DE3829183A1 - Feeder-layer aus menschlichen bindegewebszellen, verfahren zu seiner herstellung sowie verfahren zur vermehrung menschlicher epithelzellen und deren verwendung zur restitution der haut - Google Patents

Description

Feeder-Layer aus menschlichen Bindegewebszellen, Verfahren zu seiner Herstellung sowie Verfahren zur Vermehrung menschlicher Epithelzellen und deren Verwendung zur Restitution der Haut

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines Feeder-Layers aus normalen diploiden menschlichen Bindegewebszellen, insbesondere Fibroplasten, welche zunächst aus gesundem menschlichem Hautbindegewebe isoliert und anschließend in vitro vermehrt werden, sowie die Verwendung des Feeder-Layers zur In Vitro-Vermehrung von normalen menschlichen Keratinocyten, Schweißdrüsen- und Talgdrüsenzellen, insbesondere Keratinocyten, welche anschließend alleine oder in Kombination mit in Kollagengele eingearbeiteten unbehandelten menschlichen Fibroplasten zur Restitution der Haut, beispielsweise nach Verbrennungen oder beim Vorliegen anderer Hautdefekte, verwendet werden.

Es ist bekannt, beispielsweise aus dem Artikel G.G. Gallico et al., N. Engl. J. Med. 311, 448-451 (1984), daß interfollikuläre menschliche Keratinocyten in vitro vermehrt und anschließend zur Abdeckung von Brandwunden verwendet werden können. Ein wesentlicher Nachteil jenes Verfahrens besteht darin, daß dem zu behandelnden Patienten zusätzlich operativ gesunde Haut entnommen werden muß, um Ausgangsmaterial für die In Vitro-Vermehrung körpereigener Keratinocyten zu gewinnen.

Die Menge des dem Patienten zu entnehmenden Hautmaterials kann nach J. G. Rheinwald und H. Green, Cell, 6, Seiten 331-344 (1975) beziehungsweise der DE-PS 26 51 685 reduziert werden, wenn für die Anzahl der Keratinocyten- Primärkulturen ein Feeder-Layer, bestehend aus 3T3- Zellen der Maus, zu Hilfe genommen wird. Da jedoch die 3T3-Zellen tierischen Ursprungs sind und zudem bestimmte, für transformierte Zellen charakteristische Eigenschaften besitzen, ist deren Verwendung als Feeder-Layer für die In Vitro-Vermehrung menschlicher Zellen, welche anschließend auf den Patienten rückverpflanzt werden, nicht unbedenklich.

Weiterhin ist aus der Literatur A. Limat und F. K. Noser, J. Invest. Dermat. 87, 485-488 (1986) bekannt, daß intrafollikuläre Keratinocyten aus menschlichen Haarfollikeln, zum Beispiel Zellen der äußeren Wurzelscheide ausgezupfter menschlicher Anagenhaare beliebiger anatomischer Herkunft, dann in vitro vermehrt werden können, wenn der oben genannte 3T3-Feeder-Layer verwendet wird.

Es wurde auch bereits versucht, zum Beispiel von H. P. Baden et al., J. Invest. Dermat. 76, 53-55 (1981) normale menschliche Fibroplasten als Feeder-Layer für die Vermehrung von menschlichen Epithelzellen zu verwenden, jedoch war das Wachstum der Epithelzellen nach dem dort verwendeten Verfahren nicht zufriedenstellend.

Es bestand demnach die Aufgabe, ein Verfahren zur In Vitro-Vermehrung von normalen menschlichen Keratinocyten, Schweißdrüsen- oder Talgdrüsenzellen zur Verfügung zu stellen, welches mindestens ebenso reproduzierbare und gleichgute Vermehrungsergebnisse wie das Verfahren mit 3T3-Feeder-Layern erbringt, ohne jedoch dessen potentielle Nachteile in immunologischer und allenfalls auch infektiöser Hinsicht aufzuweisen.

Hierzu wurde nun gefunden, daß ein Feeder-Layer ausgehend von normalen menschlichen diploiden Bindegewebszellen, insbesondere normalen menschlichen Fibroplasten, welche in ihrer Vermehrung gehindert sind, hervorragend für die In-Vitro-Vermehrung von normalen menschlichen Epithelzellen der Haut, insbesondere Keratinocyten interfollikulärer oder intrafollikulärer Herkunft, sowie acinärer und tabulärer Zellen der ekkrinen Schweißdrüse oder Talgdrüsenzellen geeignet ist, wenn die Feeder-Layer-Zellen in der erfindungsgemäßen Dichte von 4000 bis 5000 Zellen/cm² ausplattiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Feeder-Layers aus menschlichen Bindegewebszellen, bei dem man normale diploide menschliche Bindegewebszellen so behandelt, daß sie danach an ihrer Vermehrung gehindert sind, diese sodann in einem geeigneten Nährmedium ausplattiert und dort in an sich bekannter Weise kultiviert, bis sie eine flache, epitheloide Form annehmen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindegewebszellen in einer Dichte von 4000 bis 5000 Zellen/cm², vorzugsweise 4500 Zellen/cm², ausplattiert.

Als Feeder-Layer-Zellen eignen sich beispielsweise menschliche Fibroplasten autologen oder heterologen Ursprungs der Differenzierungsstadien II-VI nach K. Bayreuther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1-5 (1988), wobei Fibroplasten der Differenzierungsstadien IV-VI bevorzugt sind.

Die Verhinderung der Vermehrung der Bindegewebszellen erfolgt entweder durch Behandlung von Bindegewebszellkulturen mit einer Zelldichte von etwa 6000-9000 Zellen/cm², vorzugsweise 8000 Zellen/cm², mit 6-12 Mikrogramm/ml, vorzugsweise 8 Mikrogramm/ml, Mitomycin C während 4-8 Stunden bei 30 bis 37 Grad Celsius oder durch Bestrahlung von trypsinisierten Bindegewebszellen mit einer Zelldichte von etwa 10⁵ bis 10⁷ Zellen/ml, vorzugsweise 10⁶ Zellen/ml, mit einer Dosis von 5000 -10 000 cGy (Zentigray), bevorzugt 7000 cGy, durch eine ionisierende Strahlungsquelle.

Ausgehend von explantiertem Hautbindegewebe von gesunden Personen werden Bindegewebszellkulturen nach bekannten Verfahren, beispielsweise nach W. S. Sly et al. Methods in Enzymology, Vol. LVIII-Cell Culture, Seiten 444- 450, Academic Press, New York (1979), gezüchtet. Anschließend werden Bindegewebszellkulturen mit einer Zelldichte von 6000-9000 Zellen/cm², bevorzugt 8000 Zellen/cm², in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), welches 10 Volumenprozent FCS (Foetal calf serum) und 6- 12 Mikrogramm/ml, bevorzugt 8 Mikrogramm/ml Mitomycin C enthält, während 4 bis 8 Stunden, bevorzugt 6 Stunden, bei 37 Grad Celsius inkubiert. Anschließend werden die Fibroblasten 4mal mit PBS (Phosphate buffered saline) gewaschen, mit Hilfe einer Lösung von 0,05 Gewichtsprozent Trypsin und 0,02 Gewichtsprozent EDTA in Ca²⁺ und Mg²⁺-freier PBS abgelöst, abzentrifugiert und erfindungsgemäß in einer Dichte von etwa 4000-5000, bevorzugt 4500 Zellen/cm², unter für Zellkulturen üblichen Inkubationsbedingungen in DMEM ausplattiert, welches 10 Volumenprozent FCS enthält.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden präkonfluente angezüchtete Bindegewebszellkulturen so wie obenstehend für das erste Verfahren beschrieben trypsinisiert. Anschließend werden die Zellen in einer Dichte von etwa 10⁵-10⁷ Zelle/ml, bevorzugt 10⁶ Zellen/ml, unter für Zellkulturen üblichen Bedingungen in DMEM suspendiert, welches 10 Volumenprozent FCS enthält. Die vorzugsweise in Röhrchen abgefüllten Portionen dieser Zellsuspension von 2 ml werden mit einer Einzeldosis ionisierender Strahlen von 5000-10 000 cGy, bevorzugt 7000 cGy, bestrahlt.

Die mit Mitomycin C behandelten oder bestrahlten Bindegewebszellen sind für die Verwendung als Feeder-Layer sowohl in frisch ausgesätem Zustand als auch nach Aufbewahrung unter für Zellkulturen üblichen Inkubationsbedingugnen bei 30 bis 37 Grad Celsius, bevorzugt 37 Grad Celsius, bis zu 4 Monaten, insbesondere 1-2 Monate, nach der Aussaat oder nach Kryokonservierung über beliebige Zeiträume hervorragend geeignet. Die Krykokonservierung der Feeder-Layer-Zellen wird wie folgt durchgeführt: Um bestrahlte Zellen zu krykokonservieren, werden dem die Feeder-Layer-Zellen enthaltenden Medium vor der Bestrahlung 5 bis 10 Volumenprozent DMSO (Dimethylsulfoxid) oder 5 bis 10 Volumenprozent Glycerin zugesetzt. Die Feeder-Layer-Zellen werden unmittelbar nach der Bestrahlung gemäß üblicher Methodik tiefgefroren. Mitomycin C-behandelte Feeder-Layer-Zellen werden 14-24 Stunden lang, insbesondere 20 Stunden lang, in Mitomycin C-freiem, 10 Volumenprozent FCS enthaltenden DMEM-Nährmedium gehalten, mit Trypsin behandelt, abzentrifugiert und unter für Zellkulturen üblichen Bedingungen in einem 5 bis 10 Volumenprozent DMSO oder 5 bis 10 Volumenprozent Glycerin enthaltenem Medium resuspendiert und anschließend gemäß üblicher Methodik tiefgefroren.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Feeder-Layer erhalten aus normalen diploiden menschlichen Bindegewebszellen, welcher eine Zelldichte von 4000 bis 5000 Zellen/cm² besitzt, insbesondere ein solcher, der durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wurde.

Bestrahlte Bindegewebszellen weisen 24 Stunden nach der Bestrahlung überwiegend die Form einer langgezogenen Spindel auf. Die Zellfläche nimmt in der anschließenden Inkubationsperiode noch beträchtlich zu. Nach 3-4 Tagen haben die bestrahlten Bindegewebszellen überwiegend eine abgeflacht-epitheloide Form. Mit Mitomycin C behandelte Bindegewebszellen weisen 24 Stunden nach der Behandlung überwiegend abgeflacht-epitheloide Form auf. Die Zellfläche nimmt während der anschließenden Inkubationsperiode noch beträchtlich zu.

Damit die Feeder-Layer Zellen ihre Feeder-Funktion ausüben können, müssen sie sich ihrem Differenzierungsstand entsprechend voll ausbreiten können; gleichzeitig muß genügend Raum für die sich vermehrenden Hautepithelzellen übrigbleiben. Die Feeder-Layer-Kapazität der Bindegewebszellen wird durch die anatomische Herkunft und die Anzahl durchlaufener Populationsverdoppelungen nicht meßbar beeinflußt.

Im Gegensatz zu 3T3-Feeder-Layern ist bei der Benutzung von Feeder-Layern aus menschlichen Bindegewebszellen während der Kultivierung der Keratinocyten keine Erneuerung des Feeder-Layers notwendig.

Ferner hat sich herausgestellt, daß, im Gegensatz zu den 3T3-Feeder-Layern, bei den erfindungsgemäßen Feeder- Layern das Anhaften an der Kulturoberfläche optimal ist.

Die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Bindegewebs-Feeder-Layer-Zellen sind daher sehr viel einfacher als die 3T3-Feeder-Layer-Zellen zu handhaben, welche während ihrer Verwendung als Feeder-Layer dazu neigen, sich vorzeitig von der Kulturoberfläche abzulösen oder sogar häufig ohne offensichtlichen Grund degenerieren.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur In-Vitro-Vermehrung von normalen menschlichen Keratinocyten der Haut, acinären und tubulären Zellen der ekrinen Schweißdrüse sowie von Talgdrüsenzellen, wobei man zunächst einen Feeder-Layer ausgehend von normalen diploiden menschlichen Bindegewebszellen nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren in einer Dichte von etwa 4000 bis 5000 Zellen/cm² herstellt und anschließend darauf die Keratinocyten und/oder Schweißdrüsen und/oder Talgdrüsenzellen aussät.

Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die Keratinocyten, Schweißdrüsen- oder Talgdrüsenzellen in einer Dichte von 50 bis 10 000, insbesondere 500 bis 4000 Zellen/cm², ausgesät werden.

Von den verwendbaren Keratinocyten sind die interfollikulären oder intrafollikulären Keratinocyten bevorzugt.

Als ganz besonders geeignet erwies sich der vorstehend beschriebene Feeder-Layer zur Kultur von Keratinocyten aus der äußeren Wurzelscheide von Haarfollikeln menschlicher Anagenhaare.

Dabei werden je nach Alter der Personen 30 (bei jungen Personen) bis 60 (bei älteren Personen) Anagenhaare ausgezupft. Zur Vermeidung von Verunreinigungen durch Keratinocyten oder Epidermis oder der Haarzwiebel werden auf der Höhe der Talgdrüse der distale Teil und proximal mitentfernte Anteile der Haarzwiebel abgetrennt und verworfen. Vom verbleibenden Haarfollikelstück werden die Keratinocyten der äußeren Wurzelscheide durch Behandlung mit Trypsin, wie bei A. Limat und F. K. Noser, J. Invest. Dermat. 87, 485-488 (1986) beschrieben, isoliert. Es werden etwa 5000-10 000 einzelne Keratinocyten/ Haarfollikel erhalten. Zur Herstellung von Primärkulturen sät man diese in dem in der vorstehend genannten Publikation A. Limat und F. K. Noser beschriebenen FAD-Nährmedium in einer Dichte von etwa 500-4000 Zellen/cm² auf dem vorstehend beschriebenen Feeder-Layer, erhalten aus normalen diploiden menschlichen Bindegewebszellen der Dichte von etwa 4000-5000 Zellen/cm², aus.

Die so erhaltenen Keratinocyten-Primärkulturen können, ebenso wie davon ausgehend angelegte Subkulturen, für welche entweder das FAD-Nährmedium oder das MCDB 153- Nährmedium (Clonetics Corporation, San Diego, USA) verwendet wird, direkt für die Rücktransplantation auf den Patienten verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wuchsen beispielsweise intrafollikuläre Keratinocyten, innerhalb von 2 bis 3 Wochen zur Konfluenz heran und verdrängten dabei die Feeder-Layer-Zellen, welche sich von der Unterlage ablösten und beim Wechsel des Mediums quantitativ beseitigt werden konnten. Die Anwachsrate von primären intrafollikulären Keratinocytenkulturen betrug etwa 4 bis 8% (n = 6), die Zahl der Populationsverdoppelungen wurde mit 9,6 innerhalb von 20 Tagen ermittelt. Präkonfluente Kulturen können überdies von noch anhaftenden Feeder- Layer-Zellen durch Behandlung mit 0,02 gewichtsprozentiger wäßriger EDTA-Lösung befreit werden.

Die Keratinocytenkulturen, welche etwa 2 bis 7 Zellagen dick sind, lassen sich für die Rücktransplantation mit Dispase II (neutrale Protease, erhältlich bei Boehringer/ Mannheim) vom Boden der Kulturgefäße ablösen.

Die Sekundärkultivierung ist optimal, wenn Keratinocyten der Primärkultur verwendet werden, welche sich noch im präkonfluenten Stadium befinden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchteten Keratinocyten sind bezüglich des Keratinexpressionsmusters identisch mit Keratinocyten in situ und mit Keratinocyten, welche mit Hilfe von 3T3-Zellen gezüchtet wurden. Bezüglich morphologischer Kriterien sind die erfindungsgemäß gezüchteten Keratinocyten identisch mit solchen, die mit Hilfe von 3T3-Zellen gezüchtet wurden; insbesondere weisen sie eine typische epitheloide Form mit hohem Kern/Cytoplasma-Verhältnis auf.

Die hervorragenden Ergebnisse bei der Vermehrung normaler menschlicher Keratinocyten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind nach dem Stand der Technik, beispielsweise der DE-PS 26 51 685, völlig überraschend. Dort wurde nämlich festgestellt, daß der 3T3-Feeder-Layer zur Vermehrung menschlicher Epidermiszellen in einer Dichte von etwa 1,5-5 × 10⁴ Zellen/cm² auszusäen ist, während eine Aussaatdichte der Epidermiszellen von etwa 50-5000 Zellen/cm² zweckmäßig ist. Außerdem sind nach jener Veröffentlichung 3T3-Zellen gegenüber menschlichen diploiden Fibroblasten hinsichtlich ihrer Verwendung als Feeder-Layer bevorzugt.

Weiterhin wurde festgestellt, daß sich das Wachstum der Keratinocyten drastisch verringert, wenn die Anzahl der 3T3-Feeder-Layer-Zellen auf Werte unterhalb von 20 000 Zellen pro cm² reduziert wird. Demgegenüber ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren festzustellen, daß gerade bei der sehr viel kleineren Anzahl von 4500 erfindungsgemäßen Zellen pro cm² eine optimale Vermehrung der Keratinocyten gewährleistet ist. Dieser Sachverhalt ist, wie oben erwähnt, dadurch bedingt, daß die wesentlich größeren erfindungsgemäßen Feeder-Zellen einen viel höheren Platzbedarf als entsprechende 3T3-Zellen aufweisen.

Zusammenfassend können für das erfindungsgemäßen Verfahren zur Vermehrung von Keratinocyten, Schweißdrüsen- oder Talgdrüsenzellen folgende Vorteile gegenüber der bekannten Vermehrung mit 3T3-Feeder-Layern genannt werden:

• 1. Die Verwendung von normalen diploiden menschlichen Bindegewebszellen im Gegensatz zu aneuploiden, schlecht definierten und transformierten, also bezüglich Wachstum und Stoffwechsel von normalen Zellen verschiedenen, Mäusezellinien.
• 2. Die Möglichkeit, heterologe und für spezielle Fragestellungen auch autologe Bindegewebszellen zu verwenden.
• 3. Die Möglichkeit, die Bindegewebszellen von anatomisch definierten Orten zu verwenden.
• 4. Die bessere Reproduzierbarkeit für die In Vitro- Vermehrung von normalen Epithelzellen der Haut aufgrund der Tatsache, daß menscliche Bindegewebs- Feeder-Layer leichter handhabbar sind.
• 5. Die Möglichkeit, menschliche Bindegewebs-Feeder-Layer für einen Zeitraum von mindestens 4 Wochen ohne merklichen Verlust ihrer Feeder-Wirksamkeit bei 37 Grad Celsius unter für Zellkulturen üblichen Inkubationsbedingungen aufzubewahren.
• 6. Die Möglichkeit, menschliche Bindegewebs-Feeder- Layer-Zellen für unbegrenzte Zeit in tiefgefrorenem Zustand aufzubewahren.
• 7. Die Verringerung von potentiellen immunologischen und auch infektiösen (viralen) Gefährdungen bei der Verwendung von auf der Grundlage des Feeder-Layers vermehrten menschlichen Keratinocyten, zur Restitution der Haut.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung von nach dem vorstehenden Verfahren vermehrten Keratinocyten, Schweißdrüsen oder Talgdrüsenzellen zur Restitution der Haut, beispielsweise nach Verbrennungen oder beim Vorliegen anderweitiger großflächiger Hautdefekte.

Während der für die In Vitro-Kultivierung der Keratinocyten, welche vorzugsweise vom Patienten selbst stammen (autologe Transplantation), benötigten Zeit, werden die Hautdefekte provisorisch abgedeckt und für die anschließende Transplantation vorbereitet (Vermeidung der Austrocknung, Anregung der Granulation, Infektbekämpfung). Zur Transplantation werden die etwa 2 bis 8 Zeitlagen dicken Keratinocytenkulturen mit Dispase II vom Boden der Kulturgefäße abgelöst, mit Haemoclips im Kulturgefäß an geeignetes Verbandmaterial, zum Beispiel Sofratulle, angeheftet und anschließend auf die gereinigten und von übermäßigen Granulationsgewebe befreiten Wundflächen transferiert und eventuell angenäht. Die weitere Behandlung erfolgt gemäß den allgemeinen Richtlinien für Hauttransplantationen.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung eines Feeder-Layers ausgehend von normalen menschlichen Fibroplasten

Ausgehend von explantiertem gesundem menschlichem Hautbindegewebe oder von diploiden menschlichen Fibroblasten- Zellstämmen, erhalten von Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, New York, wurden nach bekannten Verfahren, wie beispielsweise bei W. S. Sly et al., Methods in Enzymology, Vol LVII - Cell Culture, Seiten 444-450, Academic Press, New York (1979) beschrieben, Fibroblastenkulturen angezüchtet und nach einem der nachfolgend beschriebenen Verfahren A oder B weiterbehandelt.

Verfahren A

Die, wie vorstehend angegeben, erhaltenen Fibroblastenkulturen werden in einer Dichte von 8 × 10³ Zellen/cm² in DMEM (Dulbecco′s modified Eagle's medium), welches 10 Volumenprozent FCS (Foetal calf serum) und 8 Mikrogramm/ ml Mitomycin C enthält, 6 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Anschließend werden die durch diese Behandlung am Wachstum gehinderten Fibroblasten 4mal mit PBS (Phosphate buffered saline) gewaschen, mit Hilfe einer 0,05 Gewichtsprozent Trypsin und 0,02 Gewichtsprozent EDTA enthaltenen Ca²⁺ und Mg²⁺-freien PBS abgelöst und sodann abzentrifugiert.

Verfahren B

Die wie vorstehend angegebenen, erhaltenen präkonfluenten Fibroblastenkulturen werden mit Hilfe einer 0,05 Gewichtsprozent Trypsin und 0,02 Gewichtsprozent EDTA enthaltenden Ca²⁺- und Mg²⁺-freien PBS abgelöst, abzentrifugiert und anschließend in einer Dichte von 10⁶ Zellen/ml in DMEM, welches 10 Volumenprozent FCS enthält, suspendiert. In Röhrchen abgefüllte Portionen von 2 ml dieser Zellsuspension werden mit einer Einzeldosis von 7000 cGy (Bestrahlungsgerät und -bedingungen: Dermopan 2 (der Firma Siemens), 50 Kilovolt, 1,0 mm Aluminiumfilter, Distanz 5 cm) bestrahlt.

Die nach den Verfahren A oder B behandelten Fibroblasten sind für die Verwendung als Feeder-Layer-Zellen hervorragend geeignet und werden für diesen Zweck in einer Dichte von 4000 bis 5000 Zellen/cm² in DMEM, welches 10 Volumenprozent FCS enthält, ausplattiert.

Folgende, in der Tabelle 1 angegebene diploide menschliche Zellstämme wurden in der vorstehend beschriebenen Weise als Feeder-Layer verwendet:

Tabelle 1

Beispiel 2 Kryokonservierung der nach Beispiel 1 erhaltenen Feeder-Layer-Zellen

Die nach Verfahren A (Beispiel 1) erhaltenen, mit Mitomycin C behandelten Feeder-Layer-Zellen werden 24 Stunden lang in Mitomycin C-freiem 10 Volumenprozent FCS enthaltendem DMEM gehalten, anschließend typsinisiert, abzentrifugiert, sodann in 10 Volumenprozent Dimethylsulfoxid enthaltendem Medium resuspendiert und anschließend tiefgefroren.

Um nach B (Beispiel 1) bestrahlte Zellen zu kryokonservieren, werden dem die Feeder-Layer-Zellen enthaltenden Medium vor der Bestrahlung 10 Volumenprozent Dimethylsulfoxid oder Glycerin zugesetzt. Sodann werden die Feeder-Layer-Zellen bestrahlt und und unmittelbar nach der Bestrahlung tiefgefroren.

Das Tiefgefrieren erfolgt jeweils durch 24stündiges Abkühlen auf -80 Grad Celsius und anschließender Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise krykokonservierten Feeder-Layer-Zellen sind über beliebige Zeiträume haltbar.

Beispiel 3 In Vitro-Vermehrung von normalen menschlichen Keratinocyten

A. Keratinocyten der äußeren Wurzelscheide von ausgezupften menschlichen Haarfollikeln werden wie bei A. Limat und F. K. Noser, J. Invest. Dermatol. 87, 485 -488 (1986) beschrieben isoliert: 40 Haarfollikel werden in DMEM, welches mit 25 mmol HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N′-2-ethansulfonsäure) gepuffert ist und 400 U/ml Penicillin und 400 Mikrogramm/ml Streptomycin enthält, suspendiert. Die Haarfollikel von Haaren in der Anagen (Wachstums-)phase werden mit Hilfe eines Mikroskops sorgfältig ausgesucht. Für bestimmte Forschungszwecke kann der obere Teil des Haares bis auf die Höhe der Talgdrüse sowie die Haarzwiebel abgeschnitten werden, um eine Verunreinigung durch Keratinocyten der Epidermis oder der Haarzwiebel zu vermeiden. Nach 2 weiteren Spülungen mit DMEM werden die verbleibenden Teile der Haarfollikel in eine Petrischale überführt und die Flüssigkeit abgesaugt. Anschließend werden die Follikel mit 0,15 ml einer 0,1 Gewichtsprozent Trypsin und 0,02 Gewichtsprozent EDTA enthaltenden PBS, welche frei ist von Ca²⁺- und Mg²⁺-Ionen und einen pH-Wert von 7,2 besitzt, 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Danach erhält man durch heftiges Pipettieren der Follikelsuspension in mit 10 volumenprozentigem fötalem Kälberserum versetzten DMEM eine Suspension, welche hauptsächlich aus einzelnen Zellen besteht.

Nach 10minütigem Zentrifugieren bei etwa 2000 m/s² werden die Keratinocyten wieder im Kulturmedium suspendiert. Die auf diese Weise gewonnenen Keratinocyten aus der äußeren Wurzelscheide menschlicher Haarfollikel werden in einer Dichte von 1 × 10³ Zellen/cm² auf einem Feeder-Layer, erhalten aus normalen diploiden menschlichen Fibroblasten, welcher nach Beispiel 1 hergestellt wurde und eine Dichte von 4,5 × 10³ Zellen/cm² aufweist, in einer 10-cm-Kulturschale in FAD-Medium ausgesät. Im Verlauf von 2-3 Wochen wachsen die Keratinocyten zur Konfluenz heran und verdrängen dabei die Feeder-Layer-Zellen, welche sich von der Unterlage ablösen und beim Wechsel des Kulturmediums quantitativ beseitigt werden. Die so erhaltenen Primärkulturen der Keratinocyten oder davon ausgehend angelegte Subkulturen (Nährmedium FAD oder MCDB 153 (Clonetics Corporation, San Diego, USA)) vom jeweils benötigten Flächenausmaß können direkt für die Transplantation verwendet werden.

B. Keratinocyten der jugendlichen Vorhaut und von anderen Gewebeproben von Kindern und Erwachsenen werden durch 1,5stündige Behandlung mit 0,25 prozentigem Trypsin in Ca²⁺- und Mg²⁺-freier PBS bei 37 Grad Celsius isoliert und in der gleichen Weise vermehrt, wie unter Beispiel 3, Absatz A beschrieben.

Beispiel 4 Verwendung der Keratinocyten-Kulturen zur Restitution der Haut

Die nach Beispiel 3 in der benötigten Größe hergestellten Keratinocyten-Kulturen (Primär- oder Subkulturen), welche etwa 2-8 Zellagen dick sind, werden nach bekannten Verfahren mit Dispase II (Boehringer Mannheim) vom Boden der Kulturgefäße abgelöst, mit Haemoclips im Kulturgefäß an Sofratulle angeheftet, anschließend auf die gereinigten, von übermäßigem Granulationsgewebe befreiten Wundflächen transferiert und sodann entweder angenäht (beispielsweise im Falle von Verbrennungswunden oder nach größeren Exzisionen wie bei kutanen Hamartomen oder Melanomen) oder mittels weiterer Lagen Sofratulle und Kompressionsverband (beispielsweise im Falle von Ulcera cruris) fixiert. Die weitere Behandlung erfolgt nach den jeweiligen allgemeinen Richtlinien für Hauttransplantationen.

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung eines Feeder-Layers aus menschlichen Bindegewebszellen, bei dem man normale diploide menschliche Bindegewebszellen so behandelt, daß sie danach in ihrer Vermehrung gehindert sind, diese sodann in einem geeigneten Nährmedium ausplattiert und dort in an sich bekannter Weise kultiviert, bis sie eine flache, epitheloide Form annehmen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindegewebszellen in einer Dichte von 4000 bis 5000 Zellen/cm² ausplattiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindegewebszellen in einer Dichte von 4500 Zellen/cm² ausplattiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Bindegewebszellen menschliche Fibroplasten autologen oder heterologen Ursprungs der Differenzierungsstadien II-VI nach K. Bayreuther, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1-5 (1988), verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindegewebszellen durch Behandlung mit 6-12 Mikrogramm/ml Mitomycin C während 4-8 Stunden bei 30-37 Grad Celsius an ihrer Vermehrung gehindert werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindegewebszellen durch Bestrahlung mit einer Dosis von 5000-10 000 Zentigray durch eine ionisierende Strahlungsquelle an ihrer Vermehrung gehindert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindegewebszellen in einem Nährmedium, bestehend aus mit 10 Volumenprozent FCS (Foetal calf serum) versetztem DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), kultiviert werden.

7. Feeder-Layer erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Feeder-Layer erhalten aus normalen diploiden menschlichen Bindegewebszellen, dadurch gekennzeichnet, daß seine Zelldichte 4000 bis 5000 Zellen/cm² beträgt.

9. Verfahren zur In Vitro-Vermehrung von normalen menschlichen Keratinocyten der Haut, acinären und tubulären Zellen der ekkrinen Schweißdrüse sowie von Talgdrüsenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst einen Feeder-Layer ausgehend von normalen diploiden menschlichen Bindegewebszellen nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 herstellt und anschließend darauf die Keratinocyten und/oder Schweißdrüsen und/oder Talgdrüsenzellen aussät.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinocyten, Schweißdrüsen- oder Talgdrüsenzellen in einer Dichte von 50 bis 10 000, insbesondere 500-4000 Zellen/cm² ausgesät werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Keratinocyten interfollikulärer oder intrafollikulärer Herkunft verwendet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Keratinocyten aus der äußeren Wurzelscheide von Haarfollikeln menschlicher Anagenhaare verwendet.

13. Verwendung der nach einem der Ansprüche 9 bis 12 vermehrten Keratinocyten, Schweißdrüsen- oder Talgdrüsenzellen zur Restitution der Haut.