DE4308410A1

DE4308410A1 - Verfahren zur Synthese und Selektionierung von Sequenzen aus kovalent verbundenen Bausteinen

Info

Publication number: DE4308410A1
Application number: DE19934308410
Authority: DE
Inventors: Jens Dr Schneider-Mergener
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1993-03-12
Filing date: 1993-03-12
Publication date: 1994-09-15

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese und Selektionierung von Se quenzen aus kovalent verbundenen Bausteinen zur Bestimmung von Sequen zen; weiterhin Verfahren zur Herstellung von Sequenzen, die unter Verwendung des Synthese- und Selektionierungsverfahrens erhalten wurden, und Peptide, deren Struktur unter Verwendung des Synthese- und Selektionierungsverfah rens bestimmt wurden.

Stand der Technik

Die Entwicklung und Erforschung von neuen Medikamenten, die von Organi schen Chemikern in traditioneller Methode vorgenommen wird, basiert auf der Synthese einer großen Anzahl von Substanzen. Die bisher bekannten Selek tionierungsverfahren sind arbeitsaufwendig und weisen pro Zeiteinheit nur eine begrenzte Vielfalt an Substanzen auf. Mehr und mehr gewinnt die theoreti sche Substanzgestaltung an Bedeutung, bei der mit Computermodellen Struktu ren von Molekülen ermittelt werden. Jedoch ist diese Methode noch nicht ausreichend ausgereift, so daß klassische Selektionierungs-Verfahren noch immer von großem Wert sind.

Unterschiedliche Ansätze sind gemacht worden, Substanzen herzustellen und zu selektionieren.

Ein wesentlicher Durchbruch bei diesem Verfahren wurde durch eine Peptid- Bank (peptide library) auf Phagen-Oberflächen erzielt (J. SCOTT and G.P. SMITH, (1990) Science 249: 386). Die im Selektionierungs-Verfahren positi ven Phagen werden bezüglich ihrer DNA analysiert, wodurch die auf der Ober fläche exprimierte Aminosäure-Struktur ermittelt wird. Nachteilig ist, daß die Phagen in Wirtszellen vermehrt werden müssen und daß die Selektionierungs verfahren geeignet sein müssen, die Peptide an der Zelloberfläche zu erken nen. Das zu selektionierende Peptid ist auf den Zellen ein Peptid neben sehr vielen anderen exprimierten Proteinen. Diese Selektionierung hat dadurch eine systembedingte Unsicherheit. Weiterhin können lediglich die zwanzig natürli chen Aminosäuren bei dem Verfahren zur Herstellung und Selektionierung der gewünschten Sequenzen verwendet werden.

Bei einem weiteren bekannten Verfahren werden kugelförmige Trägermateria lien verwendet, auf denen die Peptide synthetisiert werden. (K.S. LAM et al. (1991) Nature 354: 82). Je zwanzig Ansätze werden gefahren, ein Ansatz pro Aminosäure. Nach jedem Syntheseschritt werden die Kugeln gemischt und erneut in zwanzig Reaktionsgefäße aufgeteilt. Bei der Selektionierung werden die positiven Kugeln ermittelt und die Sequenz der darauf befindlichen Peptide bestimmt. Nachteil dieser Methode ist die umständliche Handhabung nach der Synthese. Die Selektionierung von positiven Kugeln ist erschwert, eine Sequenzanalyse ist notwendig. Das bei einer Kugel vorliegende Material ist mengenmäßig sehr gering.

Eine Variante des zuvor beschriebenen Verfahrens wird in der Publikation HOUGHTEN et al. (1991) Natur 354: 84 dargestellt. Dabei wird eine kom binatorische Bibliothek angelegt. So werden zum Beispiel zwei Positionen in der Aminosäure-Sequenz festgelegt. Bei dem restlichen Koppeln weiterer Bausteine sind diese Ansätze getrennt voneinander zu halten. Zwar besitzen diese Ansätze definierte Bausteine in bestimmten Positionen und auch ist dieser Baustein bekannt, jedoch erfordert diese Methode eine Vielzahl an parallel zu behandelnden Reaktionsgefäßen. Es wird bei jeder Reaktion lediglich eine bestimmte Aminosäure gekoppelt. Cystein wird nicht als Baustein für die Er stellung der Sequenzen verwendet.

Eine weitere Methode besteht darin, daß auf einem festen planaren Träger Baustein-Kopplungsstellen angeordnet sind, die mit Hilfe von Lichtenergie zur Reaktion mit einem weiteren Baustein angeregt werden kann. Die Licht energie kann aus einem Laser stammen, der gezielt Punkte anstrahlt. Eben so ist eine Verwendung von Lochblenden möglich, die ebenfalls das gezielte Belichten von einzelnen Punkten erlauben. (P.A. FODOR et al. (1991) Science 251: 767) Nachteilig an dieser Methode ist, daß ein hoher techni scher Aufwand erforderlich ist. So muß ein Laser oder ein Gerät zur gezielten Belichtung von einigen definierten Reaktionsorten vorhanden sein. Auch sind die Reaktionsmechanismen beschränkt, da unbedingt eine Photoreaktion bei dieser Methode angewendet werden muß.

Weiterhin ist bekannt Peptide auf einem Trägermaterial, so zum Beispiel Zellu lose, zu synthetisieren. Dadurch hat jedes Peptid einen definierten Platz auf dem Trägermaterial. (R. FRANK and R. DÖRING (1988) Tetrahedron 44: 6031) Aufgrund des anschließenden Selektionierungsverfahrens kann das bindende Molekül einer bestimmten Aminosäure-Sequenz zugeordnet werden. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, daß lediglich definierte Sequenzen synthetisiert werden können.

Ist erst einmal die gesuchte Sequenz ermittelt, ist die Synthese von Peptiden einfach zu bewerkstelligen. Eine Zusammenfassung dieser Techniken kann bei J.M. STEWART and J.D. YOUNG, San Francisco, 1969, and J. MEIERHO- FER, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2 p. 46 Academic Press (New York), 1973 für Festphasen-Methode und E. SCHRODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York) 1965 für die Flüssigphasen-Me thode nachgelesen werden. Die Schritte der Synthese sind in der Publikation EP 0 097 031 beschrieben. Die allgemeinen Verfahrensschritte aus der euro päischen Publikation lassen sich analog auf die Synthese nahezu aller Peptid- Verbindungen übertragen.

Aufgabe

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren anzubieten, mit dem gezielt Se quenzen herzustellen und zu selektionieren sind, wobei die Sequenzen be stimmte gewünschte Eigenschaften besitzen sollen, wobei die gewünschten Ei genschaften aus der spezifischen Erkennung von vorgegebenen Molekülen, zum Beispiel Rezeptormolekülen, besteht. Die nach diesem Verfahren erhal tenen Sequenzen sollen dann als Vorlage für Moleküle (pharmakologische Leitstrukturen) verwendet werden, die nach klassisch-chemischer Art hergestellt werden.

Lösung

Die Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zur Synthese und Selektionie rung von funktionell bestimmten Sequenzen aus kovalent verbundenen Bau steinen,
die unterschiedliche Reaktionskinetiken bei der Synthese besitzen und die vor der Synthese reagible Bausteine sind,
mit Hilfe von einer Festphasen-Synthese,
wobei auf oder im Trägermaterial Auf tragungsorte mit Baustein-Kopplungsstellen vorgegeben sind,
wobei die Sequenz
wenigstens einen bestimmten Baustein an einer bestimmten Posi tion der Sequenz besitzt und
wenigstens einen variablen Baustein, der nach dem Zufallsprinzip aus einem Gemisch ausgewählt wird, an einer ebenfalls bestimm ten Position der Sequenz besitzt,
wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:

(i) fortlaufendes Synthetisieren der Sequenz, je eine eigene Vorgehensweise für die Synthese der bestimmten Bausteine und der variablen Bausteine vorweisend,
(aa) wobei,
wenn ein bestimmter Baustein an einer bestimmten Position synthetisiert werden soll,

der reagible, bestimmte Baustein an wenigstens einem definierten Auftragungs ort auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird,
dabei sind die bestimmten Bausteine im Überschuß gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen, und

(bb) wobei,
wenn ein variabler Baustein an einer bestimmten Position der Sequenz synthetisiert werden soll,

ein Gemisch aus reagiblen, variablen Bausteinen an allen Auftragungsorten auf oder in dem Trägermaterial hinzugegeben wird,
dabei sind die variablen Bausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens im 4-fachen Überschuß, und dabei werden nach der Kopplungsreaktion weitere Bausteine hinzugegeben,

(ii) Selektion der gewünschten Sequenzen mit Hilfe von Bindungstests oder spezifischen Reaktionen, wobei die funktionell bestimmten Sequenzen gegebe nenfalls durch Indikatoren dargestellt werden.

Bei dem Gemisch sind die variablen Bausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens in einem 2-facher Überschuß, mehr be vorzugt höchstens in einem 1,5-facher Überschuß, noch mehr bevorzugt höch stens in einem 1,2-facher Überschuß und und am meisten bevorzugt höchstens in einem 0,94-facher Überschuß.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens

Einer der Vorteile dieses erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß in sehr kurzer Zeit Strukturen von zum Beispiel Peptid-Liganden ermittelt werden können, die spezifisch an zum Beispiel die extrazellulären Domänen von Re zeptoren binden können. Mit Hilfe dieses Zufallsprinzips liegen alle theore tisch denkbaren Strukturen während der schrittweisen Selektionierung vor. Sie können aufgrund des Verfahrensprotokolls für jede Baustein-Kopplungsstel le ermittelt werden.

Lediglich durch die Bestimmung, welche Bausteine in der Sequenzabfolge zu erst bestimmt und welche variabel sind, lassen sich die Ergebnisse unter schiedlich beeinflussen. Ansonsten zeichnet sich das Verfahren gerade da durch aus, daß die zu erhaltenden Peptide trotz Zufallsverfahrens bei den nicht bestimmten Bausteinen durch voneinander getrennte Verfahrensansätze nach arbeitbar sind.

Ermöglicht wurde diese Erfindung durch Reaktionsbedingungen, die bei der Synthese der variablen Bausteine vorliegt. Es ist üblich, das Gemisch der neu zu synthetisierenden Bausteine in seiner Summe im molaren Überschuß ge genüber den Baustein-Kopplungsstellen anzubieten, da sonst nicht alle Se quenzketten zur Reaktion gelangen. Eine nicht um einen weiteren Baustein verlängerte Sequenz führt dazu, daß Defekte in der Sequenz entstehen.

Weiterhin ist ein molarer Überschuß an zu koppelnder Aminosäure (Acylierungsreagenz) notwendig, da die Kopplungskinetik der einzelnen Ami nosäuren unterschiedlich ist, sich aber die Kopplungsausbeute für einen be stimmten Kopplungsschritt und eine bestimmte Aminosäure nie voraussagen läßt. Ein deutlicher molarer Überschuß umgeht dieses Problem. Bei den Peptid-Chemikern sind zwei bei achtfache Überschüsse Routine. Üblich ist ein vierfacher Überschuß. Hierbei handelt es sich um den Überschuß bei der Kopplung einer bestimmten Aminosäure. Das Angebot von Gemischen ist bisher nicht erwähnt worden. Durch die Kopplung eines komplexen Ami nosäure-Gemisches im molaren Unterschuß kann das Problem der unter schiedlichen Kinetik für einzelne Aminosäuren umgangen werden. Da diese im Verhältnis zur Amin-Komponente im Unterschuß vorliegen, müssen alle Ami nosäuren im wesentlich an quantitative abreagieren. Durch mindestens eine weitere Kopplung im gleichen molaren Verhältnis wird die Amin-Komponente am Träger dann vollständig umgesetzt. Somit besteht in den Fachkreisen das Vorurteil, daß Reaktionen ohne Überschuß der neuen zu koppelnden Bausteine nicht erfolgreich ablaufen können.

Entgegen der vorherrschenden Vorurteile werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die variablen Bausteine nicht im deutlichen Überschuß, bevorzugt höchstens äquimolar angeboten. Hierdurch werden fast alle variablen Bau steine äquimolar mit der Sequenz reagieren. Zwar werden die einzelnen Bausteine aufgrund ihrer unterschiedlichen Kinetik zu unterschiedlichen Zeiten zu 99% reagiert haben, jedoch reagieren praktisch alle aktivierten Aminosäuren.

Weitere Ausführungsformen

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die variablen Bau steine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind. Wenn der Fachmann höhere Konzentrationen verwendet, wird er dennoch Resultate erhalten, die jedoch nicht mehr der statistischen Verteilung entsprechen. Eine Verschlechterung des Verfahrens wird dann in Kauf genommen. Dieses Verfahren arbeitet bezüglich der statistischen Vertei lung dann am besten, wenn die Summe aller angebotenen variablen Bausteine höchstens äquimolar ist. Wird der äquimolare Bereich deutlich unterschritten, werden nur einige der Synthese-Ketten mit den variablen Bausteinen gekoppelt, andere bleiben ohne Reaktionspartner.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz drei bestimmte Bausteine an je einer bestimmten Posi tion der Sequenz besitzt, indem bei der Synthese drei bestimmte Bausteine an je einer bestimmten Position synthetisiert werden. Die Affinität von Bindungs molekülen steigt etwa exponentiell zur Anzahl der definierten Bausteine an. Drei definierte Bausteine erlauben eine bessere Vorselektion der Gesamt sequenz als die Verwendung von lediglich zwei definierten Bausteinen. Drei definierte Bausteine lassen sich auch auf einem im wesentlichen planaren Trä germaterial noch problemlos auftragen. Wenn zum Beispiel Peptidsequenzen erstellt werden sollen, so ergeben sich dann 8000 Baustein-Kopplungsstellen, die noch auf einem Zelluloseträger gut handhabbar sind. Die Verwendung von drei definierten Bausteinen stellt bei Peptiden einen sinnvollen Kompromiß zwischen der hohen Anzahl an Baustein-Kopplungsstellen und Bindungskapazi tät der Peptide dar.

Auch kann die Sequenz vier oder fünf bestimmte Bausteine an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzen, indem bei der Synthese entsprechend vier oder fünf bestimmte Bausteine an je einer bestimmten Position synthetisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist. Natürliche Sequen zen von Aminosäuren sind unverzweigt. Derartige lineare Moleküle sind somit sehr gut geeignet, an andere Strukturen anzulagern und Konformations änderungen zu bewirken. Jedoch ist das erfindungsgemäße Verfahren auf die lineare Synthese nicht beschränkt, Verzweigungen sind leicht möglich. Entsprechende Schutzgruppen sind dabei anzuwenden. Die verzweigten Moleküle haben den Vorteil, daß sie auch flächige Areale abdecken können. Hierdurch öffnet sich ein weiteres Anwendungsfeld des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ebenfalls sind zyklische Ausführungen möglich, die die Konfor mationsstabilität des Moleküls erhöhen.

Vorteilhaft ist es, wenn die Bausteine D- oder L-Aminosäuren und/oder deren Derivate sind. Neben den zwanzig L-Aminosäuren existiert eine große Zahl an Aminosäure-Derivaten, die zum Beispiel in dem Katalog der Firma BACHEM, Bubendorf, Basellandschaft, Schweiz, beschrieben sind. Derartige Peptide, die veränderte Aminosäuren enthalten, legen häufig eine anders geartete Pharmakokinetik an den Tag. Sie verhalten sich im Organismus anders als die Peptide, die ausschließlich aus natürlichen Aminosäuren bestehen. Sie sind gegenüber Proteasen stabiler, sie durchdringen teilweise die Zellmembra nen schlechter, wodurch das als Medikament genutzte synthetische Peptid für die Einwirkung im extrazellulären Bereich geeigneter als eine Sequenz aus L- Aminosäuren ist.

Als Trägermaterial können verschiedene Substanzen dienen, besonders geeig net ist das Trägermaterial aus Zellulose. Es hat den Vorteil, daß ein für die Synthese brauchbarerer Träger vorliegt, auf den leicht die Bausteine und deren Gemische aufgetragen werden können. Die ebene Fläche und die hohe Saugfähigkeit erleichtern die Handhabung.

Weiter eignet sich als Trägermaterial Polystyren Kügelchen, an denen die Fest phasensynthese der Peptidbank (peptide library) mittels Simultansynthese durch Aminosäure-Gemische ebenfalls durchgeführt werden kann. Die Simul tansynthese von Einzelkomponenten (zum Beispiel bei einem Hexapeptid mit der Sequenz X₁·X₂·B₃·X₄·B₅·X₆ [X = Aminosäure mit zufälliger Vertei lung; B = bestimmte Aminosäure]) der Peptidbank (peptide library) kann beson ders gut an einem multiplen Peptidsynthese-Automaten (zum Beispiel der Firma Abimed AMS 422) durchgeführt werden. 48 Ansätze sind zum Beispiel mit ei nem zuvor genannten Gerät simultan zu synthetisieren. Mit Hilfe dieser Me thode können größere Mengen an freien Peptiden gewonnen werden, die zum Beispiel für Zelltests eingesetzt werden können.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die Baustein- Kopplungsstellen β-Alaninreste sind, die mit dem Trägermaterial kovalent ver bunden sind. β-Alanin ist dabei über eine Esterbindung an das Zellulosema terial gekoppelt. Eine definierte Anzahl von Baustein-Kopplungsstellen ist er forderlich, um zu wissen, welche Mengen an Bausteinen bei jedem Synthese schritt angeboten werden müssen. Weiterhin ist es möglich an den Kopp lungsstellen, die Sequenzen von dem Träger zu lösen.

Als weitere Baustein-Kopplungsstellen eignen sich Glycin, andere Aminosäure- Karbonsäuren (außer β-Alanin), Polyethylenglykol (RAPP et al. in Peptides 1988; Ed. G. JUNG, E. BAYER, Walter deGRUYTER, Berlin 1989, Seiten 199 - 201) und sämtliche Linkergruppen für die Peptidsynthese, die kommerziell er hältlich sind und von denen sich nach der Synthese sogar das Peptid wieder abspalten läßt (vgl. Katalog von NOVABIOCHEM 93).

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Gemisch aus natürli chen Aminosäuren, die im wesentlichen in gleichen molaren Anteilen vorliegen, bestehen.

Weiterhin kann das Gemisch aus den D-Konfigurationen der natürlichen Ami nosäuren, die im wesentlichen in gleichen molaren Anteilen vorliegen, beste hen. Ebenfalls kann es sich bei den Bausteinen um Aminosäure-Derivate handeln. Solche Derivate sind zum Beispiel in dem Katalog der Firma BACHEM, Bubendorf, Basellandschaft, Schweiz aufgelistet.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die Bausteine Zuckerbausteine sind. Zuckerbausteine sind ausführlich in der Literatur be schrieben. (zum Beispiel RÖMPPS, Chemie-Lexikon, ed. NEUMÜLLER, O.-A. (1983) 8. Auflage, Seiten 2147 bis 2152) Es ist bekannt, daß die verschiedenen Zuckerbausteine unterschiedliche Reaktionskinetiken besitzen. (vgl.: PAULSEN, H. (1990) Angew Chem 102: 851; KUNZ, H. (1987) Angew Chem 99: 297; PLEWE, M. et al. (1992) Carbohydr Res 235: 151; und OGAWA, T. et al. (1984) Pur Appl Chem 56: 779) Dadurch liegt auch hier ein vergleich bares Problem wie bei den Aminosäure-Sequenzen vor. Beide Systeme wei sen jedoch einige Unterschiede auf. Aufgrund der hohen funktionellen Dichte ist den Sacchariden ein höherer Informationsgehalt als den Aminosäuren ge geben. Im Gegensatz zur Peptidchemie sind die Verknüpfungsmöglichkeiten der Zucker äußerst komplex. Zwei Monosaccharide lassen sich theoretisch zu elf Disacchariden verbinden.

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Bau steine eine zyklische Pentose oder Hexose oder deren Derivate sind. Typi sche Pentosen sind in dem Standardwerk RÖMPPS beschrieben.

Biologisch relevante Monosacharide sind zum Beispiel Glucose, Galactose, Mannose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin oder N-Acetylneuramin säure.

Das Syntheseverfahren der bestimmten Bausteine ist dann effektiv, wenn die bestimmten Bausteine wenigstens in einem dreifachen Überschuß vorliegen. Gute Resultate sind in einer Spanne zu erwarten, die sich von dem dreifachen bis zum achtfachen Überschuß erstreckt.

Nach der Reaktion der variablen Bausteine sind einige Baustein-Kopplungsstel len nicht mit einem variablen Baustein besetzt. Um jedoch gleiche Molekül längen zu erzielen, werden nach Reaktion der variablen Bausteine die weiteren Bausteine wenigstens in einem zweifachen Überschuß hinzugegeben.

Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß nach der Synthese der Se quenzen auf bekannte und bewährte Indikatorverfahren zurückgegriffen werden kann, um festzustellen, welche Sequenzen die zu selektionierenden Eigen schaften besitzen.

Vorteilhaft ist es, wenn der Bindungstest in einem Anhaften markierter Testsub stanzen und Sichtbarmachung der Markierung besteht.

Bewährte und daher bevorzugte Verfahren bestehen darin, daß die Markierung aus radioaktivem Material oder aus Biotin oder aus kovalent verbundenen En zymen besteht. Weitere Methoden bestehen in der Messung der Fluoreszenz oder der Lumineszens.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt bei der Erfassung von Bindungsmo lekülen im speziellen auch die Moleküle, die eine Funktion auslösen. Dieses geschieht dadurch, daß die Reaktion durch zum Beispiel allosterische En zyme gemessen wird. Die Peptid-Banken (peptide library) können ebenfalls genutzt werden, um die Substratspezifität von Proteasen auszutesten oder mögliche Inhibitoren zu finden. Für die Substratspezifität müßten die Peptide z. B. fluoreszenzmarkiert werden. Dann müssen die einzelnen Baustein- Kopplungsstellen ausgeschnitten werden, mit Protease behandelt werden und die Freisetzung von Fragmenten photometrisch vermessen werden. Inhibitoren können dadurch gefunden werden, daß bestimmte Sequenzen, an die die Protease bindet, die aber die Protease nicht spalten kann, an den entsprechen den Baustein-Kopplungsstellen identifiziert werden können.

Ebenso ist es möglich, auch die Reaktion eines Zellsystems zu messen. Hierunter fallen auch alle Bindungen an Rezeptoren. So lassen sich eine Vielzahl von Rezeptoren bezüglich ihrer Bindungsfähigkeit zu den synthetisierten Liganden austesten.

Neben den Rezeptoren sind auch Metallatome für das Selektionierungs-Verfah ren geeignet, so zum Beispiel Technetium, Gadolinium, Nickel und Kalzium.

Technetium komplexierende Peptide können als zum Beispiel Tumordiagnosti ka eingesetzt werden. Nickel komplexierende Sequenzen können als Werk zeug für die Proteinreinigung über Nickelsäulen eingesetzt werden. Organisch chemische Moleküle sollten ebenfalls von Peptiden gebunden werden können. Pepetide, die Übergangsanaloga bestimmter organisch chemischer Reaktionen binden, können möglicherweise die Vorstufen neuartiger Katalysatoren bilden.

Auch komplexere Interaktionen sind zu messen, wobei die Reaktion aus einer Zell-Zell-Wechselwirkung bestehen kann.

Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren werden auch Sequenzen bean sprucht, nämlich unverzweigte oder verzweigte Peptide aus D- oder L-Ami nosäuren und/oder Aminosäure-Derivaten, welches Peptid eine Struktur besitzt, die unter Verwendung der zuvor genannten erfindungsgemäßen Synthese- und Selektionierungsverfahren erhalten wurde. Wenn mit Hilfe des erfindungsge mäßen Verfahrens eine Sequenz ermittelt worden ist, so ist es für den Fach mann ein leichtes, aufgrund dieser Sequenz zum Beispiel das Peptid synthe tisch herstellen zu können. Die Technik der Peptidsynthese ist zuvor schon ausführlich beschrieben worden. Die Erfindung liefert somit eine technische Lehre, die den Weg zur Sequenz offenbart. Die so ermittelte Sequenz kann dann auf Grund des Standardwissens des Fachmanns präparativ hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Lehre sind Sequenzen aufzufinden, die gewünschte spezifische Funktionen besitzen.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Peptidsynthese von unver zweigten oder verzweigten Peptiden aus D- oder L-Aminosäuren und/oder Ami nosäure-Derivaten, wobei die Sequenz synthetisiert wird, die die Peptid-Struktur besitzt, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Synthese- und Selektio nierungsverfahren erhalten wurde.

Definitionen

BAUSTEINE: Die Bausteine sind chemische Verbindungen, die zur Kettenbildung oder Verzweigung geeignet sind.

Vorzugsweise gehören die Bausteine zu einer Gruppe von chemischen Sub stanzen, so zum Beispiel zu den Aminosäuren und deren Derivaten. Die Ami nosäuren und deren Derivate können zur Gruppe der L- oder D-Aminosäuren gehören. Innerhalb einer Sequenz sind auch Mischformen möglich. Derivate von Aminosäuren zeichnen sich dadurch aus, daß die Seitenketten substituiert sind. Auch Sequenzketten über Seitenketten sind möglich, z. B. y-Glutamin.

Alle reaktiven Seitenketten können für die Synthese von verzweigten Peptid banken (peptide library) verwendet werden, wie zum Beispiel Lysin. Über die Umsetzung von Karbonsäuren wie Glutaminsäure und Asparaginsäure können Aminogruppen umgesetzt werden, so zum Beispiel Argingin mit Dionen.

Die Sequenzen können Verzweigungen aufweisen, wobei über eine funktionelle Gruppe die Verzweigung mit dem Hauptstrang der Sequenz verbunden ist. Bedeutsam ist, daß die Bausteine in wenigstens einem Reaktionsmedium alle löslich und reagibel sind.

Ebenfalls sind Zucker oder Zuckerderivate als Bausteine denkbar.

REAGIBLER BAUSTEIN: Ein Baustein, der eine aktivierte funktionelle Gruppe be sitzt, mit der er an schon vorhandenen Bausteinen oder Baustein-Kopplungsstel len binden kann. Weiterhin muß er solche Schutzgruppen besitzen, die eine Reaktion der gewünschten funktionellen Gruppen erlaubt, jedoch die nicht ge wünschten abschirmt.

FESTPHASEN-SYNTHESE: Die Festphasen-Synthese ist ausführlich beschrieben in Solid Phase Synthesis, E. ATHERTON and R.C. SHEPPARD (1989) IRL Press, ISBN 1-85221-133-4 und Amino Acid and Peptide Syntheses, J. JONES, Oxford Science Publication (1992) ISBN 0-19-855668-3.

TRÄGERMATERIALIEN: Verschiedenste Trägermaterialen sind in der Standardliteratur beschrieben. Besonders geeignet sind bei diesem Verfahren alle im wesentlichen planaren Träger, die ein einfaches Auftragen der reagiblen Bausteine ermöglicht. Zellulose eignet sich besonders gut. Hierbei haben sich Materialien von WHATMAN, Typ: Whatman Papier 540 (gehärtete Zellulose) als sehr brauchbar herausgestellt.

AUFTRAGUNGSORTE: Um den Versuch sinnvoll zu gestalten, ist die ein- oder zweidimensionale oder auch gegebenenfalls dreidimensionale Festlegung von Stellen auf oder in dem Trägermaterial erforderlich, um zu vermeiden, daß die Bausteine an den entsprechenden Auftragungsorten sich unkontrolliert mit den Bausteinen anderer Auftragungsorte vermischen können.

BAUSTEIN-KOPPLUNGSSTELLEN: Nicht alle Träger sind geeignet, die gewünsch ten Bausteine koppeln zu können. Weiterhin dürfen die Bausteine nach dem zweiten Synthesezyklus nicht mehr an dem Trägermaterial binden können. Daher ist es sinnvoll, auf oder in dem Trägermaterial sogenannte Anker-Mole küle zu befestigen. Hierzu eignet bei Zellulose zum Beispiel β-Alanin.

Beispiele 1. Material 1.1. Aminosäuren

Es werden Fmoc-geschützte Aminosäuren der Firma Novabiochem, Cambridge Research Biochemicals und der Firma BACHEM verwendet. Die Aminosäuren liegen teils schon aktiviert als PfP- oder Dhbt-Ester vor, teils werden sie in vitro mit TBTU oder DIC/NMI aktiviert. Die Aktivester der Aminosäuren werden als Lösung in NMP bei -20°C mit Ausnahme des Aktivesters von Arginin aufbe wahrt, der immer neu hergestellt werden muß.

1.2. Zellulose

Es wird gehärtete Zellulose (Whatman 540) verwendet.

1.3. ¹²⁵l-markiertes TNFα

Das ¹²⁵l-markierte TNFα hat eine spezifische Aktivität von etwa 650 Ci/mmol und wird von der Firma Amersham bezogen.

2. Methoden 2.1. Modifikation der Zellulose

Die Zellulose-Membran wird chemisch modifiziert, um an der Baustein-Kopp lungsstelle die nachfolgende Peptidsynthese zu ermöglichen und das an schließende Selektionierungs-Verfahren zu erleichtern. Dabei wird zwischen dem Trägermaterial und der zu synthetisierenden Peptidsequenz ein Abstands halter (Spacer) eingefügt. Dieser Abstandshalter dient dazu, die freie Zu gänglichkeit der immobilisierten Peptide zu gewährleisten. In einem ersten Schritt wird die gesamte Membran mit einer β-Alanin-Lösung inkubiert, so daß sich über eine Veresterung mit den OH-Gruppen der Zellulose eine gleich mäßige Verteilung von β-Alanin ergibt.

Das Verfahren setzt sich aus den folgenden Schritten zusammen:

- Aktivieren von 0,2 mol/l Fmoc-β-Alanin mit 0,24 mol/l DIC und 0,4 mol/l NMI (in DMF) und 3 Stunden Inkubieren mit der Zellulose- Membran,
- dreimal Waschen mit DMF,
- Abspalten der Fmoc-Schutzgruppe des veresterten β-Alanins durch Inkubation mit 20% Piperidin in DMF für 20 Minuten,
- fünfmal Waschen mit DMF,
- zweimal Waschen mit Methanol und
- Trocknen.

In einem zweiten Schritt wird ein zweites β-Alanin auf definierte Punkte der Membran aufgetropft, so daß dort ein zweites β-Alanin gekoppelt wird. Die Punkte werden vorher mit einem Bleistift auf der Rückseite der Membran mar kiert. Alle restlichen Aminofunktionen der Membran werden durch Acetylierung blockiert und Fmoc wird wieder mit Piperidin abgespalten. Die freien Amino gruppen werden nun durch Färben mit BPB sichtbar gemacht und erscheinen als blaue unterscheidbare Flecken.

Dieses Verfahren hat folgende Schritte:

- pro Fleck 0,5 µl Fmoc β-Alanin (0,3 mol/l), TBTU (0,3 mol/l 1 : 1 in NMP,
- zweimal Inkubieren mit 2% Acetanhydrid in DMF für 3 Minuten,
- einmal Inkubieren in 2% Acetanhydrid plus 1% Disopropylethyla min in DMF für 30 Minuten,
- dreimal Waschen mit DMF,
- Inkubieren in 20% Piperidin in DMF für 15 Minuten,
- fünfmal Waschen mit DMF,
- Färben mit 0,01% BPB in DMF für fünf Minuten und
- Trocknen

2.2 Bestimmung der Funktionalität der Flecken ("Spots")

Um beim Koppeln mit dem Aminosäure-Gemisch einen statistischen Einbau al ler Aminosäuren zu erreichen, wird mindestens zweimal, üblicherweise dreimal im Verhältnis 0,8 zu 1 (Summe aller Aminosäuren im Gemisch zu Baustein- Kopplungsstellen des einzelnen Spots) gekoppelt. Daher muß zunächst die Anzahl freier Aminofunktionen pro "Spot" ermittelt werden. Dazu wird eine definierte Fläche der zweifach mit β-Alanin gekoppelten Membran ausgeschnitten und mit 0,05% BPB in DMF sättigend gefärbt. Nach dreimaligem Waschen mit Methanol und Trocknen des Membranstückes wird dieses mit 20% Piperidin in DMF wieder entfärbt und die farbige Lösung im Photometer bei 605 nm gemessen. Unter der Annahme, daß ein BPB-Molekül pro NH₂-Gruppe gebunden wird und mit dem Extinktionskoeffitienten ε = 95.000 mol^-1·|·1 cm^-1 kann mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes die Anzahl freier Aminofunktionen pro "Spot" ermittelt werden. Im allgemeinen ergibt sich ein Wert von etwa 60 nmol Aminofunktionen pro "Spot" (Reaktionspartner pro Baustein-Kopplungsstellen).

2.3. Kopplung der Aminosäuren

An den Positionen 1, 2, 4 und 6 des zu synthetisierenden Hexapeptides (Syntheserichtung vom Karboxyl- zum Amino-Rest) wird ein äquimolares Ami nosäure-Gemisch aus allen Aminosäuren außer Tryptophan, Methionin und Cystein im Verhältnis 0,8 zu 1 eingesetzt (Summe aller Aminosäuren im Ge misch zu Baustein-Kopplungsstellen am jeweiligen "Spot"). Bei der oben ge nannten Funktionalität der Membran von etwa 60 nmol Baustein-Kopplungsstel len pro "Spot" ist die Konzentration der Aminosäurelösung 50 nmol/l. Um eine vollständige Acylierung zu gewährleisten, muß mindestens zweimal gekoppelt werden.

An den Positionen 3 und 5 (Syntheserichtung wie zuvor) wird die zur Erstellung einer kombinatorischen Peptidbank (peptide library) jeweils notwendige defi nierte Aminosäure in einer Konzentration 0,3 mol/l mindestens zweimal nacheinander gekoppelt, um eine vollständige Acetylierung zu gewährleisten.

Zwischen den einzelnen Kopplungen wird die Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin abgespalten.

Das Verfahren umfaßt folgende Schritte:

- Auftropfen von 1 µl Aminosäure oder Aminosäure-Gemisch auf jeden "Spot",
- Reaktion über 15 Minuten,
- Wiederholen: einmal bei definierten Aminosäuren und zweimal bei dem Gemisch,
- dreimal Waschen mit DMF, Inkubieren mit 20% Piperidin in DMF über 15 Minuten,
- fünfmal Waschen mit DMF,
- zweimal Waschen mit Methanol und
- Trocknen und
- für den nächsten Baustein analog die nächsten Kopplungen durchführen.

2.4. Acetylierung des N-Terminus und Abspaltung der Seitenschutz gruppen

Sind alle Kopplungen durchgeführt, wird nach Abspaltung der letzten Fmoc- Schutzgruppe der N-Terminus acetyliert, um die Peptide vor Proteaseabbau zu schützen. Danach werden die Seitenschutzgruppen abgespalten.

Dabei liegen folgende Verfahrensschritte vor:

- zweimal Inkubieren mit 2% Acetanhydrid in DMF für fünf Minuten,
- dreimal Waschen mit DMF,
- zweimal Waschen mit Methanol,
- Trocknen,
- Inkubieren mit 50% TFA, 3% Triisobytylsilan, 2% Wasser, 1% Phenol in DCM für drei Stunden,
- viermal Waschen mit DCM,
- dreimal Waschen mit DMF,
- zweimal Waschen mit Methanol und
- Trocknen.

2.5. Blockieren der Membran

Vor einer Inkubation mit TNF werden die freien Bindungsstellen auf der Mem bran durch eine einstündige Inkubation mit 1% BSA, 0,05% Tween80 (Detergenz) in PBS bei Raumtemperatur blockiert.

2.6. Inkubation mit TNFα

Die Membran wird fünf Stunden bei Raumtemperatur mit 20 µCi TNFα in 40 ml 1% BSA, 0,05% Tween80 in PBS inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit PBS wird die getrocknete Membran einem Röntgenfilm ausgesetzt, oder es wird eine beschichtete Platte eines Phosphoimagers belichtet.

3. Ergebnisse 3.1. Erstes Synthese- und Selektionierungsverfahren der kombinatori schen Peptidbank (peptide library) mit TNFα

Aus dem ersten Synthese- und Selektionierungsverfahren wird unter anderem als gut bindende Sequenz

NH₂-X₁·X₂·F₃·X₄·F₅·X₆-COOH

ermittelt. Dabei steht X für eine der natürlichen, nach dem Zufallsprinzip ge koppelten Aminosäuren außer Cystein. F steht gemäß dem internationalem Code für Phenylalanin. Der Index gibt die Position in der Sequenzfolge des Hexapeptides an, wobei die Zählweise mit dem N-Terminus beginnt.

3.2. Zweites Synthese- und Selektionierungsverfahren der kombinato rischen Peptidbank mit TNFα

Beim zweiten Syntheseschritt wird die Position 4 der Sequenz mit einer definierten Aminosäure besetzt. Es ergeben sich dadurch 20 bezüglich der Position 4 unterschiedliche Ansätze. Das zuvor erwähnte Selektionierungsverfahren wird ebenfalls hier angewendet.

Es wird als bestbindende Sequenz

NH₂-X₁·X₂·F₃·R₄·F₅·X₆-COOH

gefunden.

3.3. Drittes Synthese- und Selektionierungsverfahren der kombinatori schen Peptidbank mit TNF_α

Die dritte Synthese verläuft wie unter 3.2 beschrieben, jedoch wird in diesem Fall die Position 6 mit einer definierten Aminosäure besetzt.

Es wird als bestbindende Sequenz

NH₂-X₁·X₂·F₃·R₄·F₅·R₆-COOH

gefunden.

Abkürzungen

BPB Bromphenolblau
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumine)
DCM Dichlormethan
DIC Diisopropyicarbodiimid
Dhbt 3-Hydroxy-2,3-dihydro-4-oxo-bezotriazin
DMF Dimethylformamid
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
NMI N-Methylimidazol
PBS Phosphatgepuffertes Salz (phosphate buffered saline)
PfP Pentafluorphenyl
TFA Trifluoressigsäure
TNFα Tumor-Nekrose-Faktor α

SEQUENZPROTOKOLL

SEQ.ID.NO: 1
Art der Sequenz: Aminosäure-Sequenz
Sequenzlänge: 6 Aminosäuren
Art des Moleküls: synthetisches Pepetid

Xaa·Xaa·Phe·Xaa·Phe·Xaa

SEQ.ID.NO: 2
Art der Sequenz: Aminosäure-Sequenz
Sequenzlänge: 6 Aminosäuren
Art des Moleküls: synthetisches Pepetid

Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Xaa

SEQ.ID.NO: 3
Art der Sequenz: Aminosäure-Sequenz
Sequenzlänge: 6 Aminosäuren
Art des Moleküls: synthetisches Pepetid

Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Arg

SEQUENCE LISTING IN ENGLISH LANGUAGE

SEQ.ID.NO: 1
Sequence Type: Aminoacid Sequence
Sequence length: 6 Aminoacids
Molecule Type: Synthetically manufactured Pepetide

Xaa·Xaa·Phe·Xaa·Phe·Xaa

SEQ.ID.NO: 2
Sequence Type: Aminoacid Sequence
Sequence length: 6 Aminoacids
Molecule Type: Synthetically manufactured Pepetide

Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Xaa

SEQ. ID. NO: 3
Sequence Type: Aminoacid Sequence
Sequence length: 6 Aminoacids
Molecule Type: Synthetically manufactured Pepetide

Xaa·Xaa·Phe·Arg·Phe·Arg

Claims

1. Verfahren zur Synthese und Selektionierung von funktionell bestimmten Sequenzen aus kovalent verbundenen Bausteinen,
die unterschiedliche Reaktionskinetiken bei der Synthese besitzen und die vor der Synthese reagible Bausteine sind,
mit Hilfe von einer Festphasen-Synthese,
wobei auf oder im Trägermaterial Auf tragungsorte mit Baustein-Kopplungsstellen vorgegeben sind,
wobei die Sequenz
wenigstens einen bestimmten Baustein an einer bestimmten Posi tion der Sequenz besitzt und
wenigstens einen variablen Baustein, der nach dem Zufallsprinzip aus einem Gemisch ausgewählt wird, an einer ebenfalls bestimm ten Position der Sequenz besitzt,
wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:

(i) fortlaufendes Synthetisieren der Sequenz, je eine eigene Vorgehensweisen für die Synthese der bestimmten Bausteine und der variablen Bausteine vorweisend,
(aa) wobei,
wenn ein bestimmter Baustein an einer bestimmten Position synthetisiert werden soll,

(ii) Selektion der gewünschten Sequenzen mit Hilfe von Bindungstests oder spezifischen Reaktionen, wobei die funktionell bestimmten Sequenzen gegebenenfalls durch Indikatoren dargestellt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die variablen Bausteine in ihrer Summe gegenüber den Baustein-Kopplungsstellen höchstens äquimolar sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenz drei bestimmte Bausteine an je einer bestimmten Position der Sequenz besitzt, indem bei der Synthese drei bestimmte Bausteine an je einer bestimmten Position syntheti siert werden.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Sequenz verzweigt oder unverzweigt ist.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Bausteine D- oder L-Aminosäuren und/oder deren Derivate sind.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Trägerma terial aus Zellulose besteht.

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Baustein- Kopplungsstellen Alaninreste sind, die mit dem Trägermaterial kovalent verbun den sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Alaninrest über eine Esterbindung mit der Zellulose verbunden ist.

9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Gemisch aus natürlichen Aminosäuren, die im wesentlichen in gleichen molaren Anteilen vorliegen, besteht.

10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 8, wobei das Gemisch aus den D-Konfigurationen der natürlichen Aminosäuren, die im we sentlichen in gleichen molaren Anteilen vorliegen, besteht.

11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Bausteine Zuckerbausteine sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bausteine eine zyklische Pen tose oder Hexose oder deren Derivate sind.

13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die bestimmten Bausteine wenigstens im dreifachen Überschuß vorliegen.

14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei nach Reaktion der variablen Bausteine die weiteren Bausteine wenigstens in einem zweifachen Überschuß hinzugegeben wird.

15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Bindungs test in einem Anhaften markierter Testsubstanzen und Sichtbarmachung der Markierung besteht.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Markierung aus radioaktivem Material oder aus Biotin oder aus kovalent verbundenen Enzymen besteht.

17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 14, wobei die Re aktion durch allosterische Enzyme gemessen wird.

18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 14, wobei die Re aktion eines Zellsystems gemessen wird.

19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 14, wobei die Re aktion aus einer Zell-Zell-Wechselwirkung besteht.

20. Unverzweigte oder verzweigte Peptide aus D- oder L-Aminosäuren und/oder Aminosäure-Derivaten, welches Peptid eine Struktur besitzt, die unter Verwendung der zuvor genannten Synthese- und Selektionierungsverfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 10 und 13 bis 19 erhalten wurde.

21. Verfahren zur Peptidsynthese von unverzweigten oder verzweigten Pep tiden aus D- oder L-Aminosäuren und/oder Aminosäure-Derivaten, wobei die Sequenz synthetisiert wird, die die Peptid-Struktur besitzt, die unter Verwen dung der Synthese- und Selektionierungsverfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 10 und 13 bis 19 erhalten wurde.