt, deren Struktur und Sequenzposition bei der Peptidsynthese bestimmt ist, und
• ii) wenigstens eine statistisch bestimmbare Zufallsaminosäure besitzt die an einer bestimmten Sequenzposition nach dem Zufallsprinzip aus einem Aminosäuregemisch mit bestimmten Aminosäuren zur Reaktion gelangte,
  wobei sich auf oder in dem Trägermaterial Auftragungsorte zur Auftragung der aktivierten Aminosäuren befinden,
  dabei besitzen die Auftragungsorte Aminosäure-Kopplungsstellen für die Bindung der bei der Synthese aktivierten Aminosäure in der Peptidsequenz,
  die die erste Aminosäure in der Peptidsequenz ist, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
  fortlaufende Synthese der Peptidsequenz unter Kopplung der in der Peptidsequenz ersten Aminosäure an die Aminosäure-Kopplungsstelle und unter der Kopplung der in der Peptidsequenz weiteren Aminosäuren an das N- terminale Ende des teilsynthetisierten Peptides,
  je eine eigene Vorgehensweise für die Kopplung der Auswahlaminosäure und der Zufallsaminosäure,
• aa) wobei, wenn ein Auswahlaminosäure an einer bestimmten Sequenzposition gekoppelt werden soll, die aktivierte Auswahlaminosäure an wenigstens einem definierten Auftragungs­ ort auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Auswahlaminosäuren gegenüber den Aminosäure- Kopplungsstellen im Überschuß, und
• bb) wobei wenn eine Zufallsaminosäure an einer bestimmten Sequenzposition gekoppelt werden soll,
  ein Gemisch aus aktivierten Zufallsaminosäuren an allen Auftragungsorten auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird,
  dabei sind die Zufallsaminosäuren in ihrer Summe gegenüber den Aminosäure-Kopplungsstellen höchstens im 4fachen Überschuß und dabei werden nach der Kopplungsreaktion weitere Aminosäuren hinzugegeben.

Bei dem Gemisch sind die Zufallsaminosäuren in ihrer Summe gegenüber den Aminosäure-Kopplungsstellen höchstens in einem 2facher Überschuß, mehr bevorzugt höchstens in einem 1,5facher Überschuß, noch mehr bevorzugt höchstens in einem 1,2facher Überschuß und und am meisten bevorzugt höchstens in einem 0,9facher Überschuß.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Zufallsaminosäuren in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind. Wenn der Fachmann höhere Konzentrationen verwendet, wird er dennoch Resultate erhalten, die jedoch nicht mehr der statistischen Verteilung entsprechen. Eine Verschlechterung des Verfahrens wird dann in Kauf genommen.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz drei Auswahlaminosäuren an je einer bestimmten Posi­ tion der Sequenz besitzt indem bei der Synthese drei Auswahlaminosäuren an je einer bestimmten Position synthetisiert werden. Die Affinität von Bindungs­ molekülen steigt etwa exponentiell zur Anzahl der definierten Bausteine an.

Drei Auswahlminosäuren erlauben eine bessere Vorselektion der Gesamt­ sequenz als die Verwendung von lediglich zwei Auswahlaminosäuren. Drei definierte Aminosäuren lassen sich auch auf einem im wesentlichen planaren Trägermaterial noch problemlos gleichzeitig auftragen. Wenn zum Beispiel Peptidsequenzen erstellt werden sollen, so ergeben sich dann 8000 Aminosäure-Kopplungsstellen, die noch auf einem Zelluloseträger gut handhabbar sind. Die Verwendung von drei Auswahlbausteinen stellt bei Peptiden einen sinnvollen Kompromiß zwischen der hohen Anzahl an Aminosäure-Kopplungsstellen und Bindungskapazität der Peptide dar.

Auch kann die Sequenz vier oder fünf Auswahlaminosäuren an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzen, indem bei der Synthese entsprechend vier oder fünf Auswahlaminosäuren an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist. Natürliche Sequenzen von Aminosäuren sind unverzweigt. Derartige lineare Moleküle sind gut geeignet, an andere Strukturen anzulagern und Konformationsänderungen zu bewirken. Jedoch ist das erfindungsgemäße Verfahren auf die lineare Synthese nicht beschränkt, Verzweigungen sind leicht möglich. Entsprechende Schutzgruppen sind dabei anzuwenden. Die verzweigten Moleküle haben den Vorteil, daß sie auch flächige Areale abdecken können. Ebenfalls sind zyklische Ausführungen möglich, die die Konformationsstabilität des Moleküls erhöhen.

Vorteilhaft ist es, wenn die Bausteine D- oder L-Aminosäuren und/oder deren Derivate sind. Neben den zwanzig L-Aminosäuren existiert eine große Zahl an Aminosäure-Derivaten, die zum Beispiel in dem Katalog der Firma BACHEM Bubendorf, Basellandschaft, Schweiz, beschrieben sind. Derartige Peptide, die veränderte Aminosäuren enthalten, legen häufig eine anders geartete Pharmakokinetik an den Tag. Sie verhalten sich im Organismus anders als die Peptide, die ausschließlich aus natürlichen Aminosäuren bestehen. Sie sind gegenüber Proteasen stabiler, sie durchdringen teilweise die Zellmembra­ nen schlechter, wodurch das als Medikament genutzte synthetische Peptid für die Einwirkung im extrazellulären Bereich geeigneter als eine Sequenz aus L- Aminosäuren ist.

Als Trägermaterial können verschiedene Substanzen dienen, besonders geeig­ net ist das Trägermaterial aus Zellulose.

Weiter eignet sich als Trägermaterial Polystyren Kügelchen, an denen die Fest­ phasensynthese der Peptidbank (peptide library) mittels Simultansynthese durch Aminosäure-Gemische ebenfalls durchgeführt werden kann. Die Simul­ tansynthese von Einzelkomponenten (zum Beispiel bei einem Hexapeptid mit der Sequenz X₁·X₂·B₃·X₄·B₅·X₆ [X= Aminosäure mit zufälliger Vertei­ lung; B = bestimmte Aminosäure]) der Peptidbank (peptide library) kann beson­ ders gut an einem multiplen Peptidsynthese-Automaten (zum Beispiel der Firma Abimed AMS 422) durchgeführt werden. 48 Ansätze sind zum Beispiel mit ei­ nem zuvor genannten Gerät simultan zu synthetisieren. Mit Hilfe dieser Me­ thode können größere Mengen an freien Peptiden gewonnen werden, die zum Beispiel für Zelltests eingesetzt werden können.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die Aminosäure- Kopplungsstellen β-Alaninreste sind, die mit dem Trägermaterial kovalent ver­ bunden sind. β-Alanin ist dabei über eine Esterbindung an das Zellulosema­ terial gekoppelt. Eine definierte Anzahl von Aminosäure-Kopplungsstellen ist erforderlich, um zu wissen, welche Mengen an Aminosäuren bei jedem Syntheseschritt angeboten werden müssen. Weiterhin ist es möglich an den Kopplungsstellen, die Sequenzen von dem Träger zu lösen.

Als weitere Aminosäure-Kopplungsstellen eignen sich Glycin, an der Aminosäure-Carbonsäuren (außer β-Alanin), Polyethylenglykol (RAPP et al. in Peptides 1988; Ed. G. JUNG, E. BAYER, Walter deGRUYTER, Berlin 1989, Seiten 199-201) und sämtliche Linkergruppen für die Peptidsynthese, die kommerziell erhältlich sind und von denen sich nach der Synthese sogar das Peptid wieder abspalten läßt (vgl. Katalog von NOVABIOCHEM 93).

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Gemisch aus natürli­ chen Aminosäuren, die im wesentlichen in gleichen molaren Anteilen vorliegen, bestehen.

Weiterhin kann das Gemisch aus den D-Konfigurationen der natürlichen Ami­ nosäuren, die im wesentlichen in gleichen molaren Anteilen vorliegen, bestehen. Ebenfalls kann es sich bei den Bausteinen um Aminosäure-Derivate handeln. Solche Derivate zum Beispiel in dem Katolog der Firma BACHEM, Bubendorf Basellandschaft, Schweiz aufgelistet.

Weitere Ausführungsformen als Zuckersequenzbanken

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Synthese von Polysaccharidbanken aus natürlichen Zuckern und/oder deren Derivaten (Sacchariden) unter Kopplung von Sacchariden dient wobei die Saccharide, je eine Sequenzposition in der Sequenz einnehmen, die unterschiedliche Reaktionskinetiken bei der Synthese aufweisen,
die vor der Synthese zur Bildung der kovalenten Bindung aktivierte Saccharide sind, und
die aus zwei Typen von Sacchariden bestehen, zum einen (i) Auswahlsacchariden und zum anderen (ii) Zufallssacchariden, unter Verwendung einer Festphasen-Synthese auf oder in einem Trägermaterial wobei die Sequenz

• i) wenigstens ein Auswahlsaccharid besitzt dessen Struktur und Sequenzposition bei der Synthese bestimmt ist, und
• ii) wenigstens ein statistisch bestimmbares Zufallssaccharid besitzt, das an einer bestimmten Sequenzposition nach dem Zufallsprinzip aus einem Saccharidgemisch mit bestimmten Sacchariden zur Reaktion gelangte,
  wobei sich auf oder in dem Trägermaterial Auftragungsorte zur Auftragung des aktivierten Saccharids befinden,
  dabei besitzen die Auftragenungsorte Saccharid-Kopplungsstellen für die Bindung des bei der Synthese aktivierten Saccharids, das das erste in der Sequenz ist,
  wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
  fortlaufende Synthese der Saccharidsequenz unter Kopplung des in der Saccharidsequenz ersten Saccharids an die Saccharid-Kopplungsstelle und unter der Kopplung der in der Saccharidsequenz weiteren Sacccharide an die reagibel funktionelle Gruppe des teilsynthetisierten Saccharids je eine eigene Vorgehensweise für die Synthese des Auswahlsaccharids und des Zufallssacccharids,
• aa) wobei, wenn ein Auswahlsaccharid an einer bestimmten Sequenzposition synthetisiert werden soll, das aktivierte Auswahlsaccharid an wenigstens einem definierten Auftragungsort auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Auswahlsaccharide im Überschuß gegenüber den Saccharid-Kopplungsstellen, und
• bb) wobei wenn ein Zufallssaccharid an einer bestimmten Position der Sequenz synthetisiert werden soll,
  ein Gemisch aus aktivierten Zufallssacchariden an allen Auftragungsorten auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Zufallssaccharide in ihrer Summe gegenüber den Saccharid-Kopplungsstellen höchstens im 4fachen Überschuß und dabei werden nach der Kopplungsreaktion weitere Saccharide hinzugegeben.

Bei dem Gemisch sind die Zufallssaccharide in ihrer Summe gegenüber den Saccharid-Kopplungsstellen höchstens in einem 2facher Überschuß, mehr be­ vorzugt höchstens in einem 1,5facher Überschuß noch mehr bevorzugt höch­ stens in einem 1,2facher Überschuß und und am meisten bevorzugt höchstens in einem 0,9facher Überschuß.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Zufallssccharide in ihrer Summe gegenüber den Saccharid-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind. Wenn der Fachmann höhere Konzentrationen verwendet, wird er dennoch Resultate erhalten, die jedoch nicht mehr der statistischen Verteilung entsprechen. Eine Verschlechterung des Verfahrens wird dann in Kauf genommen. Wird der äquimolare Bereich deutlich unterschritten, werden nur einige der Synthese-Ketten mit den variablen Bausteinen gekoppelt, andere bleiben ohne Reaktionspartner.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz drei Auswahlsaccharide an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzt indem bei der Synthese drei Auswahlsaccharide an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

Auch kann die Sequenz vier oder fünf Auswahlsaccharide an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzen, indem bei der Synthese entsprechend vier oder fünf Auswahlsaccharide an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist. Die verzweigten Moleküle haben den Vorteil, daß sie auch flächige Areale abdecken können. Hierdurch öffnet sich ein weiteres Anwendungsfeld des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ebenfalls sind zyklische Ausführungen möglich, die die Konfor­ mationsstabilität des Moleküls erhöhen.

Als Trägermaterial können verschiedene Substanzen dienen, besonders geeig­ net ist das Trägermaterial aus Zellulose.

Saccharide sind ausführlich in der Literatur beschrieben. (Zum Beispiel RÖMPPS, Chemie-Lexikon, ed. NEUMÜLLER, O.-A. (1983) 8. Auflage, Seiten 2147 bis 2152) Es ist bekannt, daß die verschieden Zuckerbausteine unter­ schiedliche Reaktionskinetiken besitzen. (vgl.: PAULSEN, H. (1990) Angew Chem 102: 851; KUNZ, H. (1987) Angew Chem 99: 297; PLEWE, M. et al. (1992) Carbohydr Res 235: 151; und OGAWA, T. et al. (1984) Pur Appl Chem 56: 779) Dadurch liegt auch hier ein vergleichbares Problem wie bei den Aminosäure-Sequenzen vor. Beide Systeme weisen jedoch einige Unterschiede auf. Aufgrund der hohen funktionellen Dichte ist den Sacchariden eine höherer Informationsgehalt als den Aminosäuren gegeben. Im Gegensatz zur Peptidchemie sind die Verknüpfungsmöglichkeiten der Zucker äußerst komplex. Zwei Monosaccharide lassen sich theoretisch zu elf Disacchariden verbinden.

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Saccharide eine zyklische Pentose oder Hexose oder deren Derivate sind. Ty­ pische Pentosen sind in dem Standardwerk RÖMPPS beschrieben.

Biologisch relevante Monosccharide sind zum Beispiel Glucose, Galactose Mannose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosam in oder N-Acetylneuramin­ säure.

Das Syntheseverfahren der Auswahlbausteine, Auswahlaminosäuren oder Auswahlsaccharide ist dann effektiv, wenn die Auswahlbausteine Auswahlaminosäuren oder Auswahlsaccharide wenigstens in einem dreifachen Überschuß vorliegen. Gute Resultate sind in einer Spanne zu erwarten, die sich von dem dreifachen bis zum achtfachen Überschuß erstreckt.

Nach der Reaktion der Zufallsbausteine, der Zufallsaminosäuren oder der Zufallssaccharide sind einige Kopplungsstellen nicht mit einem Zufallsbaustein einer Zufallsaminosäure oder einem Zufallssaccharid besetzt. Um jedoch gleiche Moleküllängen zu erzielen, werden nach Reaktion der Zufallsbausteine Zufallsaminosäuren oder Zufallssaccharide die weiteren Bausteine wenigstens in einem zweifachen Überschuß hinzugegeben.

Weitere Ausführungsform als Selektionsverfahren

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Synthese und Selektionierung von Sequenzen aus kovalent verbundenen erfindungsgemäßen Bausteinen Aminosäuren oder Sacchariden, wobei nach der Synthese der Sequenz eine Selektion der gewünschten Sequenzen mit Hilfe von Bindungstests oder spezifischen Reaktionen erfolgt dabei werden die funktionell bestimmten Sequenzen gegebenenfalls durch Indikatoren dargestellt.

Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten des Selektionsverfahrens

Durch ein einfaches Selektionierungsverfahren wird aus den Millionen unterschiedlichen Molekülen zum Beispiel ein einzelnes Peptid herausgefunden, daß eine bestimmte gewünschte Eigenschaft hat, wie zum Beispiel Wirkung als therapeutische Substanz oder Bindung und Eliminierung von giftigen Schwermetallen.

Dieses sei an einem Hexapeptid veranschaulicht: Die Synthese wird so geführt, daß in einer Anordnung aus 20×20 Feldern 400 Auftragungsorte ("Spots") angeordnet sind. Jeder dieser Auftragungsorte enthält ein Gemisch aus über 100 000 einzelnen Peptiden der Zusammensetzung X₁X₂B₃B₄X₅X₆. Dabei sind B₃ und B₄ Auswahlminosäuren. In jeder der Positionen X₁; X₂; X₅; und X₆ werden simultan alle 20 Aminosäuren mit gleicher Wahrscheinlichkeit eingebaut.

Da es 20 natürliche Aminosäuren gibt, führt dieses zu Peptidgemischen mit zwei definierten Positionen an 400 Auftragungsorten. Pro Auftragungsort liegen 160 000 Peptide vor, da die Positionen X₁; X₂; X₅; und X₆ nach dem Zufallsprinzip besetzt sind. Dabei sind die 160 000 Peptide mit der gleichen Wahrscheinlichkeit vertreten. Alle Auftragungsorte enthalten zusammen 64 000 000 unterschiedliche Peptide.

Bei der Suche nach einem bestimmten Peptid mit einer bestimmten Eigenschaft (zum Beispiel Bindung an ein Hüllprotein des HlV-Virus), sucht man im ersten Schritt die Auftragungsorte ("Spots"), die die beste Bindung zeigen. Damit sind die beiden ersten Aminosäuren bestimmt. Im nächsten Schritt werden die beiden nächsten Aminosäurepositionen festgelegt und die restlichen frei variiert. Wieder werden 400 Auftragungsorte auf ihre Bindung getestet und die besten identifiziert. Nun liegen 4 Positionen fest. Bei Hexapeptiden legt man im nächsten Schritt alle Peptide in ihrer Sequenz fest und identifiziert die Peptide mit der besten Bindung. Dieser ganze Prozeß der Suche einer bestimmten Verbindung unter Milliarden oder gar Billionen von Verbindungen benötigt deutlich weniger Zeit als die herkömmlichen Methoden erforderten. In wenigen Tagen kann die Suche nach Peptiden mit der gewünschten Eigenschaft erfolgreich abgeschlossen sein.

Das Verfahren ist für viele Modifikationen offen. Es können natürliche und nicht natürliche Aminosäuren, D-Aminosäuren, Zucker, des aminierte Aminosäuren oder Peptoide benutzt werden. Es können Verzweigungen über Seitenketten eingebracht werden oder Konformationen über Seitenkettenvernetzungen oder Zyklisierungen von Oligomere stabilisiert werden. Es können längere Oligomere synthetisiert werden, bei denen mehrere Positionen konstant bleiben die aber räumlich festgelegte Konformationen ausbilden. Mit dem Verfahren können also gezielt Wirkstoffe und analytische Moleküle vergleichbar monoklonalen Antikörper hergestellt werden, ohne die zahlreiche Nachteile dieser natürlichen Moleküle zu haben (Tierversuche, Herstellungskosten).

Mit dem Verfahren ist auf kleinstem Raum möglich, mit minimalem Materialaufwand (mg-Bereich) eine Vielfalt von Verbindungen herzustellen, wie sie nicht einmal die Natur kennt. Diese Vielfalt kann dann auf gewünschte Eigenschaften (Bindung, enzymatische Aktivität, Hemmung von Aktivität) untersucht werden. Das Verfahren stellt damit eine Basistechnologie in der Biologie, Medizin, Pharmazie, Analytik, Sensortechnologie und Mikrosystemtechnik dar.

Das Verfahren ist in seiner Potenz, eine beliebige Vielfalt von Molekülen herzustellen und daraus gezielt solche Verbindungen mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen, allen anderen Verfahren, insbesondere bei sehr großen Variantenzahlen (108 Verbindungen) überlegen. In den letzten Jahren gab es verschiedene Bestrebungen, Verfahren zu entwickeln, die die Vorzüge des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzen. Diese Versuche scheiterten jedoch an Problemen der chemischen Synthese. Niemand ist sonst in der Lage, dafür zu sorgen, daß bei einem Angebot von 20 Aminosäuren alle mit gleicher Wahrscheinlichkeit in das Peptid eingebaut werden. Weiterhin ermöglicht diese Methode erst die Verwendung einer für diese Zwecke bisher nicht benutzte Festphase. Aufwendigere Verfahren wurden von einigen Gruppen entwickelt, die jedoch zu einem zu hohen, ab einer bestimmten Anzahl von Varianten nicht mehr vertretbarem Aufwand führen. In diesen Verfahren nach dem Stand der Technik werden als Festphase in der Regel kleine Kügelchen verwendet, an welche die Moleküle kovalent gebunden werden und deren Handhabung rasch zu Kapazitätsgrenzen führt. Dieses Problem wird durch das erfindungsgemäße Verfahren so erfolgreich gelöst, daß eine Anwendung in jedem chemischen Labor jederzeit problemlos möglich ist.

Neben der Biotechnologie gewinnt die synthetische Biologie mehr und mehr an Bedeutung. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die gezielte Suche nach Peptiden und anderen oligomeren chemischen Verbindungen mit definierten Eigenschaften innerhalb kürzester Zeit. Bisher war eine gezielte Suche nach solchen Verbindungen nur mit einem um ein Vielfaches höheren Aufwand möglich, dadurch in den meisten Fällen eine nicht gangbare Methode. Das Verfahren ist in der Lage die Entwicklung innovativer Produkte in der chemisch­ pharmazeutischen Industrie entscheidend zu beschleunigen.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt einen wesentliche, schnell ausführbaren und praktikablen Weg in eine synthetische Biologie dar, ohne die Benutzung gentechnischer Methoden dabei zu verwenden. Die bisher nur aus der Natur selbst bekannte Vielfalt an organischen Verbindungen kann mit dem vorliegenden Verfahren bei weitem übertroffen werden. Aus dieser Vielfalt erlaubt das Verfahren eine gezielte Suche nach dem am besten für eine Anwendung geeigneten Molekül. Biologisch Moleküle mit vollkommen neuen Eigenschaften lassen sich so konstruieren. Der biologische Prozeß von Mutation und Selektion in einem bestimmten Zeitintervall wird durch das vorliegende Verfahren in der Schnelligkeit übertroffen, da die Anzahl der Mutanten der verschiedenen auszutestenden Moleküle deutlich höher als in der Natur liegt.

In der pharmazeutischen Industrie wird die Wirkstoffindung von dem bisherigen Zufallsprinzip (15000 synthetisierte Moleküle auf ein zugelassenes Produkt) zu einem besser überschaubaren Verfahren. Die Arzneimittelentwicklung kann beschleunigt werden, da die Wirkstoffindung heute noch eine der zeitlich aufwendigsten Phasen der Entwicklung darstellt. Das Verfahren erlaubt zum Beispiel die Identifizierung von metallbindenden Peptiden, die zur Behandlung von Schwermetallvergiftungen eingesetzt werden können, innerhalb von wenigen Tagen.

Die heute weitgehend auf Nutzung monoklonaler Antikörper beruhende in-vitro Diagnostik wird voraussichtlich vollständig durch die Nutzung des beschriebenen Verfahrens ersetzt. Alle heute auf der Anwendung monoklonaler Antikörper basierenden analytische und diagnostischen Verfahren werden durch die Verwendung von synthetischen Peptiden, die mit dem hier beschriebenen Verfahren gezielt hergestellt und identifiziert werden, ersetzt. Keine Immunisierung von Mäusen, kein monatelanges Herstellungsverfahren von Antikörpern, keine biotechnologische Produktion von Proteinen (Antikörpern), keine zu 95% ungenutztes teures Protein ist mehr erforderlich. (Bei den Antikörpern interessieren nur die Bindungsstellen, die nur wenige Prozent der Gesamtmasse ausmachen.)

In der Umweltanalytik eröffnet das Verfahren die Möglichkeit, schnelle Nachweissysteme für Umweltschadstoffe zu entwickeln, die mit einem minimalen Material- und Zeitaufwand eine quantitative Bestimmung ermöglichen. Für die Umwelttechnologie können Verbindungen dargestellt werden, die selektiv giftige (Schwermetalle, Dioxine, Furane) binden und unschädlich machen.

Weiterhin eröffnet das Verfahren die Möglichkeit, toxische und ökotoxikologische Einschätzungen von Schadstoffen mittels in vitro Verfahren zu treffen. Dies geschieht, indem die schadstoffbindenden Sequenzen mit Hilfe des Verfahrens identifiziert werden und anschließend in Proteinsequenzdatenbanken auf ihr Vorkommen in Proteinen gesucht werden. Diese Proteine können dann gezielt auf rezeptorspezifische Toxizität untersucht werden. Dies ist ein vollkommen neuer Ansatz, der bisher ohne das Verfahren nicht möglich war und die Entwicklung ökologisch verträglicher Substanzen erleichtert. Da die Untersuchung sehr frühzeitig, direkt nach einer ersten Synthese durchgeführt werden kann, reduziert das Verfahren die Anzahl der Fehlentwicklungen von neuen Produkten der chemischen Industrie.

Eine Anwendung des Verfahrens auf die Entwicklung von Biosensoren für eine Vielfalt von Fragestellungen ist naheliegend, insbesondere, da die Verbindungen nicht so empfindlich gegen physikalische Einflüsse, wie zum Beispiele hohe Temperaturen sind, was die Anwendung von Biosensoren heute oft noch einschränkt. Der Einsatz entsprechend selektionierter Verbindungen als Sensoren in der Mikrosystemtechnik ist eine weitere Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens. Die Beschichtung von Oberflächen mit entsprechend entworfenen Verbindungen in der Nanotechnoloie ist möglich gemacht worden.

Das Verfahren arbeitet mit minimalen Substanzmengen, im Bereich von Nanogramm, so daß in der Selektionsphase für den Anwender des Verfahrens keine nennenswerten Kosten entstehen, wenn er diese Phase nicht als Auftrag vergibt. Die Reduktion von Kosten bei den Anwendern sind dagegen beträchtlich, da gezielt nach Verbindungen gesucht werden kann. Die Kosten für die Produktion werden von dem Verfahren nicht beeinflußt.

Weitere Ausführungsformen bezüglich der Selektionierung

Vorteil des erfindungsgemäßen Synthese- und Selektionierungsverfahrens ist daß nach der Synthese der Sequenzen auf bekannte und bewährte Indikatorverfahren zurückgegriffen werden kann, um festzustellen, welche Sequenzen die zu selektionierenden Eigenschaften besitzen.

Vorteilhaft ist es, wenn der Bindungstest in einem Anhaften markierter Testsub­ stanzen und Sichtbarmachung der Markierung besteht.

Bewährte und daher bevorzugte Verfahren bestehen darin, daß die Markierung aus radioaktivem Material oder aus Biotin oder aus kovalent verbundenen En­ zymen besteht. Weitere Methoden bestehen in der Messung der Fluoreszenz oder der Lumineszens.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt bei der Erfassung von Bindungsmo­ lekülen im speziellen auch die Moleküle, die eine Funktion auslösen. Dieses geschieht dadurch, daß die Reaktionen durch zum Beispiel allosterische Enzyme gemessen wird. Die Peptid-Banken (peptide library) können ebenfalls genutzt werden, um die Substratspezifität von Proteasen auszutesten oder mögliche Inhibitoren zu finden. Für die Substratspezifität müßten die Peptide z. B. fluoreszenzmarkiert werden. Dann müssen die einzelnen Baustein- Kopplungsstellen ausgeschnitten werden, mit Protease behandelt werden und die Freisetzung von Fragmenten photometrisch vermessen werden. Inhibitoren können dadurch gefunden werden, daß bestimmte Sequenzen, an die die Protease bindet, die aber die Protease nicht spalten kann, an den entsprechen­ den Baustein-Kopplungsstellen identifiziert werden können.

Ebenso ist es möglich, auch die Reaktion eines Zellsystems zu messen. Hierunter fallen auch alle Bindungen an Rezeptoren. So lassen sich eine Vielzahl von Rezeptoren bezüglich ihrer Bindungsfähigkeit zu den synthetisierten Liganden austesten.

Neben den Rezeptoren sind auch Metallatome für das Selektionierungs-Verfah­ ren geeignet, so zum Beispiel Technetium, Gadolinium, Nickel und Kalzium. Technetium komplexierende Peptide können als zum Beispiel Tumordiagnostika eingesetzt werden. Nickel komplesierende Sequenzen können als Werkzeug für die Proteinreinigung über Nickelsäulen eingesetzt werden. Organisch chemische Moleküle sollten ebenfalls von Peptiden gebunden werden können. Pepetide, die Übergangsanaloga bestimmter organisch chemischer Reaktionen binden, können möglicherweise die Vorstufen neuartiger Katalysatoren bilden.

Auch komplexere Interaktionen sind zu messen, wobei die Reaktion aus einer Zell-Zell-Wechselwirkung bestehen kann.

Weitere Ausführungsformen

Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren werden auch Sequenzen bean­ sprucht, nämlich unverzweigte oder verzweigte Peptide aus D- oder L- Ami­ nosäuren und/oder Aminosäure-Derivaten, welches Peptid eine Struktur besitzt die unter Verwendung der zuvor genannten erfindungsgemäßen Synthese- und Selektionierungsverfahren erhalten wurde. Wenn mit Hilfe des erfindungsge­ mäßen Verfahrens eine Sequenz ermittelt worden ist, so ist es für den Fach­ mann ein leichtes, aufgrund dieser Sequenz zum Beispiel das Peptid synthetisch herstellen zu können. Die Technik der Peptidsynthese ist zuvor schon ausführlich beschrieben worden. Die Erfindung liefert somit ein technische Lehre, die den Weg zur Sequenz offenbart. Die so ermittelte Sequenz kann dann auf Grund des Standardwissens des Fachmanns präparativ hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Lehre sind Sequenzen aufzufinden, die gewünschte spezifische Funktionen besitzen.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Peptidsynthese von unver­ zweigten oder verzweigten Peptiden aus D- oder L-Aminosäuren und/oder Ami­ nosäure-Derivaten, wobei die Sequenz synthetisiert wird, die die Peptid-Struktur besitzt, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Synthese- und Selektio­ nierungsverfahren erhalten wurde.

Definitionen

BAUSTEINE: Die Bausteine sind chemische Verbindungen, die zur Kettenbildung oder Verzweigung geeignet sind.

Vorzugsweise gehören die Bausteine zu einer Gruppe von chemischen Sub­ stanzen, so zum Beispiel zu den Aminosäuren und deren Derivaten. Die Ami­ nosäuren und deren Derivate können zur Gruppe der L- oder D-Aminosäuren gehören. Innerhalb einer Sequenz sind auch Mischformen möglich. Derivate von Aminosäuren zeichnen sich dadurch aus, daß die Seitenketten substituiert sind. Auch Sequenzketten über Seitenketten sind möglich, z. B. γ-Glutamin.

Alle reaktiven Seitenketten können für die Synthese von verzweigten Peptid­ banken (peptide library) verwendet werden, wie zum Beispiel Lysin. Über die Umsetzung von Karbonsäuren wie Glutaminsäure und Asparaginsäure können Aminogruppen umgesetzt werden, so zum Beispiel Argingin mit Dionen.

Die Sequenzen können Verzweigungen aufweisen, wobei über eine funktionelle Gruppe die Verzweigung mit dem Hauptstrang der Sequenz verbunden ist.

Bedeutsam ist, daß die Bausteine in wenigstens einem Reaktionsmedium alle löslich und reagibel sind.

Ebenfalls sind Zucker oder Zuckerderivate als Bausteine denkbar.

AKTIVIERTER BAUSTEIN: Ein Baustein, der eine aktivierte funktionelle Gruppe be­ sitzt, mit der er an schon vorhandenen Bausteine oder Baustein-Kopplungsstel­ len binden kann. Weiterhin muß er solche Schutzgruppen besitzen, die eine Reaktion der gewünschten funktionellen Gruppen erlaubt, jedoch die nicht ge­ wünschten abschirmt.

FESTPHASEN-SYNTHESE: Die Festphasen-Synthese ist ausführlich beschreiben in Solid Phase Synthesis, E. ATHERTON and R.C. SHEPPARD (1989) IRL Press, ISBN 1-85221-133-4 und Amino Acid and Peptide Syntheses, J. JONES, Oxford Science Publication (1992) ISBN 0-19-855668-3.

TRÄGERMATERIALIEN: Verschiedenste Trägermaterialen sind in der Standardliteratur beschreiben. Besonders geeignet sind bei diesem Verfahren alle im wesentlichen planaren Träger, die ein einfaches Auftragen der reagiblen Bausteine ermöglicht. Zellulose eignet sich besonders gut. Hierbei haben sich Materialien von WHATMAN, Typ: Whatman Papier 540 (gehärtete Zellulose) als sehr brauchbar herausgestellt.

AUFTRAGUNGSORTE: Um den Versuch sinnvoll zu gestalten, ist die ein- oder zweidimensionale oder auch gegebenenfalls dreidimensionale Festlegung von Stellen auf oder in dem Trägermaterial erforderlich, um zu vermeiden, daß die Bausteine an den entsprechenden Auftragungsorten sich unkontrolliert mit den Bausteinen anderer Auftragungsorte vermischen können.

BAUSTEIN-KOPPLUNGSSTELLEN: Nicht alle Träger sind geeignet, die gewünsch­ ten Bausteine koppeln zu können. Weiterhin dürfen die Bausteine nach dem zweiten Synthesezyklus nicht mehr an dem Trägermaterial binden können. Daher ist es sinnvoll, auf oder in dem Trägermaterial sogenannte Anker-Molekü­ le zu befestigen. Hierzu eignet bei Zellulose zum Beispiel β-Alanin.

Anwendungsbeispiele des erfinderischen Verfahrens

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die wesentlich schnellere Findung neuer Wirkstoffe und deren Entwicklung bis zur Marktreife. Zahlreiche neue Produkte können in Diagnostik und Therapie entwickelt werden, die mit den bisherigen Methoden nicht entwickelt werden konnten. So sind gewebespezifische Diagnostika in der Nukleardiagnostik, Kernspintomographie, Ultraschalldiagnostik und Röntgendiagnostik endlich in den Bereich des Machbaren gerückt. Neue Verfahren, wie die Nutzung von Laser für die Diagnostik (laserinduzierte Fluoreszenz) und Therapie (photodynamische Therapie), die bisher mangels struktur,- zell- oder gewebespezifischer (targetspezifischer) Farbstoffe scheiterten, werden durch das vorliegende Verfahren möglich.

I) Peptide gegen AIDS

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Substanzen auffindbar, die zur Behandlung von AIDS (aquired immune definciency syndrome) geeignet sind (HIV-Antagonsiten, human immunodeficiency virus). Hier können zwei verschiedene Wege beschritten werden:

• a) für die Virusvermehrung essentielle Enzyme, wie z. B. die HIV-Protease oder reverse Transkriptase können durch mit diesem Verfahren ermittelte Antagonisten inhibiert werden, was die Ausbreitung des Virus blockieren würde.
• b) das Andocken des Virus an die T-Lymphozyten, vermittelt durch den CD4 Rezeptor kann entweder durch CD4-Antagonisten oder Moleküle, die die CD4 Bindungsstelle auf dem Hüllprotein gp120 des Virus binden, unterdrückt werden und damit eine virale Infektion verhindert werden.

Beispiel zu a

Mit der Methode können HIV-Protease-Antagonisten (M. Miller et al. (1989), Science 246: 1149) ermittelt werden, indem fluoreszenz- oder radioaktivmarkierte Protease auf die Zellulosebank gegeben wird und diejenigen Gemische ermittelt werden, die von der Protease gebunden aber nicht hydrolysiert werden. Die Bindung der Protease an die Membran läßt sich über die Qunatifizierung der Radioaktivität ermitteln. Die antagonistischen Eigenschaften der Peptide lassen sich dadurch ermitteln, indem die Peptide in Gegenwart der HIV-Protease und natürlichen Substraten inkubiert werden. Wirken die Peptide antagonistisch, wird die Spaltung des natürlichen Substrats verhindert (J. Schneider und S.B.H. Kent (1998), Cell 54: 363). Weiterhin können die potentiellen Antagonisten durch Zugabe zu einer T-Zellkultur daraufhin getestet werden, ob sie eine Ausbreitung des Virus verhindern (S. Seelmeier et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6616).

Beispiel zu b

Mit der Methode können Peptide ermittelt werden, die möglicherweise die Stelle des HIV-Hüllproteins gp120 binden, die für das Andocken an den CD4-Rezeptor der T-Lymphozyten verantwortlich ist (M. H. Brodsky et al. (1990), J. Immun. 144: 3078). Ein Blockierung dieser Stelle würde eine Infektion der T-Zellen durch das HIV Virus verhindern. Hier lassen sich mit dem beschriebenen Verfahren sowohl Peptide ermitteln, die CD4 Rezeptor Bindungsstelle auf dem Hüllprotein gp120 oder auch die gp120 Bindungsstelle auf CD4 spezifisch binden und damit jeweils das Andocken des Virus an den T-Lympozyt verhindern. Bisher wurden für einen solchen Therapieansatz entweder lösliche CD4 Rezeptoren oder rekombinates gp120 jeweils in E.coli hergestellt (Größe über 100 Aminosäuren) eingesetzt (M. Watanabe et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 120; F. LaRosa et. al. (1990), Science 249: 932). Auch hier hätten Peptide wegen ihrer geringeren Größe viele Vorteile, wie geringere Antigenität, günstigere Pharmakokinetik etc. Über radioaktiv markiertes gp120 oder CD4 können mit dem Verfahren Peptide ermittelt werden, die diese beiden Proteine spezifisch binden. Die auf diese Weise ermittelten Sequenzen, können nun in vitro getestet werden, ob sie in der Lage sind, eine T-Lymphozyten Kultur vor einer Virusinfektion zu schützen (Seelmeir et al., s. o.).

II) Pepetide gegen Atherosclerose

Weiterhin können atherosclerotische Processe verhindert werden, indem Peptide gefunden werden, die die Bindung von T-Lymphozyten und Monozyten, die sich in Schaumzellen durch zuviel Aufnahme an oxidiertem "low density lipoprotein (LDL) verwandelt haben an die Rezeptoren der Gefäßwände (Arterien) blockieren (S. M. Edgington (1993), BIO/TECHNOLOGY 11: 676). Die Schaumzellen sekretieren Chemokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren, die an der Bildung von atherosclerotischen Plaques beteiligt sind (S. Cushing et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 5134; Schall et al. (1990), Nature 347: 669; Tanaka et al. (1993), Nature 361: 79). Eine besondere Rolle bei diesem Prozeß spielt das Chemokin MCP-1 (monocyte chemoatractant protein 1, Cushing et al., s. o.), das u. a. die Bindung der Monozyten an die Gefäßwände vermittelt. Eine Substanz, die die Bindung von MCP-1 an seinen Rezeptor (D. Michiel (1993), BIO/TECHNOLOGY 11: 739) blockiert könnte als Medikament zur Behandlung von Arthereosclerose eingesetzt werden. Der Rezeptor wird hierzu radioaktiv markiert und die Peptidbanken auf Peptide hin untersucht, welche den MCP-1 Rezeptor binden. Die auf diese Art und Weise erhaltenen Peptide werden nun in einem in vitro Modell (Cushing et al., s. o.), daraufhin untersucht ob sie in der Lage sind die Bindung von Macrophagen an Endothelzellen zu verhindern.

III) Peptide gegen Thrombose

Weiterhin könnte mit dem Verfahren ein Medikament zur Behandlung und Vorbeugung von Thrombose entwickelt werden. Eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Thromben spielt die Bindung des von Willebrand Faktors (vWF) an den "platelet glycoprotein (GP) 1b" Rezeptor (Z. M. Ruggeri und T. Zimmerman (1985), Semin. Hematol 22: 230). Ein anti-thrombotisches Peptid muß die Interaktion von vWF und GPIb verhindern. Mit den Peptidbanken können nun Peptide ermittelt werden, die den Rezeptor spezifisch binden. Der Rezeptor GPIb (M. Sugimoto et al. (1993), J. Biol. Chem., im Druck) wird wiederum radioaktiv markiert und mit den Banken inkubiert. Auf diese Weise erhaltene GPlb bindende Peptide können daraufhin in einem in vitro Modell daraufhin untersucht werden, ob sie die Bindung von vWF an GPIb verhindern und dadurch die durch die Bindung ausgelöste Fibrinogen Bindung an den GlycoproteinIIb/IIIa Komplex inhibieren. Dadurch würde eine Plättchen Agregation verhindert werden (L. DeMarco et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7424) und das mit dem Verfahren erhaltenen Peptid sich zur Behandlung von Thrombose eignen.

IV) Pepetide zur Immunstimulation

Weiterhin lassen sich mit diesem Verfahren Immunstimulanzien entwickeln was sich besonders zur Behandlung von mycobakteriellen (Tuberkolose, Lepra), Pilz- (Cryptococcus, Histoplasma), viralen (Herpes Simplex, HIV, Cytomegalovirus) und parasitären Infektionen (Toxoplasmose, Leishmania Pneumozystis) eignet. Hierbei spielt das Zytokin Interleukin-2 (IL-2) eine besondere Rolle. IL-2 wird durch T-Lymphozyten nach Stimulierung von Antigenen (Proteinen) sekretiert (K. A. Smith (1988), Science 240: 1169). Daraufhin stimuliert IL-2 selber die Proliferation und Differenzierung aller lymphoiden Zellen durch Bindung an IL-2 spezifische Zelloberflächenrezeptoren p55 und p75 (K. A. Smith (1989), Annual Review of Cell Biology 5: 397). Mit dem Verfahren können somit IL-2 Agonisten gefunden werden, indem mittels markierter Rezpetoren Peptide ermittelt werden, die p55 und p75 spezifisch binden. In einem in vitro Versuch kann nun eine mögliche agonistische Wirkung der Peptide getestet werden. Sind die Peptide aktiv, werden NK-("natural killer"), B- und T-Lymphozyten stimuliert werden und über verschiedene sekretorische Marker qunatifiziert werden. Hierzu wurde eine Vielzahl verschiedenster Tests entwickelt (zur Übersicht siehe Kaplan et al. (1992), BIO/TECHNOLOGY 10: 157).

V) Pepetide für die Immunscintigraphie

Mit diesem Verfahren können weiterhin Substanzen für die Immunscintigraphie ermittelt werden. Solche das radioaktive Metall Technetium 99m (Tc99m) komplexierenden Peptide können gentechnisch an einen anti-Tumor Antikörper fusioniert werden. Ein solcher Antikörper, der z. B. das Tumorzelloberflächenmarkerprotein CEA (Carcinoembryonales Antigen, J. Beatty et al. (1979), Arch. Surg. 114: 563; T. R. Barnett et al. (1989), J. Cell Biol. 108: 267) erkennt und der mit einem Tc-bindenden Peptid verbunden ist, läßt sich zur Bilddarstellung von Tumoren im allgemeinen verwenden, da CEA ein allgemeines Markerprotein für Tumoren darstellt. Das Peptid läßt sich mit dem beschriebenen Verfahren herstellen, indem die Peptidbank mit Tc99m inkubiert wird und die Peptide ermittelt werden, die Tc99m binden. Tc-bindende Peptide lassen sich mittels eines Phosphoimagers der Firma Molecular Dynamics finden und quantifizieren. Die Funktionsweise des Tc-komplexierenden Peptids in Lösung läßt sich mittels klassischer HPLC-Methoden (s. o.) zeigen. Bindet das Peptid Technetium, läßt sich dies mittels HPLC durch Quantifizierung eines "radioaktiven Peptidpeaks" ermitteln. In vivo kann nun die Funktionsweise des Antikörper/Tc-Peptid Komplexes in Mäusen, die Tumoren tragen nachgewiesen werden, indem der Antikörper appliziert wird und anschließend mittels einer Gamma-Kamera geprüft wird, ob die Tumoren sichtbar gemacht werden können (H. Schrewe et al. (1990), Molec. Cell Biol. 10: 2738).

VI) Peptide für die Tumordiagnostik

Weiterhin können mit dem Verfahren diagnostische Marker für Tumorzellen gefunden werden. Hierzu werden mit dem Verfahren Peptide ermittelt, die das Tumorzelloberflächenmarkerprotein CEA (s. o.) spezifisch binden. CEA bindende Peptide werden ermittelt, indem radioaktiv markiertes CEA mit den Banken inkubiert wird und bindende Peptide durch Schwärzung wie beschrieben ermittelt und weiter angenähert werden. Die Funktion des Peptids kann wie oben beschrieben in in vivo Versuchen gezeigt werden. Ein solches CEA-bindendes Peptid läßt sich mit einem Tc-komplexierenden Peptid zu einem bifunktionalen Peptid zur Bilddarstellung von Tumoren wie oben beschrieben verbinden.

VII) Peptide zur Nickelbindung

Mit diesem Verfahren können weiterhin Nickel-bindende Peptide ermittelt werden. Dieses ist für die Reinigung von rekombinant hergestellten Proteinen von besonderer Bedeutung. Bisher werden an die Proteine gentechnisch sogenannte "affinity tags" angehängt (Hucholi et al.). Diese Schwänze bestehen aus 6 Histidinen, was verschiedenen Nachteile hat. Die Anwesenheit von 6 Histidinen führt zu oft zu Löslichkeits- und Faltungsproblemen (J. Hucholi et al. (1987), J. Chrom. 411: 177). Mit diesem Verfahren können nun mittels der Peptidbanken Sequenzen gefunden werden, die ähnlich oder sogar stärker binden als 6 Histidine. Die Peptidbanken werden mit einem Nickelsalz inkubiert, gewaschen und die Nickelbindung an die Peptide über einen klassischen Nickelnachweis mit Dimethylglyoxim als rotem Farbkomplex nachgewiesen (Jander/Blasius, Lehrbuch der analytischen und präparativen anorganischen Chemie, S. Hirzel Verlag Stuttgart; U. Reineke und J. Schneider-Mergener et al., Manuskript in Vorbereitung). Die Nickelbindung kann daraufhin in Lösung mittels HPLC (R. Oliver, HPLC of Macromolecules, IRL Press, Oxford), Kapillarzonenelektrophorese (l. S. Kreull und J.R. Mazzeo (1992), Nature 357: 92) und Laserdesorptions Massenspektrometrie (J. Hodgson (1992), BIO/TECHNOLOGY 10: 399) nachgewiesen werden.

VIII) Peptide gegen Hämochromatose

Weiterhin läßt sich dem Verfahren ein Peptid finden, das das Metal Eiseri spezifisch bindet. Ein solches Peptid könnte einen Ersatz für das Medikament Desferrioxamin darstellen, was zur Behandlung verschiedener Krankheiten des Eisenstoffwechsel, wie u. a. der Hämochromatose Thalassämie, aber auch zur Inhibition von Tumorzellen verwendet wird (Voest et al. (1993) Cell Prolif. 26: 77). Desferrioxamin wirkt dadurch, daß es Eisen bindet. Es kommt bei der Behandlung von Patienten mit diesem Medikament häufig zu schweren Nebenwirkungen, wie z. B. Nierenversagen (Cianciulli et al. (1992) Haematologica 77: 514). Eisen-bindende Peptide, die nicht toxisch sein sollten, werden nun dadurch ermittelt, indem radioaktives Eisen 55 mit der Peptidbank inkubiert wird und die best-bindenden über einen Phosphoimager (Molecular Dynamics) ermittelt werden und wie beschrieben weiterhin iterativ bis mindestens zum Heptapeptid bestimmt werden. Die biologische Funktion kann wie unter Voest et al. und Cianciulli et al. beschrieben getestet werden. Eisen-bindende Peptide lassen sich weiterhin möglicherweise zur Behandlung von Malaria verwenden (Loyevsky (1993) J. Clin. Invest. 91: 218). lancet 341, 1088 L1 ciba-geigy

IX) Peptitide zur Tumorbehandlung

Weiterhin läßt sich mit dem Verfahren ein anti-Darmtumor oder anti-Pankreastumor Medikament entwickeln. Wesentlich an der Tumorentstehung beteiligt ist hierbei das Onkogenprodukt ras, ein zelluläres GTP-Bindungsprotein (M. Barbicid (1987) Ann. Rev Biochm. 56: 779). Mutationen im ras-Protein führen zur Transformation von Darm- bzw. Pankreaszellen (J. L. Bos (1989) Cancer Res. 49: 4682) Potentielle ant-Tumor Angentien richten sich somit gegen die ras-induzierte Transformation bestimmter Zelltypen und damit direkt gegen ras. Entscheidend für die Funktion von ras ist eine post-translationelle Modifizierung, nämlich die Anheftung eines Fettsäure(Farnesyl)rests an das C-terminale Cystein von ras durch eine Farnesyltransferase (J. B. Gibbs (1991) Cell 65: 1). Mit den Peptidbanken können nun Peptide ermittelt werden, die die Bindungsstelle der Farnesayltransferase auf ras spezifisch binden und damit die Farnesylierung blockieren. Hierzu wird ras in markierte Form mit den Banken inkubiert und auf diese Weise ermittelte ras-bindende Peptide in einem in vitro System auf Blockierung von ras hin untersucht (J. F. Hancock et al. (1989) Cell 57: 1167). Hierbei wird die Inhibierung des Wachstums von L731 Rattenzellen in Softagar in Gegenwart der Peptide untersucht (S. Powers et al. (1986) Cell 47, 413). Wirkt ein gefundendes Peptid antagonistisch, verhindert es die Bildung von Zellhaufen.

X) Peptide gegen Lupus Erythematosis

Weiterhin läßt sich dem Verfahren ein Medikament entwickeln, daß zur Behandlung der schweren humanen Autoimmunschwäche Lupus Erythematosis (LE) geeignet ist. Hierbei scheint das Zelloberflächenprotein MHC 1, daß auf nahezu allen somatischen Gewebetypen vorkommt, eine wesentliche Rolle spielen (Singer und Maguire (1990) Crit. Rev Immun. 10: 235). Es kann mit dieser Methode ein Peptid gefunden werden, daß MHC 1 spezifisch blockiert und damit die Autoimmunoantwort verhindert. Das rdioaktiv oder flureszenzmarkierte MHC-Protein wird mit der Peptidbank inkubiert und wie beschrieben MHC-bindenden Peptide selektioniert. In einem in vivo Modell kann nun geprüft werden, ob die gefundenen Peptide die Autoimmunantwort unterdrücken. In diesem Modell werden Mäuse mit einem Antikörper des Idiotyps 16/61d immunisiert. Diese entwickeln darauf hin LE ähnliche Symptome (Mozes et al. (1993) Science 261: 91). Auf diese Weise ermittelte Peptide, die als LE-Antagonisten wirken sollten diese Reaktion unterdrücken.

XI) Peptide gegen Wundinfektion

Weiterhin läßt sich mit dieser Methode ein Medikament zur Behandlung von Wundinfektionen finden. Als pathogener Keim spielt hierbei Staphylococcus aureus (S. aureus) eine entscheidende Rolle. Die teilweise lebensbedrohlichen Infektionen werden durch das Protein alpha-Toxin von S. aureus hervorgerufen. (Bhakdi und Tranum-Jensen (1987) Rev. Physiol. Biochem. Pharm. 107: 147) Antikörper gegen α-Toxin wurden bereits erfolgreich bei der Wundbehandlung, im speziellen von Brandwunden getestet (Dodd und Stutman (1991) Adv. Paed. Inf. Disease 6: 137). α-Toxin Antagonisten werden ermittelt, indem markiertes α -Toxin mit der Peptidbank inkubiert wird und bindende Peptide auf ihre antagonistischen Eigenschaft in einem in vitro Modell untersucht werden. Hierbei wird die Aktivität bzw. die Inhibierung der Aktivität über einen Hämolysetest an Kaninchenerythricyten nachgewiesen. (Füssle et al. (1981) J. Cell Biol. 91: 83) Peptide, die antagonistisch wirken, blockieren die Zerstörung der Zellmembran der Kaninchenzelle.

XII) Peptide gegen Lungenzellkarzinom

Weiterhin läßt sich mit dem Verfahren ein Medikament zur Behandlung des kleinen Lugenzellkarzinoms (SCLC) entwickeln (Corps et al. (1985) Biochemistry 213: 781). Eine wesentlich Rolle spielen hierbei die Proteine Bombesin und das "gastrine releasing peptide (GRP)". Ein Medikament zur Behandlung von SCLC sollte nun entweder ein Bombesin- oder GRP-Antagonist bzw. Bombesin- oder GRP-Rezeoptor-Antagonist sein. Die beschrieben markierten Proteine Bombesin und GRP bzw. ihre Antagonisten werden markiert mit den Libraries inkubiert und die best-bindenden Peptide in einem in vitro Modell getestet, ob sie in der Lage sind, Bobesin induziertes Wachstum von Fibroblastenzellen bzw. Bronchialepithelium zu inhibieren (Cuttitta et al. (1985) Nature 316: 828).

XIII) Peptide gegen Asthma

Weiterhin läßt sich dem Verfahren ein Medikament zur Behandlung von Asthma entwickeln. Hierbei spielt das "vaso active intestinal peptide (VIP" eine wesentliche Rolle. VIP oder Derivate sind zur Behandlung von Asthma geeignet (Bolin et al. (1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41: 124). VIP Agonisten werden dadurch ermittelt, indem der VIP Rezeptor wie beschrieben mit der Peptidbank inkubiert wird, VIP-Rezpetor-bindenden Peptide indentifiziert werden und auf ihre biologische Wirksamkeit getestet werden. VIP-Agonisten sollten bronchodilatorische Eigenschaften haben (O′Donnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 6389).

XIV) Peptide gegen Tumore und Infektionskrank­ heiten

Weiterhin läßt sich dem Verfahren ein Medikament entwickeln was sich zur allgemeinen Stimulation des Immunsystems und damit zur allgemeinen Behandlung von Tumoren und chronischen Infektionskrankheiten eignet. Hierbei spielt das Lymphozyten Protein CD3 eine wesentliche Rolle. Antikörperfragmente gegen CD3 sind in der Lage, das Immunsystem in vivo zu aktivieren (Wedrychowsky et al. (1993) BIO/TECHNOLOGY 11: 486). Wichtig hierbei ist die Bindung des Antikörperfragments an CD3 Voraussetzung. Mit dem beschriebenen Verfahren lassen sich Peptide oder Derivate finden, die CD3 spezifisch binden. Markiertes CD3 Protein wird wiederum mit der Peptidbank inkubiert und die best-bindenden Peptide in vitro auf ihre immunstimulatorische Wirkung hin getestet. Peptide, die immunstimulatorisch wirken, sollten in der Lage sein, ähnlich den Antikörperfragmenten das Wachstum bestimmter Zelltypen zu beschleunigen (VanWauwe et al. (1980) J. Immuno. 124: 2708).

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch in der Umweltanalytik anwendbar. Hier bietet das Verfahren die Möglichkeit, Vor-Ort-Analytik von Umweltschadstoffen über die Verwendung von Peptiden zur Identifizerung mehrerer Substanzen mittels Multisensoren entscheidend zu verbessern. Für jeden Schadstoff lassen sich Peptide als spezifisch bindende Substanzen identifizieren, die dann in geeigneten Biosensoren einen eindeutigen Nachweis erlauben. Gerade die schnelle Analytik bei Störfällen kann helfen, Schäden für die betroffene Bevölkerung zu minimieren.

Beispiele

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Substanzen auffindbar die zur Behandlung des septischen Schocks, Kachexie und Arthritis geignet sind. Ein wesentlicher Mediator dieser Krankheiten ist der Tumor-Nekrosis-Faktor-alpha (TNFα, zur Übersicht über die Wirkungsweisen des TNFs siehe A. G. Porter (1991), TIBTECH 9: 158). Eine solche Substanz, nämlich ein TNFa-Antagonist muß die Stelle des Moleküls spezifisch binden, die normalerweise für die Bindung an die beiden TNF-Rezeptoren sp55 und sp75 (L. A. Tartaglia und D. V. Goeddel (1992), Immunology Today, 13: 151) verantwortlich ist.

Die antagonistischen Eigenschaften der mit diesem Verfahren erhaltenen Peptide wird auf folgende Weise ermittelt: Es wird in einem Zellkultursystem geprüft, ob diese Peptide in der Lage sind bestimmte Zelltypen vor dem zytotoxischen Effekt des TNF zu schützen (C. J. Galloway et al. (1991), J. Immun. Meth. 140: 37). Dazu wird TNF alleine und in Gegenwart der Peptide zu einer Zellkultur gegeben, die TNF sensitive Zellen enthält. Bei der Zugabe von TNF alleine oder in Gegenwart von nicht aktiven Peptiden sterben die Zellen innerhalb eines Tages. Wirken die Peptide als Antagonisten, überleben die Zellen. Die Wirkung der Peptide läßt sich über calorimetrische Verfahren quantifizieren (L. M. Green et al. (1984), J. Immun, Meth. 70: 257), denn nur lebende Zellen lassen sich mit Tetrazolium Farbstoff anfärben.

Die Beschreibung der Beispiele verdeutlicht, daß das erfindungsgemäße Verfahren es ermöglicht, funktionelle TNF-Antagonisten mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptidbank aufzufinden.

1. Material 1.1 Aminosäuren

Es werden Fmoc-geschützte Aminosäuren der Firma Novabiochem, Cambridge Research Biochemicals und der Firma BACHEM verwendet. Die Aminosäuren liegen teils schon aktiviert als PfP- oder Dhbt-Ester vor, teils werden sie in vitro mit TBTU oder DIC/NMI aktiviert. Die Aktivester der Aminosäuren werden als Lösung in NMP bei -20°C mit Ausnahme des Aktivesters von Arginin aufbe­ wahrt, der immer neu hergestellt werden muß.

1.2. Zellulose

Es wird gehärtete Zellulose (Whatman 540) verwendet.

1.3. ¹²⁵1-markiertes TNFα

Das ¹²⁵1-markierte TNFα hat eine spezifische Aktivität von etwa 650 Ci/mmol und wird von der Firma Amersham bezogen.

2. Methoden 2.1. Modifikation der Zellulose

Die Zellulose-Membran wird chemisch modifiziert, um an der Baustein-Kopp­ lungsstelle die nachfolgende Peptidsynthese zu ermöglichen und das an­ schließende Selektionierungs-Verfahren zu erleichtern. Dabei wird zwischen dem Trägermaterial und der zu synthetisierenden Peptidsequenz ein Abstands­ halter (Spacer) eingefügt. Dieser Abstandshalter dient dazu, die freie Zu­ gänglichkeit der immobilisierten Peptide zu gewährleisten. In einem ersten Schritt wird die gesamte Membran mit einer ß-Alanin-Lösung inkubiert, so daß sich über eine Veresterung mit den OH-Gruppen der Zellulose eine gleich­ mäßige Verteilung von β-Alanin ergibt.

Das Verfahren setzt sich aus den folgenden Schritten zusammen:

• - Aktivieren von 0,2 mol/l Fmoc-β-Alanin mit 0,24 mol/l DIC und 0,4 mol/l NMI (in DMF) und 3 Stunden Inkubieren mit der Zellulose- Membran,
• - dreimal Waschen mit DMF,
• - Abspalten der Fmoc-Schutzgruppe des veresterten β-Alanins durch Inkubation mit 20% Piperidin in DMF für 20 Minuten
• - fünfmal Waschen mit DMF,
• - zweimal Waschen mit Methanol und Trocknen.

In einem zweiten Schritt wird ein zweites β-Alanin auf definierte Punkte der Membran aufgetropft, so daß dort ein zweites β-Alanin gekoppelt wird. Die Punkte werden vorher mit einem Bleistift auf der Rückseite der Membran mar­ kiert. Alle restlichen Aminofunktionen der Membran werden durch Acetylierung blockiert und Fmoc wird wieder mit Piperidin abgespalten. Die freien Amino­ gruppen werden nun durch Färben mit BPB sichtbar gemacht und erscheinen als blaue unterscheidbare Flecken.

Dieses Verfahren hat folgende Schritte:

• - pro Fleck 0,5 µl Fmoc β-Alanin (0,3 mol/l), TBTU (0,3 mol/l 1 : 1 in NMP,
• - zweimal Inkubieren mit 2% Acetanhydrid in DMF für 3 Minuten,
• - einmal Inkubieren in 2% Acetanhydrid plus 1% Disopropylethyla min in DMF für 30 Minuten,
• - dreimal Waschen mit DMF,
• - Inkubieren in 20% Piperidin in DMF für 15 Minuten,
• - fünfmal Waschen mit DMF,
• - Färben mit 0,01% BPB in DMF für fünf Minuten und
• - Trocknen

2.2 Bestimmung der Funktionalität der Flecken ("Spots")

Um beim Koppeln mit dem Aminosäure-Gemisch einen statistischen Einbau aller Aminosäuren zu erreichen, wird mindestens zweimal, üblicherweise dreimal im Verhältnis 0,8 zu 1 (Summe aller Aminosäuren im Gemisch zu Baustein- Kopplungsstellen des einzelnen Spots) gekoppelt. Daher muß zunächst die Anzahl freier Aminofunktionen pro "Spot" ermittelt werden. Dazu wird eine definierte Fläche der zweifach mit β-Alanin gekoppelten Membran ausgeschnitten und mit 0,05% BPB in DMF sättigend gefärbt. Nach dreimaligem Waschen mit Methanol und Trocknen des Membranstückes wird dieses mit 20% Piperidin in DMF wieder entfärbt und die farbige Lösung im Photometer bei 605 nm gemessen. Unter der Annahme, daß ein BPB-Molekül pro NH₂-Gruppe gebunden wird und mit dem Extinktionskoeffitienten ε = 95.000 mol^-1·|·cm^-1 kann mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes die Anzahl freier Aminofunktionen pro "Spot" ermittelt werden. Im allgemeinen ergibt sich ein Wert von etwa 60 nmol Aminofunktionen pro "Spot" (Reaktionspartner pro Baustein-Kopplungsstellen).

2.3. Kopplung der Aminosäuren

An den Positionen 1, 2, 4 und 6 des zu synthetisierenden Hexapeptides (Syntheserichtung vom Karboxyl- zum Amino-Rest) wird ein äquimolares Ami­ nosäure-Gemisch aus allen Aminosäuren außer Tryptophan, Methionin und Cystein im Verhältnis 0,8 zu 1 eingesetzt (Summe aller Aminosäuren im Ge­ misch zu Baustein-Kopplungsstellen am jeweiligen "Spot"). Bei der oben ge­ nannten Funktionalität der Membran von etwa 60 nmol Baustein-Kopplungsstel­ len pro "Spot" ist die Konzentration der Aminosäurelösung 50 nmol/l. Um eine vollständige Acylierung zu gewährleisten, muß mindestens zweimal gekoppelt werden.

An den Positionen 3 und 5 (Syntheserichtung wie zuvor) wird die zur Erstellung einer kombinatorischen Peptidbank (peptide library) jeweils notwendige defi­ nierte Aminosäure in einer Konzentration 0,3 mol/l mindestens zweimal nacheinander gekoppelt, um eine vollständige Acetylierung zu gewährleisten.

Zwischen den einzelnen Kopplungen wird die Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin abgespalten.

Das Verfahren umfaßt folgende Schritte:

• - Auftropfen von 1 µl Aminosäure oder Aminosäure-Gemisch auf jeden "Spot",
• - Reaktion über 15 Minuten,
• - Wiederholen: einmal bei definierten Aminosäuren und zweimal bei dem Gemisch,
• - dreimal Waschen mit DMF,
• - Inkubieren mit 20% Piperidin in DMF über 15 Minuten,
• - fünfmal Waschen mit DMF,
• - zweimal Waschen mit Methanol und
• - Trocknen und für den nächsten Baustein analog die nächsten Kopplungen durchführen.

2.4. Acetylierung des N-Terminus und Abspaltung der Seitenschutz­ gruppen

Sind alle Kopplungen durchgeführt, wird nach Abspaltung der letzten Fmoc- Schutzgruppe der N-Terminus acetyliert, um die Peptide vor Proteaseabbau zu schützen. Danach werden die Seitenschutzgruppen abgespalten.

Dabei liegen folgende Verfahrensschritte vor:

• - zweimal Inkubieren mit 2% Acetanhydrid in DMF für fünf Minuten,
• - dreimal Waschen mit DMF,
• - zweimal Waschen mit Methanol,
• - Trocknen,
• - Inkubieren mit 50% TFA, 3% Triisobytylsilan, 2% Wasser, 1% Phenol in DCM für drei Stunden,
• - viermal Waschen mit DCM,
• - dreimal Waschen mit DMF,
• - zweimal Waschen mit Methanol und
• - Trocknen.

2.5. Blockieren der Membran

Vor einer Inkubation mit TNF werden die freien Bindungsstellen auf der Mem­ bran durch eine einstündige Inkubation mit 1% BSA, 0,05% Tween80 (Detergenz) in PBS bei Raumtemperatur blockiert.

2.6. Inkubation mit TNFα

Die Membran wird fünf Stunden bei Raumtemperatur mit 20 µCi TNFα in 40 ml 1% BSA, 0,05% Tween80 in PBS inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit PBS wird die getrocknete Membran einem Röntgenfilm ausgesetzt, oder es wird eine beschichtete Platte eines Phosphoimagers belichtet.

3. Ergebnisse 3.1. Erstes Synthese- und Selektionierungsverfahren der kombinatori­ schen Peptidbank (peptide library) mit TNFα

Aus dem ersten Synthese- und Selektionierungsverfahren wird unter anderem als gut bindende Sequenz

NH₂-X₁·X₂·F₃·X₄·F₅·X₆-COOH

ermittelt. Dabei steht X für eine der natürlichen, nach dem Zufallsprinzip ge­ koppelten Aminosäuren außer Cystein. F steht gemäß dem internationalem Code für Phenylalanin. Der Index gibt die Position in der Sequenzfolge des Hexapeptides an, wobei die Zählweise mit dem N-Terminus beginnt.

3.2. Zweites Synthese- und Selektionierungsverfahren der kombinato­ rischen Peptidbank mit TNFα

Beim zweiten Syntheseschritt wird die Position 4 der Sequenz mit einer definierten Aminosäure besetzt. Es ergeben sich dadurch 20 bezüglich der Position 4 unterschiedliche Ansätze. Das zuvor erwähnte Selektionierungsverfahren wird ebenfalls hier angewendet.

Es wird als bestbindende Sequenz

NH₂-X₁·X₂·F₃·R₄·F₅·X₆-COOH

gefunden.

3.3. Drittes Synthese- und Selektionierungsverfahren der kombinatori­ schen Peptidbank mit TNFα

Die dritte Synthese verläuft wie unter 3.2 beschrieben, jedoch wird in diesem Fall die Position 6 mit einer definierten Aminosäure besetzt.

Es wird als bestbindende Sequenz

NH₂-X₁·X₂·F₃·R₄·F₅·R₆-COOH

gefunden.

Abkürzungen

BPB Bromphenolblau
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumine)
DCM Dichlormethan
DIC Diisopropylcarbodiimid
Dhbt 3-Hydroxy-2,3-dihydro-4-oxo-bezotriazin
DMF Dimethylformamid
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
NMI N-Methylimidazol
PBS Phosphatgepuffertes Salz (phosphate buffered saline)
PfP Pentafluorphenyl
TFA Trifluoressigsäure
TNFα Tumor-Nekrose-Faktor α

SEQUENZPROTOKOLL

SEQ. ID. NO: 1
Art der Sequenz: Aminosäure-Sequenz
Sequenzlänge: 6 Aminosäuren
Art des Moleküls: synthetisches Pepetid
Xaa·Xaa·Phe·Xaa·Phe·Xaa

SEQ. ID. NO: 2
Art der Sequenz: Aminosäure-Sequenz
Sequenzlänge: 6 Aminosäuren
Art des Moleküls: synthetisches Pepetid
Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Xaa

SEQ. ID. NO: 3
Art der Sequenz: Aminosäure-Sequenz
Sequenzlänge: 6 Aminosäuren
Art des Moleküls: synthetisches Pepetid
Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Arg

SEQUENCE LISTING IN ENGLISH LANGUAGE

SEQ. ID. NO: 1
Sequence Type: Aminoacid Sequence
Sequence length: 6 Aminoacids
Molecule Type: Synthetically manufactured Pepetide
Xaa·Xaa·Phe·Xaa·Phe·Xaa

SEQ. ID. NO: 2
Sequence Type: Aminoacid Sequence
Sequence length: 6 Aminoacids
Molecule Type: Synthetically manufactured Pepetide
Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Xaa

SEQ. ID. NO: 3
Sequence Type: Aminoacid Sequence
Sequence length: 6 Aminoacids
Molecule Type: Synthetically manufactured Pepetide
Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Arg

Claims (29)

1. Verfahren zur Synthese von Sequenzbanken die Sequenzen besitzen, welche sich aus kovalent verbundenen Bausteinen, zusammensetzen,
die je eine Sequenzposition in der Sequenz einnehmen, die unterschiedliche Reaktionskinetiken bei der Synthese aufweisen,
die vor der Synthese zur Bildung der kovalenten Bindung aktivierte Bausteine sind, und
die aus zwei Typen von Bausteinen bestehen, zum einen (i) Auswahlbausteinen und zum anderen (ii) Zufallsbausteinen unter Verwendung einer Festphasen-Synthese auf oder in einem Trägermaterial, wobei die Sequenz

• i) wenigstens einen Auswahlbaustein besitzt dessen Struktur und Sequenzposition bei der Synthese bestimmt ist, und
• ii) wenigstens einen statistisch bestimmbaren Zufallsbaustein besitzt der an einer bestimmten Sequenzposition nach dem Zufallsprinzip aus einem Bausteingemisch mit bestimmten Strukturen zur Reaktion gelangte,

wobei sich auf oder in dem Trägermaterial Auftragungsorte zur Auftragung der aktivierten Bausteine befinden, dabei besitzen die Auftragenungsorte Baustein-Kopplungsstellen für die Bindung des bei der Synthese aktivierten Bausteins, der der erste in der Sequenz ist,
wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
fortlaufende Synthese der Sequenz, je eine eigene Vorgehensweise für die Synthese der Auswahlbausteine und der Zufallsbausteine,

• aa) wobei, wenn ein Auswahlbaustein an einer bestimmten Position synthetisiert werden soll, der aktivierte Auswahlbaustein an wenigstens einem definierten Auftragungsort auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Auswahlbausteine im Überschuß gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen, und
• bb) wobei wenn ein Zufallsbaustein an einer bestimmten Position der Sequenz synthetisiert werden soll, ein Gemisch aus aktivierten Zufallsbausteinen an allen Auftragungsorten auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die. Zufallsbausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens im 4fachen Überschuß, und dabei werden nach der Kopplungsreaktion weitere Bausteine hinzugegeben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zufallsbausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenz drei Auswahlbausteine an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzt indem bei der Synthese drei Auswahlbausteine an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Trägerma­ terial aus Zellulose besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren zur Synthese von Peptidbanken aus natürlichen Aminosäuren und/oder deren Derivaten (Aminosäuren) unter Kopplung von Aminosäuren dient, wobei die Aminosäuren je eine Sequenzposition in der Sequenz einnehmen, vor der Kopplung zur Bildung der kovalenten Bindung am Carboxylende aktiviert sind, und die aus zwei Typen von Aminosäuren bestehen, zum einen (i) Auswahlaminosäure und zum anderen (ii) Zufallsaminosäure, unter Verwendung einer Festphasen-Synthese auf oder in einem Trägermaterial wobei die Sequenz

• i) wenigstens eine Auswahlaminosäure besitzt, deren Struktur und Sequenzposition bei der Peptidsynthese bestimmt ist, und
• ii) wenigstens eine statistisch bestimmbare Zufallsaminosäure besitzt die an einer bestimmten Sequenzposition nach dem Zufallsprinzip aus einem Aminosäuregemisch mit bestimmten Aminosäuren zur Reaktion gelangte,

wobei sich auf oder in dem Trägermaterial Auftragungsorte zur Auftragung der aktivierten Aminosäuren befinden, dabei besitzen die Auftragungsorte Aminosäure-Kopplungsstellen für die Bindung der bei der Synthese aktivierten Aminosäure in der Peptidsequenz, die die erste Aminosäure in der Peptidsequenz ist,
wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
fortlaufende Synthese der Peptidsequenz unter Kopplung der in der Peptidsequenz ersten Aminosäure an die Aminosäure-Kopplungsstelle und unter der Kopplung der in der Peptidsequenz weiteren Aminosäuren an das N- terminale Ende des teilsynthetisierten Peptides, je eine eigene Vorgehensweise für die Kopplung der Auswahlaminosäure und der Zufallsaminosäure,

• aa) wobei, wenn ein Auswahlaminosäure an einer bestimmten Sequenzposition gekoppelt werden soll, die aktivierte Auswahlaminosäure an wenigstens einem definierten Auftragungs­ ort auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird dabei sind die Auswahlaminosäuren gegenüber den Aminosäure- Kopplungsstellen im Überschuß, und
• bb) wobei wenn eine Zufallsaminosäure an einer bestimmten Sequenzposition gekoppelt werden soll, ein Gemisch aus aktivierten Zufallsaminosäuren an allen Auftragungsorten auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird,
• dabei sind die Zufallsaminosäuren in ihrer Summe gegenüber den Aminosäure-Kopplungsstellen höchstens im 4fachen Überschuß
  und dabei werden nach der Kopplungsreaktion weitere Aminosäuren hinzugegeben.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zufallsaminosäuren in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Sequenz drei Auswahlaminosäuren an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzt, indem bei der Synthese drei Auswahlaminosäuren an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 6 bis 8, wobei die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist.

10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 6 bis 9, wobei das Trägermaterial aus Zellulose besteht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die Aminosäuren D- oder L- Aminosäuren und/oder deren Derivate sind.

12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 6 bis 11, wobei die Aminosäure-Kopplungsstellen Alaninreste sind, die mit dem Trägermaterial kovalent verbunden sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Alaninrest über eine Esterbindung mit der Zellulose verbunden ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren zur Synthese von Polysaccharidbanken aus natürlichen Zuckern und/oder deren Derivaten (Sacchariden) unter Kopplung von Sacchariden dient, wobei die Saccharide, je eine Sequenzposition in der Sequenz einnehmen,
die unterschiedliche Reaktionskinetiken bei der Synthese aufweisen,
die vor der Synthese zur Bildung der kovalenten Bindung aktivierte Saccharide sind, und
die aus zwei Typen von Sacchariden bestehen, zum einen (i) Auswahlsacchariden und zum anderen (ii) Zufallssacchariden, unter Verwendung einer Festphasen-Synthese auf oder in einem Trägermaterial, wobei die Sequenz

• i) wenigstens ein Auswahlsaccharid besitzt dessen Struktur und Sequenzposition bei der Synthese bestimmt ist, und
• ii) wenigstens ein statistisch bestimmbares Zufallssaccharid besitzt das an einer bestimmten Sequenzposition nach dem Zufallsprinzip aus einem Saccharidgemisch mit bestimmten Sacchariden zur Reaktion gelangte,
  wobei sich auf oder in dem Trägermaterial Auftragungsorte zur Auftragung des aktivierten Saccharids befinden, dabei besitzen die Auftragenungsorte Saccharid-Kopplungsstellen für die Bindung des bei der Synthese aktivierten Saccharids, das das erste in der Sequenz ist,
  wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
  fortlaufende Synthese der Saccharidsequenz unter Kopplung des in der Saccharidsequenz ersten Saccharids an die Saccharid-Kopplungsstelle und unter der Kopplung der in der Saccharidsequenz weiteren Sacccharide an die reagibel funktionelle Gruppe des teilsynthetisierten Saccharids je eine eigene Vorgehensweise für die Synthese des Auswahlsaccharids und des Zufallssacccharids,
• aa) wobei, wenn ein Auswahlsaccharid an einer bestimmten Sequenzposition synthetisiert werden soll, das aktivierte Auswahlsaccharid an wenigstens einem definierten Auftragungsort auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Auswahlsaccharide im Überschuß gegenüber den Saccharid-Kopplungsstellen, und
• bb) wobei wenn ein Zufallssaccharid an einer bestimmten Position der Sequenz synthetisiert werden soll, ein Gemisch aus aktivierten Zufallssacchariden an allen Auftragungsorten auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird, dabei sind die Zufallssaccharide in ihrer Summe gegenüber den Saccharid-Kopplungsstellen höchstens im 4fachen Überschuß, und dabei werden nach der Kopplungsreaktion weitere Saccharide hinzugegeben.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zufallssaccharide in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Sequenz drei Auswahlsaccharide an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzt, indem bei der Synthese drei Auswahlsaccharide an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 14 bis 16, wobei die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist.

18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 14 bis 17, wobei das Trägermaterial aus Zellulose besteht.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Bausteine eine zyklische Pentose oder Hexose oder deren Derivate sind.

20. Verfahren zur Synthese und Selektionierung von Sequenzen aus kovalent verbundenen Bausteinen, Aminosäuren oder Sacchariden nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei nach der Synthese der Sequenz eine Selektion der gewünschten Sequenzen mit Hilfe von Bindungstests oder spezifischen Reaktionen erfolgt, dabei werden die funktionell bestimmten Sequenzen gegebenenfalls durch Indikatoren dargestellt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Bindungstest in einem Anhaften markierter Testsubstanzen und Sichtbarmachung der Markierung besteht.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Markierung aus radioaktivem Material oder aus Biotin oder aus kovalent verbundenen Enzymen besteht.

23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Reaktionen durch allosterischen Enzyme gemessen wird.

24. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Reaktion eines Zellsystems gemessen wird.

25. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Reaktion aus einer Zell-Zell- Wechselwirkung besteht.

26. Unverzweigte oder verzweigte Peptide aus D- oder L-Aminosäuren und/oder Aminosäure-Derivaten, welches Peptid eine Struktur besitzt, die unter Verwendung der zuvor genannten Synthese- und Selektionierungsverfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 20 bis 25 unter Rückbezug auf die Ansprüche 6 bis 13 erhaltbar ist.

27. Verfahren zur Peptidsynthese von unverzweigten oder verzweigten Pep­ tiden aus D- oder L-Aminosäuren und/oder Aminosäure-Derivaten, wobei die Sequenz synthetisiert wird, die die Peptid-Struktur besitzt, die unter Verwendung der Synthese- und Selektionierungsverfahren nach einem der vorherigen An­ sprüche 20 bis 25 unter Rückbezug auf die Ansprüche 6 bis 13 erhaltbar ist.