DE4121891A1

DE4121891A1 - Arzneimittelabgabesystem zur verabreichung von wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE4121891A1
Application number: DE4121891A
Authority: DE
Inventors: Ponti Roberto De; Clara Torricelli; Carlo Confalonieri; Marco Adami; Alessandro Martini; Ercole Lardini
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL; Carlo Erba SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1990-07-05
Filing date: 1991-07-02
Publication date: 1992-01-09
Also published as: GB2245831B; JPH04279530A; IT1248543B; GB9114493D0; ITMI911741A0; ITMI911741A1; GB9014871D0; GB2245831A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die geeignet sind, Wachstumsfaktoren an Verbrennungen und Wunden abzugeben. Die Erfindung betrifft insbesondere solche Zusammensetzungen, die basische Fibroplastwachstumsfaktoren (b-FGF) umfassen.

Wachstumsfaktoren wurden in letzter Zeit für die Wundheilbehandlung vorgeschlagen. Pellets mit langsamer Freisetzung, die aus Cholesterol, Methylcellulose und Lactose hergestellt sind und in der Lage sind, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) mit einer Rate von 10 bis 20 µm pro Tag freizusetzen, wurden von Buckle et al (PNAS USA 82, 7340-7344, 1985; J. Surg. Res. 43, 322-328, 1987) hergestellt. Diese Pellets sind in Polyvinylalkoholschwämmen eingebettet.

Dieses System wurde bei Tieruntersuchungen getestet, und es wurde gefunden, daß es speziell für Implantate geeignet ist. Jedoch treten Probleme, bedingt durch die Anwesenheit von Methylcellulose (MC), auf. MC kann als bioabbaubar betrachtet werden, obwohl es exakterweise mehr oder weniger abhängig vom Substitutionsgrad als bioabsorbierbar bezeichnet werden könnte. MC hat eine geringe Biokompatibilität. MC bewirkt eine Immunreaktion, wenn es dem Körper verabreicht wird (Myamoto et al, J. Biom. Mater. Research 23, 125-133, 1989).

EP-A-02 67 015 offenbart stabilisierte Zusammensetzungen, die einen Wachstumsfaktor wie EGF beinhalten. Wäßrige medizinische Zusammensetzungen, die einen Polypeptidwachstumsfaktor mit mitogener Wirksamkeit bei Menschen enthalten, sind hinsichtlich des Verlustes an biologischer Wirksamkeit bei Anwesenheit von Feuchtigkeit dadurch stabilisiert, indem man eine stabilisierende Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids einschließt.

Gelformationen zur Anwendung bei der Wundheilung, und die einen Polypeptidwachstumsfaktor mit mitogener oder aniogener Wirksamkeit bei Menschen, insbesondere EGF, beinhalten, werden in EP-A-03 12 208 beschrieben. Die wäßrigen Gelformulierungen umfassen auch ein wasserlösliches oder wasserquellbares, pharmazeutisch verträgliches Polymer, um eine Viskosität von 1 bis 12× 10⁴ Pas (10³ bis 1.2×10⁷ cps) bei Raumtemperatur zu schaffen. Diese Gele können aus Polyacrylsäure (Carbopol, Warenzeichen), Poloxameren (Pluronics, Warenzeichen), Hydroxypropylmethylcellulose (Methocel, Warenzeichen), Hyaluronsäure und Polyacrylamid (Cyanomer, Warenzeichen) hergestellt werden. Jedoch kann der Einsatz einer Gelformulierung, bedingt durch den hohen Gehalt an Wasser, ein Stabilitätsproblem hinsichtlich des Wachstumsfaktors ergeben, und kann zu einer kurzen Haltbarkeit des Produktes führen. Die Gele können lylophilisiert werden, um eine stabile Dosierungsform zu schaffen, die zum Zeitpunkt des Einsatzes wieder gebildet werden kann (EP-A-03 08 238).

Ein anderer Weg, um b-FGF und andere Wachstumsfaktoren ("Heparin bindende Wachstumsfaktoren") zu stabilisieren, besteht darin, sie an Heparin, andere Glycosaminoglycane oder sulphatierte und/oder carboxylierte Makromoleküle zu binden (Thomas et al., "Structure and Activities of Acidic Fibroblast Growth Factor", in Angiogenesis (laufende Mitteilungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie), herausgegeben von: Rifkin D. B., Klagsbrun M., Cold Spring Harbor Laboratory, 9-12 (1987); Morton et al., Current Eye Research, 8 (10), 975-986 (1989); Shing et al., Analytical Biochemistry, 185, 108-111 (1990); Lobb, European Journal of Chemical Investigation 18, 321- 336 (1988)). Diese Stabilisierungswirkung wird auch von einem Schutz gegen inaktivierende Proteasen begleitet (Rosengart et al, Fed. Proc., 46, 2116 (1987); Lobb, Biochemistry, 27, 2572- 2578 (1988)).

Ein Vorschlag, b-FGF oder andere Wachstumsfaktoren auf einem Träger aufzubringen, bestand darin, den Wachstumsfaktor in einen Graft-Verbund zur Behandlung von Verbrennungen, hergestellt aus Collagen-Glycosaminoglycanmembranen, zu laden, wobei die Oberfläche der Membran mit gezüchteten, menschlichen Kerationocyten (Hanbrough et al., JAMA, 262 (15), 2125-2130 (1989)) beschichtet ist. Dieses therapeutische System ist aber offensichtlich nicht für eine Herstellung im großen Maßstab bestimmt, und bleibt eine Behandlung, die auf spezialisierte Zentren für die Behandlung von Verbrennungen beschränkt ist.

Es wurde nun gefunden, daß das Beladen von wasserunlöslichen, wasserquellbaren Microsphären mit b-FGF einen geeigneten Weg schafft, um b-FGF zur Heilung von Verbrennungen oder Wunden bereitzustellen. Diese Erkenntnis findet allgemeine Anwendbarkeit auf alle Heparin bindenden Wachstumsfaktoren.

Dementsprechend schafft die vorliegende Erfindung ein Pulver, das wasserunlösliche und wasserquellbare Mikrosphären umfaßt, die mit einem Heparin bindenden Wachstumsfaktor beladen sind. Das Pulver weist die Fähigkeit zur Gelbildung auf, es ist typischerweise ein lyophilisiertes Pulver. Die Microsphären sind typischerweise bioabbaubar.

Der Ausdruck "Heparin bindende Wachstumsfaktoren" beinhaltet nicht nur das natürliche, menschliche Wachstumsfaktor Polypeptid, sondern auch Polypeptide, die eine biologische Wirksamkeit aufweisen, die ähnlich zu der des natürlichen, menschlichen Wachstumsfaktor Polypeptid ist. Damit beinhaltet dieser Ausdruck einen menschlichen, Heparin bindenden Wachstumsfaktor, der durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird oder aus natürlichen Quellen abgeleitet wird, und auch eng verwandte Wachstumsfaktoren von Säugetieren, wie Mäusen (Ratten) oder Nagetieren. Ein menschlicher, Heparin bindender Wachstumsfaktor, der durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt ist, ist gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt.

Der Heparin bindende Wachstumsfaktor ist typischerweise ein saurer oder basischer Fibroplast-Wachstumsfaktor, d. h. a-FGF oder B-FGF. Der Einsatz von b-FGF ist bevorzugt. Jedes b-FGF Molekül, wie es z. B. in WO 86/07 595, WO 87/01 728, EP-A-02 26 181; Abraham et al., EMBO J. 5, 2523-2528, 1986; oder Lobb, Eur. J. Clin. Invest. 18, 321-336, 1988 beschrieben ist, kann bei der vorliegenden Erfindung nutzbringend eingesetzt werden.

Eine Mischung von b-FGFs kann verwendet werden. Dies kann eine ungefähr 50 : 50-Mischung sein von:

- einem 154 Aminosäure haltigen, menschlichen b-FGF mit der Aminosäuresequenz der 155 Aminosäureform, die von Abraham et al. beschrieben ist, aber ohne den N-ständigen Met Rest, wobei diese 154 Aminosäuresequenz auch auf der letzten Seite der Beschreibung dargestellt ist und
- einem 153 Aminosäure haltigen, menschlichen b-FGF, das aus der obigen 154 Aminosäureform ohne den Ala Rest in der Stellung 1 besteht.

Die Mikrosphären sind typischerweise aus Zellulose, einem Zellulosederivat, Stärke, einem Stärkederivat, Gelatine, Albumin, Collagen, Dextran oder einem Dextranderivat zusammengesetzt. Die Mikrosphären sind wasserunlöslich und wasserquellbar. Vorzugsweise sind die Mikrosphären, die aus Dextranderivaten zusammengesetzt sind, aus einem anionischen Derivat, wie einem carboxilierten oder sulphatierten Dextran, oder einem kationischen Derivat, wie Diethylaminoethyl- oder einem quaternären Aminoethyldextran aufgebaut. Die Mikrosphären sind vernetzte Stärkemikrosphären, wie Spherex (Warenzeichen), Mikrosphären oder vernetzte Dextranmikrosphären.

Die Mikrosphären werden mit einer Menge des Wachstumsfaktors beladen, die für den Einsatz bei der Behandlung einer Wunde oder einer Verbrennung wirksam ist. Die Menge kann deshalb auf die einzelnen Erfordernisse abgestimmt werden.

Typischerweise werden jedoch die Mikrosphären mit 0,2 bis 5,0 mg an Wachstumsfaktor pro Gramm Mikrosphären beladen. Eine geeignete Menge liegt bei 0,8 bis 1,5 mg Wachstumsfaktor pro Gramm Mikrosphären.

Das Pulver kann weiterhin Mikrosphären umfassen, die nicht mit einem therapeutischen Mittel beladen sind. Mikrosphären, die mit einem anderen therapeutischen Mittel, wie einem anderen Wachstumsfaktor, beladen sind, können zusätzlich oder als Alternative zu den unbeladenen Mikrosphären vorliegen. Die unbeladenen Mikrosphären können verwendet werden, um die mit Wachstumsfaktor beladenen Mikrosphären zu verdünnen. Die Mikrosphären, die mit einem anderen therapeutischen Mittel beladen sind, können verwendet werden, um ein anderes Mittel neben dem Wachstumsfaktor an die Stelle einer Wunde oder einer Verbrennung zu schaffen. Typischerweise ist die Art der unbeladenen Mikrosphären oder der mit einem anderen Mittel beladenen Mikrosphären die gleiche, hinsichtlich der Zusammensetzung und der Größe, wie die Art der Mikrosphären, die mit dem Wachstumsfaktor beladen sind. Diese anderen Mikrosphären sind deshalb allgemein auch bioabbaubar.

Das Pulver der vorliegenden Erfindung hat typischerweise einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 5 bis 1000 µm, wobei 20 bis 250 µm bevorzugt sind. Ein Pulver mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 20 bis 30 µm, z. B. von 20 bis 25 µm, ist gut geeignet. Auch ist ein Pulver mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 20 bis 100 µm, z. B. von 50 bis 90 µm, geeignet.

Das Pulver wird durch ein Verfahren hergestellt, das die Schritte umfaßt:

i) Eintauchen der wasserunlöslichen und wasserquellbaren Polysaccharid-Mikrosphären in eine wäßrige Lösung eines Heparin bindenden Wachstumsfaktors; und
ii) Lyophilisieren der Dispersion der Mikrosphären in der wäßrigen Wachstumsfaktorlösung.

Der Wachstumsfaktor wird in die Mikrosphären geladen, indem man zuerst eine gewogene Menge an Mikrosphären in eine Lösung des Wachstumsfaktors in Wasser taucht. Das Verhältnis von Mikrosphären zu Wachstumsfaktor in der Lösung und von Mikrosphären zu der Lösung des Wachstumsfaktors kann in einem weiten Bereich variiert werden. Vorzugsweise wird ein Verhältnis der Mikrosphären zu dem Wachstumsfaktor von 8 : 1 (Gew./Gew.) bis 8000 : 1 (Gew./Gew.) eingesetzt. Vorzugsweise sind die Mikrosphären hinsichtlich der Lösung des Wachstumsfaktors in einer Menge von 0,005% (Gew./Vol.) bis 5% (Gew./Vol.) vorhanden. Der pH-Wert und die Ionenstärke können innerhalb bevorzugter Bereiche von einem pH-Wert 4 bis und einer Ionenstärke I=0 bis I=1 variiert werden.

Die Mikrosphären, die mit dem Wachstumsfaktor beladen werden sollen, haben typischerweise einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 20 bis 250 µm. Mikrosphären mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 20 bis 30 µm, z. B. von 20 bis 25 µm, sind ebenso geeignet, wie Mikrosphären mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 20 bis 100 µm, z. B. von 50 bis 90 µm.

Der Wachstumsfaktor kann stabilisiert werden, indem man eine Komplexbildung mit einem anionischen Polymer durchführt. Das anionische Polymer kann ein natürliches Polymer sein. Das anionische Polymer kann ein Glycosaminoglycan, Zellulose, Cyclodextrin oder Xanthangummi sein. Beispiele für geeignete Polymere sind Heparin, Heparinsulfat, Chondroitinsulfat, Keratinsulfat, ein Hyaluronat, ein Alginat, Zellulosesulfat, Carboxymethylcellulose und Derivate von alpha-, beta-, und delta-Cyclodextrinen und ihren Polymeren. Der Wachstumsfaktor, der mit dem anionischen Polymer komplexiert ist, wird in die Lösung gegeben, in der die Mikrosphären eingetaucht werden sollen. Ein Antioxidationsmittel, wie Dithiothreitol, kann auch in der Lösung vorliegen.

Während des Eintauchens erreichen die Mikrosphären einen bestimmten Quellungsgrad, der von ihrer chemischen Zusammensetzung, dem nicht gequollenen Durchmesser, der Art des Vernetzungsmittels und des relativen Gehalts in bezug auf die Mikrosphären, der Temperatur, dem pH-Wert, der Ionenstärke, der Art der Lösung und dem Vorliegen von Oberflächenmodifizierungsmitteln auf den Mikrosphären abhängt. Die Mikrosphären werden für eine genügende Zeit eingetaucht, so daß der Wachstumsfaktor auf/oder in die Mikrosphären adsorbiert wird. Die Zeit, die für das Eintauchen (Inkubieren) notwendig ist, kann im weiten Bereich variieren. Die Zeit kann von 2 Minuten bis 48 Stunden, vorzugsweise von 2 Minuten bis 2 Stunden bei Raumtemperatur reichen.

Im Anschluß an den Eintauchschritt wird ein Gefriertrocknen durchgeführt, um Wasser zu eliminieren. Die Art des Gefriertrocknungsprozesses kann sehr variieren. Geeignete Ergebnisse werden mit jeder sehr einfachen Ausrüstung (z. B. wird eine Mikrosphärensuspension in einer Lösung des Wachstumsfaktors, die in einem Kolben enthalten ist, von der Gefriervorrichtung entnommen, und der Kolben wird dann direkt an eine Vakuumpumpe angebracht) bis hin zu groß ausgestatteten Geriertrockner, bei denen es möglich ist, verschiedene Temperaturen (Außentemperatur, Produkttemperatur, Kondensiertemperatur), das Vakuum und die Zeiten zu kontrollieren, erhalten.

Die Mikrosphären, die mit dem Wachstumsfaktor beladen sind und die in Form eines Pulvers aus dem Gefriertrockner erhalten werden, können in einem geeigneten Behälter zur Anwendung bei der Heilung von Wunden oder Verbrennungen gegeben werden. Die beladenen Mikrosphären können verdünnt werden, indem man sie mit Mikrosphären mischt, die unbeladen sind oder mit anderen Wachstumsfaktoren oder einem anderen therapeutischen Mittel beladen sind, oder ganz allgemein mit Pulvern (beladen oder unbeladen). Jedoch ist es bevorzugt, mit Wachstumsfaktor beladene Mikrosphären mit einer geeigneten Menge an unbeladenen Mikrosphären zu verdünnen. Diese geeignete Menge hängt von der Notwendigkeit ab, genügend Pulver zur Verfügung zu haben, um eine Verbrennungs- oder Wundstelle vollständig abzudecken.

Bei der Behandlung der Wunde oder der Verbrennung wird das Pulver gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, um die verwundete oder verbrannte Stelle zu bedecken. Die Mikrosphären quellen dann auf, wobei sie Flüssigkeit aus dem Gewebe ziehen und damit einen nutzbringenden Reinigungseffekt aufweisen. Nach der Quellung wird ein Gel in situ erhalten, aus dem der Wachstumsfaktor freigesetzt wird. Das Gel kann für eine andere Anwendung leicht durch Waschen entfernt werden.

Ein Verfahren zur Behandlung einer Wunde oder einer Verbrennung umfaßt deshalb das Aufbringen einer therapeutisch wirksamen Menge des vorliegenden Pulvers auf die Wunde oder die Verbrennung. Das Pulver kann über die Stelle der Wunde oder Verbrennung verteilt werden. Eine Bandage kann verwendet werden, um diese Stelle zu bedecken. Ein Gel bildet sich auf natürliche Weise. Wenn die Bandage z. B. täglich entfernt wird, dann wird das Gel entfernt und die Wunde oder die Verbrennung ist gereinigt. Das Pulver kann dann wieder verabreicht werden.

Es kann eine Bandage anstelle des Verteilens des Pulvers über die Wunde oder Verbrennung eingesetzt werden, in der das Pulver eingearbeitet ist. Die Bandage beinhaltet das Pulver im Inneren oder auf einer Oberfläche, die in Kontakt mit der Wunde oder Verbrennung gebracht wird. Solch eine Bandage kann, wenn notwendig, ersetzt werden.

Die Menge an Pulver, die auf eine Wunde oder eine Verbrennung bei einem menschlichen Patienten aufgebracht wird, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die die Schwere der Wunde oder Verbrennung, die Stelle der Wunde oder Verbrennung am Körper, die Tatsache, ob das Pulver auf der Wunde verteilt wird oder ob eine Bandage, in der das Pulver eingearbeitet ist, angewandt wird, beinhalten. Typischerweise jedoch sollte genügend Pulver verabreicht werden, um den Wachstumsfaktor in einer Menge von 10 ng bis 1 mg pro cm² zu verabreichen.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung. Es wird auch ein Zubereitungsbeispiel geliefert.

Zubereitungsbeispiel: Herstellung von b-FGF (FCE 26 184)

Der Aufbau der synthetischen DNA-Sequenz für b-FGF und des Expressionsplasmids, das solche eine Sequenz durchführt, erfolgte gemäß dem n EP-A-3 63 675 beschriebenen Verfahren. Die Fermentation und der Reinigungsprozeß wurden wie folgt ausgeführt:

a) Fermentationsverfahren

Ein bakterieller Strang, E. Coli vom Typ B, aus dem Pasteur-Institut wurde mit einem Plasmid transformiert, das sowohl das für b-FGF kodierende menschliche Gen als auch das Gen für die Tetrazyklinwiderstandsfähigkeit trägt. Dieser transformierte Strang wurde zur Herstellung von rekombinanten, nicht glykosilierten h-b-FGF (menschliches b-FGF) verwendet. Eine Master Zellenbank (15 gefriergetrocknete Ampullen) und eine Arbeitszellenbank (W.C.B.) (70 Ampullen, die in flüssigem Stickstoff bei -190°C gehalten sind) wurden von diesem Strang hergestellt. Der Gehalt einer Ampulle der W.C.B. wurde als Impfstoff für die Fermentationsphase verwendet.

Der Fermentationsprozeß wurde in 10 l Fermentoren, die mit 4 l Kulturmedium gefüllt waren, durchgeführt.

Tetracyclinhydrochlorid wurde zu dem Medium hinzugegeben, um die Bedingungen für die Strangselektion aufrechtzuerhalten. Nach 20 Stunden Wachstum bei 37°C betrug die Endbiomasse 42±2 g/l Trockengewicht, und die Produktion an b-FGF betrug 2500±500 mg/l, wie es durch vergleichende Gelelektrophorese gemessen wurde.

Eine Anreicherung an reinem Sauerstoff war während der Fermentationsphase erforderlich, um ein großes bakterielles Wachstum zu ermöglichen.

b) Anfängliche Reinigung

Die Zellen (Mikroorganismen) wurden von der Gesamtfermentationsbrühe durch Zentrifugieren abgetrennt. Das erhaltene Pellet wurde in einem Natriumphosphatpuffer, der Natriumchlorid enthielt, wieder suspendiert. Mindestens drei Passagen durch einen Hochdruckhomogenisierer waren erforderlich, um die Zellen wirksam aufzubrechen. Das erhaltene Zellysat wurde durch Zentrifugieren geklärt, und der Überstand wurde für das weitere Verfahren gesammelt.

d) Reinigung

Der geklärte Überstand wurde auf eine Säule von Sepharose (Warenzeichen) S Fast Flow (Kationenaustauscher) gegeben, und das Produkt wurde aus dieser Säule eluiert, wobei man einen Gradienten mit steigender Natriumchloridkonzentration in einem Phosphatpuffer (Warenzeichen) verwendete. Das Produkt wurde weiterhin auf einer Säule von Heparinsepharose 6B gereinigt, indem man mit einem Gradienten von steigender Natriumchloridkonzentration in einen Phosphatpuffer eluierte. Schließlich wurde ein Pufferaustausch auf einem Sephadex (Warenzeichen) G25 Harz durchgeführt, um das Produkt in dem Hauptproduktpuffer (Natriumphosphat-EDTA) zu erhalten.

d) Säulensanierung

Die Sepharose S Fast Flow- und Sephadex G25 - Säulen wurden saniert, indem man sie mit Natriumhydroxidlösungen gewaschen hat. Heparinsepharose wurde abwechselnd mit Lösungen eines pH-Wertes von 8,5 und von 5,5, die 3M Natriumchlorid enthielten, gewaschen. Auf diese Weise wurde b-FGF, das als FCE 26 184 bezeichnet, ist, erhalten. Dies ist eine ungefähre 50 : 50 Mischung von:

- einem 154 Aminosäure haltigen menschlischen b-FGF mit der Aminosäuresequenz der 155 Aminosäureform, die von Abraham et al. beschrieben ist, jedoch ohne den N-ständigen Met-Rest, wobei diese 154 Aminosäuresequenz auch auf der letzten Seite der Beschreibung dargestellt ist und
- einem 153 Aminosäure haltigen menschlichen b-FGF, das aus der obigen 154 Aminosäureform ohne den Ala Rest an der Position 1 besteht.

Beispiel 1

5 mg an FCE 26 184 und 10 mg Dithiothreitol wurdenin 200 ml doppelt destilliertem Wasser gelöst, das vorher auf einen pH-Wert von 6,0 mit 0,01 N NaOH gebracht wurde, in das 4 g an Stärke-Mikrosphären zuvor transferiert worden waren. Die Stärketeilchen waren vernetzte Stärketeilchen des Typs Spherex, die einen durchschnittlichen Durchmesser von 21±5 µm aufwiesen, wie er durch optische Mikroskopie bestimmt worden war. Die Suspension ließ man dann bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen und lyophilisierte sie anschließend. Ein weißes Pulver wurde erhalten.

Beispiel 2

5 mg an FCE 26 184 und 10 mg Dithiothreitol wurden in 200 ml an doppelt destilliertem Wasser gelöst, das zuvor auf einen pH-Wert von 6,0 mit 0,01 N NaOH gebracht worden war, in das 4 g an Dextranmikrosphären zuvor transferiert worden waren. Die Dextranmikrosphären waren vernetzte Mikrosphären des Typs Sephadex G-50 superfein, die einen Durchmesser von 28±7 µm, wie es durch optische Mikroskopie bestimmt worden war, aufwiesen. Die Suspension ließ man dann bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen und lyophilisierte sie anschließend. Ein weißes Pulver wurde erhalten.

Die Stabilität der mit dem b-FGF beladenen Dextranmikrosphären wurde bei 25°C untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Die Angaben in Prozent betreffen die prozentuale Stabilität hinsichtlich der Stabilität zum Zeitpunkt Null, d. h. die Menge an restlichem b-FGF hinsichtlich der Mengen zum Zeitpunkt Null, gemessen über Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC).

Tabelle 1

HPLC-Verfahren Materialien

Gefrorene Lösung an b-FGF Bulk gemäß Arbeitsstandard,
Acetonitril, HPLC-Grad
Wasser, HPLC-Grad
0,9% Natriumchloridinjektion, pharmazeutische Reinheit,
Trifluoressigsäure, analytische Reinheit
1,4-Dithiothreitol, analytische Reinheit

Ausrüstung

Flüssigkeitschromatograph Milton Roy Model CM 4000, oder eine äquivalente Anlage, ausgerüstet mit:

- Chromatographiesäule: (Länge 250 mm, innerer Durchmesser 4.6 mm), gefüllt mit Vydac 218TP54 300 A (durchschnittliche Teilchengröße 5 mcm) oder eine äquivalente Säule hierzu,
- Injektionsventil: Rheodyne Modell 7125 oder eine äquivalente Ausführung hierzu, ausgestattet mit einer 100 mcl Probenöffnung,
- Detektor: Schimadzu Modell SPD 6A, oder eine äquivalente Ausrüstung,
- Integrationsrekorder: SP 4270 (Spectra-Physics), oder eine äquivalente Anlage

Membranfilter 0,22 µm Porosität, Millipore Durapore GVWP oder eine äquivalente Ausführung,
Hochpräzisionsglasware für das Labor
Kunststoffpipettenspitzen (Gilson)
Automatische Pipetten (Gilson)
Wegwerfkunststoffröhrchen, Kapazität 2,5 ml (Eppendorf).

Lösungen

Mobile Phase (A), bestehend aus Wasser, das 0,1% Trifluoressigsäure (Gew./Vol.) enthielt, und durch den Membranfilter filtriert worden war und entgast worden war.

Mobile Phase (B), bestehend aus 95% Acetonitril-5% Wasser, das 0,1% Trifluoressigsäure (Gew./Vol.) enthielt und durch den Membranfilter gefiltert wurde und entgast wurde.

1.4-Dithiothreitollösung

Zubereitung einer Lösung, die ungefähr 1 mg/ml Wasser des HPLC Reinheitsgrades enthielt.

Standardlösung

Überführung eines geeigneten Volumens einer Bulk-Lösung von b-FGF gemäß dem Arbeitsstandard, das genau gemessen wurde, in eine Wegwerfkunststoffmikroröhre.

Verdünnen mit einem geeigneten Volumen an 1,4-Dithiothreitollösung, um eine Entlösung zu erhalten, die ungefähr 50 mcg/ml an b-FGF enthielt.

Die Standardlösung muß frisch zubereitet werden und innerhalb eines Arbeitstages verbraucht werden.

Probenlösung

Zubereitung der Probenlösung unter Verwendung von mindestens 5 gefriergetrockneten Ampullen.

Der Gehalt jeder Ampulle, die in einer Menge von 50 mcg an b-FGF, das auf Mikrosphären geladen ist, dosiert wird, wird in 1.0 ml 0.9% Natriumchloridinjektion gelöst, und dann wird ein Pool mit allen zubereiteten Lösungen gebildet.

Die gesammelte Probe läßt man für mindestens eine halbe Stunde zum Dekantieren stehen, und dann wird sie in den Flüssigkeitschromatograph injiziert.

Chromatographiebedingungen (HPLC)

Die Standard- und die Probenlösung wurden nacheinander mindestens dreimal in dem Flüssigkeitschromatographen unter den folgenden experimentellen Bedingungen injiziert:

Beispiel 3

Das in Beispiel 1 erhaltene Pulver wurde 10 Minuten lang mit 6 g an Spherex Mikrosphären mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 21±5 µm über eine Trommel vermengt. Die Spherex-Mikrosphären waren nicht beladen.

Beispiel 4

Das in Beispiel 2 erhaltene Pulver wurde 10 Minuten lang mit 6 g Mikrosphären des Typs Sephadex G-50 superfein mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 28±7 µm über eine Trommel vermengt. Die Mikrosphären des Typs Sephadex G-50 superfein waren nicht beladen.

Beispiel 5

Das im Beispiel 1 erhaltene Pulver wurde 10 Minuten lang mit 6 g Mikrosphären des Typs Sephadex G-50 superfein mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 28±7 µm über eine Trommel vermengt. Die Mikrosphären des Typs Sephadex G-50 superfein waren nicht beladen.

Beispiel 6

Das in Beispiel 2 erhaltene Pulver wurde 10 Minuten lang mit 6 g an Mikrosphären des Typs Spherex mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 21±5 µm über eine Trommel vermengt. Die Mikrosphären des Typs Spherex waren nicht beladen.

Beispiel 7

Bei einer Vorgehensweise, die analog zu der in den vorherigen Beispielen ist, wurden analoge Zubereitungen vergleichbarer Stabilität erhalten mit:

- einem menschlichen b-FGF, das die 153 und 154 Aminosäureformen, die in dem Zubereitungsbeispiel genannt sind, in verschiedenen Anteilen enthielt, insbesondere ein b-FGF, wobei die 154 Aminosäureform in einer Menge von ungefähr 50 bis ungefähr 100% vorliegt;
- menschliches b-FGF mit 146 Aminosäureresten, d. h., mit der auf der letzten Seite der Beschreibung aufgezeigten Aminosäuresequenz, ausgehend von der Aminosäure 9; und
- die menschliche b-FGF Form der 155 Aminosäurereste, die von Abraham et al beschrieben sind, d. h. mit der im folgenden gezeigten Aminosäuresequenz, aber mit einem N-ständigen Met-Rest.

Claims

1. Pulver, das mit einem Heparin bindenden Wachstumfaktor beladene wasserunlösliche und wasserquellbare Polysaccharid-Mikrosphären umfaßt.

2. Pulver nach Anspruch 1, wobei der Wachstumsfaktor ein basischer Fibroplast Wachstumsfaktor (b-FGF) ist.

3. Pulver nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikrosphären aus Zellulose, einem Zellulosederivat, Stärke, einem Stärkederivat, Gelatine, Albumin, Collagen, Dextran oder einem Dextranderivat zusammengesetzt sind.

4. Pulver nach Anspruch 3, wobei die Mikrosphären vernetzte Stärke- oder vernetzte Dextran-Mikrosphären sind.

5. Pulver nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wachstumsfaktor mit einem anionischen Polymer komplexiert ist.

6. Pulver nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin Mikrosphären umfaßt, die nicht mit einem therapeutischen Mittel beladen sind.

7. Verfahren zur Herstellung eines Pulvers gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

i) Eintauchen der wasserunlöslichen und wasserquellbaren Polysaccharidmikrosphären in eine wäßrige Lösung eines Heparin bindenden Wachstumsfaktor; und
ii) Lyophilisieren der Dispersion der Mikrosphären in der wäßrigen Lösung des Wachstumsfaktors.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Schritt (i) innerhalb von 2 Minuten bis 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Verhältnis der Mikrosphären zu dem Wachstumsfaktor in der Lösung im Schritt (i) zwischen 8 : 1 und 8000 : 1 (Gew./Gew.) beträgt, und die Mikrosphären im Schritt (i) im Hinblick auf die Lösung des Wachstumsfaktors in einer Menge von 0,005% bis 5% (Gew./Vol.) vorliegen.

10. Pulver nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung bei der Behandlung einer Wunde oder einer Verbrennung.

11. Bandage, in die ein Pulver nach einem der Ansprüche 1 bis 6 eingearbeitet ist.