DE4042342C2 - - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß Mikroorganismen aus verschiedenen Gattungen in der Lage sind, in bestimmten Substraten aus Mono- und Disacchariden Polysaccharide zu bilden.

Zum Beispiel sind Stämme von Xanthomonas campestris die wichtigsten Organismen für eine technische Herstellung von Xanthanen. Xanthan besteht aus einer Hauptkette mit 1,4-β- glykosidischen Bindungen und Seitenketten mit Mannose und Glucuronsäure.

Die Struktur von Xanthan entspricht folgender Formel:

Xanthan entsteht aus Disaccharid gemäß folgender nicht­ stöchiometrischer Reaktionsformel:

Polysaccharide wie zum Beispiel Xanthan werden als Dickungs­ mittel zum Beispiel in der Lebensmittelindustrie und in der kosmetischen Industrie sowie in der Papierindustrie und Erdölindustrie angewandt. Dabei können sie mit Dextrinen, pflanzlichen Dickungsmitteln, Polyalkenoxiden, anderen Polysacchariden und dergleichen gemischt werden. Sie können auch in Farben, Lacke und in Zahnpasta eingearbeitet werden. Eine wichtige Anwendung liegt in der Ölgewinnung, wo sie als Zusatz zum "Flutungswasser" gut geeignet sind.

Xanthane werden in Verfahren des Standes der Technik als Nativ- Polysaccharide mit Xanthomonas campestris hergestellt. Als Sub­ strate dienen zuckerhaltige Medien mit Zusatz von Mineralsal­ zen und komplexen N-Quellen, z. B. Destillationsrückständen.

Bei hoher Viskosität nimmt die Polysaccharidbildung wieder ab. Verschiedene Sauerstoffkonzentrationen haben wenig Einfluß, wichtig ist jedoch der pH-Wert, der bei 5-8 gehalten werden sollte. Die Fermentation läuft bei 25 bis 35°C ab. Bei Melasse als Substrat dauert die Polysaccharidbildung im Submerfermen­ ter 60-70 h.

Die Ausbeuten betragen 60-80% des vorgelegten Zuckers, allerdings dürfen wegen der hohen Viskosität nicht mehr als 8% Zuckerlösung im Fermenter vorliegen.

Es sind bereits Bakterienstämme der Gattung Xanthomonas campestris beschrieben:

US 44 07 950,
US 44 07 951.

Der erfindungsgemäße Stamm DSM 5278 unterscheidet sich von den Xanthomonas-camprestis-Stämmen

NRRL - B - 1459
ATCC 31601
ATCC 31602
ATCC 31922
ATCC 31923

durch seine Stabilität in kontinuierlicher Kultur auf komplexem Medium über einen Zeitraum von mindestens 3 Monaten und durch seine hohe vol. Produktitvität von 2 kg Xanthan pro m³ und h und seine spezifische Produktivität von 1,4 kg Xanthan pro kg Zellmasse und Stunde. Die max. spez. Wachstumsrate des erfindungsgemäßen Stammes Xanthomonas campestris DSM 5278 beträgt auf komplexem Medium 0,395 pro Stunde.

Im folgenden Beispiel wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel

Die Stammhaltung des Stammes DSM 5278 erfolgt in Nunc-Einfrier­ röhrchen. Ca. 1/3 des Röhrchens werden mit Glaskugeln 0,2 mm gefüllt und mit 0,3 ml Glycerin überschichtet und autoklaviert. Nach dem Abkühlen werden 0,8 ml Flüssigkeits­ kultur, 578 nm 0D 6, hinzugegeben. Die Flüssigkeits­ kultur sollte ca. 8 h alt sein, d.h. sich am Ende der log. Wachstumsphase, aber vor der Produktionsphase befinden. Anschließend wird mit einer Kanüle sämtliche Flüssigkeit vom Boden abgesaugt und das Röhrchen sofort bei -20°C eingefroren. Die Kultur ist dann ein Jahr lang wieder rekultivierbar.

Rekultivierung

Nach dem Auftauen der Röhrchen werden die Glaskugeln eines Röhrchens in einen Erlenmeyerkolben mit 20 ml Medium 1 überführt. Der Erlenmeyerkolben wird anschließend im Schüttelbrutschrank bei 200 Upm und 29°C geschüttelt. Zur Kontrolle wird mit dieser Kultur ein Ausstrich auf YM- Agarplatten durchgeführt und 5 Tage bei 30°C bebrütet.

Stammhaltung

1 ml der durchkultivierten Kultur im Erlenmeyerkolben werden in 20 ml Medium 1, pH 5,5, transferiert und 24 h inkubiert. Anschließend kann die Kultur maximal 4mal transferiert werden.

Inokulumanzucht

20 ml der durchkultivierten Kultur eines Erlenmeyerkolbens werden in einen Fernbachkolben mit 200 ml Medium 1, pH 5,5, transferiert. Der Fernbachkolben wird bei 200 Upm und 29°C 24 h im Schüttelbrutschrank inkubiert. Anschließend wird die Kultur in einen sterilen 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Boden­ olive und Anstechgarnitur überführt und dient zum Animpfen eines 2-l-Fermenters.

Der Fermenter enthält 2 l Medium 1 mit einem pH von 5,5. Nach dem Animpfen wird 24 h bei 29°C, guter Durchmischung und 1 vvm Begasungsrate im Batchbetrieb kultiviert. An­ schließend wird auf kontinuierlichen Betrieb umgeschaltet. Der pH sollte auf 6,5 und die Temperatur auf 30°C geregelt werden. Die Durchflußrate sollte D=0,07 (1/h) sein. Das Medium 1 sollte einen pH von 6 und 2,5% Saccharose enthalten und steril filtriert werden.

Produktion

Das Fermentationsmedium 1 sollte mit 5-10% Inokulum beimpft werden. Beträgt die Inokulummenge 1%, hat dies eine verlängerte lag-Phase von 24 h zur Folge. Der pH des Mediums sollte 5,5 und die Temperatur 29°C betragen. Eine Begasungsrate von 1,0 vvm ist ausreichend. Als erste C-Quelle wird Citronensäure verwertet. Der pH driftet dabei in den alkalischen Bereich (pH 7-8). In dieser Phase wird haupt­ sächlich Biomasse und kein Produkt gebildet. Anschließend wird als weitere C-Quelle Saccharose aufgenommen. Das Bio­ massewachstum kommt aufgrund der N-Limitation zum Still­ stand, und die Produktionsphase beginnt. Durch Ausscheidung verschiedener organischer Säuren fällt der pH wieder in den sauren Bereich. Wenn ein pH von 6,5 erreicht ist, muß die pH-Regulation zugeschaltet und bei pH 6,5 konstant gehalten werden.

Bei der Batch-Produktion ist nun mit den Fermentationspara­ metern pH 6,5, 29°C und 1,0 vvm Begasungsrate so lange weiter zu fermentieren, bis der Saccharose-Gehalt nicht weiter abnimmt (unter 1 g/l Endkonzentration) und die Viskosität nicht weiter ansteigt.

Für die kontinuierliche Produktion ist nach 10-24 h, wenn pH 6,5 erreicht sein sollte, auf kontinuierlichen Medien­ zufluß und Produktabzug umzuschalten. Es ist zuerst eine Durchflußrate von D=0,1 (1/h) einzustellen. Die Durch­ flußrate kann den verschiedenen Erfordernissen angepaßt werden. Eine Durchflußrate von D=0,1 (1/h) ist ein Kompromiß zwischen einer niedrigen Durchflußrate von D=0,03 (1/h), wobei eine hohe Produktausbeute und ein Xanthan mit einer hohen Viskosität pro TS gebildet wird, und einer hohen Durchflußrate von D=0,2 (1/h), wobei eine hohe Produktivität erzielt wird. Weitere wichtige Parameter, die von der Durchflußrate abhängen, sind die Zellgröße und der Acetatgehalt des Xanthans.

Das Verfahren beinhaltet drei verschiedene Nährmedien. Das Nährmedium 1 hat den Vorteil, daß Xanthomonas campestris auf diesem Medium eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit hat. Große Schwankungen der Durchflußrate und Medienzusammen­ setzung führen deshalb nicht zum Auswaschen der Biomasse. Das Nährmedium 2 hat gegenüber dem Nährmedium 1 die Vorteile des niedrigeren Preises, der höheren Produktionsausbeute und der höheren Produktivität. Diese Vorteile werden durch eine niedrigere Wachstumsgeschwindigkeit der Biomasse erkauft.

Das Nährmedium 3 ist ein rein synthetisches Nährmedium. Es hat die Vorteile eines niedrigen Preises, der guten Filtrierbarkeit, sowohl des Nährmediums als auch des Produktes und des hohen Produkt/Biomasse-Verhältnisses.

Medium 1
Saccharose
25 g/l für Konti bzw. 40 g/l für Batch
Mg SO₄ × 7 H₂O	0,2 g/l
Citronensäure	1,0 g/l
K₂HPO₄	1,0 g/l
NH₄Cl	0,32 g/l
Hefeautolysat	1,0 g/l
ad Leitungswasser, mit KOH auf pH 5,5 (zum Autoklavieren) bzw. pH 6,0 (zum Sterilfiltrieren) einstellen.

Medium 2 (nur für kontinuierliche Fermentation)
Saccharose|25,0 g/l
Citronensäure	1,0 g/l
K₂HPO₄	0,4 g/l
HN₄SO₄	1,0 g/l
Hefeautolysat	0,1 g/l
ad Leitungswasser, mit KOH auf pH 5,5 bzw. 6,0 (bei Sterilfiltration) einstellen.

Medium 3
Saccharose|25,0 g/l
Citronensäure	2,0 g/l
K₂HPO₄	0,5 g/l
Mg SO₄ × 7 H₂O	0,2 g/l
NH₄NO₃	0,6 g/l

YM-Agar-Medium
Glucose|6,0 g/l
Hefeautolysat	1,8 g/l
Malzextrakt	1,8 g/l
Pepton aus Fleisch	3,0 g/l
Agar Agar	12,0 g/l
ad 600 ml VE-Wasser. Der pH sollte sich auf 6,2±0,2 einstellen und wird nicht weiter korrigiert.

Fermentationsbeispiel 1

Kontinuierliche Kultur
Nährmedium 1
Stamm: Xanthomonas campestris DSM 5278
Durchflußrate D = 0,07 (1/h)
pH 6,5
T = 29°C

Fermentationsbeispiel 2

Kontinuierliche Kultur
Nährmedium 2
Stamm: Xanthomonas campestris DSM 5278
Durchflußrate D = 0,2 (1/h)
pH 6,5, T=29°C, TS 10 g/l, BTS 1,4 g/l

Claims (1)

1. Xanthomonas campestris DSM 5278.