DE3923279C2 - - Google Patents

Description

Es ist allgemeines Wissensgut, daß die Zusammensetzung der extrazellulären Biomatrix bei der Zellkultivation in biologischen und biotechnologischen Experimenten von sehr großer Bedeutung für das Anhaften und die spezielle Differenzierungsleistung der jeweiligen Zellen ist. Eine solche extrazelluläre Matrix besteht unter anderem aus verschiedenen Kollagenen, Laminin, Fibronektin und anderen kollagen- oder nichtkollagenartigen Proteinen. In vielen Experimenten hat sich gezeigt, daß hochspezialisierte Zellen ohne ein solches Trägermaterial nicht kultiviert werden können.

Neben der Mikrocarriertechnik gibt es bisher nur wenige Hilfsmittel, die es ermöglichen, lebende Zellen auf Supporten zu kultivieren. Dabei handelt es sich um Hohlzylinder mit einem auf einer Seite aufgebrachten Filtermaterial, auf dem die Zellen wachsen können. Es ist weiterhin bekannt, daß eine zusammenhängende Zellschicht auf einem porösen oder halbdurchlässigen Substrat kultiviert werden kann, wobei das Substrat in scheibenförmiger Form in eine ringförmige Halterung zu spannen ist, die so stabilisiert in das entsprechende Kulturgefäß eingebracht wird (US-Patentschrift 46 08 342).

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung für die Kultivierung von Zellen zu entwickeln, in der Zellen unter möglichst natürlichen Bedingungen gehalten werden können und bei der das kultivierte Material von einer Versuchsanordnung schnell in eine andere überführt werden kann. Die Zellen wachsen dabei in einem speziellen Kulturgefäß mit Ein- und Ausstromöffnung für das Kulturmedium auf einzelnen (Fig. 1) oder mehreren (Fig. 2) austauschbaren, blatt- oder folienartigen Zellträgern. Diese Technik erlaubt die Kultivierung von hoch differenzierten Zellen im kleinen Labormaßstab, wie durch beliebige Vergrößerung der Träger in immer größerer Dimension wie z. B. in Bioreaktoren. Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 beschriebene Vorrichtung. Weitere Ausgestaltungen sind aus den Ansprüchen 2 bis 7 zu entnehmen.

Durch Überführung von kultivierten Zellen aus einfachen Kulturschalen in die spezielle Vorrichtung (Fig. 1) wird eine neue Art der Zellkultivation unter Perfusionsbedingungen mit apikalen und basalen Kulturmediumgradienten und damit z. B. für Epithelzellen unter nahezu natürlichen Bedingungen möglich. Dies wird unter anderem dadurch erreicht, daß die lebenden Zellen nicht fest mit dem impermeablen Boden eines normalen Kulturgefäßes verbunden sind, sondern sich auf einem in die Vorrichtung einzulegenden, also den Kulturschalenboden in der Qualität verbessernden und damit den natürlichen Bedingungen angleichenden folienartigen und permeablen Träger von variabler Größe befindet, der jederzeit wieder aus der Vorrichtung entfernt werden kann.

Durch Ausschneiden oder Ausstanzen einer geeigneten Folie, eines Filters, Gitters oder sonstigen geeigneten Trägermaterials sowie eventueller Beschichtung in jeder Größe und Form z. B. mit einem zellulären oder extrazellulären Matrixprodukt und durch Verankerung dieses Trägers in einer flachen Halterung wird der Zellträger hergestellt.

Das ausgestanzte Trägermaterial wird dann in einen Ring eingelegt. Mit einem kleineren, eng sitzenden flachen Ring wird das Trägermaterial im größeren Ring fixiert, ähnlich einem Trommelfell auf einer Trommel. Nachdem man den kleinen Ring eingepreßt hat, ist die Befestigungsprozedur beendet. Wenn eine Beschichtung notwendig werden sollte, kann dies entweder vor dem Montieren des Zellträgers oder aber auch danach geschehen.

Es ist ein wesentliches Kriterium der Zellträger, daß sie als blatt- oder folienartige Unterlagen in die Vorrichtung für die Kultivierung von Zellen eingelegt werden, um dort lebenden Zellen eine gute Anhaftung und eine möglichst hohe Differenzierung zu erleichtern oder unter möglichst natürlichen Bedingungen überhaupt erst zu ermöglichen. Die Zellträger verbessern somit für lebende Zellen entscheidend die Qualität der sehr unspezifischen Charakteristika von sonstigen Kulturgefäßen.

Perfusionssystem: Die erfindungsgemäße Vorrichtung für die Kultivierung von Zellen besitzt apikal und basal eine Einstrom- und Ausstromöffnung (Fig. 1). Durch eine seitliche Abdichtung des folienartigen Zellträgers, die den Innenraum der Vorrichtung in zwei voneinander getrennte Räume aufteilt, wird eine getrennte apikale und basale Perfusion der Zellen parallel zu einer elektrophysiologischen Registrierung von Transportvorgängen bei geringstem Totraumvolumen ermöglicht. Diese seitliche Abdichtung des Zellträgers in der speziellen Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen kann sehr leicht ein Leck verhindern. Dadurch wird es möglich, Transportvorgänge zwischen der apikalen und basalen Seite zu messen. Hinzu kommt, daß durch eine individuelle apikale und basale Perfusion mit hypo- oder hypertonen Medien die Bildung eines Gradienten während der Kultur oder des Experiments ermöglicht wird, wie das z. B. in der Niere vorkommt. Diese Art der Nutzung kultivierter Zellen ist einzigartig, öffnet ein neues Feld in der zellbiologischen Wissenschaft und war bisher in dieser Art nicht möglich.

Bioreaktoren: In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden mehrere Zellträger gestapelt (Fig. 2). Dabei kann sowohl der Durchmesser der Träger in der Vorrichtung variieren, es kann aber auch die Stapelhöhe beliebig gewählt werden.

In der speziellen Vorrichtung können die Träger perfundiert werden, nämlich von der apikalen und von der basalen Seite mit einem extrem niedrigen Totraumvolumen.

In der Vorrichtung können entweder Träger mit gleichartigen Zellen eingebracht werden, oder es können auch mit unterschiedlichen Zellarten bewachsene Träger zur Anwendung kommen, wodurch unter Umständen eine positive Beeinflussung der Zellen untereinander ermöglicht wird.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist darin zu sehen, daß jeder einzelne Zellträger für sich allein in der Vorrichtung kontrolliert werden kann. Dies geschieht dadurch, daß jeder Träger von apikal und basal eine Flüssigkeitszufuhr und Flüssigkeitsabfuhr besitzt (Fig. 2). Damit kann z. B. jeder Zellträger für sich allein auf eine Infektion oder Sekretion hin kontrolliert werden. Das Reaktorrohr der Vorrichtung kann leicht geöffnet werden und jeder gewünschte Träger kann für sich allein herausgenommen und ersetzt werden.

Erklärungen zu den Zeichnungen

Fig. 1:
Schematischer Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen (1) auf einzelnen Zellträgern (2) mit einer apikalen (3) und basalen (4) Flüssigkeitszufuhr und Flüssigkeitsabfuhr.

Fig. 2:
Schematischer Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen (1) auf mehreren Zellträgern (2) mit Einstromöffnung (3) und Ausstromöffnung (4) für das Kulturmedium. (5) Abdichtung der Reaktorsegmente.

Claims (7)

1. Vorrichtung für die Kultivierung von Zellen mit Ein­ stromöffnung und Ausstromöffnung für das Kulturmedium und austauschbarer Zellunterlage, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Kulturgefäß mindestens ein blatt- oder folienartiger Träger, der zwischen zwei konzentrische, ineinandergreifende Ringe fixiert ist, eingelegt wird, so daß der Träger für Zellen von apikal und basal eine Flüssigkeitszufuhr und Flüssigkeitsabfuhr besitzt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der kleinere eng sitzende Haltering des Zellträgers dünner ist als der größere Ring.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ringe so flach gehalten sind, daß sie nicht wesentlich über das Niveau des Zellträgers herausragen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellträger mit einem zellulären oder extrazellulären Biomatrixmaterial beschichtet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere folienartige Träger in der Vorrichtung für die Kultivierung von Zellen mit einer eigenen Flüssigkeitszufuhr und Flüssigkeitsabfuhr gestapelt angeordnet sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die folienartigen Zellträger unterschiedliche Durchmesser aufweisen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellträger eine unterschiedliche Beschichtung haben.