DE4042343C2

DE4042343C2 -

Info

Publication number: DE4042343C2
Application number: DE4042343A
Authority: DE
Inventors: Peter T.S. Dr. 6900 Heidelberg De Souw; Michael Dr. 3000 Hannover De Kloss; Wolfgang 6900 Heidelberg De Muehlhardt
Original assignee: Bih Bio-Industrie Heidelberg Biotechnische Industrieprodukte GmbH & Co KG GmbH; Ibl International Biotechnology Laboratories 6900 Heidelberg De GmbH
Current assignee: BIO-INDUSTRY-HEIDELBERG GMBH BIOTECHNISCHE INDUSTR
Priority date: 1990-02-27
Filing date: 1990-02-27
Publication date: 1992-01-16
Also published as: DE4042343A1

Description

Es ist bekannt, daß Mikroorganismen aus verschiedenen Gattungen in der Lage sind, in bestimmten Substraten aus Mono- und Disacchariden Polysaccharide zu bilden.

Zum Beispiel sind Stämme von Xanthomonas campestris die wichtigsten Organismen für eine technische Herstellung von Xanthanen. Xanthan besteht aus einer Hauptkette mit 1,4-β-glykosidischen Bindungen und Seitenketten mit Mannose und Glucuronsäure.

Die Struktur von Xanthan entspricht folgender Formel:

Xanthan entsteht aus Disaccharid gemäß folgender nichtstöchiometrischer Reaktionsformel:

Polysaccharide wie zum Beispiel Xanthan werden als Dickungsmittel zum Beispiel in der Lebensmittelindustrie und in der kosmetischen Industrie sowie in der Papierindustrie und Erdölindustrie angewandt. Dabei können sie mit Dextrinen, pflanzlichen Dickungsmitteln, Polyalkenoxiden, anderen Polysacchariden und dergleichen gemischt werden. Sie können auch in Farben, Lacke und in Zahnpasta eingearbeitet werden. Eine wichtige Anwendung liegt in der Ölgewinnung, wo sie als Zusatz zum "Flutungswasser" gut geeignet sind.

Xanthane werden in Verfahren des Standes der Technik als Nativ-Polysaccharide mit Xanthomonas campestris hergestellt. Als Substrate dienen zuckerhaltige Medien mit Zusatz von Mineralsalzen und komplexen N-Quellen, z. B. Destillationsrückständen.

Bei hoher Viskosität nimmt die Polysaccharidbildung wieder ab. Verschiedene Sauerstoffkonzentrationen haben wenig Einfluß, wichtig ist jedoch der pH-Wert, der bei 5-8 gehalten werden sollte. Die Fermentation läuft bei 25 bis 35°C ab. Bei Melasse als Substrat dauert die Polysaccharidbildung im Submersfermenter 60-70 h.

Die Ausbeuten betragen 60-80% des vorgelegten Zuckers, allerdings dürfen wegen der hohen Viskosität nicht mehr als 8% Zuckerlösung im Fermenter vorliegen.

Es sind bereits Bakterienstämme der Gattung Xanthomonas campestris beschrieben:

US 44 07 950
US 44 07 951.

Der erfindungsgemäße Stamm Xanthomonas campestris DSM 5279 unterscheidet sich von den Xanthomonas-campestis-Stämmen

NRRL -B- 1459
ATCC 31 601
ATCC 31 922
ATCC 31 923

durch seine Stabilität in kontinuierlicher Kultur auf komplexem Medium und durch seinen Verlust zur Bildung des gelben Farbpigmentes.

Im folgenden Beispiel wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel

Die Stammhaltung des Stammes DSM 5279 erfolgt in Nunc-Einfrierröhrchen. Ca. 1/3 des Röhrchens werden mit Glaskugeln 0,2 mm gefüllt und mit 0,3 ml Glycerin überschichtet und autoklaviert. Nach dem Abkühlen werden 0,8 ml Flüssigkeitskultur, 578 nm OD 6, hinzugegeben. Die Flüssigkeitskultur sollte ca. 8 h alt sein, d. h. sich am Ende der log. Wachstumsphase, aber vor der Produktionsphase befinden. Anschließend wird mit einer Kanüle sämtliche Flüssigkeit vom Boden abgesaugt und das Röhrchen sofort bei -20°C eingefroren. Die Kultur ist dann ein Jahr lang wieder rekultivierbar.

Rekultivierung

Nach dem Auftauen der Röhrchen werden die Glaskugeln eines Röhrchens in einen Erlenmeyerkolben mit 20 ml Medium 1 überführt. Der Erlenmeyerkolben wird anschließend im Schüttelbrutschrank bei 200 Upm und 29°C geschüttelt. Zur Kontrolle wird mit dieser Kultur ein Ausstrich auf YM-Agarplatten durchgeführt und 5 Tage bei 30°C bebrütet.

Stammhaltung

1 ml der durchkultivierten Kultur im Erlenmeyerkolben werden in 20 ml Medium 1, pH 5,5 transferiert und 24 h inkubiert. Anschließend kann die Kultur maximal 4mal transferiert werden.

Inokulumanzucht

20 ml der durchkultivierten Kultur eines Erlenmeyerkolbens werden in einen Fernbachkolben mit 200 ml Medium 1, pH 5,5, transferiert. Der Fernbachkolben wird bei 200 Upm und 29°C 24 h im Schüttelbrutschrank inkubiert. Anschließend wird die Kultur in einen sterilen 250 ml Erlenmeyerkolben mit Bodenolive und Anstechgarnitur überführt und dient zum Animpfen eines 2-l-Fermenters.

Der Fermenter enthält 2 l Medium 1 mit einem pH von 5,5. Nach dem Animpfen wird 24 h bei 29°C, guter Durchmischung und 1 vvm Begasungsrate im Batchbetrieb kultiviert. Anschließend wird auf kontinuierlichen Betrieb umgeschaltet. Der pH sollte auf 6,5 und die Temperatur auf 30°C geregelt werden. Die Durchflußrate sollte D=0,07 (1/h) sein. Das Medium 1 sollte einen pH von 6 und 2,5% Saccharose enthalten und steril filtriert werden.

Produktion

Das Fermentationsmedium 1 sollte mit 5-10% Inokulum beimpft werden. Beträgt die Inokulummenge 1%, hat dies eine verlängerte lag-Phase von 24 h zur Folge. Der pH des Medium sollte 5,5 und die Temperatur 29°C betragen. Eine Begasungsrate von 1,0 vvm ist ausreichend. Als erste C-Quelle wird Citronensäure verwertet. Der pH driftet dabei in den alkalischen Bereich (pH 7-8). In dieser Phase wird hauptsächlich Biomasse und kein Produkt gebildet. Anschließend wird als weitere C-Quelle Saccharose aufgenommen. Das Biomassewachstum kommt auf Grund der N-Limitation zum Stillstand und die Produktionsphase beginnt. Durch Ausscheidung verschiedener organischer Säuren fällt der pH wieder in den sauren Bereich. Wenn ein pH von 6,5 erreicht ist, muß die pH-Regulation zugeschaltet und bei pH 6,5 konstant gehalten werden.

Bei der Batch-Produktion ist nun mit den Fermentationsparametern pH 6,5, 29°C und 1,0 vvm Begasungsrate so lange weiter zu fermentieren, bis der Saccharose-Gehalt nicht weiter abnimmt (unter 1 g/l Endkonzentration) und die Viskosität nicht weiter ansteigt.

Für die kontinuierliche Produktion ist nach 10-24 h, wenn pH 6,5 erreicht sein sollte, auf kontinuierlichen Medienzufluß und Produktabzug umzuschalten. Es ist zuerst eine Durchflußrate von D=0,1 (1/h) einzustellen. Die Durchflußrate kann den verschiedenen Erfordernissen angepaßt werden. Eine Durchflußrate von D=0,1 (1/h) ist ein Kompromiß zwischen einer niedrigen Durchflußrate von D=0,03 (1/h), wobei eine hohe Produktausbeute und ein Xanthan mit einer hohen Viskosität pro TS gebildet wird, und einer hohen Durchflußrate von D=0,2 (1/h), wobei eine hohe Produktivität erzielt wird. Weitere wichtige Parameter, die von der Durchflußrate abhängen, sind die Zellgröße und der Acetatgehalt des Xanthans.

Das Verfahren beinhaltet drei verschiedene Nährmedien. Das Nährmedium 1 hat den Vorteil, daß Xantomonas campestris auf diesem Medium eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit hat. Große Schwankungen der Durchflußrate und Medienzusammensetzung führen deshalb nicht zum Auswaschen der Biomasse. Das Nährmedium 2 hat gegenüber dem Nährmedium 1 die Vorteile des niedrigeren Preises, der höheren Produktausbeute und der höheren Produktivität. Diese Vorteile werden durch eine niedrigere Wachstumsgeschwindigkeit der Biomasse erkauft.

Das Nährmedium 3 ist ein rein synthetisches Nährmedium. Es hat die Vorteile eines niedrigen Preises, der guten Filtrierbarkeit, sowohl des Nährmediums als auch des Produktes und des hohen Produkt/Biomasse Verhältnisses.

Medium 1
Saccharose
25 g/l für Konti bzw. 40 g/l für Batch
Mg SO₄ × 7 H₂O	0,2 g/l
Citronensäure	1,0 g/l
K₂HPO₄	1,0 g/l
NH₄Cl	0,32 g/l
Hefeautolysat	1,0 g/l

ad Leitungswasser, mit KOH auf pH 5,5 (zum Autoklavieren) bzw. pH 6,0 (zum Sterilfiltrieren) einstellen.

Medium 2 (nur für kontinuierliche Fermentation)
Saccharose\|25,0 g/l
Citronensäure	1,0 g/l
K₂HPO₄	0,4 g/l
NH₄SO₄	1,0 g/l
Hefeautolysat	0,1 g/l

ad Leitungswasser, mit KOH auf pH 5,5 bzw. 6,0 (bei Sterilfiltration) einstellen.

Medium 3
Saccharose\|25,0 g/l
Citronensäure	2,0 g/l
K₂HPO₄	0,5 g/l
Mg SO₄ × 7 H₂O	0,2 g/l
NH₄NO₃	0,6 g/l

YM-Agar-Medium
Glucose\|6,0 g/l
Hefeautolysat	1,8 g/l
Malzextrakt	1,8 g/l
Pepton aus Fleisch	3,0 g/l
Agar Agar	12,0 g/l

ad 600 ml VE-Wasser. Der pH sollte sich auf 6,2 ± 0,2 einstellen und wird nicht weiter korrigiert.

Fermentationsbeispiel 1

Batch-Fermentation
Nährmedium 1
Stamm: Xanthomonas campestris DSM 5279
T = 29°C, pH 7, TS = 30 g/l
Fermentationsdauer 50 h, Viskosität 13 000 cp.

Fermentationsbeispiel 2

Kontinuierliche Kultur
Nährmedium 1
Stamm: Xanthomonas Campestris DSM 5279
pH 6,5; T = 29°C.

Durchflußrate (1/h)
Acetatgehalt (%)
0,03
4,0
0,25	2,0
0,30	1,7

Versuchsbeschreibung zur Stammentwicklung DSM 5279

Als Ausgangsstamm diente der Stamm PS 78. Der Stamm wurde in YM-Medium angezogen. Nach dem erneuten Transferieren wurde bei einer Zelldichte von 2×10⁸/nl 10 ml 15 min abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 9 ml 0,03 M Phosphatpuffer aufgenommen und mit 1 ml sterilem N-Methyl-N-nitroso-N′-nitroguanidin (Endkonzentration 100 µg/ml 0,03 M Phosphatpuffer aufgenommen. Der Puffer wurde in 0,9% NaCL 1 : 1000 verdünnt und 100 µl auf Agarplatten ausplattiert. Danach wurden die Platten 3 Tage bei 29°C bebrütet. Es entwickelten sich ca. 100 Einzelkolonien, von denen eine die Fähigkeit zur Bildung des gelben Farbpigmentes verloren hatte. Dieser Klon wurde abgepickt und unter der Bezeichnung ES 86 weiter kultiviert. Der Stamm ist unter der Bezeichnung DS 5279 bei der DSM hinterlegt.

Claims

Xanthomonas campestris DSM 5279.