[go: up one dir, main page]

CN114703109B - 一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用 - Google Patents

一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114703109B
CN114703109B CN202210502036.4A CN202210502036A CN114703109B CN 114703109 B CN114703109 B CN 114703109B CN 202210502036 A CN202210502036 A CN 202210502036A CN 114703109 B CN114703109 B CN 114703109B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bovine
bile
extract
intestine
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210502036.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114703109A (zh
Inventor
王厚伟
窦彦玲
王康诚
张珂璠
徐凌川
李依展
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN202210502036.4A priority Critical patent/CN114703109B/zh
Publication of CN114703109A publication Critical patent/CN114703109A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114703109B publication Critical patent/CN114703109B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种微生物筛选用培养基，特别涉及一种用于分离耐受牛胆汁的高效牛黄转化细菌的培养基、配制方法及应用。所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量1000.0ml的量，还含有牛肝提取物100.0g～300.0g、牛肾提取物100.0g～300.0g、蛋白胨5.0g～15.0g、葡萄糖3.0g～5.0g、NaCl 3.0g～5.0g、磷酸氢二钠3.0g～5.0 g、牛胆汁100.0ml～600.0 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂10.0g～30.0g，调节pH 6.8～7.5。应用本发明的培养基所分离筛选的菌种具有能够长时间耐受牛胆汁、牛黄转化效率高的特点。

Description

一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用
技术领域
本发明涉及一种微生物筛选用培养基，特别涉及一种用于分离耐受牛胆汁的高效牛黄转化细菌的培养基、配制方法及应用。
背景技术
牛黄是牛科动物牛（Bostaurus domestlcus Gmel）或水牛（Bubalus bubalisl）在病理状况下于其胆囊或胆管内形成的结石的干燥品，属于名贵中药之一，具有清心、开窍、镇惊、清热、解毒等多种临床功效。我国4500种中成药约有650种含有牛黄，我国牛群中天然牛黄的出现率仅为0.21 %，自然产量十分稀少，自古皆有“药中之贵，莫复过此”之说。上世纪90年代蔡红娇教授首先研制出了体外培育牛黄（CN1022668C，CN1044402A，CN1041105A），并收录于中国药典（2020版）中，它是以牛新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成。目前，我国仅有武汉健民大鹏药业有限公司独家生产体外培育牛黄。从其专利文献看，其生产的体外培育需要通过额外添加大量的复合胆红素钙盐与胆酸来满足药典的质量标准，这导致生产成本高昂，成品的市场价格极其昂贵，超过天然牛黄的三分之一，
牛黄是牛的病理性产物，其形成的两个基本条件一是牛胆病原微生物感染，二是异物侵入胆囊。病原微生物作为多酶复合体，其代谢活动可以转化牛胆汁成分为牛黄。现代体外培育牛黄技术是模拟病理条件下牛胆结石形成过程，应用牛胆汁与微生物共培养转化形成，其化学成分与临床功效与天然牛黄相近，多数情况可等同于天然牛黄入药和临床应用。因此，选择高效的牛黄转化菌是体外培育牛黄的关键。但是牛胆汁具有广谱性抑菌作用，多数胆囊细菌不耐受胆汁，不能在胆汁中较长时间的存活，特别是一些高效牛黄转化细菌更是很难存活于胆汁中超过48小时，严重影响牛黄转化效率。目前应用现有文献报道的各类培养基（LB，TSA，BHI等）中，难以筛选出能够在牛胆汁中较长时间存活的菌株，更无法应用这类菌种与牛胆汁共培养发酵生产体外培育牛黄。因此，发明一种能够筛选耐受牛胆汁的高效牛黄转化菌株的特制培养基，是体外培育牛黄发酵生产的核心技术。
发明内容
为攻克体外培育牛黄发酵生产中菌种在发酵牛胆汁中存活时间短，不耐受牛胆汁，牛黄转化效率低的技术难题，本发明提供一种可有效用于筛选能够耐受牛胆汁的高效牛黄转化菌的特制培养基及其配制方法，应用本发明特制培养基所分离筛选的菌种具有能够长时间耐受牛胆汁、牛黄转化效率高的特点。
本发明解决以上技术问题，采用的技术方案如下：
一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量1000.0ml的量，还含有牛肝提取物100.0g～300.0g、牛肾提取物100.0g～300.0g、蛋白胨5.0g～15.0g、葡萄糖3.0g～5.0g、NaCl 3.0g～5.0g、磷酸氢二钠3.0g～5.0g、牛胆汁100.0ml～600.0 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂10.0g～30.0g，加水定容至1000.0ml，调节pH 6.8～7.5。
优选地，所述加水定容采用的水为蒸馏水或去离子；所述牛肝提取物的制备方法如下：将新鲜牛肝切成小块，匀浆成泥，得到牛肝肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用过滤去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肝提取物的冻干粉。
优选地，所述牛肾提取物的制备方法如下：将新鲜牛肾切成小块，匀浆成泥，得到牛肾肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体过滤以去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肾提取物的冻干粉。
优选地，所述牛肠浸液的加入量为牛肝肉泥或牛肾肉泥的2-5倍；所述牛肠浸液的制备方法为：取新鲜的牛小肠，剖开后去除内容物，冲洗干净后切成小段，匀浆成肉泥，加入3倍体积的去离子水、蒸馏水或者生理盐水，继续匀浆5～10min，过滤，滤液离心，取上清液冷冻干燥，制成牛肠浸液冻干粉；取适量牛肠浸液冻干粉用去离子水或蒸馏水配制成10-20%的牛肠浸液。
进一步地，所述搅拌条件为37℃，时间为6h；所述高压蒸煮的条件为121℃，时间为1h。
优选地，所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂为 1000ml 的量，含有牛肝提取物200.0g、牛肾提取物250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖3.0g、NaCl5.0g、磷酸氢二钠3.0g、牛胆汁300 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂15.0g，加蒸馏水或生理盐水定容至1000.0ml，调节pH 7.2。
上述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基的配制方法，包括以下步骤：
（1）按照配方称取或量取各组分，先将牛肝提取物、牛肾提取物、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、磷酸氢二钠用适量蒸馏水或去离子水充分搅拌溶解；
（2）固体培养基添加配方量的琼脂，再向溶液中缓慢加入配方量的牛胆汁；
（3）充分搅拌溶解后，用蒸馏水或去离子水定容至1000.0ml，调节pH在6.8～7.5范围内，121℃高压灭菌20min。
优选地，步骤（2）中分别配制含牛胆汁100.0ml、200ml、300ml、400ml、500ml或/和600.0 ml的培养基，用于驯化菌种耐受牛胆汁的能力。
上述培养基用于分离筛选牛胆囊、牛胆汁、牛肾脏、牛肝脏或牛消化道中能够耐受牛胆汁的牛黄转化菌。
上述耐受牛胆汁的牛黄转化菌在体外培育牛黄上的应用。
所述培养基中添加牛肝提取物和牛肾提取物以满足牛黄转化菌繁殖的营养需求，添加牛胆汁有利于筛选出能够耐受牛胆汁的牛黄转化菌。
本发明的有益效果
本发明提供了一种可有效用于筛选能够耐受牛胆汁的高效牛黄转化菌的特制培养基及其配制方法。所述培养基中添加了特制的牛肝提取物和牛肾提取物，用以满足牛黄转化菌繁殖的营养需求，添加了牛胆汁以有利于筛选出能够耐受牛胆汁的牛黄转化菌。应用本发明特制培养基所分离筛选的菌种具有能够长时间耐受牛胆汁、牛黄转化效率高的有益效果，攻克了体外培育牛黄发酵生产中菌种在发酵牛胆汁中存活时间短，不耐受牛胆汁，牛黄转化效率低的技术难题。
附图说明
图1为应用本发明所述培养基（BBLK）筛选出的一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌株在BBLK培养基和其他3种商品培养基（BHI、LB、TSB）中繁殖的形态学观察。A，耐牛胆汁牛黄转化菌株接种在BHI液体培养基中培养48h后的形态学观察，菌体细胞分裂增殖抑制，生长缓慢；B，耐牛胆汁牛黄转化菌株接种在LB液体培养基中培养48h后的形态学观察，菌体数量减少，大量菌体细胞收缩死亡；C，耐牛胆汁牛黄转化菌株接种在TSB液体培养基中培养48h后的形态学观察，菌体分裂增殖抑制，部分菌体细胞收缩死亡；D，耐牛胆汁牛黄转化菌株接种在本发明BBLK液体培养基中培养48h后的形态学观察，菌体细胞分裂增殖旺盛，生长良好，菌体密度极高，培养液颜色因添加牛胆汁而呈显灰黄色；
图2应用本发明实施例1所述培养基（BBLK）筛选出的一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌株在牛胆汁中发酵培养的生长曲线。
图3为应用本发明实施例1所述培养基（BBLK）筛选出的一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌的牛黄转化能力。A为一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌发酵牛胆汁形成牛黄颗粒浑浊液；B为一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌发酵牛胆汁形成的牛黄颗粒逐渐聚合成石；C为一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌发酵牛胆汁形成的牛黄颗粒聚合成石；D为一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌发酵牛胆汁形成的牛黄颗粒聚合成型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：
牛肠浸液的制备：取新鲜的牛小肠，剖开后去除内容物，冲洗干净后切成小段，匀浆成肉泥，加入3倍体积的生理盐水，继续匀浆，纱布过滤，滤液4000rpm离心15 min，取上清液冷冻干燥，制成牛肠浸液冻干粉。取适量牛肠浸液冻干粉用去离子水配制成15%的牛肠浸液。
牛肝提取物的制备方法如下：将新鲜牛肝切成1～2cm3的小块，加入匀浆器匀浆成泥，向牛肝肉泥中加入3倍体积的15%牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7，于37℃条件搅拌保温6h，121℃高压蒸煮1h，冷却后，置于15℃低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用纱布过滤以去除不溶物，滤液4000rpm离心30min，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肝提取物的冻干粉。
牛肾提取物的制备方法如下：将新鲜牛肾切成1～2cm3的小块，加入匀浆器匀浆成泥，向牛肾肉泥中加入3倍体积的15%牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7，于37℃条件搅拌保温6h，121℃高压蒸煮1h，冷却后，置于0℃低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用纱布过滤以去除不溶物，滤液以4000rpm离心30min，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肾提取物的冻干粉。本实施例用于筛选耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配方如下：相对于溶剂为 1000ml 的量，含有牛肝提取物200.0g、牛肾提取物250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氢二钠3.0g、牛胆汁300 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂15.0g，加蒸馏水定容至1000.0ml，调节pH 7.2。
本实施例用于筛选耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配制方法如下：按照以上配方称取各组分，先将牛肝提取物、牛肾提取物、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、磷酸氢二钠等成分用适量蒸馏水充分搅拌溶解，固体培养基添加15.0g琼脂，再向溶液中缓慢加入300ml牛胆汁，充分搅拌溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，调节pH为7.2，于121℃高压灭菌20min。
本实施例应用上述培养基筛选耐牛胆汁的牛黄转化菌的分离筛选方法如下：取新鲜的成石牛胆汁，在上述固体培养基上划线培养，于37 ℃恒温培养24 h后，挑取一个分离度良好的单个菌落编号为NDZ-01，接种于上述液体培养基中，培养24 h后，取100μL菌液加入至50 ml灭菌牛胆汁中，于37 ℃恒温振荡培养（160r/min），每隔12h吸取3ml菌液进行菌体细胞的外部形态显微观察（图1），并测定吸光度值（OD560），以对应的不接种菌株的牛胆汁为对照，作时间-吸光度曲线（图2）。进一步根据中国药典（2020，一部，药材和饮片，181页）体外培育牛黄项下规定的质量检测方法，检测发酵牛胆汁中胆红素和胆酸含量，检测菌种转化牛黄能力（图3）。
实施例2：
牛肠浸液的制备：取新鲜的牛小肠，剖开后去除内容物，冲洗干净后切成小段，匀浆成肉泥，加入3倍体积的去离子水、蒸馏水或者生理盐水，继续匀浆，纱布过滤，滤液4000rpm离心30 min，取上清液冷冻干燥，制成牛肠浸液冻干粉。取适量牛肠浸液冻干粉用去离子水或蒸馏水配制成10%的牛肠浸液。
牛肝提取物的制备方法如下：将新鲜牛肝切成1～2cm3的小块，加入匀浆器匀浆成泥，向牛肝肉泥中加入3倍体积的10%牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7.5，于37℃条件搅拌保温6h，121℃高压蒸煮1h，冷却后，置于5℃低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用纱布过滤以去除不溶物，滤液4000rpm离心15min，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肝提取物的冻干粉。
牛肾提取物的制备方法如下：将新鲜牛肾切成1～2cm3的小块，加入匀浆器匀浆成泥，向牛肾肉泥中加入3倍体积的10%牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7.5，于37℃条件搅拌保温6h，121℃高压蒸煮1h，冷却后，置于10℃低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用纱布过滤以去除不溶物，滤液以4000rpm离心30min，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肾提取物的冻干粉。
本实施例用于筛选耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配方如下：相对于溶剂为1000ml 的量，含有牛肝提取物100.0g、牛肾提取物300.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖5.0g、NaCl3.0g、磷酸氢二钠3.0g、牛胆汁100 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂10.0g，加去离子水定容至1000.0ml，调节pH 6.8。
本实施例用于筛选耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配制方法如下：按照以上配方称取各组分，先将牛肝提取物、牛肾提取物、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、磷酸氢二钠等成分用适量蒸馏水充分搅拌溶解，固体培养基添加10.0g琼脂，再向溶液中缓慢加入100ml牛胆汁，充分搅拌溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，调节pH为6.8，于121℃高压灭菌20min。
本实施例应用上述培养基筛选耐牛胆汁的牛黄转化菌的分离筛选方法如下：取新鲜的成石牛胆汁，在上述固体培养基上划线培养，于37 ℃恒温培养24 h后，挑取一个分离度良好的单个菌落编号为NDZ-02，接种于上述液体培养基中，培养24 h后，取100μL菌液加入至50 ml牛胆汁中，于37 ℃恒温振荡培养（160r/min）。根据中国药典（2020，一部，药材和饮片，181页）体外培育牛黄项下规定的质量检测方法，检测发酵牛胆汁中胆红素和胆酸含量，检测菌种转化牛黄能力。
实施例3
牛肠浸液的制备：取新鲜的牛小肠，剖开后去除内容物，冲洗干净后切成小段，匀浆成肉泥，加入3倍体积的去离子水、蒸馏水或者生理盐水，继续匀浆，纱布过滤，滤液4000rpm离心30 min，取上清液冷冻干燥，制成牛肠浸液冻干粉。取适量牛肠浸液冻干粉用去离子水或蒸馏水配制成20%的牛肠浸液。
牛肝提取物的制备方法如下：将新鲜牛肝切成1～2cm3的小块，加入匀浆器匀浆成泥，向牛肝肉泥中加入3倍体积的20%牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7.2，于37℃条件搅拌保温6h，121℃高压蒸煮1h，冷却后，置于0℃低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用纱布过滤以去除不溶物，滤液4000rpm离心20min，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肝提取物的冻干粉。
牛肾提取物的制备方法如下：将新鲜牛肾切成1～2cm3的小块，加入匀浆器匀浆成泥，向牛肾肉泥中加入3倍体积的10%牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7.2，于37℃条件搅拌保温6h，121℃高压蒸煮1h，冷却后，置于15℃低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用纱布过滤以去除不溶物，滤液以4000rpm离心25min，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肾提取物的冻干粉。
本实施例用于筛选耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配方如下：相对于溶剂为1000ml 的量，含有牛肝提取物300.0g、牛肾提取物100.0g、蛋白胨15.0g、葡萄糖3.0g、NaCl5.0g、磷酸氢二钠3.0g、牛胆汁600 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂30.0g，加蒸馏水定容至1000.0ml，调节pH 6.8。
本实施例用于筛选耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配制方法如下：按照以上配方称取各组分，先将牛肝提取物、牛肾提取物、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、磷酸氢二钠等成分用适量蒸馏水充分搅拌溶解，固体培养基添加30.0g琼脂，再向溶液中缓慢加入600ml牛胆汁，充分搅拌溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，调节pH为6.8，于121℃高压灭菌20min。
本实施例应用上述培养基筛选耐牛胆汁的牛黄转化菌的分离筛选方法如下：取新鲜的成石牛胆汁，在上述固体培养基上划线培养，于37 ℃恒温培养24 h后，挑取一个分离度良好的单个菌落编号为NDZ-03，接种于上述液体培养基中，培养24 h后，取100μL菌液加入至50 ml牛胆汁中，于37 ℃恒温振荡培养（160r/min）。根据中国药典（2020，一部，药材和饮片，181页）体外培育牛黄项下规定的质量检测方法，检测发酵牛胆汁中胆红素和胆酸含量，检测菌种转化牛黄能力。
实施例4：
本实施例用于驯化耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配方如下：相对于溶剂为1000ml 的量，含有牛肝提取物200.0g、牛肾提取物250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖3.0g、NaCl5.0g、磷酸氢二钠3.0g，固体培养基在此基础上添加琼脂15.0g，在此基础上，分别配制牛胆汁添加量为100.0ml、200ml、300ml 、400 ml、500ml和600ml的驯化培养基，用蒸馏水定容至1000.0ml，调节pH 7.2。
本实施例用于筛选耐受牛胆汁的牛黄转化菌的培养基配制方法如下：按照以上配方称取各组分，先将牛肝提取物、牛肾提取物、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、磷酸氢二钠等成分用适量蒸馏水充分搅拌溶解，固体培养基添加15.0g琼脂，再分别向溶液中缓慢加入100.0ml、200ml、300ml 、400ml、500ml、600ml的牛胆汁，充分搅拌溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，调节pH为7.2，于121℃高压灭菌20min。
本实施例应用上述培养基驯化耐牛胆汁的牛黄转化菌的培养方法如下：
将实例1-3的培养基筛选出的菌液，继续接种于含100ml牛胆汁的驯化培养基中，经37 ℃恒温培养24 h，取100μl接种于含200ml牛胆汁的驯化培养基中，经37 ℃恒温培养24 h后，再取100μl接种于含300ml牛胆汁的驯化培养基中，经37 ℃恒温培养24 h后，取100μl接种于含400ml牛胆汁的驯化培养基上，经37 ℃恒温培养24 h后，取10μl涂布于含500ml牛胆汁的驯化固体培养基中，经37 ℃恒温培养24 h后，挑取生长良好的单菌落编号为NDZ-01、NDZ-02、NDZ-03，接种到含600ml牛胆汁的驯化液体培养基中，经37 ℃恒温培养24 h后，取100μl接种于过滤除菌的牛胆汁中，37 ℃培养96h后，吸取3ml菌液检测吸光度值（OD560），根据中国药典（2020，一部，药材和饮片，181页）体外培育牛黄项下规定的质量检测方法，检测发酵牛胆汁中胆红素和胆酸含量，检测菌种转化牛黄能力，按照以上方法重复驯化3次，得到驯化的耐牛胆汁的牛黄转化菌种（表1）。
表1驯化培养基（BBLK）筛选出的耐受牛胆汁的牛黄转化菌的生长特性与牛黄转化活性的比较分析

Claims (9)

1.一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量1000.0ml的量，还含有牛肝提取物100.0g～300.0g、牛肾提取物100.0g～300.0g、蛋白胨5.0g～15.0g、葡萄糖3.0g～5.0g、NaCl 3.0g～5.0g、磷酸氢二钠3.0g～5.0 g、牛胆汁100.0ml～600.0 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂10.0g～30.0g，加水定容至1000.0ml，调节pH 6.8～7.5；
所述牛肝提取物的制备方法如下：将新鲜牛肝切成小块，匀浆成泥，得到牛肝肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH=7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体过滤去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肝提取物的冻干粉；
所述牛肾提取物的制备方法如下：将新鲜牛肾切成小块，匀浆成泥，得到牛肾肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH=7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体过滤以去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肾提取物的冻干粉。
2.根据权利要求1所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述加水定容采用的水为蒸馏水或去离子水。
3.根据权利要求1所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述牛肠浸液的加入量为牛肝肉泥或牛肾肉泥的2-5倍；所述牛肠浸液的制备方法为：取新鲜的牛小肠，剖开后去除内容物，冲洗干净后切成小段，匀浆成肉泥，加入3倍体积的去离子水、蒸馏水或者生理盐水，继续匀浆5～10min，过滤，滤液离心，取上清液冷冻干燥，制成牛肠浸液冻干粉；取适量牛肠浸液冻干粉用去离子水或蒸馏水配制成10-20%的牛肠浸液。
4.根据权利要求1所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述搅拌条件为37℃，时间为6h；所述高压蒸煮的条件为121℃，时间为1h。
5.根据权利要求1所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂为 1000ml 的量，含有牛肝提取物200.0g、牛肾提取物250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖3.0g、NaCl5.0g、磷酸氢二钠3.0g、牛胆汁300 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂15.0g，加蒸馏水或生理盐水定容至1000.0ml，调节pH 7.2。
6.一种权利要求1所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按照配方称取或量取各组分，先将牛肝提取物、牛肾提取物、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、磷酸氢二钠用适量蒸馏水或去离子水充分搅拌溶解；
（2）固体培养基添加配方量的琼脂，再向溶液中缓慢加入配方量的牛胆汁；
（3）充分搅拌溶解后，用蒸馏水或去离子水定容至1000.0ml，调节pH在6.8～7.5范围内，121℃高压灭菌20min。
7.根据权利要求6所述的配制方法，其特征在于，步骤（2）中分别配制含牛胆汁100.0ml、200ml、300ml、400ml、500ml和600.0 ml的培养基，用于驯化菌种耐受牛胆汁的能力。
8.权利要求1～5任一项所述的培养基用于分离筛选牛胆囊、牛胆汁、牛肾脏、牛肝脏或牛消化道中能够耐受牛胆汁的牛黄转化菌。
9.权利要求8所述的耐受牛胆汁的牛黄转化菌在体外培育牛黄上的应用。
CN202210502036.4A 2022-05-10 2022-05-10 一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用 Active CN114703109B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210502036.4A CN114703109B (zh) 2022-05-10 2022-05-10 一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210502036.4A CN114703109B (zh) 2022-05-10 2022-05-10 一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114703109A CN114703109A (zh) 2022-07-05
CN114703109B true CN114703109B (zh) 2023-09-01

Family

ID=82177267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210502036.4A Active CN114703109B (zh) 2022-05-10 2022-05-10 一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114703109B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115851497B (zh) * 2022-09-16 2024-03-19 山东中医药大学 一株耐牛胆汁型牛黄转化菌及其应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8918263D0 (en) * 1988-08-29 1989-09-20 Wella Ag Feeder layer of human connective tissue cells,method of producing it,and method of propagating human epithelial cells and their use for skin restitution
JPH04193823A (ja) * 1990-11-27 1992-07-13 Matsui Seiyaku Kk 噛み砕きやすく水なしで飲みやすい丸剤
CN101007021A (zh) * 2007-01-11 2007-08-01 赵建文 体外培育牛黄和硝基咪唑类抗生素的组合药物
CN103316046A (zh) * 2013-06-09 2013-09-25 宁波优美肽生物科技有限公司 一种体外培育牛黄的酶促生产工艺
CN103690563A (zh) * 2013-12-08 2014-04-02 王昌勇 一种体外培育牛黄的方法
CN111658671A (zh) * 2020-06-22 2020-09-15 武汉健民大鹏药业有限公司 一种体外培育牛黄及其制备方法
CN114736563A (zh) * 2022-05-30 2022-07-12 山东中医药大学 一种牛黄表面可食性抗氧化保护膜及其制备方法
CN114891707A (zh) * 2022-05-20 2022-08-12 中国科学院微生物研究所 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法
CN115851497A (zh) * 2022-09-16 2023-03-28 山东中医药大学 一株耐牛胆汁型牛黄转化菌及其应用
CN116059251A (zh) * 2023-03-07 2023-05-05 济南七贤堂生物科技有限公司 一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法
CN219010066U (zh) * 2022-05-30 2023-05-12 山东中医药大学 一种人工牛黄废液处理系统

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8918263D0 (en) * 1988-08-29 1989-09-20 Wella Ag Feeder layer of human connective tissue cells,method of producing it,and method of propagating human epithelial cells and their use for skin restitution
JPH04193823A (ja) * 1990-11-27 1992-07-13 Matsui Seiyaku Kk 噛み砕きやすく水なしで飲みやすい丸剤
CN101007021A (zh) * 2007-01-11 2007-08-01 赵建文 体外培育牛黄和硝基咪唑类抗生素的组合药物
CN103316046A (zh) * 2013-06-09 2013-09-25 宁波优美肽生物科技有限公司 一种体外培育牛黄的酶促生产工艺
CN103690563A (zh) * 2013-12-08 2014-04-02 王昌勇 一种体外培育牛黄的方法
CN111658671A (zh) * 2020-06-22 2020-09-15 武汉健民大鹏药业有限公司 一种体外培育牛黄及其制备方法
CN114891707A (zh) * 2022-05-20 2022-08-12 中国科学院微生物研究所 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法
CN114736563A (zh) * 2022-05-30 2022-07-12 山东中医药大学 一种牛黄表面可食性抗氧化保护膜及其制备方法
CN219010066U (zh) * 2022-05-30 2023-05-12 山东中医药大学 一种人工牛黄废液处理系统
CN115851497A (zh) * 2022-09-16 2023-03-28 山东中医药大学 一株耐牛胆汁型牛黄转化菌及其应用
CN116059251A (zh) * 2023-03-07 2023-05-05 济南七贤堂生物科技有限公司 一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In vitro cultured calculus bovis attenuates cerebral ischaemia-reperfusion injury by inhibiting neuronal apoptosis and protecting mitochondrial function in rats;Feibiao Lu等;《Journal of Ethnopharmacology》;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114703109A (zh) 2022-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108728382A (zh) 一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用
WO2021082502A1 (zh) 一种产短链脂肪酸的干酪乳杆菌、培养方法及其应用
CN110373347A (zh) 一株富硒乳酸菌及其筛选方法和富含白藜芦醇和有机硒的风味酸奶的制备方法
CN118773042B (zh) 一种微生物组合物及其应用
CN114703109B (zh) 一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用
CN107151638B (zh) 一株改善肝功能的植物乳杆菌zy001及其在发酵乳中的应用
CN117586924B (zh) 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌发酵培养基及其制备方法
CN111714572A (zh) 一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂及其制备方法
CN103271155B (zh) 一种提高益生菌活菌数的方法
CN114891663B (zh) 植物乳杆菌lp1406及分离培养方法
CN104644538B (zh) 黄芩乳酸菌发酵物、含发酵物的化妆品及制备方法和用途
CN112715964B (zh) 一种螺旋藻寡糖及其在制备调节肠道健康功能制剂中的应用
CN118045144A (zh) 一种缓解赭曲霉毒素a引起的肾损伤的复合益生菌后生元发酵物及其应用
CN111793579A (zh) 一种适用于植物乳杆菌高效增殖的氮源及其应用
WO2021077788A1 (zh) 一株解脂耶式酵母及其在制备低糖低脂椰蓉营养粉中的用途
CN105176892B (zh) 一株消化乳杆菌w369及其功能应用
TWI740073B (zh) 具有促進腸幹細胞增生、抗病毒、抗發炎和抗過敏功效的乳酸菌晶體組合物及其製備方法
CN115380918B (zh) 一种响应面法优化提取海带多酚的方法
CN117305150B (zh) 一种动物双歧杆菌blh1、直投式发酵剂及其制备方法和应用
KR20170108214A (ko) 우수한 홍삼박 발효능을 갖는 바실러스 서브틸리스 hd 9098 균주, 이를 포함하는 면역증강용 생균제 조성물 및 그 제조방법
CN115969008B (zh) 一种乳酸菌和酵母菌协同发酵制作发酵豆粉的方法和产品及应用
CN120285066B (zh) 一种中药玫瑰花的发酵方法和发酵组合物
CN111154694A (zh) 一种微生物发酵菌剂及其制备方法和应用
CN119799601B (zh) 一株两歧双歧杆菌sx-p824及其在制备降脂和/或抗氧化的产品中的应用
KR101670321B1 (ko) 사이클로알리인(cycloalliin) 함량이 증가된 마늘추출물 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant