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DE3939797A1 - Neue vom neuropeptid y abgeleitete peptide - Google Patents

Neue vom neuropeptid y abgeleitete peptide

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Publication number
DE3939797A1
DE3939797A1 DE19893939797 DE3939797A DE3939797A1 DE 3939797 A1 DE3939797 A1 DE 3939797A1 DE 19893939797 DE19893939797 DE 19893939797 DE 3939797 A DE3939797 A DE 3939797A DE 3939797 A1 DE3939797 A1 DE 3939797A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
arg
ile
tyr
asn
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19893939797
Other languages
English (en)
Inventor
Johann-Christian Dr Zechel
Sabine Dr Schult
Liliane Dr Unger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
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Priority to EP19900917028 priority patent/EP0502874A1/de
Priority to PCT/EP1990/001997 priority patent/WO1991008223A1/de
Publication of DE3939797A1 publication Critical patent/DE3939797A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57545—Neuropeptide Y
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • Biophysics (AREA)
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  • Genetics & Genomics (AREA)
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  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft neue, vom Neuropeptid Y (NPY) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.
NPY wurde 1982 aus Schweinehirn isoliert (Nature 296 (1982) 659) und ist inzwischen in einer ganzen Reihe von Säugerspezies nachgewiesen worden. Humanes NPY besitzt die folgende Sequenz:
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Me-t-Ala
Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg--Tyr-NH₂
Das im peripheren und zentralen Nervensystem weit verbreitete Peptid ist einer der potentesten bekannten Vasokonstriktoren. Es verstärkt zudem die blutdrucksteigernde Wirkung von Noradrenalin und ist in der Lage, kardiale und cerebrale Vasospasmen hervorzurufen. Alle diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß NPY maßgeblich an der neuronalen Regulation des Blutdrucks beteiligt ist.
Es wurden nun Peptide gefunden, mit denen man NPY antagnonisieren kann.
Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel
Z-Ak-Bl-Cm-Dn-Eo-Fp-Gq-H-Thr-I-Gln-J-K-NH₂
worin
A Phe oder Tyr,
B Pro, Ser, Abu, Gly, Ala, Cys, Pro-Ser, Cys-Ser, Abu-Ser, Gly-Ser, Ala- Ser oder Pro-Ala,
C eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
D Pro oder Cys,
E die Gruppierung -NH-(C₂)t-CO- (mit t in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 0 bis 10),
F Cys, Abu, Gly oder Ala,
G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn,
H ein aus lipophilen Aminosäuren zusammengesetzter Dipeptidrest,
I eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
J eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
K Phe oder Tyr und
Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Benzylrest, einen C2-10-Acylrest oder einen C1-5-Alkylrest
darstellen,
k, l, m, n, o, p und q die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, wobei jedoch k+l+ m+n+o+p+q1 sein muß,
und zwei gegebenenfalls vorhandene Cys-Reste über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sein können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
In den neuen Peptiden sind die teilweise strukturell modifizierten N- und C-terminalen Fragmente des NPY über einen den mittleren Sequenzabschnitt des NPY ersetzenden Spacer (E) miteinander verbunden. Die Längen der N- und C-terminalen Enden und des Spacers sind variabel.
Als basische Aminosäuren für C, I und J kommen Arg, hArg, His, Lys und Orn in Betracht. Als lipophile Aminosäuren (vgl. H) sind Ile, Leu, Val, Phe, Trp, Nle, Pro zu nennen. Geeignete Schutzgruppen (vgl. Z) sind folgende: t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.
Von den neuen Peptiden sind diejenigen bevorzugt, in denen C Lys, Orn, Arg oder hArg, G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn, H Leu-Ile, Leu-Val, Leu-Leu, Val-Leu, Val-Val, Val-Ile, Ile-Ile, Ile-Leu oder Ile-Val, I Orn, Lys, Arg oder hArg, J Orn, Lys, Arg oder hArg und Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Acetyl-, p-Hydroxybenzoyl-, p-Hydroxyphenylacetat- oder p-Hydroxyphenylpropionylrest bedeuten.
Besonders bevorzugt sind die Peptide, in den
C Lys oder Arg,
E die Gruppierung -NH-(CH₂)t-CO- (mit t in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 1 bis 7)
F Cys oder Abu,
G Ile-Asn oder Asn
H Leu-Ile
I Arg
J Arg
Z ein Wasserstoffatom, einen Acetyl-, p-Hydroxybenzoyl-, p-Hydroxyphenylacetyl-, p-Hydroxyphenylpropionylrest
bedeuten und A, B, D, K sowie k-q die angegebenen Bedeutungen haben.
Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.
So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragmentverknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführt Cyclisierungsreaktion erhalten.
Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkupplung müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden.
Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl- 2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphonsäureanhydrid (PPA), N,N- Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amindophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenyl- phosphorylazid (DPPA), Castro's Reagenz (BOP), O-Benzotriazolyl-N,N,N′,N′- tetramethyluronium-Salz (HBTU), 2,5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Stegliches Reagenz; HOTDO) und 1,1′-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N′-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.
Während bei der enzymatischen Peptidsynthese normalerweise auf Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktionellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthese werden drei literaturbekannte Schutzgruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxycarbonyl (Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Schutzgruppentechnik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der trifunktionellen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Aminoschutzgruppe abgespalten werden. Eine ausführliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20-906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.
Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkupplung unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc- Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlöslichen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit überflüssig.
Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z. B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamidomethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzylalkohol- Harz, Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyloxymethyl- Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN) oder SASRIN-Harz (Fa. BACHEM).
Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N′-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Di- chlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaft besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel.
Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemischen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z. B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.
Die neuen Peptide binden mit hoher Affinität an NPY-Rezeptoren, ohne aber die physiologische Wirkung des NPY auszulösen, sind also kompetitive Antagonisten und unterdrücken die Wirkung des endogenen NPY. Die neuen Peptide besitzen blutdrucksenkende Eigenschaften und sind wertvolle Arzneimittel, die sich zur Behandlung von Kreislauferkrankungen, insbesondere des Bluthochdrucks, und von Gefäßspasmen eignen. Sie können dabei mit ACE-Hemmern, Ca-Antagonisten oder Diuretika kombiniert werden.
Die neuen Peptide sind außerdem wertvolle diagnostische und analytische Reagentien für die biochemische und medizinische Forschung, für die Erforschung des Bluthochdrucks und besonders für die Untersuchung der Biochemie und Pathophysiologie von NPY.
Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide wurden in folgenden Testsystemen durchgeführt:
  • 1. Rezeptorbindungsassay (Kaninchennierenkortex)
  • 2. funktionelle Tests an der despinalisierten und an der narkotisierten Ratte.
1. Rezeptorbindungsassay
Nierenrinde von Kaninchen wurde sofort nach Entnahme der Niere präpariert und in 0,32 M Saccharoselösung (4°C) homogenisiert. Das Homogenat wurde filtriert und anschließend bei 480 g zentrifugiert (5 min, 4°C), der Überstand gesammelt und bei 45 000 g zentrifugiert (10 min, 4°C). Der resultierende Rückstand wurde durch Resuspension und Rezentrifugation 2× mit Inkubationspuffer (25 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1% Bacitracin, pH 7,4) gewaschen und in Inkubationspuffer aufgenommen.
Die Testansätze (1 ml) setzten sich zusammen aus : 100 µg Membranprotein (BCA Protein Assay, Pierce, Rockford, Illinois, USA), 0,5 nM ³H-NPY (Amersham, Braunschweig, spez. Radioaktivität 3 TBq/mmol) in Inkubationspuffer (totale Bindung) oder a) mit zusätzlich 0,3 µM NPY (unspezifische Bindung) oder b) mit Prüfsubstanz. Die Ansätze wurden als Triplikate hergestellt.
Nach beendeter Inkubation (60 min, 30°C) wurden die Ansätze über Glasfaserfilter (Whatman GF/B) filtriert und mit eiskaltem Waschpuffer (50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 0,2% Rinderserumalbumin, pH 7,4) gewaschen. Die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität wurde mittels Flüssigkeitsszintillationsmessung bestimmt. Die unspezifische Bindung betrug bei 0,5 nM ³H-NPY ca. 20 bis 30% der totalen Bindung.
Die Auswertung der Kompetitionskurven erfolge über iterative nichtlineare Regressionsanalyse in Anlehnung an das Programm "Ligand" (Munson und Rodbard: Anal. Biochem. 107, 220, 1980).
2. a) Funktioneller Test auf NPY-Antagonismus an der despinalisierten normotonen Ratte
Für die Versuche wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten von 250 bis 300 g Körpergewicht verwendet. Die Fütterung wurde 16 bis 24 h vor Versuchsbeginn ausgesetzt, Wasser war ad libitum verfügbar. Die Tiere wurden 30 bis 40 min vor Versuchsbeginn mit Amobarbital 120 mg/kg i. p. narkotisiert. Die Beatmung erfolgte künstlich über eine Atempumpe mit einem Atemvolumen von 3 ml/Hub und 50 Atomhüben/min. Die Substanzapplikation erfolgte i. v. über die Vena jugularis mit einem Injektionsvolumen von 1 ml/kg und einer Injektionsdauer von 20 sec.
10 min nach Narkoseeinleitung wurden die Trachea, Arteria carotis und Vena jugularis präpariert und anschließend die Despinalisierung und Vagotomie durchgeführt. NPY-Injektionen (3 µg/kg i. v.) erfolgten 15 min vor sowie 5 min nach Substanzapplikation. Der Blutdruck in der Arteria carotis wurde mit Statham-Druckaufnehmern gemessen, die Verstärker und Registriergeräte waren von der Firma Hellige. Gemessen wurde die relative Hemmung (Δ %) der durch NPY ausgelösten Blutdrucksteigerung (Δ mmHg).
2. b) Blutdruckmessung an der normotonen Ratte
Für die Versuche wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten von 250 bis 300 g Körpergewicht verwendet. Die Fütterung wurde 16 bis 24 h vor Versuchsbeginn ausgesetzt, Wasser war ad libitum verfügbar. Die Tiere wurden 30 bis 40 min vor Vesuchsbeginn mit Urethan 1,7 g/kg i. p. narkotisiert. Die Atmung erfolgte spontan über Trachealkanüle.
20 min nach Narkoseeinleitung erfolgte die Präparation der Trachea, Arteria carotis und Vena jugularis. Subkutane Elektrodennadeln zur Ableitung des EKGs wurden angelegt. Der mittlere Carotis-Druck MAP (mmHg) wurde über Statham-Transducer p23Db gemessen. Die Herzfrequenz HR (min-1) wurde aus der Blutdruckamplitude bestimmt. Beide Meßgrößen wurden mit Hellige-Schreibern registriert.
Die Dosiswirkungsbeziehung wurde beschrieben durch eine lineare Regressionsanalyse zwischen log-Dosis (mg/kg) und der relativen Blutdruckänderung (y=a+b · log x). Tiere, bei denen EKG-Veränderungen auftraten, wurden registriert.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteogenen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem Dreibuchstabencode abgekürzt (gemäß Eur. J. Biochem. 138, 1984, 9-37). Darüberhinaus bedeuten: Abs=4-Aminobuttersäure, Abu=2-Aminobuttersäure, Ac=Essigsäure, Ahx=Aminohexansäure, Aoc=8-Aminooktansäure, Ape=5-Aminopentansäure, HBz=p-Hydroxybenzoesäure, Hpac=p-Hydroxyphenylessigsäure, Hpp=p-Hydroxyphenylpropionsäure.
A. Allgemeine Arbeitsvorschrift
Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Gerät Modell 430 A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS.
Folgender Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik wurde verwendet:
1. 30% Trifluoressigsäure in DCM|1×3 min
2. 50% Trifluoressigsäure in DCM 1×17 min
3. DCM-Waschschritt 5×1 min
4. 5% Diisopropylethylamin in DCM 1×1 min
5. 5% Diisopropylethylamin in NMP 1×1 min
6. NMP-Waschschritt 5×1 min
7. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure (Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und 1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM); Peptidkupplung (1. Teil) 1×30 min
8. Zugabe von DMSO zur Reaktionsmischung bis zu einem Volumenanteil von 20% DMSO @ 9. Peptidkupplung (2. Teil) 1×16 min
10. Zugabe von 3,8 Äquivalenten Diisopropylethylamin zur Reaktionsmischung @ 11. Peptidkupplung (3. Teil) 1×7 min
12. DCM-Waschschritt 3×1 min
13. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der Kupplung (zurück zu 5.) @ 14. 10% Essigsäureanhydrid, 5% Diisopropylethylamin in DCM 1×2 min
15. 10% Essigsäureanhydrid in DCM 1×4 min
16. DCM-Waschschritt 4×1 min
17. zurück zu 1.
B. Spezielle Arbeitsvorschriften Beispiel 1 H-Tyr-Abu-Ser-Lys-Aoc-Abu-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
0,5 g Boc-Tyr(Br-Z)-p-Methylbenzhydrylaminharz mit einer Substitution von 0,49 mmol/g, entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol, wurden gemäß A mit je 1 mmol
Boc-Arg(Tos)-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Gln-OH Boc-Abu-OH
Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Aoc-OH
Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys-(Cl-Z)-OH
Boc-Ile-OH Boc-Ser(Bzl)-OH
Boc-Leu-OH Boc-Abu-OH
Boc-Asn-OH Boc-Tyr(Br-Z)-OH
umgesetzt. Nach Beendigung der Synthese wurde das Harz N-terminal entschützt. (Ausführung der Schritte 1-3 gemäß A).
Das erhaltene Peptidharz (1,06 g) wurde einer HF-Spaltung unterworfen (10 ml HF, 1 ml Anisol); 0°C, 45 min). HF und der größte Teil des Anisols wurde im Vakuum abgezogen, das Harz mit Essigester gewaschen, und das Peptid mit 10% Essigsäure extrahiert. Der Extrakt wurde lyophilisiert. Die Reinigung des Rohpeptides erfolgte durch Mitteldruckchromatographie (HD-SIL®-Reversed-Phase-C₁₈-Material, 100Å, 25-45 µ Korngröße) mit einem Gradienten von 50-70% B in 80 min (A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in MeOH). Ausbeute: 93 mg. Analyt. HPLC: Retentionszeit 14,3 min (VYDACR 218TP54-C₁₈-RP-Säule; Fluß 2 ml/min; T₀=1,8 min; linearer Gradient von 0%-50% B in 50 min; A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in Acetonitril).
FAB-MS:M=1864,2; berechnete monoisotopische Molekülmasse:1864,1.
Analog Beispiel 1 wurden hergestellt (bei den N-terminal acetylierten Peptiden wurden nach beendeter Synthese die Schritte 1-6 und 14-16 gemäß A ausgeführt):
 2. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
 3. H-Tyr-Pro-Ser-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
 4. H-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
 5. H-Tyr-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
 6. H-Tyr-Pro-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
 7. H-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
 8. H-Tyr-Pro-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
 9. H-Gly-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
10. H-Tyr-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
11. H-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
12. H-Phe-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
13. H-Tyr-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
14. H-Phe-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
15. H-Tyr-Pro-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
16. H-Tyr-Pro-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-MH₂
17. Ac-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
18. Hpp-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
19. Hpac-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
20. Hbz-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
21. H-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
22. H-Tyr-Lys-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
23. Ac-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
24. Hpp-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
25. H-Tyr-Lys-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
26. H-Tyr-Lys-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
27. H-Tyr-Lys-Aoc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
28. H-Tyr-Lys-Ahx-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
29. H-Tyr-Lys-Abs-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
30. H-Tyr-Lys-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
31. H-Tyr-Pro-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
32. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aoc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
33. Ac-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
34. H-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
35. Ac-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
Beispiel 36
0,5 g Boc-Tyr(Br-Z)-p-Methylbenzhydrylaminharz mit einer Substitution von 0,49 mmol/g, entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol wurden gemäß A mit je 1 mmol
Boc-Arg(Tos)-OH
Boc-Ile-OH
Boc-Gln-OH Boc-Cys(pMB)-OH
Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Aoc-OH
Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys-(Cl-Z)-OH
Boc-Ile-OH Boc-Ser(Bzl)-OH
Boc-Leu-OH Boc-Cys(pMB)-HO
Boc-Asn-OH Hpp-OH
umgesetzt.
Das erhaltene Peptidharz (1,01 g) wurde einer HF-Spaltung unterworfen (10 ml HF, 1 ml m-Kresol; 0°C, 45 min). Der HF wurde im Vakuum abgezogen, das Harz mit Essigester gewaschen, und das Peptid mit 10% Essigsäure extrahiert. Das lyophilisierte Rohpeptid wurde in 1 l entgastem Wasser gelöst und der pH der Lösung mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. 0,01 n wäßrige K₃Fe(CN)₆-Lösung wurde langsam zugetropft, bis die gelbe Farbe bestehen blieb. Es wurde 1 h nachgerührt und mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert. Nach Zugabe von BIORAD® AG3-X4A-Anionenaustauscherharz wurde 2 h gerührt, filtriert und das Filtrat lyophilisiert.
Die Reinigung des Rohpeptides erfolgte durch Gelchromatographie (SEPHADEX® G-25, 10% HOAc) und anschließende Mitteldruckchromatographie (HD-SIL®-Reversed-Phase-C₁₈-Material, 100 A, 25-45 µ Korngröße) mit einem Gradienten von 50-70% B in 40 min (A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in MeOH). Ausbeute: 87 mg. Analyt. HPLC: Retentionszeit: 13,9 min (VYDAC® 218TP54-C₁₈-RP-Säule; Fluß 2 ml/min; T₀=1,8 min; linearer Gradient von 0%-50% B in 50 min; A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in Acetonitril).
FAB-MS:M=1882,9; berechnete monoisotopische Molekülmasse: 1883,0.
Analog Beispiel 36 wurden hergestellt:

Claims (5)

1. Peptide der Formel Z-Ak-Bl-Cm-Dn-Eo-Fp-Gq-H-Thr-Gln-J-K-NH₂worin
A Phe oder Tyr,
B Pro, Ser, Abu, Gly, Ala, Cys, Pro-Ser, Cys-Ser, Abu-Ser, Gly-Ser, Ala-Ser oder Pro-Ala,
C eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
D Pro oder Cys,
E die Gruppierung -NH-(CH₂)t-CO- (mit t in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 0 bis 10),
F Cys, Abu, Gly oder Ala,
G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn,
H ein aus lipophilen Aminosäuren zusammengesetzter Dipeptidrest,
I eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
J eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
K Phe oder Tyr und
Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Benzylrest, einen C2-10-Acylrest oder einen C1-5-Alkylrest,
darstellen,
k, l, m, n, o, p und q die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, wobei jedoch k+ l+m+n+o+p+q1 sein muß,
und zwei gegebenenfalls vorhandene Cys-Reste über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sein können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
2. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diese nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellt.
3. Peptide gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
4. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von Bluthochdruck.
5. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von diagnostischen und analytischen Reagenzien für die biochemische und medizinische Forschung.
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