DE2202701A1 - Verfahren zur herstellung von zitronensaeure durch gaerung - Google Patents

Description

DU Ä. POSCHENRIEDER

► DR. E. BOETTNER
DIPL-ING. H..J. MÜLLER

Patentanwälte 2 £ U £ /Ul

Λ 8 MÜNCHEN 80 Lucile - Grahn - Straße 38 Telefon 475155

No. 6-4, Otemachi Mitsui Sugar Co., Ltd., Tokyo. Japan,2 chome, Chiyoda-ku,

Hiroshi Iizuka, Tokyo, Japan, 14, No. 5, 4-chome, Nishiochiai, Shin.juku-ku

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Gärung

(zusatz zu Patent . ... Patentanmeldung

P 18 12 71C.1-41).

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure durch Gärung, und insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Gärung unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelle.

Bei einem bekannten Gärungsverfahren zur Herstellung von Zitronensäure, das in der Technik praktisch ausgeübt wird, werden Schimmelpilze verwendet, und als Kohlenstoffquelle für das bei der Gärung verwendete Kulturmedium wird ein Saccharid, insbesondere Melasse, benutzt. Darüber hinaus wird die Gärung für gewöhnlich vermittels einer Oberflächenkultur durchgeführt, doch gewinnt die Submerskultur seit kurzem eine immer größere praktische Bedeutung.

Die Submerskultur von Schimmelpilzen bietet jedooh wegen der Eigenschaften eines Stammes, der zur Gattung

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Asperglllus niger gehört, der einen typischen, normalerweise bei der Gärung verwendeten Schimmelpilz darstellt, verschiedene Schwierigkeiten. So erfordert die submerse Züchtung beispielsweise einen hohen technischen Aufwand zur Regulierung des Gärprozesses.

Die eigene ältere offengelegte Patentanmeldung P 18 12 7^0.1 betrifft ein biotechnisches Herstellungsverfahren für Zitronensäure oder ihren Salzen durch Mikroorganismen in zuckerhaltigen Nährsubstraten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den unter ATCC 20 177 niedergelegten Mikrostamm der Gattung Candida oleophila unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit, welche assimilierbare Kohlenhydrate und übliche Neutralisierungsmittel, wie Calciumcarbonat, in Verbindung mit anderen anorganischen und organischen Bestandteilen enthält, züchtet, und das in großer Menge angesammelte Zitrat aus der Kulturflüssigkeit gewinnt.

Dieses Verfahren bietet besondere Vorteile bezüglich der Ausbeute, einer kürzeren Kulturdauer, eines geringeren Belüftungsaufwandes und der Möglichkeit, kontinuierlich zu arbeiten.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß dieser zur Gattung Candida oleophila gehörige Stamm, der aus einem Petroleumkraftstoff-Tank isoliert wurde, nicht nur Kohlenwasserstoffe assimiliert, sondern bei Züchtung in einem flüssigen, Kohlenwasserstoffe enthaltenden Kulturmedium Zitronensäure in großer Menge zu bilden vermag, die sioh in dem Kulturmedium ansammelt und aus der Gärmaische gewonnen werden kann.

Das erfindungegemäße Verfahren aur bioteohnischen Herstellung von Zitronensäure oder ihren Salzen durch Züchten

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OFUGtNAL INSPECTED

von Candida oleophila ATCC 20 177 unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit, welche eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und übliche Neutralisierungsmittel, wie Calciumcarbonat, in Verbindung mit anderen anorganischen und organischen Bestandteilen enthält, und Gewinnen des gebildeten

Zitrats aus der Kulturflüssigkeit nach Patent

(Patentanmeldung P 18 12 710.1-41), ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kulturflüssigkeit verwendet, die als Kohlenstoffquelle η-Paraffine oder überwiegend η-Paraffine enthaltende Kohlenwasserstoffe enthält.

Die für die Taxonomie der erfindungsgemäß verwendeten Art Candida oleophila charakteristischen Eigenschaften sind die folgenden:

- 4 - 'i (ι Ί Η 0 7 / 1 1 A 9

(1) Wachstum in Malzextrakt

Naoh dreitägigem Wachstum bei 25°C sind ovale oder länglich-ovale Zellen entstanden, deren Größe (2,5 bis 5,0 Ai) χ (3,0 bis 15,0/u) beträgt. Auf der Oberfläche des Kulturmediums hat sich ein schwerflüssiger ausgedehnter Ring bzw. eine entsprechende Haut gebildet. Dieser Ring bzw. diese Haut ist glatt oder runzlig und hellbräunlich-cremefarben. Es werden keine Ascosporen, sondern es wird ein Pseudomycel gebildet.

(2) Aufstrelohkultur auf Malz-Agar

Nach dreitägigem Wachstum bei 25°C ist die Aufstreichkultur glatt und hellbräunlich-cremefarben. Die Form der Zellenist die gleiche wie im Falle des Malzextraktes. Es werden keine Ascosporen, sondern es wird ein Pseudomycel gebildet.

(3) Plattenkultur

Das Pseudomycel entwickelt sich gut auf Kartoffel-Agar.

(4) Physiologische Eigenschaften

i) optimale Wachstumsbedingungens p_H 5,2; Temperatur 30°C; aerobe Bedingungen; ii) Assimilierung von Kaliumnitratt keine; iii) Koagulierung von Milcht keine; iv) osmophlle Eigenschaft (in 1Obigem NaCl-Medium) keine;

v) Verflüssigung von Oelatine: keine; vi) Vitaminbedarf: keiner;
vii) Bildung von Karotinfarbstoffeni keine.

(5) Assimilierbare Stickstoffquelle Pepton, Ammoniumsulfat und Harnstoff

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(6) Assimilierbare Kohlenstoffguelle Olukose +

Galactose + Saccharose + Maltose Lactose Stärke

(7) Äthanol als einzige Kohlenstoffguelle Outes Wachstum

(8) Kerosin als einzige Kohlenstoffquelle Gutes Wachstum

(9) Gärungen von Glukose, Galactose, Saccharose, Maltose und Lactose

Keine

(10) Arbutin-Spaltung Keine

(11) Vorkommen

Dieser Mikroorganismus kommt in Petroleumkraftstoff-Tanks u.dgl. vor.

Die vorstehend angeführten taxonomen Eigenschaften stehen im Gegensatz zu dem, was in dem Buch von Lodder und Kreger- van RiJ "The Yeast" (1952) beschrieben ist. Obwohl der vor liegend verwendete Mikroorganismus in die Gattung Candida eingeordnet wurde, ist nichts in der entsprechenden Beschreibung der Species erwähnt, mit welcher der vorliegende Mikro organismus gleichgesetzt werden kann. Er scheint mit der bekannten Species Candida rugosa eng verwandt zu sein, un terscheidet sich jedoch deutlich von dieser durch die Fähig keit zur Assimilierung von Saccharose und durch die Bildung des schwerflüssigen Ringes bzw. der Haut im Falle der Züch tung im Malzextrakt. Demgemäß wird der Mikroorganismus, der

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bei der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangt, als neue Species angesehen, die zur Gattung Candida gehört und dem die Erfinder den Namen "Candida oleophila" gegeben haben.

Eine Kultur des lebenden Organismus ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 20177 hinterlegt worden.

Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung kann jeder beliebige Stamm, der zur Species Candida oleophila gehört, für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Es kann jeder Organismus für die vorliegende Erfindung Anwendung finden, der als Mutante oder Variante von Candida oleophila anerkannt werden kann und der die oben angeführten hauptsächlichen mykologischen Eigenschaften aufweist.

Als Kohlenwasserstoffe, die für das erfindungsgemäße Kulturmedium verwendet werden, kann man auf übliche Paraffine zurüokgreifen, doch werden vorzugsweise n-Paraffine benutzt. Als solche η-Paraffine können 9 bis 35 Kohlenstoffatome aufweisende η-Paraffine verwendet werden, doch benutzt man solche η-Paraffine, die 9 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen, so wird Zitronensäure in besonders hoher Ausbeute erzeugt. Die vorstehend angeführten n-Paraffine können für sich allein oder im Gemisch untereinander angewendet werden.

Zu den Stickstoffquellen, die beim erfindungsgemäßen Kulturmedium verwendet werden, gehören beispielsweise Ammoniak, Harnstoff, anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumacetat, Pepton,

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Fleischextrakt* Hefeextrakt, Maiseinweichwasser, Fischmehl, ein aufgeschlossenes Produkt desselben, Sojabohnenkuchen oder ein aufgeschlossenes Produkt desselben u.dgl. mehr. Diese Stickstoffquellen können für sich allein oder in Kombination miteinander verwendet werden.

Erforderlichenfalls kann ein anorganisches Material, wie ein Phosphat, ein Magnesiumsalz oder ein Mangansalz, und ein Vitamin, wie Thiamin oder Nicotinsäure, dem Kulturmedium einverleibt werden.

Um zu verhindern, daß das p_H des Kulturmediums schwankt, ist es empfehlenswert, vorher Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat dem Kulturmedium zuzusetzen, um während der Züchtung gebildete und angesammelte Zitronensäure zu neutralisieren, doch kann das vorerwähnte Salz oder Calciumhydroxyd oder Natriumhydroxyd dem Kulturmedium während der Züchtung als Neutralisiermittel zugegeber» werden.

Das erfindungsgemäß verwendete Kulturmedium wird für gewöhnlich in der Weise hergestellt, daß man eine wäßrige Lösung der oben angeführten Nährstoffe sterilisiert und danach den Kohlenwasserstoff oder die Kohlenwasserstoffe zugibt, doch kann in dem Fall, in dem eine Sterilisierung des Kohlenwasserstoffes erforderlich ist, der Kohlenwasserstoff vorher einer solchen Sterilisierung durch Erhitzen oder einer Sterilisierung durch Filtration unterworfen werden. Die Konzentration des Kohlenwasserstoffes im Kulturmedium liegt vorzugsweise zwischen 5 und 20 Volumenprozent pro Einheitevolumen des Kulturmediums. Der Kohlenwasserstoff bzw. die Kohlenwasserstoffe werden für gewöhnlich sämtlich dem Kulturmedium zu Beginn zugesetzt, doch können

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sie dem Kulturmedium während der Züchtung auch stufenweise oder kontinuierlich zugesetzt werden.

Danach wird im Normalfall eine wäßrige Anschlämmung von Calciumcarbonat durch Erhitzen sterilisiert und dem Kulturmedium als Neutralisationsmittel zugesetzt.

Als ZUchtungsmethode wird erfindungsgemäß eine aerobe Züchtung angewendet. Es ist vorteilhaft, von einer submersen Züchtungsmethode unter Durchwirbeln vermittels Einblasen von Luft mit nachfolgendem lebhaftem Rühren zwecks guter Dispergierung der Kohlenwasserstoffe in dem Kulturmedium Gebrauch zu machen. Die Luftmenge, die zu diesem Zweok in das Kulturmedium eingeblasen wird, beträgt das 1/2- bis 2-fache des Volumens des Kulturmediums pro Minute, und der Druck in dem Gärtank kann Kormaldruck oder ein erhöhter Druck sein.

Die Züchtung wird für gewöhnlich bei Temperaturen von etwa 20 bis 35°C, bei einem p_H von 2 bis 8, vorzugsweise 4 bis 8, und für eine Dauer von etwa 3 bis 7 Tagen durchgeführt.

Ist die Züchtung beendet, so liegt die gebildete Zitronensäure in der Oärflüssigkeit dank dem Calciumcarbonat, das dem Kulturmedium zugesetzt worden ist, für gewöhnlich in Form von Calclumcitrat vor. Das Salz der Zitronensäure wird von der GärflUssigkeit dadurch abgetrennt, daß man das in dieser Flüssigkeit suspendierte Calciumcitrat gemeinschaftlich mit der restlichen Hefe abfiltriert, die Feststoffe nach dem Waschen mit einer bestimmten Menge Schwefelsäure versetzt, um die Zitronensäure freizumachen und in Lösung zu bringen,und danach die ungelösten festen

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Substanzen, die aus Calciumsulfat und Hefe bestehen, durch Abfiltrieren entfernt. Das Filtrat wird zwecks Entfärbung erforderlichenfalls mit Aktivkohle oder Ionenaustauschharzen behandelt und danach konzentriert, wodurch die Zitronensäure ausgefällt und gesammelt wird. Man kann auch von einer anderen Methode zur Gewinnung der Zitronensäure Gebrauch machen, bei welcher die Zitronensäure in der Weise isoliert wird, daß man zur Gärflüssigkeit direkt Schwefelsäure zusetzt, die Hefe und das Calciumsulfat durch Filtrieren entfernt und das Filtrat - erforderlichenfalls nach entsprechender Reinigung konzentriert, um die Zitronensäure zum Kristallisieren zu bringen.

Die mit der vorliegenden Erfindung verbundenen Vorteile lassen sich wie folgt zusammenfassen:

(1) Im Vergleich zu dem üblichen Pail der Verwendung von Sacchariden als Rohmaterial ist es beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich, ein Perrocyanid, Methanol u. dgl. zum Kulturmedium zuzugeben, und darüber hinaus sind Vorbehandlungsoperationen, wie das Entsalzen und das Reinigen des Saccharids als Rohmaterial unnötig und zudem wird die Zitronensäure in höherer Ausbeute erhalten.

(2) Das Säurebildungsvermögen des erfindungsgemäß verwendeten und zur Gattung Candida oleophila gehörigen Stammes ist in hohem Maße beständig, und die Mikroorganismen sind recht einfach zu handhaben.

(3) Da beim erfindungsgemäßen Verfahren eine Hefe, wie Candida oleophila und als Kohlenstoffquelle Kohlenwasserstoffe benutzt werden, sind bei der Gärung geringere Befürchtungen hinsichtlich einer Verunreinigung durch Bakterien oder Hefen zu hegen, selbst wenn die

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Gärapparate, das Kulturmedium und die Luft einmal nicht so sorgfältig sterilisiert worden sind. Ferner ist im. Vergleich zu den zum Stand der Technik gehörigen Verfahren, die Melasse u.dgl. als Rohmaterialien verwenden, die Bildung von Schaum während der Züchtung beim erfindungsgemäßen Verfahren geringer, wodurch der erfindungsgemäße Prozeß besonders wirtschaftlich gestaltet werden kann, und zwar sowohl im Hinblick auf dessen praktische Durchführung als auch auf die Einsparung an Antischaummitteln. Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren wirtschaftlicher in bezug auf die betriebstechnische Durchführung der Fermentation im Vergleich zu der von bekannten Verfahren.

(4) Da die Fermentationsdauer beim erfindungsgemäßen Verfahren weitgehend, d.h. zum Beispiel auf etwa 74 Stunden, herabgesetzt werden kann, ist ea möglich, das Verhältnis im Durchsatz zur Anlagegröße außerordentlich günstig zu gestalten. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren des Fermentationsprozesses sowohl absatzweise als auch in einem kontinuierlichen System durchgeführt werden.

(5) Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet somit die Gewinnung von Zitronensäure in wirtschaftlicher Weise unter Verwendung eines Kohlenwasserstoffes als Kohlenstoffquelle mittels einer Submerskultur.

(6) Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Kohlenwasserstoff, insbesondere ein η-Paraffin, in einer hohen Konzentration, die 5 bis 20 # beträgt, in einem Kulturmedium fermentiert. Auch der Kohlenwasserstoff bzw. das η-Paraffin kann dem Kulturmedium diskontinuierlich oder

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kontinuierlich während der Gärung zugesetzt werden. (7) Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Zi tronensäure (als Anhydrid) in der erstaunlich hohen Ausbeute von 150 Gewichtsprozent (W/W), bezogen auf den Kohlenwasserstoff, insbesondere das n-Paraffin, erhalten.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung soll nun durch die vorliegenden Beispiele eingehender erläutert werden.

Beispiel 1

Nach Einfüllen von 100 ml eines Kulturmediums, das 1 i<> Glukose, 0,5 $> Pepton, 0,3 % Hefeextrakt und 0,3 $> Malzextrakt (die Prozentwerte sind jeweils als Gewicht pro Volumen berechnet) enthält, in einen 500 ml-Sakaguchi-Kol- ben und Sterilisieren des Kulturmediums durch Aufkochen (boiling), wurde das Inokulum hergestellt durch Inkubation eines zu Candida oleophila ATCC 20177 gehörigen Stammes im Kulturmedium und Züchtung vermittels 24 Stun den langem Schütteln des Kulturmediums bei 28⁰C. Von dem nach dieser Prozedur erhaltenen Inokulum wurden 400 ml zur Beimpfung des Gärmediums verwendet.

In etwa 9 Liter Wasser wurden 120 g Glukose, 60 g Pepton, 36 g Hefeextrakt und 36 g Malzextrakt gelöst und die so hergestellte Lösung wurde durch 15 Minuten langes Kochen bei 120⁰C in einem Fermenter von 30 1 sterilisiert und danach auf 28⁰C abgekühlt. Dann wurden 1,2 Liter eines Gemisches von η-Paraffinen mit 11 bis 15 Kohlenstoff atomen, das vorher durch Filtrieren sterilisiert worden war, und 600 g CaCO₅, die durch Erhitzen sterilisiert worden waren, zu der Lösung in dem Fermenter zugegeben und ferner sterilisiertes Wasser zum

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Qemisch zugesetzt« um das Volumen des Gemisches auf 11,6 Liter einzustellen, und danach folgte ein gründliches Durchrühren.

Das auf diese Weise erhaltene Kulturmedium wurde mit dem wie oben angegeben hergestellten Inokulum beimpft. In dem so hergestellten Gärmedium betrug die Anfangskonzentration der n-Paraffine 10 Volumenprozent und das Anfangs-p„ 5#5·

Unmittelbar nach der Beimpfung wurde die Gärung in Gang gebracht und hierzu eine Belüftungsgeschwindigkeit von 12 Liter Luft/Minute, eine Rührgeschwindigkeit von 500 Umdrehungen/Minute und eine Temperatur von 28°C eingehalten. Unter diesen Bedingungen war die Gärung nach 96 Stunden abgeschlossen.

Nach Beendigung der Gärung betrug die Menge der Zitronensäure, die sich gebildet hatte, 1320 g, und die Mikroorganismen-Population belief sich auf 8,5 x 10 Zellen/ml. Der Mengenwert entsprach einer Zitronensäureausbeute von 152 Gewichtsprozent.

Aus der so entstandenen Gärbrühe wurden CaIciumzitrat, die Mikroorganismen und überschüssiges Calciumcarbonat durch Filtrieren abgetrennt und gesammelt, und nach dem Wasohen des abfiltrierten Gemisches wurde dieses Oemisch mit Schwefelsäure versetzt, um die Zitronensäure in Freiheit zu setzen. Nach dem Entfernen der Mikroorganismen und des Calciumsulfate durch Filtrieren wurde das verbleibende Filtrat konzentriert und in einem Kristallisierapparat zur Kristallisation gebracht, um so Zitronensäurekristalle zu gewinnen.

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Beispiel 2

In etwa 9 Liter Wasser wurden 24 g NH₂^Cl, 2,4 g g^ 2,4 g MgSO^·7 H₂O, 3,0 g MnSO^·η H₂O und 120 g Maiseinweichwasser gelöst, die Lösung wurde durch 15 Minuten langes Kochen bei 120⁰C in einem 30 Liter-Schüttel-Fermenter sterilisiert und danach auf 28⁰C abgekühlt. Zu der so hergestellten Lösung wurden 1,2 Liter eines Gemisches von η-Paraffinen mit 11 bis 15 Kohlenstoffatomen, das vorher durch Erhitzen sterilisiert worden war, und 600 g gepulvertes Calciumcarbonat, das gleichfalls durch Erhitzen sterilisiert worden war, zugesetzt. Danach wurde das Volumen des Gemisches durch Zugabe von sterilisiertem Wasser auf 11,6 Liter eingestellt, und dann folgte ein gründliches Durchrühren. Das so hergestellte Kulturmedium wurde mit 400 ml des Inokulums, das nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 hergestellt worden war, beimpft. In dem so entstandenen Gärmedium betrug die Anfangskonzentration an n-Paraffinen 10 Volumen-^ und das ρ« 5*5·

Unmittelbar nach der Beimpfung wurde die Gärung in Gang gebracht und hierzu eine Belüftungsgeschwindigkeit von 12 Liter Luft pro Minute und eine Rührgeschwindigkeit von 500 Umdrehungen pro Minute eingestellt und eine Temperatur von 28⁰C eingehalten. Unter diesen Bedingungen war die Gärung nach 96 Stunden abgeschlossen.

Nach Beendigung der Gärung betrug die Menge der gebildeten Zitronensäure I23O g, was einer Zitronensäureausbeute von 141 Gewichtsprozent entspricht.

Durch Zugabe von Schwefelsäure zu der so erhaltenen Gärbrühe wurde die Zitronensäure in Freiheit gesetzt, und die Mikroorganismen und das Calciumsulfat wurden hieraus durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde konzentriert

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und in einem Kristallisierapparat zur Kristallisation gebracht, um Kristalle der Zitronensäure zu gewinnen.

Beispiel 3

In etwa 9 Liter Wasser wurden 24 g NH^Cl, 2,4 g KH₂PO₁^, 2,4 g MgSOjj· 7 H₂O, 3*0 g MnSO₁^* η HgO und 120 g MaiseinweichflUssigkeit gelöst, die Lösung wurde in einen 30 Liter fassenden flae Fermenter gefüllt, und danach erfolgte das 15 Minuten lang durchgeführte Sterilisieren durch Koohen bei 120⁰C, wonach auf 28°C abgekühlt wurde.

Zu der so hergestellten Lösung wurden 480 ml eines Gemisches von n-Paraffinen mit 11 bis 15 Kohlenstoffatomen, das vorher durch Erhitzen sterilisiert worden war, und 600 g gepulvertes Caloiumcarbonat, das gleichfalls durch Erhitzen sterilisiert worden war,, zugegeben. Hiernach wurde das Volumen des Oemisches durch Zugabe von sterilisiertem Wasser auf 11,6 Liter eingestellt, und dann setzte das Rühren ein. Das so hergestellte Kulturmedium wurde mit 400 ml eines Inokulums, das aus Candida oleophlla ATCC 20177 in der gleichen Weise, wie es in Beispiel 1 angegeben 1st, gewonnen worden war, beimpft, und hierdurch wurde die Anfangskonzentration an η-Paraffinen auf 4,0 Volumen-^ und das Anfangs-Pj, des Kulturmediums auf 5*5 eingestellt.

Unmittelbar nach der Beimpfung wurde die Gärung in Oang gesetzt und zu diesem Zweck eine Belüftungsgeschwindigkeit von 12 Liter Luft/Minute, eine Rührgeschwindigkeit von 500 Umdrehungen/Minute und eine Temperatur von 28°C eingehalten. Nachdem die Oärung in Gang gebracht worden

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war, wurden 2 Volumen-^ η-Paraffine periodisch in drei Stufen zugegeben, und die Gärung war nach 74 Stunden beendet.

Die Zitronensäure, die sich nach Beendigung der Gärung gebildet hatte, betrug mengenmäßig 1350 g, was einer Zitronensäureausbeute von 155 Gewichtsprozent entsprach.

Aus der Gärbrühe wurden Kristalle der Zitronensäure in der gleichen Weise, wie es Jn Beispiel 1 beschrieben ist, gewonnen .

Beispiel 4

Drei Fermenter von einem Fassungsvermögen von Je ^O Liter wurden miteinander in Serie verbunden, und dann wurde in dem ersten Fermenter die Gärung von Candida oleophila ATCC 20177 nach der gleichen Arbeitsmethode, die in Beispiel 2 angegeben ist, in Oang gebracht. Danach wurde ein sterilisiertes Kulturmedium, das 0,2 % (Qewicht/Volumen) NH₄Cl, 0,02 % (Gewicht/Volumen) KH₂PO₄, 0,02 % (Gewicht/Volumen) MgSO₄*7 H₃O, 0,025 % (Gewicht/Volumen) MnSOj,·η HpO, 1,0 % (Gewicht/Volumen) Maiseinweichwasser, 10 Volumen-^ n-Paraffine und 5,0 % (Gewicht/Volumen) CaCO, enthielt, kontinuierlich in den ersten Fermenter in einer Dosierung von 12 Liter/24 Stunden gegeben, und zwar 24 Stunden nach Ingangsetzen der Gärung, und danach wurde die Gärbrühe kontinuierlich in den zweiten Fermenter und dann nacheinander in den dritten Fermenter befördert. Nachdem der erste, zweite und dritte Fermenter in den stationären Zustand gebracht worden waren, wurde die Gärbrühe aus dem dritten Fermenter kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit

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von 12 Liter/24 Stunden abgezogen, und es wurde die gebildete Zitronensäure bestimmt.

Wenn die Gärung 20 Tage lang fortgesetzt wurde, so wurden keine ungewöhnlichen Umstände in bezug auf die Fermentation und die Zitronensäureausbeute beobachtet. Außerdem wurde, nachdem das System den stationären Zustand erreicht hatte, Zitronensäure in einer Menge von 107 g/Liter erzeugt. Dieser Wert entspricht einer Zitronensäureausbeute von 148 Gewichtsprozent, bezogen auf die zugesetzten n-Paraffine.

Aus der so erhaltenen Gärbrühe wurden Zitronensäurekristalle nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise gewonnen.

- Patentansprüche -

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Claims (6)

Patentansprüche

1. Yerfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure oder ihren Salzen durch Züchten von Candida oleophila ATCC 20 177 unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit, welche eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und übliche Neutralisierungsmittel, wie Calciumcarbonat, in Verbindung mit anderen anorganischen und organischen Bestandteilen enthält, und Gewinnen des gebildeten Zitrats

aus der KuItürflüssigkeit nach Patent

(Patentanmeldung P 18 12 710.1), dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kulturflüssigkeit verwendet, die als Kohlenstoffquelle η-Paraffine oder überwiegend n-Paraffine enthaltende Kohlenwasserstoffe enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, daß die KulturflüsBigkeit η-Paraffine mit einer Kettenlänge von 5 bis 35, vorzugsweise 9 bis 20 C-Atomen enthält.

3; Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturflüssigkeit 5 bis 20, vorzugsweise 10 bis 15 Volumenprozent der η-Paraffine, bezogen auf die Kuitürflüssigfceit, enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man äie Fermentation in einem pH-Bereich von 2 bis 8 durchführt.

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5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Kohlenwasserstoffe entweder zu Beginn der Fermentation insgesamt oder stufenweise während der Fermentation oder kontinuierlich zugibt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur zwisohen etwa 20 und 35⁰C durchführt.

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