DE2810279C2

DE2810279C2 - Verfahren zur Herstellung hochviskoser Polysaccharide und diese enthaltende Mittel

Info

Publication number: DE2810279C2
Application number: DE2810279A
Authority: DE
Inventors: Norio Tokio/Tokyo Matsumoto; Hiroo Sasaki; Masaki Tamura
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1977-03-09
Filing date: 1978-03-09
Publication date: 1986-09-04
Also published as: FR2383231B1; FR2383231A1; GB1557755A; JPS53113090A; YU41585B; IT7821058A0; ES467652A1; IT1093755B; YU56378A; NL7802573A; JPS5646400B2; DE2810279A1; BE864687A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung hochviskoser saurer Polysaccharide und diese enthaltende Mittel.

Aufgabe der Erfindung ist es, saure Polysaccharide mit überlegener Beständigkeit gegenüber Säure, Alkali und Wärme nach einem industriell anwendbaren Verfahren mit hoher Ausbeute aus billigen Ausgangsmaterialien herzustellen. Hierzu wird ein neu aus dem Boden isolierter Mikroorganismus, Bacillus lentus, in einem Kulturmedium gezüchtet, das verschiedene Kohlenhydrate als Kohlenstoffquelle enthält, und das so gebildete Polysaccharid isoliert und gereinigt. Der erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus lentus FERM BP-915 züchtet und die Reinigung bis zum Erhalt eines Polysaccharids mit einer Viskosität von 4000 bis 5000 cp, gemessen in 1 ^c/oiger wäßriger Lösung, durchführt.

Polysaccharide sind zusammen mit Nukleinsäure-Protein und Lipiden Bestandteile, die eine lebenswichtige Funktion in Hochpolymeren in lebenden Körpern erfüllen. Dank ihrer Eigenschaften wie Haftung und Kiebrigkeit besitzen viskose Polysaccharide eine breite Anwendbarkeit und werden auf vielen Gebieten verwendet, wie als Zusätze für Nahrungsmittel und Kosmetika, Schlichtmittel. Gefrierstabilisatoren, SuspendJerhilfsmiticl, Schmier- oder Gleitmittel, beim Suspensionsabbau von Mineralien, als Bohrsädammzusätze, bei der Ölgewinnung auf Ölfeldern. Auf dem medizinischen Bereich ist eine breite Verwendung bekannt als Folge der Erkenntnis der pharmakologischen Wirkung einiger Polysaccharide gegen Tumore und gegen Blutdruck in den letzten Jahren.

Herkömmlicherweise liegt die Bezugsquelle für solche Polysaccharide in der Flora und Fauna, so daß der Produktionsnachschub nicht konstant war und die Qualität stark schwankte. Daher wurde nach einer leicht steuerbaren Quelle bei Mikroorganismen gesucht, die eine große Zahl von Polysacchariden zu bilden vermögen.

Mit diesem Hintergrund wurden breit angelegte analytische Untersuchungen von Mikroorganismen der ganzen Erde vorgenommen, um bakterien zu erhalten, die in der Lage sind, hoch viskose Polysaccharide aus Saccharid-Ausgangsmaterialien zu erzeugen. So wurde gefunden, daß der zur Gattung Bacillus gehörende Bacillus lentus D-228 viskose saure Polysaccharide hoher Viskosität bei geringen Dichten bildet.

Seine bakteriologischen Eigenschaften sind:

Morphologische Eigenschaften

1) Gestalt vegitativer Zellen:

2) Sporen und Sporangien:

3) Motilität:

4) Flagella:

5) Gram-Stamm:

6) Säurebeständigkeit:

II. Kultureigenschaften

1) Agarbrühe-Schrägkultur:

2) Glucose-Agarbrühe-Schrägkultur:

3) Glucose-Casaminosäuren-Schrägkultur:

4) Glucose-, Proteose-. Pepton·. Agar-Schrägkultur:

III. Physiologische Eigenschaften

1) Gelatineverflüssigung:

2) Hydrolyse von Casein:

3) Indolbildung:

4) Ammoniakbildung(Pepton/Wasser- und Sonley's Argininhalbfest-Kulturmedium):

Stäbchen (0,6—0,8 μιη χ 1,2—3,0 μπι). keine Bildung von Kettenzellen.
Endosporen, elliptisch

(0,7-0,9μΐΐι χ 1,2-3,0μπι), Position zcniral oder vorne. Sporangium nicht merklich aufgeweitet.

liegt vor

Oberflächenhaare
positiv
negativ

geringes Wachstum

mäßiges Wachstum jedoch Bildung viskoser Polysaccharide in großer Menge
Wachstum schwächer als mäßig; etwas Bildung viskoser Polysaccharide

Wachstum geringer als mäßig; etwas Bildung viskoser Polysaccharide.

5)	Hydrogensulfid-Bildung (Cystein, Pepton-Kultur-	—
	medium und Kligler's Eisen-Agar-Kulturmedium):	+
6)	Urease:	sehr gering
7)	Reduktion von Nitraten:	keine Änderung
8)	Lackmus-Milchkultur:	+
9)	Stärkehydfolyse:	—
10)	Bildung von Kohlendioxid (Glucose):	—
")	Methylrot-Test:
12)	Voges-Proskauer-Test	—
	(Acetyl-methylcarbinol-Bildung):	—
13)	Zitronensäure-Verbrauch:	+
14)	Katalyse:	+
15)	Oxydase:	—
16)	Phenylalanir.-Desaminase:	—
17)	Ornithin- Decarboxylase:	—
18)	Lysin-Decarbcxylase:	—
19)	Bildung von Fluoreszenzfarbstoff:	—
20)	Denitrierung von Nitrat	bildet große Me
21)	Bildung von Polysacchariden:

verschiedenen Kohlenhydraten, wie Glucose. Maltose, Dextrin, hydrolysieren Stärken, verschiedenen stärkeartigen Ausgangsmaterialien, Saccharose usw.

22) Salzbeständigkeit: Glucosebrühe-Kulturmedium ohne NaCl: I —3% NaCl-Zusatzzum Kulturmedium: 5% NaCl-Zusatzzum Kulturmedium:

23) Wachstumsbedingungen:

Temperatur:

15-40⁰C 25-35°C 45°C pH:6-8

63-7,5

24) Zucker-Verwertung

Wachstumsbereich

optimal

kein Wachstum

Wachstumsbereich

optimal

geringfügiges Wachstum
gutes Wachstum
kein Wachstum

aerob günstig

KumL-nstoffqueüc

Zersetzung

Oxydation

Säure

Gas

Fermentation
Säure

Gas

Materialisation

Glycerin

Xylose

Saccharose

Glucose

Lactose

Stärke

Fructose

Galactose

Mannose

Arabinose

Maltose

Mpnnit

Sorbit

gering gering gering gering gering

gering

gering gering

Die obigen Eigenschaften wurden auf der Grundlage von »Laboratory Methods in Microbiology«, W. F. Harrigan et al. und des »Manual of Microbiological Method«, American Microbiological Society, geprüft. Nach einer Durchsicht des »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« 7. Auflage (1957), 8. Auflage (1974) nach Bakterien mit diesen Eigenschaften wurde auf der Grundlage der nachfolgend aufgeführten Informationen bestimmt, daß dieses Bakterium Bacillus lentus ist und D-228 als »Bacillus lentus D-228« bezeichnet wird.

1. Bildet Endosporen.

2. Die Sporen sind oval, liegen zentral oder vorne in Kulturzellen.

3. Sporangium nicht erkennbar ausgedehnt oder aufgebläht.

4. Gram-positiv.

5. Hydrolysiert Stärke, jedoch keine Reduktion von Kasein oder Verflüssig! .ng von Gelatine festgestellt.

6. Bildet Urease.

7. Wächst nicht in Kulturmedium mit 5% NaCI-Zusatz.

8. Wächst nicht bei 45°C.

Dieses Bakterium ist beim Fermentation Research Inscitute, Agency of Industrial Science and Technology, unter BP-915 registriert.

Es liegen keine Berichte darüber vor, daß dieses Bakterium viskose Saccharide erzeugt, und insbesondere darüber, daß in einem vergleichsweise einfachen Kulturmedium mit Stärke als Ausgangsmaterial dieses Bakterium große Mengen hochviskoser Polysaccharide anhäuft, die hinsichtlich ihrer Beständigkeit gegenüber Säure und Wärme überlegen sind, d. h. eine völlig neue Erkenntnis.

Als im erfindungsgemäßen Kulturmedium verwendete Kohlenstoffquelle sind Glucose, Saccharose, Maltose, Stärke-Saccharide und alle Arten von Stärke wirksame Ausgangsmaterialien, und Dextrin liefert besonders gute Ausbeuten. Als Stickstoffquelle sind Maisquellwasser, Pepton und Hefeextrakt, Fleischsaftextrakt usw. für die Erzeugung von hochviskosen Polysacchariden äußerst wirksam, und Art und Dichte können je nach der verwendeten Kohlenstoffquelle variiert werden. Wirksame anorganische Salze sind Phosphate, Magnesium-, Calcium-, Eisensalze usw, die die Polysaccharid-Erzeugung und -Viskosität verstärken.

Günstige Kulturbedingungen für diese Bakterien sind Temperaturen von 20—40, vorzugsweise 23—3O⁰C, ein Anfangs-pH des Kulturmediums von 5—8, vorzugsweise 7 — 7,5, Schüttelkultur oder Kultur durch Zugbewegung. Nach 24 h stellt man das Schäumphänomen der Kulturflüssigkeit fest, und mit weiterer Kulturdauer beginnt die Produktion von Polysacchariden. Nach 60—90 h geliert die Kulturflüssigkeit und erreicht einen maximalen Viskositätswert. Mit weiterem Züchten fällt der pH der Kulturflüssigkeit, bis schließlich bei 5,2—5,4 die Kultur endet, um Polysaccharid maximaler Viskosität mit den überlegensten Eigenschaften zu ergeben. Ferner ist die Menge zr. Organismen viel kleiner als bei anderen Puiysaccnarid erzeugenden Bakterien. Die Isolierung der Polysaccharide aus der Kulturflüssigkeit kann nach bekannten Methoden erfolgen. Beispielsweise werden nacih dem Verdünnen der Flüssigkeit mit einer geeigneten Menge Wasser die Organismen und unlösliches Material abzentrifugiert, und nach Zusatz von 1—2% Kaliumchlorid zu der überstehenden Flüssigkeit werden die Polysaccharide durch Zusatz von Methanol, Äthanol oder Aceton als Fällungsmittel ausgefällt, gewaschen und mit Aceton entwässert und zu einer faserigen Masse vakuumgetrocknet. Die Ausbeute beträgt 85—95% des Saccharid-Ausgangsmaterials.

Das nach diesem Verfahren erhaltene rohe, viskose Polysaccharid wird erneut gelöst, wärmebehandelt, zum

Entfernen einer kleinen Menge an Organismen und unlöslichem Material zentrifugiert, wiederholt mit Aceton oder so ausgefällt, daß hochreine, weiße, fadenförmige, raffinierte, viskose Polysaccharide anfallen. Auch durch Fällung mit 'Cetyl-trimethylammoniumhydroxid (CTA-Behandlung), Dialyse und die Verwendung lonenaustauscher-Harzes usw. kann ein hochreines, superraffiniertes Produkt erhalten werden.

Die Eigenschaften des nach diesem Verfahren erhaltenen sauren Polysaccharids sind folgende:

1. Schmehipunkt:

Im allgemeinen haben Polysaccharide keinen Schmelzpunkt; der Zersetzungspunkt ist 210—218°C.

2. Viskosität:

In Wasser wird zu einer klebrigen Flüssigkeit gelöst. In 19/oiger wäßriger Lösung beträgt die Viskosität 4000—5000ep (25⁰C). Fig. 1 gibt einen Vergleich der Viskosität dieses Saccharids und der von Xanthan-Harz und natürlichen Polysacchariden.

3. Löslichkeit in organischem Lösungsmittel:

Unlöslich in normalen Fällungsmitteln für Polysaccharid, wie Methanol, Äthanol, Aceton usw.

4. Reaktion mit Cetyl-trimethylammoniumhydroxid:
Bildet weiße Fällung; also saure Polysaccharide.

5. Stabilität in Säure und Alkali:

Verhältnismäßig stabile Viskosität im Bereich von pH 3— 11.

so 6. Stabilität in Salzen:

Hohe Viskosität in Gegenwart zweiwertiger Metallsalze, wie Kalium- und Magnesiumsalzen, und auch in Meerwasser.

7. IR-Absorption:

Wie F · g. 2 zeigt, liegt Absorption bei Wellenlängen von 5,8 und 6,25 μΐη vor, aufgrund des Vorhandenseins von Ester- und Säurerest.

8. Farbe und Form:

Das raffinierte Produkt ist weiß, fadenartig,
eo

9. Bestandteilbildendes Saccharid:

Gemäß gaschromatographischer Analyse sind die Hauptbestandteile Glycose, Galactose, Mannose und Glucuronsäure.

Herkömmlicherweise bekannte bestandteilbildende Saccharide saurer, durch Bacillus-Mikroorganismen erzeugter Polysaccharide sind von Rhamnose, Galactose, Mannose und Glucuronsäure abgeleitete, von Glucose und Uronsäun; abgeleitete, von Glucose, Mannose und Uronsäure abgeleitete, von Fucose, Glucose, Galactose und Glucuroniiäure abgeleitete, von Glucose, Mannose, Xylose und Uronsäure abgeleitete, aber die bestandteil-

bildenden Saccharide Glucose, Galactose, Mannose und Glucuronsäure für die erfindungsgemäß erhaltenen sauren Polysaccharide waren bislang nicht bekannt. Ferner hat, wie F i g. 1 klar zeigt, dieses saure Polysaccharid in l%iger wäßriger Lösung eine sogar noch höhere Viskosität als Xanthan-Harz (von Xanthomonas-Mikroorganismen erzeugtes saures Polysaccharid), das die höchste Viskosität unter den von Mikroorganismen erzeugten sauren Polysacchariden aufweist. F i g. 1 zeigt auch die Viskositäten der natürlichen Polysaccharide »Guar«- und 5 »Karaya«-Harz.

Die vorstehenden Tatsachen bestätigen, daß die erfindungsgemäß erhaltenen sauren Polysaccharide von den herkirnmlicherweise bekannten Polysacchariden abweichen. Die erfindungsgemäß erhaltenen sauren Polysaccharidewurden (vorläufig) mit D-228 bezeichnet.

Aufgrund ihrer hohen Viskosität können die erfindungsgemäß erhaltenen Polysaccharide als viskositätserhö- 10 hende Mittel für Nahrungsmittel und br. der Gewinnung von öl aus Ölbohrungen verwendet werden. Sie können auch als äußerliche Arzneimittelträger, Textilschlichtemittel. Toiletteproduktzusätze usw. Verwendung finden. ty

Beispiel 1 15 Ϊ}

Zusammensetzung eines Kulturmediums für Schrägkultur: Vj

Glucose 0,5%, Pepton 1 %, Fleischsaftextrakt 1 %, Natriumchlorid 0,5%, Agar-Agar 1,5%, pH 7,4. ' j

Zusammensetzung eines Vorkulturmediums: 20 <\

Glucose 0,5%, Pepton 0,5%, Hefeextrakt 0,2%, Fleischsaftextrakt 0,1 %, ph 7,4.

Zusammensetzung eines Kulturmediums für die Hauptkultur (Produktion):

Maisstärke 3%, Maisquellwasser 0,5%, Pepton (oder Hefeextrakt) 0,1%, K₂HPO₄ 0,05%, ph 8,0.

Die Schrägkultur- und Vorkulturmedien wurden 15 min bei 110⁰C dampfsterilisiert, das Produktionsmedium 15—30 min bei 120⁰C. Nach 48stündigem Züchten von Bacillus lentus BP-915 in dem Schrägkulturmedium bei 28° C wurde eine Schleife des Bacillus lentus eingeimpft in 50 ml Vorkulturmedium in einen mit einer Schulter versehenen 500-ml-Kolben und 12—14 h bei 28° C der Schüttelkultivierung unterworfen.

1 —5 ml dieser Vorkulturflüssigkeit werden mit 50 ml Produktionskulturmedium in einem 500-ml-Schulterkol- 30 ben zusammengebracht und 72 h bei 25—28⁰C und 200 Umdrehungen/min schüttelkultiviert. Nach 15—20 h

Züchtung tritt das Schäumphänomen auf; dann beginnt die Polysaccharid-Bildung, die Viskosität der Kulturflüs- \>

sigkeit steigt mit fortschreitender Züchtung an, bis sie nach 60—72 h geliert und ihre Viskosität einen Maximal- 'ij

wert erreicht. Mit zunehmender Viskosität ist auch eine zunehmende Ansammlung an Polysaccharid zu erken- ^:'\

nen, und der pH der Kulturflüssigkeit fällt von 73 auf 5,5—5,3. 35 ^:J

Ist die Kultur beendet, wird 1 1 Kulturflüssigkeit maximaler Viskosität gewonnen, mit einer geeigneten Menge '■]

Wasser verdünnt, bei 10 000 UpM abzentrifugiert und die Bakterien entfernt. War jedoch die Menge der £

ursprünglichen Bakterien sehr klein, besteht keine Notwendigkeit zur Verwendung einer Zentrifuge, um die *jj

Polysaccharid-Bestandteile zu erhalten. Daher wird die Kulturflüssigkeit mit einer geeigneten Menge Wasser ^i

verdünnt, und nach Zusatz von 1% Kaliumchlorid wird unter Rühren eine gleiche Menge Aceton zur Fällung des 40 |t

faserigen Polysaccharids zugesetzt, dieses mit wasserfreiem Aceton entwässert und vakuumgetrocknet. Die C^;j

Ausbeute an dem erhaltenen weißen, faserigen Mittel betrug 26 g (87%). Zur Reinigung wurde genügend Vi

Wasser zugesetzt, um 10 g dieses Mittels zu lösen, dann wurde 5 min bei 90⁰C wärmebehandelt und nach dem ;·;

Abkühlen zum völligen Entfernen restlicher Bakterien und unlöslichen Materials zentrifugiert Die überstehende j|j

Flüssigkeit wurde unter Rühren mit CTA-Lösung versetzt, worauf saure Polysaccharide ausfielen. 45 ff\

Nach dem Entfernen des CTA wurde das Polysaccharid in Wasser erneut aufgelöst und wieder mit Aceton %

ausgefällt. Die Fällung wurde gewaschen und mit Aceton entwässert und zu 8,5 g eines reinen, weißen, fadenarti- : j

gen gereinigten Produkts getrocknet. i|

Beispiel 2 50 _:>

Herstellung eines Kulturmediums für die Produktion.

1. Sirup mit 5% Maltose (Trockengewicht), Pepton 8%, Maisquellwasser 0,15%, K₂HPO₄ 0,15%, MgSO,; ■ 7 H₂O0,015%,FeCl₃ · 6 H2O0,008%,CaCl₂0,008%,pH8,0(110°C,20 min Dampfsterilisation). 55

2. Sirup mit 3% Maltose (Trockengewicht), Fleischsaftextrakt 03%, Maisquellwasser 0,2%, K₂HPO₄ 0,i%, MgSO₄ · 7 H₂O 0,01%, FeCl₃ · 3 H₂O 0,005%, CaCl₂ 0.005%, pH 8,0 (110° C, 20 min Dampfsterilisation).

3. Glucose 3%, Pepton 0,5%, Maisquellwasser 0,1%, K₂HPO₄ 0,1%, MgSO₄ · 7 H₂O 0,01%, FeCl₃ · 6 H₂O 0,005%, CaCl₂ 0,005%, pH 8,0 (110⁰C, 20 min Dampfsterilisation).

4. Dextrin (DE 30) 3%, Maisquellwasser 0,5%, Hefeextrakt 0,1%, K₂HPO₄ 0,05%, pH 8,0 (I20°C, 15 min 60 Dampfsterilisation).

5. Maisstärke 5%, Maisquellwasser 0,83%, Hefeextrakt 0,165%, K₂HPO₄ 0,083%, pH 8,0 (120°C, 30 min Dampfsterilisation).

6. Maisstärke 2%, Maisquellwasser 0,6 pH 8,0 (120° C, 30 min Dampfsterilisation).

Mit 70—SOstündiger Kultivierung wie in Beispiel 1 unter Verwendung des Produktionskulturmediums 1—5 des obigen Beispiels 2 wurden Polysaccharide aus dem geleeartigen Kulturmaterial wie in Beispiel 1 gewonnen. Die mit den Kulturmedien dieses Beispiels erhaltenen Polysaccharide entsprachen grob denen des Beispiels 1.

-■j
jr

•S

!O

20

25

Ausbeuten und gewonnene Mengen sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

Produktions	Ausbeute	gewonnene Menge	Züchtungszeit
kulturmedium	(%)	(g)	(h)
1	- 50	25	80
	50	15	72
3	43	12,9	72
4	56	16,8	72
5	87	43,6	80
6	97	19,4	60

4. Kurze Erläuterung der Figuren

F i g. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen Konzentration und Viskosität für das Polysaccharid D-228 in wäßriger Lösung zeigt, erhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Fig. 2 ist das IR-Absorptionsspektrum für Polysaccharid D-228, erhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

In F i g. 1 gilt die Kurve 1 für Polysaccharid D-228, Kurve 2 für für Guar, Kurve 3 für Xanthan, Kurve 4 für Karaya, die Ordinate bedeutet die Viskosität (cp) und die Abszisse die Konzentration (%).

F i g. 2 gibt auf der oberen Abszisse die Wellenlänge, auf der unteren Abszisse die Wellenzahl (cm-¹) und auf der Ordinate die Durchlässigkeit (in %) an.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

30

35

40

45

fV.

!■'

50

55

60

65

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung hochviskoser Polysaccharide durch Züchten eines Mikroorganismus und Isolieren und Reinigen des Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus lentus FERM EP-9I5 züchtet und die Reinigung bis zum Erhalt eines Polysaccharids mit einer Viskosität von 4000 bis 5000 cp, gemessen in 1 %iger wäßriger Lösung, durchführt.

2. Mittel, enthaltend ein hochviskoses saures Polysaccharid, erhalten gemäß Anspruch 1, dessen Hauptbestandteile Glucose, Galactose, Mannose und Glucuronsäure sind und das in 1%iger wäßriger Lösung eine Viskosität von 4000 bis 5000 cp (25° C) aufweist.