DE3808223A1

DE3808223A1 - Verfahren zur untersuchung von regenerations- und wanderungsprozessen in zellsystemen in-vitro

Info

Publication number: DE3808223A1
Application number: DE3808223A
Authority: DE
Inventors: Wilfried Dr Seifert; Friedrich Dipl Biol Foerster
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1989-09-21
Also published as: US4986501A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Regenerations- und Zellwanderungsprozessen in Zellsystemen und insbesondere ein Verfahren zur Untersuchung von Regenerationsprozessen des Nervenzellsystems.

Nervenzellkulturen sind für die Suche nach neurotrophischen Faktoren oder Wachstumsfaktoren von großem Nutzen, da sie ein ziemlich einfaches und gut beschriebenes Untersuchungssystem darstellen. Als geeignete Zellkulturen haben sich dabei solche des Cortex und des Hippocampus erwiesen. Das Hippocampus-Zellkultursystem ermöglicht die Untersuchung, welchen Einfluß neurotrophische Faktoren, Hormone oder Signale anderer Zellen auf die Entwicklung und Funktionen der Pyramidenneuronen besitzen; ein besonderes Merkmal dieses Kultursystems ist das Fehlen von Serum, welches durch eine Hormonmischung ersetzt wurde [vgl. zusammenfassend W. Seifert, Naturwissenschaftliche Rundschau, 40 (1987), Heft 1, Seiten 1 bis 9].

Zellkulturen, und insbesondere Hippocampus-Zellkultursysteme, erwiesen sich als nützlich für in-vitro-Untersuchungen zur Entwicklung und Vermehrung von Zellsystemen, wie des Nervensystems. Es wurde nun ein Kultursystem gefunden, das sich sehr gut für in-vitro-Untersuchungen von Regenerations- und Wanderungsprozessen eignet. Bei diesen Zellsystemen handelt es sich um eine dichte Zellkultur, in die eine "Wunde" eingekratz wurde. Diese sogenannte "Wund-Kultur", z. B. von ZNS-Zellen, ermöglicht es, Regenerations- und Wanderungsprozesse in einem zweidimensionalen Zellkultursystem zu untersuchen. Mit diesem "Wund- Kultur"-System wird ein Modellsystem bereitgestellt, mit dem es möglich ist, regenerative Prozesse zu untersuchen, die nach Läsionen oder Verletzungen des Hirns in vivo auftreten. In diesem System ist es z. B. möglich, die Effekte von Gangliosiden und neurotrophen Faktoren, wie z. B. FGF, auf die Regeneration von zentralen Neuronen zu untersuchen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Untersuchungen von Regenerations- und Zellwanderungsprozessen in Zellsystemen, die insbesondere bei Nervenzellsystemen drei wichtige Anwendungsbereiche besitzen, nämlich erstens den Bereich der Regeneration nach Verletzungen von Teilen des Nervensystems; zweitens den Bereich degenerativer Erkrankungen des Nervensystems, die vererbt sein können oder durch Intoxikation oder als Folge von chronischem Alkoholismus erworben sein können; und drittens den Bereich des Alterns.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Untersuchung von Regenerations- und Zellwanderungsprozessen in Zellsystemen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zellkultur auf einem Kultursubstrat herstellt, in dem dichten Zellrasen einen Schnitt anbringt und anschließend das Zellwachstum von den Schnitträndern in den erzeugten Schnittkanal hinein unter dem Einfluß der zu untersuchenden Substanzen bestimmt.

Zweckmäßige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 11.

Da das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Untersuchung von Nervensystemen eine große Bedeutung besitzt, wird als Zellkultur insbesondere eine Kultur von Zellen des peripheren oder zentralen Nervensystems aus embryonalem Gewebe für das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung von Regenerationsprozessen des Nervensystems in vitro eingesetzt; diese Kultur von Zellen wird auf einem Kultursubstrat zur Anheftung von Nervenzellen hergestellt unter Verwendung eines Anheftungsmediums, nach dem Anheften der Zellen auf dem Kultursubstrat wird die Zellkultur in einem Medium bis zur Ausdifferenzierung weitergezüchtet, und dann wird im gebildeten dichten Zellrasen der Schnitt angebracht und anschließend das Zellwachstum von den Schnitträndern in den erzeugten Schnittkanal hinein unter dem Einfluß der zu untersuchenden Substanzen oder Faktoren in Abhängigkeit von der Zeit quantitativ bestimmt. Als embryonales Gewebe von Säugetieren wird vorzugsweise ein solches von spezifischen Regionen des zentralen Nervensystems verwendet und insbesondere Cortex, Hippocampus, Cerebellum oder Rückenmark.

Es ist selbstverständlich auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren auch als Modellsystem für Wundheilungsprozesse außerhalb des Nervensystems zu verwenden, wie z. B. für Epithelzellen der Haut sowie Phänomene der Kontakthemmung bzw. Zellwanderung bei Tumorzellen.

Als Substrat oder zur Oberflächenbehandlung eines Substrates werden solche Substanzen verwendet, die die Bindung der Zellen an die Kulturplatte ermöglichen oder verbessern. Vorzugsweise werden, insbesondere zur Anheftung von Nervenzellen, als Substrat oder zur Oberflächenbehandlung Proteine oder Polypeptide verwendet, die die Bindung der Zellen an die Kulturplatte ermöglichen oder verbessern. Solche Proteine oder Polypeptide sind z. B. Polyornithin, Laminin, Kollagen, Fibronectin oder ähnliche Proteine bzw. Polypeptide und insbesondere Polylysin. Als Substrat zur Anheftung von Nervenzellen kommt auch ein dichter Rasen von Glia-Zellen in Frage.

Als Anheftungsmedium wird im allgemeinen ein Serum-haltiges Anheftungsmedium (Anwachsmedium) verwendet, wie dies z. B. bei bekannten Zellkultursystemen zur Untersuchung des Einflusses von neurotrophen Faktoren auf die Entwicklung oder Vermehrung von Zellsystemen üblich ist [vgl. zum Beispiel W. Seifert, Naturwissenschaftliche Rundschau 40 (1987), Seiten 1 bis 9]. Als Serum-haltiges Anheftungsmedium wird insbesondere DMEM, das 5% fötales Kälberserum und 5% Pferdeserum enthält, verwendet.

Zur Ausdifferenzierung bzw. weiteren Entwicklung der Zellkulturen kann ein Serum-haltiges Medium verwendet werden, das mit dem Serum-haltigen Anheftungsmedium identisch sein kann, oder aber vorzugsweise ein Serum-freies Medium verwendet werden; die Verwendung eines Serum-freien Mediums als Ausdifferenzierungsmedium hat den Vorteil, daß es sich bei dem Serum-freien Medium um ein chemisch definiertes Medium handelt, bei dem das Serum wegen seiner wechselnden Qualität durch eine Hormon-Mischung ersetzt ist. Als Serum-freies, Hormon-haltiges Ausdifferenzierungsmedium wird insbesondere das sogenannte HM-Medium, das als Hormon- Mischung Insulin, Transferrin, Hydrocortison und Trÿodthyronin enthält, oder das N2-Medium verwendet.

Die quantitative Bestimmung des Einwachsens von den Schnitträndern in den erzeugten Schnittkanal kann durch direkte Beobachtung mittels Mikroskop oder Zeitrafferaufzeichnung, z. B. mittels Filmkamera, Video, digitaler Bildspeicherung, erfolgen oder durch indirekte Beobachtung mittels an sich bekannter und üblicher biochemischer, autoradiographischer oder immunohistochemischer Methoden.

Zur direkten Beobachtung mittels Mikroskop oder Zeitrafferaufzeichnung wird erfindungsgemäß vorzugsweise eine "Läsionsapparatur" verwendet. Bei dieser Läsionsapparatur handelt es sich um eine multiple Zellkultur-Kammer mit Wund-Applikator. Dadurch können in parallelen Experimenten etwa 10 bis 50 Bedingungen gleichzeitig untersucht und unter standardisierter Wundsetzung (Läsion) und definierten Kulturbedingungen verglichen werden.

Die erfindungsgemäß verwendete Läsionsapparatur ermöglicht deshalb die standardisierte und reproduzierbare Durchführung von Reihenuntersuchungen von Substanzen (Hormone, Wachstumsfaktoren, Peptide usw.), die Regenerations- und Wanderungsprozesse beeinflussen können.

Die Größe (Wahl der Dimensionen) der Läsionsapparatur richtet sich insbesondere nach den Dimensionen (Länge und Breite) des beabsichtigten Wundmodells.

Nachfolgend wird eine erfindungsgemäß verwendete Zellkulturkammer mit Läsionsvorrichtung (Läsionsapparatur) für die Herstellung zweidimensionaler Läsionen in Zellkulturen beschrieben:

Die dissoziierten Zellen werden zunächst auf einer ca. 2 mm starken, mit Bindungs-Substrat (Anheftungssubstrat) vorbeschichteten Glasplatte kultiviert, die den Boden eines verschließbaren Gefäßes mit stabilen, ca. 20 mm hohen Seitenwänden bildet. Durch eine kammartige Ritzvorrichtung wird zur gegebenen Zeit über die gesamte Länge ein paralleles Streifenmuster eingebracht. Die Breite der Läsionen richtet sich insbesondere nach der vorgesehenen Beobachtungsdauer und liegt in der Regel zwischen 200 µm und 2 mm bei einem Bahnabstand von ca. 2 bis 10 mm.

Die Größe der Glasplatte wird der beabsichtigten Beobachtung angepaßt; sie entspricht in der Regel der xy-Verschiebung eines üblichen Mikroskop-Kreuztisches.

Die kammartige Ritzvorrichtung (Ritzkamm) wird auf die Kulturkammer aufgesetzt und auf den als Führung dienenden Seitenwänden entlang geschoben. Die Schneiden sind elastisch aufgehängt und verursachen eine Durchtrennung und Verdrängung der Zellfortsätze. Durch eine geeignete Schneidenkonstruktion ist es möglich, die Zellreste aus dem Ritzkanal zu entfernen.

In das Kulturgefäß wird nun ein Einsatz aus Metall mit einer geeigneten Dichtung, insbesondere einer Silicondichtung, eingepreßt, der die Bodenplatte in mehrere Kammern, vorzugsweise von der Größe 10×10 mm, segmentiert. Die Kammern können nun mit unterschiedlichen Test-Substanzen beschickt werden und das Wiederauswachsen der Zellfortsätze und Einwandern der Zellen beobachtet werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit ein Verfahren zur Untersuchung von Regenerationsprozessen und Zellwanderungsprozessen zur Verfügung gestellt, mit dem sich der Einfluß verschiedener Substanzen (Hormone, Wachstumsfaktoren, Pharmaka usw.) beobachten und bestimmen läßt; dieses Verfahren sellt ein gutes Modell für in vivo auftretende Läsionen und Wundheilungsprozesse dar. Durch Langzeit-Kultivierung in vitro (bei Nervenzellen der Ratte z. B. zwei bis drei Wochen) können die Nervenzellen voll ausdifferenzieren und damit ein Stadium erreichen, das dem Nervensystem des adulten Tieres entspricht. Mit dem erfindungsgemäßen "Läsions-System" ("Wund-System") lassen sich an Zellkulturen, z. B. aus dem peripheren oder zentralen Nervensystem, nach Applikation einer "Läsion" ("Wunde") Regenerationsprozesse unter den definierten Bedingungen dieses Systems studieren.

Bei dem erfindungsgemäßen Gegenstand handelt es sich also um ein zweidimensionales Zellkultur-Modell für Untersuchungen, die sonst normalerweise nur in aufwendigen und schwierigen Tier-Experimenten nach Verletzungen (Wunden, Läsionen), z. B. des Nervensystems bzw. Gehirns, durchgeführt werden können. Wegen der außerordentlichen klinischen Bedeutung solcher Regenerationsprozesse ist die Entwicklung eines solchen erfindungsgemäßen Läsions-Systems in der Zellkultur von großer Bedeutung für die Medizin und die pharmazeutische Industrie (Entwicklung von Heilmitteln).

Die besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Systems werden insbesondere durch die folgenden Aspekte begündet: Hohe Reproduzierbarkeit der Versuche durch die Standardisierung der experimentellen Bedingungen; freie Wahl der Versuchsparameter und ausgezeichnete Beobachtbarkeit und Auswertung der Regenerationsprozesse in vitro; Einsparung von Tier- Experimenten; Verwendungsmöglichkeit für Reihenuntersuchungen und zum "Screening" (z. B. von Pharmaka, Hormonen und anderen Bio-Chemikalien) unter standardisierten und reproduzierbaren Bedingungen.

Je nach Auswahl der Zellkulturen lassen sich dabei spezifische Erscheinungsformen untersuchen; so kommt z. B. dem Rückenmark bei Querschnittslähmungen eine enorme Bedeutung zu und damit auch der Untersuchung von Rückenmarksgewebe, bei dem es sich ebenfalls um Nervensystemgewebe handelt, mit dem erfindungsgemäßen "Läsionssystem".

In den Fig. 1 bis 4 bedeuten:

Fig. 1a zeigt eine Phasenkontrastphotographie von hippocampalen Neuronen zwei Stunden nach Auftragen auf mit Polylysin beschichtete Deckgläser;

Fig. 1b zeigt die gleiche Kultur hippocampaler Neuronen 24 Stunden nach dem Auftragen.

Es kann ein starkes Neuriten-Auswachsen festgestellt werden. Die meisten Zellen haben zwei oder mehrere lange Fortsätze entwickelt. Der eingetragene Maßstab stellt 100 µm dar.

Die Fig. 2 zeigt die Wirkung des Zusatzes von exogenem GT1b-Gangliosid zu einer hippocampalen Zellkultur, wie sie in Fig. 1 gezeigt wird (Einwirkungsdauer 24 Stunden). Die Neuritenlänge wird in Mikrometer pro Neuron aufgetragen, gemessen an Vergrößerungen von Phasenkontrast-Aufnahmen. Der Maßstab bezieht sich auf das SEM von drei unabhängigen Experimenten. Jedes Experiment bestand aus drei Deckgläschen mit vier verschiedenen mikroskopischen Feldern auf jeder Deckgläschenkultur.

1. Kontrollkulturen mit einer durchschnittlichen Neuritenlänge von 95 µm.
2. Zugabe von GT1b (5×10^-5 M): vollständige Inhibierung des Neuritenwachstums.
3. Zugabe von GT1b (8×10^-8 M): Stimulierung des Neuritenwachstums mit einer durchschnittlichen Länge von 160 µm.

Fig. 3 stellt eine Phasenkontrastaufnahme von "Wund-Kultur"- Systemen dar. Es handelt sich um eine dichte Cortex-Kultur neugeborener Ratten, die in einem Serum-freien, N2 enthaltenden Medium 10 Tage kultiviert wurde. Der Maßstab bedeutet 10 µm.

a) 0 Stunden nach Einkratzen der Wunde in die Kultur;
b) Scanning-Elektronenmikrographie, aufgenommen 24 Stunden nach der Wundzufügung.

Es zeigen sich lange Fortsärze mit Wachstumskegeln, die von der Kante der Wunde in den offenen Schnittkanal hineinwachsen. Der Maßstab bedeutet 10 µm.

Die Fig. 4 zeigt das gleiche "Wund-Kultur"-System wie die Fig. 3a, 24 Stunden nach dem Zufügen der Wunde, als Phasenkontrastmikrographie.

a) Kontrolle: Man stellt Neuritenwachstum und individuelle Zellen, die in der Wunde wandern, fest.
b) Zugabe von 10 ng FGF/ml Medium (während 24 Stunden): Die Wunde ist durch starkes Neuritenwachstum und Glia-Zellenwanderung fast geschlossen.

Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren näher, ohne es darauf zu begrenzen.

Beispiele Verwendete Medien DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium)

Pulvermedium (bezogen von der Firma Boehringer, Mannheim)
3,7 g/l NaHCO₃
100 000 U Penicillin/Streptomycin (Boehringer)

Hepes-Medium

DMEM
20 ml/l 1 M Hepes, ph = 7,3 (Gibco)

FKS-Medium

DMEM
10% inaktiviertes fötales Kälberserum

Anheftungsmedium

DMEM
5% inaktiviertes fötales Kälberserum
5% inaktiviertes Pferdeserum

HM-Medium

DMEM
7,25 µg/l Hydrocortison (2×10^-8 M)
5 mg/l Insulin (8,8×10^-7 M)
1 mg/l Transferrin (1,1×10^-8 M)
0,2 µg/l Trÿodthyronin (3×10^-10 M)

N2-Medium

DMEM
5 mg/l Insulin (8,8×10^-8 M)
10,35 ng/l Na-Selenit (30 nM)
6,3 µg/l Progesteron (20 nM)
16 mg/l Putrescin (100 µM)
100 mg/l Transferrin (1,1 uM)

Kultivierungsmethoden Herstellung von Glia-Kulturen

a) Zur Herstellung von Glia-Kulturen (Glia-Feederlayer- Kulturen) wurden die Vorderhirnhemisphären von 3 bis 5 Tage alten Ratten herauspräpariert, von den Meningen befreit, in Hepes-Medium gesammelt und nach fünfzehnminütiger Inkubation mit Trypsin-EDTA, gefolgt von dreimaligem Waschen mit DMEM, ungefähr 10- bis 15mal durch eine Spritze mit 18-G-Kanüle geschert. Die Zellsuspension wurde dann mit ca. 10 ml FKS-Medium pro Hemisphäre versetzt und zu je 10 ml auf Petrischalen von 10 cm Durchmesser verteilt. Nachdem die Zellen etwa eine Woche angewachsen waren, wurde das FKS-Medium durch Serum-freies HM-Medium ersetzt.

Herstellung von Hippocampus-Neuronenkulturen

a) Um eine Kultur von hippocampalen Pyramiden-Neuronen [G. A. Banker, W. M. Cowan, Brain Res 126 (1977), 397 bis 425] zu erhalten, wurden die Hippocampi aus den Feten einer ca. 18 Tage trächtigen Ratte herauspräpariert und analog den Glia-Kulturen trypsinisiert und geschert. Die Zellsuspension wurde dann mit einer Dichte von 500 000 Zellen/ml in Anheftungsmedium entweder auf Petrischalen von 2 cm Durchmesser plattiert, in denen sich 7 mit Polylysin (0,3 mg/ml) beschichtete runde Deckgläschen (Durchmesser 10 mm) befanden, oder auf die Kreise von ebenfalls mit Polylysin beschichteten Spezialobjektträgern (Flow Multitest Slides; 10 well) pipettiert (je 50 µl). Nach 45minütiger Anheftungszeit wurden die Zellen einmal mit DMEM gewaschen und dann entweder in N2-Medium gehalten oder die Deckgläschen auf in HM-Medium wachsende Glia-Kulturen gesetzt.

Herstellung von Cortex-Mischkulturen

Um Kulturen herzustellen, die sowohl kortikale Neuronen als auch Gliazellen enthalten, wurden die Hemisphären von neugeborenen Ratten vorsichtig mit einer 5-ml-Zellkulturpipette geschert. Außerdem wurde ein Zentrifugationsschritt (Heraeus Labofuge GL; 10 Minuten, 2000 UpM und eine Filtration) durch einen 80-µm-Nylonfilter zwischengeschaltet. Die Zellen wurden mit einer Dichte zwischen 800 000 und 10⁶ Zellen/ml in Anheftungsmedium auf Polylysin-beschichtete Deckgläser oder Flow-Objektträger ausgesät und nach 45 Minuten Anheftung in N2-Medium gezogen.

Beispiel 1

Zellkulturen aus Ratten-Hippocampus wurden wie vorstehend beschrieben in Serum-freiem, Hormon-haltigem Medium hergestellt. Für die dissoziierten Kulturen hippocampaler Neuronen niedriger Dichte wurden Zellen von 18 Tage alten Rattenembryos genommen und mit einer Konzentration von 2×10⁵ Zellen/ml Medium auf mit Polylysin beschichtete Deckgläschen aufgetragen. Nach der anfänglichen Anheftungsphase in 5% Pferdeserum und 5% fötales Kälberserum enthaltendem Medium während 45 Minuten wurden die Deckgläschen vorsichtig gewaschen und in HM-Medium gegeben, das Zusätze von Gangliosiden oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) enthielt. Die Enddichte der angehefteten Zellen betrug 2 bis 4×10⁴ Zellen/cm².

Beispiel 2

Kulturen aus Rattencortex (Cortex-Mischkultur) hoher Dichte wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß N2-Medium verwendet wurde, das ein Langzeit- Überleben zu verbessern scheint. Diese Kultur wurde nach 10 Tagen für die "Wundexperimente", wie sie in den Fig. 3 und 4 dargestellt sind, verwendet.

Die Identifizierung der Zelltypen wurde mittels Immunofluoreszenz- Anfärbung durchgeführt: Anti-GFAP für Astrocyten und Anti-Neurofilament für Neuronen. Das Zellüberleben wurde durch Fluoreszenz-Anfärbung gemessen, bei der es sich um einen zuverlässigeren Test als die Trypanblau-Reaktion handelt. Individuelle Ganglioside wurden von Serolab, München, erhalten und Fibroblastwachstumsfaktor (FGF) von Sigma Co., München.

Die Beobachtung der Zellen und Neuriten wurde mittels Phasenkontrast-Mikroskopie und Mikro-Kinematographie vorgenommen. Die Neuritenlänge in µm pro Neuron wurde mittels Phasenkontrast-Photographien bei geeigneten Vergrößerungen gemessen. Jede experimentelle Bedingung wurde in 3 bis 5 unabhängigen Experimenten durchgeführt. Jedes Experiment umfaßte drei Deckgläschen, und vier verschiedene Felder wurden für jedes Deckgläschen quantitativ ausgewertet, mit einer Gesamtzellenzahl von ca. 400 Zellen pro Deckgläschen.

Aus den vorstehend genannten Untersuchungen und Beispielen lassen sich folgende Ergebnisse ableiten:

1. Wirkung von exogenen Gangliosiden auf hippocampale Neuronen bei niedriger Zelldichte in Serum-freiem Medium

Das Neuronenzellkultursystem von embryonalem Ratten-Hippocampus besteht hauptsächlich aus neuronalen Zellen (vgl. W. Seifert et al. in "Neurobiology of the Hippocampus", Academic Press, London, 1983, Seiten 109 bis 135; W. Seifert und H. W. Müller, 1984, l.c.). Aufgrund der Entwicklungszeiten enthalten diese Kulturen fast keine Granularneuronen, die sich post-natal entwickeln und dann die Zellschicht des gezahnten Gyrus (dentate gyrus) bilden. Sie bestehen hauptsächlich aus pyramidalen Neuronen (glutamatergisch) und zu einem geringeren Teil aus Korbneuronen (basket neurons; gabanergisch). Zusätzlich sind ca. 10% der Zellen Astrocyten, und weniger als 1% sind andere Zelltypen, wie z. B. Oligodendrocyten und Microgliazellen. Mit ca. 90% neuronaler Zellen eines definierten Ursprungs und Entwicklungsstadiums (ca. 24 bis 48 Stunden postmitotisch) kann dieses neuronale Zellkultursystem aus Hippocampus für alle praktischen Zwecke als relativ homogenes Zellkultursystem angesehen werden, insbesondere im Hinblick auf die Komplexizität anderer Systeme des Zentralnervensystems.

Aufgrund der Tatsache, daß diese Neuronen gerade postmitotisch wurden und zur Zeit der Dissoziation und dem Aufbringen auf Kulturschalen oder Deckgläschen keine Fortsätze besitzen, kann das Auswachsen zu Neuriten während der ersten 24 oder 48 Stunden beobachtet werden. Bei niedriger Zelldichte können individuelle Zellen und ihr Neuritenwachstum verfolgt werden und durch Phasenkontrast-Mikrophotographie und Kinematographie gemessen werden, so wie es in Fig. 1 dargestellt wird.

In diesem System wurde die neurotrophische Wechselwirkung von Astrocyten und Neuronen untersucht und als niedrigmolekularer neurotrophischer Faktor beschrieben [vgl. H. W. Müller und W. Seifert, J. Neursci. Res. 8 (1982), 195 bis 204; H. W. Müller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1248 bis 1252]. Weitere Forschungen haben gezeigt, daß in dem Astrocyten-konditionierten Medium zusätzlich ein Faktor mit hohem Molekulargewicht existiert. Wie von S. Beckh et al., NATO ASI Series H: Cell Biology, Bd. 2, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1987), Seiten 385 bis 406, beschrieben, besitzt die Komponente mit dem niedrigen Molekulargewicht die Überlebensaktivität, und es wurde festgesellt, daß es sich dabei um Pyruvat handelt [vgl. I. Selak et al., J. Neurosci 5 (1985), 23 bis 28]. Die hochmolekulare Komponente ist für die Neuriten-fördernde Aktivität verantwortlich und scheint in antigener Beziehung zu Laminin zu stehen (vgl. S. Beckh et al., l.c.).

2. Wirkung von Gangliosiden und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) auf Nervenzellen-Kulturen hoher Dichte aus Rattencortex in den "Wund-Experimenten"

Ein offensichtlicher Vorteil des erfindungsgemäßen "Wund- Kultur"-Systems ist die Möglichkeit der kontinuierlichen Beobachtung durch Mikro-Kinematographie, die Identifizierung aller Zelltypen durch Kombination von Immunohistochemie und Autoradiographie und die Möglichkeit der Manipulation durch Drogen, Arzneimittel, Hormone und andere Substanzen, wie z. B. Gnagliosiden, während des Prozesses der Regeneration in einem in-vitro-System.

Als Beispiel für ein erfindungsgemäßes Kultursystem wurden Nervenzellen von Ratten-Cortex oder -Hippocampus genommen, die mit hoher Zelldichte aufgetragen wurden und mehrere Tage (ein bis zwei Wochen) in einem Serum-freien, Hormon enthaltenden Medium gehalten wurden. Unter diesen Bedingungen sind sowohl Neuronen als auch Glia-Zellen vorhanden. Aufgrund der langen Kulturperiode können diese dichten Kulturen bis zu einem bestimmten Ausmaß als zweidimensionales in-vitro- System des Gehirns der erwachsenen Ratte angesehen werden. Dann wird eine "Wunde" in die Zell-Monoschicht eingekratzt, die in dem Phasenkontrast-Mikroskop wie eine offene "Schnellstraße" erscheint. Ein solches Beispiel zeigt die Fig. 3, worin a die Phasenkontrast-Photographie zur Zeit 0 zeigt und b die Ansicht durch ein Rasterelektronen-Mikroskop 24 Stunden später darstellt. Diese Figur zeigt die auswachsenden Fortsätze mit den Wachstumskegeln, die in den offenen Raum hinausragen. Der gleiche Zeitpunkt nach 24 Stunden wird in dem Phasenkontrast-Photo in Fig. 4a gezeigt. Auch hier wird Neuriten-Wachstum und zuästzliche Wanderung einzelner Zellen in die offene "Wunde" festgestellt.

Die "Wund-Experimente" können routinemäßig durch Phasenkontrast- Mikroskopie und Zeitraffer-Kinematographie verfolgt werden und die Zelltypen der gleichen Flächen durch Immunohistochemie und Autoradiographie identifiziert werden. Auf diese Weise kann man z. B. die verschiedenen Mobilitäten und Aktivitäten von sowohl Neuronen als auch Astrocyten in dem Wund-Paradigma beobachten. Mit dem erfindungsgemäßen "Wund- Kultur"-System ist es möglich, die Wirkung von Gangliosiden und neurotropher Faktoren auf eine solche "in-vitro-Läsion" zu untersuchen. Als Beispiel dafür zeigt die Fig. 4b die Wirkung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF) auf dieses System, und zwar zum gleichen Zeitpunkt (24 Stunden) wie in Fig. 4a gezeigt, aber nach Behandlung mit 10 ng/ml FGF im Medium. Die Wirkung ist deutlich zu sehen. Aufgrund des extensiven Neuritenwachstums und der Zellwanderung hat sich die "offene Wunde" fast vollständig geschlossen. Dies ist in Übereinstimmung damit, daß FGF als ein neurotropher Faktor auf zentrale Neuronen wirken kann [P. Walicke, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 3012 bis 3016], zeigt aber in dem erfindungsgemäßen "Wund-Kultur"-System, daß FGF in einer Wunde tatsächlich eine nützliche Wirkung besitzen kann und deshalb vermutlich auch bei Vorliegen einer in-vivo-Läsion durch Stimulierung der Regenerationsprozesse vorteilhaft ist.

Claims

1. Verfahren zur Untersuchung von Regenerations- und Wanderungsprozessen in Zellsystemen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zellkultur auf einem Kultursubstrat herstellt, in dem dichten Zellrasen einen Schnitt anbringt und anschließend das Zellwachstum von den Schnitträndern in den erzeugten Schnittkanal hinein unter dem Einfluß der zu untersuchenden Substanzen bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung von Regenerations- und Wanderungsprozessen des Nervensystems in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zellkultur des peripheren oder zentralen Nervensystems aus embryonalem Gewebe auf einem Kultursubstrat zur Anheftung von Nervenzellen herstellt unter Verwendung eines Anheftungsmediums, nach dem Anheften der Zellen auf dem Kultursubstrat diese in einem Medium bis zur Ausdifferenzierung weiterzüchtet, dann im gebildeten dichten Zellrasen den Schnitt anbringt und anschließend das Zellwachstum von den Schnitträndern für den erzeugten Schnittkanal hinein unter dem Einfluß der zu untersuchenden Substanzen oder Faktoren in Abhängigkeit von der Zeit quantitativ bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man embryonales Gewebe von spezifischen Regionen des Zentralnervensystems verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Cortex, Hippocampus, Cerebellum oder Rückenmark verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Anheften von Nervenzellen als Substrat oder zur Oberflächenbehandlung eines Substrats Proteine oder Polypeptide verwendet, die die Bindung der Zellen an die Kulturplatte ermöglichen oder verbessern.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Polyornithin, Polylysin, Laminin, Kollagen, Fibronectin oder ähnliche Proteine oder Polypeptide verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat zur Anheftung von Nervenzellen einen dichten Rasen von Glia-Zellen verwendet.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Serum-haltiges Anheftungsmedium verwendet und zur weiteren Ausdifferenzierung der Zellkulturen ein Serum-freis, Hormon-haltiges Medium verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serum- haltiges Anheftungsmedium DMEM mit 5% fötalem Kälberserum und 5% Pferdeserum verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausdifferenzierungsmedium Insulin, Transferrin, Hydrocortison und Trÿodthyronin enthält.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die quantitative Bestimmung des Einwachsens in den Schnittkanal durch direkte Beobachtung mit einem Mikroskop oder mit einer Zeitraffer-Aufzeichnung durchführt oder durch indirekte Beobachtung mittels biochemischer, autoradiographischer oder immunohistochemischer Methoden durchführt.