DE69617303T2

DE69617303T2 - Transmembran Ko-Kultureinsatz und Verfahren zu deren Anwendung

Info

Publication number: DE69617303T2
Application number: DE69617303T
Authority: DE
Inventors: William A. Macchi; Edward Francis Mussi
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2016-03-23
Also published as: EP0735134B1; US5583037A; EP0735134A3; DE69617303D1; EP0735134A2

Description

ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Transmembran-Mischkultur von Zellen. Im Einzelnen bezieht sich die Erfindung auf einen Zwei-Behälter-Zellkultur-Einsatz, bei dem die Behälter durch eine mikroporöse Membran getrennt sind, und ein Verfahren zu seiner Anwendung bei der Kultur von Zellen.

HINTERGRUND

Die Kultur von Zellen verschiedener Typen ist zu einem Routineprozeß in vielen Laboratorien geworden. Zellen werden gezüchtet, um Präparate zu ernten, um auf unterschiedliche Sensibilitäten gegenüber potentiell toxischen Präparaten zu untersuchen und sogar, um Gewebe für Transplantate bereitzustellen. Diese Arbeit ist im allgemeinen eine Monokultur, d.h., Zellen eines Typs werden in einem geeigneten Medium gezüchtet.
In der letzten Zeit hat sich das Interesse an der Mischkultur von Zellen entwickelt. Die Mischkultur von Zellen beinhaltet die Kultur einer Population von Zellen in der Gegenwart einer anderen Population von Zellen. Die Mischkultur von Zellen ist wichtig für die Untersuchung von Entzündungsreaktionen, Zelldifferenzierungsprozessen und für Untersuchungen zur Durchlässigkeit zwischen Blut und Gehirn.
Repräsentative Berichte aus der Fachliteratur, die sich auf Zell-Mischkultur beziehen, schließen ein: Magnum et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 1135-1143 (Dez. 1990), "Co-Culture of Primary Pulmonary Cells to Model Alveolar Injury and Translocation of Protein" (Die Mischkultur von primären Pulmonarzellen zur Modellierung von Alvenolenverletzung und Translozierung von Protein); Madera et al., J. Tissue Cult. Method, 14: 209-216, (1992), "A Simple Approach to Electrical Parameters of Cultured Epithelial Monolayers: Use in Assessing Neutrophil-Epithelial Interactions" (Eine einfache Herangehensweise an die elektrischen Parameter von gezüchteten Epithelmonoschichten: Anwendung bei der Einschätzung von Neutrophil-Epithel-Wechselwirkungen); Miller et al., J. Tissue Cult. Method, 14: 217-224, "Application of Cultured Endothelial Cells in the Brain Microvasculature in the Study of the Blood-Brain Barrier" Anwendung von gezüchteten Endothelzellen in den Mikrogefäßen des Gehirns bei der Untersuchung der Blut-Gehirn-Barriere); und Science, 266: 564-565 (1995), "Finding Clues About How Embryo Structures Form" (Suche nach dem Schlüssel zur Bildung von Embryostrukturen). Die Artikel, auf die oben verwiesen wird, werden zitiert, um einen Hintergrund hinsichtlich der In-vitro-Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Zelltyp und einem anderen bereitzustellen.
Miller et al., der oben zitiert wird, beschreibt die Kultur von Zellen auf festen Kunststoff- Oberflächen und Filtern oder Membran-Einsätzen. Miller et al. berichtet, daß Rinder-Hirn-Endothelial- Zellen (BBEC), die auf Filtern oder Membran-Einsätzen gezüchtet werden, einen Vorteil gegenüber BBEC bereitstellen, die auf festen Kunststoff-Oberflächen gezüchtet werden. Dieser Vorteil besteht darin, daß die Zellpolarität in Bezug auf den Stoffwechsel oder die Rezeptorenverteilung untersucht werden kann. Miller et al. stellt außerdem fest, daß die BBEC-Kultur auf Filtern oder Membran-Einsätzen erforderlich ist, um den transzellulären Transport oder die Permeabilität einer Verbindung durch die einlagige Zellschicht zu bestimmen.
Der Artikel in Science, auf den oben verwiesen wird, beschreibt Arbeiten, die über die Nieren- Entwicklung berichten. Der Artikel berichtet, daß Mesenchym-Zellen, die in Mischkultur mit Wnt-1- Protein produzierenden Zellen gezüchtet wurden, sich zu Nierenstrukturen, einschließlich Nephron röhrenförmiges und glomuläres Gewebe differenzieren, und gibt an, daß diese Wirkung bei Kontroll-Zellen nicht beobachtet wird.
Als Reaktion auf den sich entwickelnden Bedarf an Vorrichtungen und Ausrüstungen für die Mischkultur von Zellen wird in der Mussi et al. gemeinsam zugewiesenen US-Patentanmeldung Nr. 08/124415, veröffentlicht als US-A-5409829, ein Mischkultur-System offengelegt. Die Offenlegung stellt ein vollständiges, iri sich geschlossenes System zur Herstellung einer Mischkultur von Zellen bereit.
US-PS Nr. 5026649 von Lyman et al. legt eine Einsatz-Vorrichtung offen, die für die Kultur und Mischkultur von Zellen angewendet werden kann.
US-PS Nr. 4871674 von Matsui et al. legt einen Einsatz zur Kultur von Zellen offen, der eine poröse Membran hat, die den Boden eines Zylinders bildet. Der Zylinder hat zusätzlich Vorrichtungen, um in einem eingelassenen Behälter aufgehängt zu werden.
Sowohl die Offenlegung von Lyman et al. als auch die Offenlegung von Matsui et al. können für die Kultur von Zellen auf einer Membran eingesetzt werden, keine der beiden aber ist dafür geeignet, Populationen von Zellen auf gegenüberliegenden Seiten einer Membran zu züchten. Das Zellkultur-System, das in US-A-5409829 offengelegt wird, ist gut für die Kultur von Zellen auf den beiden Seiten einer Membran geeignet, erfordert aber eine Reihe von Handhabungen, die für Screening-Untersuchungen, bei denen vielfältige Mischkulturen entwickelt werden, zeitraubend sind.
EP-A 24048 bezieht sich auf einen zweiseitigen, beschichtbaren Membranfilter für die Anwendung beim mikrobiologischen Screening, wobei der Membranfilter auf solche Weise in einer Haltevorrichtung befestigt werden kann, daß eine Schicht von Agar-Agar sowohl auf die Oberseite als auch auf die Unterseite des Filters aufgetragen werden kann, wobei eine Agar-Agar-Schicht für die Aufnahme von Mikroorganismen dient, die aktive Substanzen produzieren, während die andere Agar-Agar-Schicht die Testkeime enthält.
WO-A-92/07063 legt eine Transwell-Vorrichtung für das Zellwachstum offen, die ein Rückhalte- Element, das grundlegend eine Halterung für eine poröse Membran ist, und ein trichterförmiges Hängeelement umfaßt, das auf einen eingelassenen Behälter und das Rückhalte-Element abgestimmt ist und das die Aufgabe hat, die Membran in einer bestimmten Position in dem eingelassenen Behälter aufzuhängen. Die Trichterform des Hängeelements ist dafür gedacht, einen Flüssigkeitsfluß durch Kapillarwirkung zwischen den Seitenwänden des eingelassenen Behälters und des Hängeelements zu verhindern.
Es gibt in der Fachliteratur Berichte, die darauf schließen lassen, daß es wünschenswert ist, während des Zellwachstums auf der Oberseite der Membran Luftbläschen an der Unterseite einer Membran im wesentlichen auszuschließen, weil ein gleichförmiges Wachstum auf der Membranoberseite auf den Membranbereichen, die Bläschen an der Unterseite haben, gehemmt wird. Die Beseitigung der Bläschen von der Unterseite der Membran mit den angegebenen Vorrichtungen kann sich als schwierig erweisen.
Angesichts des wachsenden Interesses an der Mischkultur von Zellen, gibt es einen Bedarf an einem einfach anzuwendenden Gerät für die Mischkultur von Zellen, das den Praktiker in die Lage versetzt, Luftbläschen an der Unterseite der Membran im wesentlichen zu vermeiden. Eine solche Vorrichtung und ein Verfahren für deren Anwendung werden hierin nachstehend beschrieben:

ZUSAMMENFASSUNG

Ein Transmembran-Zellkultur-Einsatz schließt ein hohles Gehäuse mit einem in Axialrichtung durch diesen führenden Durchgang, einem ersten Ende, einem zweiten Ende und einem Mittelabschnitt zwischen dem ersten Ende und dem zweiten Ende ein. Der Durchgang am ersten Ende und am zweiten Ende des Rohres hat ein Innendurchmesser, der größer als der Innendurchmesser des Durchgangs im Mittelabschnitt ist, so daß sich der Durchgang von jedem Ende zum Mittelabschnitt hin verjüngt. Der Mittelabschnitt schließt weiterhin eine poröse Membran mit einer ersten Oberfläche und einer zweiten Oberfläche ein. Die Membran ist fest quer zum Durchgang angebracht und blockiert diesen, so daß ein erster Behälter vom Durchgang von der ersten Membranoberfläche zum ersten Ende hin gebildet wird und ein zweiter Behälter vom Durchgang von der zweiten Membranoberfläche zum zweiten Ende hin gebildet wird.
Ein Verfahren für die Anwendung des Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung schließt das Eintauchen des Einsatzes, dessen Achse im wesentlichen waagerecht verläuft, in einen ersten eingelassenen Behälter ein, der ausreichend flüssiges Zellwachstumsmedium enthält, um den Einsatz mit der Membran im wesentlichen senkrecht zur Achse zu bedecken und die beiden Behälter ohne Luftbläschen mit dem Medium zu füllen. Der Einsatz wird dann in eine Position gekippt, in der die Achse im wesentlichen senkrecht ist, während das zweite Ende unterhalb der Oberfläche des Mediums gehalten wird, so daß der zweite Behälter mit dem Medium gefüllt wird und keine Luftbläschen hat. Der Einsatz wird dann auf seinem zweiten Ende in den eingelassenen Behälter gestellt, so daß die erste Oberfläche der Membran nach oben gerichtet ist. Der Füllstand des Mediums im ersten Behälter und im ersten eingelassenen Behälter werden dann so reguliert, daß ein ausreichendes Volumen des Mediums im eingelassenen Behälter vorhanden ist, um Zellen zu züchten, und der Einsatz aufrecht im ersten eingelassenen Behälter steht. Das Verfahren schließt dann die Einführung einer ersten Zellkultur-Suspension in den ersten Behälter und die Inkubation des ersten eingelassenen Behälters mit dem darin befindlichen Einsatz ein, so daß die Zellen der ersten Suspension auf der ersten Oberfläche der Membran ein Wachstum bilden. Danach wird der Einsatz aus dem ersten eingelassenen Behälter herausgenommen, und der erste Behälter wird abgelassen, wobei das erste Zellwachstum auf der ersten Oberfläche der Membran verbleibt. Das Verfahren schließt dann das Eintauchen des Einsatzes im wesentlichen waagerecht in einen eingelassenen Behälter ein, der ausreichend flüssiges Wachstumsmedium enthält, um den Einsatz zu bedecken. Wenn der Einsatz in Axialrichtung waagerecht eingetaucht wird, ist die Membran im wesentlichen senkrecht zur Achse, und die Behälter füllen sich ohne Luftbläschen mit dem Medium. Der Einsatz wird dann in eine senkrechte Position gekippt, während das erste Ende unterhalb der Oberfläche des Mediums gehalten wird, so daß der erste Behälter ohne Luftbläschen mit dem Medium gefüllt ist. Der Einsatz wird dann auf sein erstes Ende gestellt, so daß die zweite Oberfläche der Membran nach oben gerichtet ist, und das Volumen des Mediums im zweiten Behälter und im eingelassenen Behälter wird so reguliert, daß ausreichend Medium im zweiten Behälter vorhanden ist, um Zellen zu züchten, und der Einsatz im eingelassenen Behälter steht. Danach wird eine zweite Zellkultur-Suspension in den zweiten Behälter eingebracht, und der eingelassene Behälter mit dem Einsatz wird inkubiert, so daß die Zellen der zweiten Suspension ein Wachstum auf der zweiten Oberfläche der Membran bilden.
Der Einsatz und das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen eine einfache, leicht anzuwendende Vorrichtung und ein Methode bereit, die für die Kultur von Zellpopulationen auf beiden Seiten einer porösen Membran von Nutzen sind. Zellpopulationen, die auf diese Weise gezüchtet werden, entwickeln Strukturen, die von Nutzen für die Modellierung der Blut-Gehirn-Barriere, für Untersuchungen der Organentwicklung und dergleichen sind. Die Zelldifferentierung, die unter Anwendung des Einsatzes und Verfahrens der vorliegenden Erfindung beobachtet werden konnte, konnte vorher in vitro nur schwer dupliziert werden. Die sich verjüngenden Wände der Behälter ermöglichen es, daß im wesentlichen die gesamte Luft durch das Medium verdrängt wird, wenn der Einsatz waagerecht eingetaucht wird, wodurch die Probleme der Hemmung des Zellwachstums vermieden werden, die auf Luftbläschen an der unteren Fläche der Membran zurückzuführen sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht des bevorzugten Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung in auseinandergezogener Darstellung,
Fig. 2 ist ein schematischer Querschnitt des Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung, wie er in Fig. 1 gezeigt wird, längs der Linie 2-2,
Fig. 3a ist eine Draufsicht vom ersten Ende des Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung, wie er in Fig. 1 gezeigt wird,
Fig. 3b ist eine Draufsicht vom zweiten Ende des Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung, wie er in Fig. 1 gezeigt wird,
Fig. 4a ist eine schematische Querschnittsansicht des Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung, Fig. 1, der im wesentlichen waagerecht in einen eingelassenen Behälter eingetaucht ist, der ein flüssiges Zellwachstumsmedium enthält,
Fig. 4b ist eine schematische Querschnittsansicht des Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung von Fig. 1, der im wesentlichen senkrecht in einem eingelassenen Behälter steht, der ein flüssiges Zellwachstumsmedium enthält, und
Fig. 5a und 5b zeigen ein Prozeß-Ablaufdiagramm des bevorzugten Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung für die Kultur von Zellen auf den beiden Seiten einer porösen Membran.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Es wird auf Fig. 1, 2, 3a und 3b Bezug genommen, ein Transmembran-Mischkultur-Einsatz 10 nach der vorliegenden Erfindung schließt ein hohles Gehäuse 12 mit einem Durchgang 14 ein, der eine durchführende Längsachse A hat. Der Einsatz 10 hat ein erstes Ende 16 und ein zweites Ende 18 mit einem Mittelabschnitt 20 zwischen dem ersten Ende und dem zweiten Ende. Der Durchgang 14 hat einen Innendurchmesser "a" am ersten Ende und einen Innendurchmesser "b" am zweiten Ende. Der Innendurchmesser an jedem der beiden Enden ist vorzugsweise größer als ein Innendurchmesser "c" des Mittelabschnitts 20, so daß der Durchgang 14 von jedem Ende zum Mittelabschnitt eine. Verjüngung 22 bildet. Vorzugsweise ist der Innendurchmesser "a" am ersten Ende 16 im wesentlichen gleich dem Innendurchmesser "b" am zweiten Ende 18.
Der Mittelabschnitt schließt eine poröse Membran 24 mit einer ersten, zum ersten Ende 16 gerichteten Oberfläche 26 und einer zweiten, zum zweiten Ende 18 gerichteten Oberfläche 28 ein. Die Membran 24 ist vorzugsweise quer zum Durchgang 14 angebracht und blockiert diesen. Die Membran unterteilt den Durchgang in einen ersten Behälter 30, der vom Durchgang 14 von der ersten Membranoberfläche 26 bis hin zum ersten Ende 16 gebildet wird, und einen zweiten Behälter 32, der vom Durchgang 14 von der zweiten Membranoberfläche 28 bis hin zum zweiten Ende 18 gebildet wird.
Vorzugsweise schließen das erste Ende 16 und das zweite Ende 18 eine Zinnenbildung 40 ein, um die Fluid-Verbindung vom Inneren der Behälter zu einer äußeren Umgebung zu erlauben, wenn der Einsatz 10 aufrecht ist und auf einem der Enden in einem eingelassenen Behälter steht, der ein Wachstumsmedium enthält. Wie in Fig. 3a und 3b gezeigt wird, wird es vorgezogen, daß sich das Muster 42 der Zinnenbildung am ersten Ende 16 vom Muster 44 der Zinnenbildung am zweiten Ende I8 unterscheidet, wodurch für eine schnelle visuelle Identifikation des ersten Endes und des zweiten Endes gesorgt wird, um eine Unterscheidung zwischen Zellen zu erlauben, die ein ähnliches physisches Erscheinungsbild haben. Die Zinnenbildung kann aus rechtwinkligen Kerben bestehen, wie es in den Figuren gezeigt wird, oder kann andere Formen haben, welche die Fluid-Verbindung zwischen den Behältern und der äußeren Umgebung erlauben.
Vorzugsweise wird der Einsatz 10 nach der vorliegenden Erfindung aus zwei Abschnitten gebildet, einem ersten Abschnitt 60 und einem zweiten Abschnitt 62, die am Mittelabschnitt 20 aneinandergefügt werden. Vorzugsweise schließt der erste Abschnitt 60 einen Stutzen 64 für die Aufnahme des zweiten Abschnitts ein. Vorzugsweise hat der zweite Abschnitt 62 einen Vorsprung 66, der so bemessen ist, daß er in den Stutzen 64 hineinpaßt und den Mittelabschnitt 20 des Einsatzes bildet. Der Vorsprung 66 schließt vorzugsweise eine Fläche 68 ein, um die Membran 24 anzubringen, so daß nach der Verbindung der Abschnitte zur Bildung des Einsatzes der Vorsprung 66 und der Stutzen 64 den Mittelabschnitt 20 bilden, wobei die Membran 24 im wesentlichen senkrecht quer über dem Durchgang 14 zwischen dem ersten und dem zweiten Ende angeordnet ist.
Vorzugsweise werden der erste Abschnitt 60 und der zweite Abschnitt 62 durch einen Spritzguß- Vorgang aus einem thermoplastischen Harz geformt. Geeignete Harze sind Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol, Polyvinylchlorid; Polymethylmethacrylat und dergleichen. Vorzugsweise werden der erste Abschnitt und der zweite Abschnitt aus Polyethylenterephthalat gebildet.
Die poröse Membran 24 wird vorzugsweise aus einem solchen Material wie beispielsweise Polyethylenterephthalat, Polycarbonat und dergleichen mit einer Vielzahl von durchführenden, offenen Poren 50 gebildet. Vorzugsweise haben die Poren 50 einen Innendurchmesser zwischen 0,2 um und 10,0 um, und die Membran 24 hat vorzugsweise eine Porendichte zwischen 0,1 · 10&sup6; und 10 · 10&sup6; Poren/cm². Am stärksten bevorzugt wird der Fall, daß die Membran 24 aus Polyethylenterephthalat mit Poren mit einem Durchmesser von etwa 1 um und einer Porendichte von etwa 1,6 · 10&sup6;/cm² hergestellt wird.
Die Membran 24 kann an der Fläche 68 durch Heißsiegeln, Schallschweißen, Lösungsmittel- Bondieren, Klebstoff-Bondieren und dergleichen angebracht werden. Besonders bevorzugt wird die Befestigung der Membran 24 durch Heißsiegeln an der Fläche 68. Alternativ dazu kann die Membran 24 durch Einschließen zwischen dem ersten Abschnitt 60 und dem zweiten Abschnitt 62 mechanisch angebracht werden.
Der erste Abschnitt 60 kann am zweiten Abschnitt 62 durch Heißsiegeln, Schallschweißen, Lösungsmittel-Bondieren, Klebstoff-Bondieren und dergleichen angebracht werden. Alternativ dazu kann der erste Abschnitt 60 am zweiten Abschnitt 62 durch eine mechanische Preßpassung angebracht werden. Vorzugsweise wird der erste Abschnitt durch Schallschweißen am zweiten Abschnitt angebracht.
Die Verjüngung 22 des Durchgangs 14 zwischen dem ersten und dem zweiten Ende und dem Mittelabschnitt des Zellkultur-Einsatzes nach der vorliegenden Erfindung bildet einen Verjüngungswinkel Theta (θ) zwischen zwei Grad und flinfundvierzig Grad. Vorzugsweise beträgt der Verjüngungswinkel A zwischen zwei und 15 Grad. Der Zweck der Verjüngung ist es zu ermöglichen, daß im wesentlichen die gesamte eingeschlossene Luft aus den Behältern entweichen kann, wenn der Einsatz im wesentlichen waagerecht in die flüssige Wachstumsmedien eingetaucht wird. Für den Zweck dieser Beschreibung beziehen sich die Termini "waagerecht" und "senkrecht" auf eine Achse A des Durchgangs 14 des hohlen Gehäuses.
Ein bevorzugtes Verfahren für das Wachstum von Populationen von Zellen auf den beiden Seiten der Membran 24 wird in den Fig. 4a und 4b schematisch veranschaulicht und in den Fig. 5a und 5b als Prozeß-Ablaufdiagramm dargestellt. Das Prozeß-Ablaufdiagramm soll das bevorzugte Verfahren nach der vorliegenden Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken. Bei bestimmten Anwendungen kann es wünschenswert sein, die Schritte in einer unterschiedlichen Reihenfolge auszuführen und Schritte hinzuzufügen oder auszulassen. Das bevorzugte Verfahren schließt das waagerechte Eintauchen des Zellkultur-Einsatzes 10 nach der vorliegenden Erfindung in einen ersten eingelassenen Behälter 70 ein, der eine Tiefe "Y" mit einer Weite "X" und einen Boden 72 hat. Die Tiefe Y und die Weite X sollten ausreichend sein, um den Einsatz 10 mit einem flüssigen Wachstumsmedium 80 zu bedecken, das einen anfänglichen Füllstand L&sub1; hat, um den Einsatz vollständig einzutauchen, wenn der Einsatz im wesentlichen waagerecht ist, während die Membran im wesentlichen senkrecht zur Achse A ist. Wenn der Einsatz auf diese Weise eingetaucht wird, erlaubt es die Verjüngung des Durchgangs, daß im wesentlichen alle Luftbläschen, die in Fig. 4a als 82 veranschaulicht werden, durch das flüssige Medium verdrängt zu werden und aus den Behältern entweichen. Alternativ dazu kann der Einsatz nur teilweise eingetaucht werden, wobei die Achse A einen spitzen Winkel mit der Flüssigkeit bildet, wobei ein Behälter außerhalb des flüssigen Mediums verbleibt, sich der eingetauchte Behälter mit der Flüssigkeit füllt und die Luft aufgrund der verjüngten Wandung im wesentlichen verdrängt wird.
Das bevorzugte Verfahren schließt das Kippen des Einsatzes in eine im wesentlichen senkrechte Position ein, während das zweite Ende 18 unterhalb der Oberfläche der Flüssigkeit gehalten wird und der Einsatz im wesentlichen senkrecht auf dem zweiten Ende 18 auf dem Boden des eingelassenen Behälters steht, wodurch der zweite Aufnahmegefäß im wesentlichen mit Flüssigkeit gefüllt gehalten wird. Vorzugsweise wird der Füllstand des Mediums 80 im eingelassenen Behälter dann auf einen Füllstand L&sub2; reguliert, so daß der Einsatz im eingelassenen Behälter steht. Der Füllstand L&sub3; des Mediums im ersten Behälter 30 wird dann so reguliert, daß ein ausreichendes Volumen für die Kultur von Zellen vorhanden ist.
Vorzugsweise wird dann eine erste Suspension von Zellen in den ersten Behälter eingebracht, und der erste eingelassene Behälter mit dem Einsatz wird dann in eine geeignete Umgebung gebracht, um die erste Zellkultur zu inkubieren und ein Wachstum der ersten Zellen auf der ersten Oberfläche 26 der porösen Membran zu bilden. Da der zweite Behälter 32 im wesentlich3n mit Flüssigkeit gefüllt ist, sind auf der zweiten Membran-Oberfläche 28 im wesentlichen keine Luftbläschen vorhanden, die ein im wesentlichen kontinuierliches Wachstum der ersten Zellen auf der ersten Oberfläche 26 beeinträchtigen und hemmen könnten. Zusätzlich erlaubt die Zinnenbildung 40 die freie Fluid-Verbindung zwischen dem flüssigen Medium 80 und dem zweiten Behälter 32, während der Einsatz 10 auf dem zweiten Ende 18 steht.
Wenn die Zellen der ersten Suspension die gewünschte Population entwickeln, wird der Einsatz 10 vorzugsweise aus dem eingelassenen Behälter herausgenommen und abgeleitet, wobei das Wachstum der ersten Zellen auf der ersten Oberfläche 26 der Membran verbleibt. In Abhängigkeit von der speziellen Anwendung kann der eingelassene Behälter 70 wiederverwendet werden, wie das hier beschrieben wird, um die Erklärung zu vereinfachen, oder es kann ein zweiter eingelassener Behälter bereitgestellt werden. Außerdem wird mit der Absicht, die Beschreibung zum vereinfachen, die Darstellung des Verfahrens zur Schaffung einer zweiten Population von Zellen auf der zweiten Oberfläche 28 der Membran nicht bildlich dargestellt, sondern nur nachstehend beschrieben. Alle strukturellen Elemente, die bei der Kultur der zweiten Population eingesetzt werden, werden oben Vollständig identifiziert und beschrieben, und das Einsetzen des Einsatzes in den eingelassenen Behälter erfolgt analog zur Beschreibung und zu den Figuren für die Kultur der Population von Zellen auf der ersten Seite der Membran.
Der Einsatz 10 wird dann im wesentlichen waagerecht eingetaucht in den eingelassenen Behälter eingetaucht, der ausreichend Wachstumsmedium enthält, um den Einsatz zu bedecken, wenn die Membran im wesentlichen senkrecht zur Achse A ist und sich die Behälter mit Medium füllen, das die Luftbläschen im wesentlichen verdrängt. Vorzugsweise wird der Einsatz in eine im wesentlichen senkrechte Position gekippt, während das erste Ende 16 unterhalb der Oberfläche des flüssigen Mediums gehalten wird, so daß sich der erste Behälter 30 mit Medium füllt und im wesentlichen keine Luftbläschen aufweist. Der Einsatz 10 wird dann vorzugsweise auf dem ersten Ende 16 auf den Boden 72 des eingelassenen Behälters gestellt, so daß der zweite Behälter 32 aufrecht steht. Der Füllstand des Mediums im zweiten Behälter wird so reguliert, daß ein ausreichendes Volumen für die Kultur von Zellen vorhanden ist, und der Füllstand des Mediums im eingelassenen Behälter wird so reguliert, daß der Einsatz im eingelassenen Behälter steht.
Vorzugsweise wird eine zweite Suspension von Zellen in den zweiten Behälter eingebracht, und der eingelassene Behälter mit dem Einsatz wird in eine für die Inkubation der beiden Zellpopulationen und für die Entwicklung einer Population von Zellen aus der zweiten Suspension auf der zweiten Seite 28 der Membran geeignete Umgebung gebracht.
Fachleute auf dem Gebiet der Kultur von Zellen und der Handhabung von Laborgefäßen werden erkennen, daß die Füllstandseinstellungen des Mediums in den Behältern und eingelassenen Behältern wahrscheinlich mit Pipetten oder ähnlichen volumetrischen Ansaug- oder Abgabevorrichtungen ausgeführt werden.
Der Einsatz nach der vorliegenden Erfindung stellt dem Praktiker für Transmembran- Mischkulturen eine einfache, leicht anzuwendende Vorrichtung zur Verfügung, die bei der Anwendung nach dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung Populationen von Zellen auf den beiden Seiten einer porösen Membran bereitstellt. Die Erfindung erleichtert sowohl Untersuchungen von zellulären Wechselwirkungen, der zellulären Strukturentwicklung, des Blut-Gehirn-Barriere-Transport-Phänomens als auch die Herstellung von Zellprodukten aus einer Population von Zellen, welche die Anwesenheit einer anderen Population von Zellen erforderlich machen. Der Einsatz nach der vorliegenden Erfindung stellt durch seine Einfachheit und Leichtigkeit der Anwendung einen Fortschritt gegenüber vorher offengelegten Vorrichtungen und Verfahren dar.

Claims

1. Ein Transmembran-Mischkultur-Einsatz, der folgendes aufweist:

ein hohles Gehäuse mit einem durch diesen führenden Durchgang, einem ersten Ende, einem zweiten Ende und einem Mittelabschnitt zwischen dem ersten Ende und dem zweiten Ende,

wobei der Durchgang an dem ersten Ende und an dem zweiten Ende einen Innendurchmesser hat, wobei der Innendurchmesser jedes der Enden größer als der Innendurchmesser des Durchgangs am Mittelabschnitt ist, so daß der Durchgang von jedem der Enden zu dem Mittelabschnitt hin eine Verjüngung bildet, und

der Mittelabschnitt außerdem eine poröse Membran umfaßt, die eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche hat, wobei die Membran quer zu dem Durchgang angebracht ist und diesen blockiert, wodurch sie den Durchgang aufteilt in einen ersten Behälter, der von dem Durchgang von der ersten Membranoberfläche bis zum ersten Ende hin gebildet wird, und einen zweiten Behälter, der von dem Durchgang von der zweiten Membranoberfläche bis zum zweiten Ende hin gebildet wird.

2. Einsatz nach Anspruch 1, bei dem das erste Ende und das zweite Ende eine Zinnenbildung einschließen, wobei die Zinnenbildung die Fluid-Verbindung von innerhalb der Behälter zu einer äußeren Umgebung erlaubt, wenn der Einsatz aufrecht steht und auf einem der Enden in einem eingelassenen Behälter steht, der ein Wachstumsmedium enthält.

3. Einsatz nach Anspruch 2, bei dem sich die Zinnenbildung des ersten Endes sich von der Zinnenbildung des zweiten Endes unterscheidet, um so das erste Ende vom zweiten Ende zu unterscheiden.

4. Einsatz nach Anspruch 1, bei dem die Innendurchmesser des Durchgangs an dem ersten und zweiten Ende im wesentlichen gleich sind.

5. Einsatz nach Anspruch 1, bei dem die poröse Membran aus einem Material gebildet wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Polyethylenterephthalat und Polycarbonat besteht, wobei die Membran durchführende, offene Poren hat, die einen Durchmesser zwischen 0,2 und 10,0 um und eine Porendichte zwischen 0,1 · 10&sup6; und 10,0 · 10&sup6; Poren/cm² haben.

6. Einsatz nach Anspruch 1, bei dem der Einsatz aus einem ersten Abschnitt und einem zweiten Abschnitt gebildet wird, wobei die Abschnitte an dem Mittelabschnitt angebracht sind,

wobei der erste Abschnitt einen Stutzen hat, um den zweiten Abschnitt aufzunehmen, wobei der zweite Abschnitt einen Vorsprung hat, der so bemessen ist, daß er in den Stutzen hineinpaßt, wobei der Vorsprung außerdem eine Fläche zur Anbringung der Membran auf dieser einschließt, so daß nach der Verbindung der Abschnitte zur Bildung des Einsatzes der Vorsprung und der Stutzen den Mittelabschnitt bilden, wobei die Membran im wesentlichen senkrecht quer zudem Durchgang zwischen dem ersten Ende und dem zweiten Ende angeordnet ist.

7. Einsatz nach Anspruch 6, bei dem die Membran an der Fläche durch ein Verfahren angebracht wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Heißsiegeln, Schallschweißen, Lösungsmittel-Bondieren und Klebstoff-Bondieren und dem mechanischen Einschließen zwischen dem ersten Abschnitt und dem zweiten Abschnitt besteht.

8. Einsatz nach Anspruch 7, bei dem der erste Abschnitt an dem zweiten Abschnitt durch ein Verfahren angebracht wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Heißsiegeln, Schallschweißen, Lösungsmittel-Bondieren, mechanischer Preßpassung und Klebstoff-Bondieren besteht.

9. Einsatz nach Anspruch 1, bei dem die Verjüngung des Durchgangs einen Verjüngungswinkel von den Enden zu dem Mittelabschnitt zwischen 2 Grad und 45 Grad hat.

10. Verfahren für die Kultur von Zellen auf den beiden Seiten einer porösen Membran, das folgendes umfaßt:

Eintauchen eines Zellkultur-Einsatzes, der ein hohles Gehäuse umfaßt, das einen in Axialrichtung durch diesen führenden Durchgang, ein erstes Ende, ein zweites Ende und einen Mittelabschnitt zwischen dem ersten Ende und dem zweiten Ende hat, wobei der Durchgang einen Innendurchmesser an dem ersten Ende und an dem zweiten Ende hat, wobei die Innendurchmesser an jedem der Enden größer sind als ein Innendurchmesser des Durchgangs in dem Mittelabschnitt, so daß der Durchgang von jedem der Enden zu dem Mittelabschnitt hin eine Verjüngung bildet, und bei dem der Mittelabschnitt außerdem eine poröse Membran umfaßt, die eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche hat, wobei die Membran quer zu dem Durchgang angebracht ist und diesen blockiert, wodurch sie den Durchgang aufteilt in einen ersten Behälter, der von dem Durchgang von der ersten Membranoberfläche bis zum ersten Ende hin gebildet wird, und in einen zweiten Behälter, der von dem Durchgang von der zweiten Membranoberfläche bis zum zweiten Ende hin gebildet wird, waagerecht in einen eingelassenen Behälter, wobei der eingelassene Behälter einen Boden hat und ausreichend flüssiges Zellwachstumsmedium enthält, um den Einsatz im wesentlichen waagerecht im Verhältnis zu der Achse einzutauchen, so daß die Membran im wesentlichen senkrecht ist und das Medium die Luft in dem Behälter verdrängt,

Kippen des Einsatzes in eine im wesentlichen senkrechte Position, während das zweite Ende unterhalb der Oberfläche des Mediums gehalten wird, so daß der zweite Behälter mit dem Medium gefüllt wird und keine Luftbläschen aufweist,

Stellen des Einsatzes auf seinem zweiten Ende in den eingelassenen Behälter, so daß der erste Behälter der Membran nach oben gerichtet ist,

Regulieren des Volumens des Mediums im ersten Behälter, so daß ein ausreichendes Volumen für die Kultur von Zellen vorhanden ist,

Regulieren des Volumens des Mediums im eingelassenen Behälter, so daß der Einsatz im eingelassenen Behälter steht,

Einführen einer ersten Zellkultur-Suspension in den ersten Behälter,

Inkubieren des eingelassenen Behälters mit dem darin befindlichen Einsatz, so daß die erste Zellkultur ein Wachstum auf der ersten Oberfläche der Membran bildet,

Herausnehmen des Einsatzes aus dem eingelassenen Behälter,

Ablassen des ersten Behälters, wobei das erste Zellwachstum auf der ersten Oberfläche verbleibt,

im wesentlichen waagerechtes Eintauchen des Einsatzes in einen eingelassenen Behälter, wobei der eingelassene Behälter ausreichend flüssiges Zellwachstumsmedium enthält, um den Einsatz waagerecht einzutauchen, so daß die Membran im wesentlichen senkrecht ist und sich die Behälter ohne Luftbläschen mit dem Medium füllen, Kippen des Einsatzes in eine senkrechte Position, während das erste Ende unterhalb der Oberfläche des Mediums gehalten wird, so daß der erste Behälter mit dem Medium gefüllt wird und keine Luftbläschen aufweist,

Stellen des Einsatzes auf seinem ersten Ende in den eingelassenen Behälter, so daß der zweite Behälter aufrecht steht,

Regulieren des Volumens des Mediums im zweiten Behälter, so daß ein ausreichendes Volumen für die Kultur von Zellen vorhanden ist,

Einführung einer zweiten Zellkultur-Suspension in den zweiten Behälter, und Inkubieren des eingelassenen Behälters mit dem darin befindlichen Einsatz, so daß die zweite Zellkultur ein Wachstum auf der zweiten Oberfläche der Membran bildet.