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Beschreibung
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Verfahren und Vorrichtung zur Messung immunologischer Reaktionen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung einer immunologischen
Antigen-Antikörper-Reaktion aufgrund einer Schwankung in der Intensität von Licht,
das durch feine Teilchen, die in der Reaktionsflüssigkeit suspendiert sind, gestreut
wird.
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Es sind immunologische Analysenzur Messung von immunologischen Substanzen,
Hormonen, Arzneimitteln und verschiedenen Komponenten wie Immunregulatoren, die
in geringen Mengen in lebenden Körpern vorhanden sind unter Anwendung spezieller
immunologischer Reaktionen bekannt. Die immunologischen Analysen können grob eingeteilt
werden in solche, bei denen Markierungssubstanzen wie Enzyme und Isotope als Indikatorsubstanzen
verwendet werden und solche, bei denen die Antigen-Antikörper-Komplexe direkt, ohne
daß Markierungssubstanzen vorhanden sind, gemessen werden.
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Bei der zuerst genannten Gruppe der mit Markierungssubstanzen arbeitenden
immunologischen Analysen sind allgemein bekannt das Radio-Immuno-Assay (RIA), das
Enzym-Immuno-Assay (EIA) und das Fluoreszenz-Immuno-Assay (FIA). Diese
Assays
bzw. Untersuchungen haben den Vorteil, daß eine hohe Empfindlichkeit erzielt werden
kann, aber auch den Nachteil, daß die Handhabung von Isotopen und verbrauchten Flüssigkeiten
schwierig ist, die Meßzeiten lang sind und die Markierungsreagentien teuer sind1
so daß die Untersuchungskosten pro probe, d.h. die laufenden Kosten leicht zu hoch
werden.
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Für die zuletzt genannte immunologische Analyse ohne Markierung wurden
die Immuno-Elektrophorese, Immuno-Diffusion und-Sedimentation entwickelt. Diese
Verfahren sind ziemlich einfach, jedoch nicht ausreichend empfindlich quantitativ
und reproduzierbar, wie es für genaue Messungen erforderlich ist.
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In "Immuno chemistry", Bd. 12 Nr. 4 (1975), S. 349 bis 351 ist eine
immunologische Analyse beschrieben, bei der Antigene oder Antikörper, die an die
Oberfläche kleiner Teilchen gebunden sind, mit Antikörpern oder Antigenen in einer
Testflüssigkeit reagieren und die mittlere Diffusionskonstante, die ein Zeichen
für die Brown'sche Bewegung der Aggregate aus agglutinierten Teilchen ist, wird
aus einer Variation in der spektralen Breite von Laserlicht gemessen, das von einer
Lösung von Teilchen gestreut wird. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, daß keinerlei
Reagens verwendet wird. Da jedoch die Breite (Verbreiterung) des Spektrums, die
auf dem Dopplereffekt aufgrund der Brown'schen Bewegung der Aggregate beruht mit
Hilfe eine Spektrometers nachgewiesen wird, ist die Vorrichtung ziemlich groß und
teuer.
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Darüber hinaus kann es zu Fehlern führen, wenn das Spektrometer mechanisch
angetrieben wird, so daß die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit schlecht werden.
Darüber hinaus wird bei diesen bekannten Verfahren die mittlere Diffusionskon-
stante
aus der spektralen Breite gemessen, wodurch nur eine beschränkte Information über
die Antigen-Antikörper-Reaktion zur Verfügung steht.
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Es ist Aufgabe der Erfindung, ein neues und günstiges Verfahren zur
Messung einer Antigen-Antikörper-Reaktion zu entwickeln, bei dem es nicht erforderlich
ist, teure Reagentien und teure und große Spektrometer zu verwenden und bei dem
die Messung mit großer Genauigkeit reproduzierbar durchgeführt werden kann. Die
Messung soll automatisch innerhalb kurzer Zeit durchführbar sein und es sollen kleine
Mengen bzw. Konzentrationen an Antigen oder Antikörper in einer Testprobe genau
meßbar sein.
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Das. erfindungsgemäße Verfahren zur Messung von immunologischen Reaktionen
umfaßt die folgenden Stufen: Richten von Strahlung auf eine Reaktionsflüssigkeit,
enthaltend zumindest Antigen und Antikörper; Nachweis der durch die Teilchen in
der Reaktionsflüssigkeit gestreuten Strahlung; Aufzeichnen eines Dichtespektrums
der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung und Messung der Antigen-Antikörper-Reaktion
auf der Basis dieser Änderung des Dichtespektrums.
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Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung der immunologischen Reaktion mit Hilfe
der Schwankung (Veränderung) der Intensität des von den Teilchen gestreuten Lichtes.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Messung der immunologischen Reaktion
umfaßt: eine Lichtquelle, die einen Lichtstrahl (Lichtstrom) aussendet;
eine
Zelle, die eine Antigen-Antikörper-Reaktionsflüssigkeit enthält; optische Einrichtungen,
um den von der Lichtquelle ausgesandten Lichtstrahl in die Zelle zu leiten; Fotodetektoren,
die das von den Teilchen in der Antigen-Antikörper-Reaktionsflüssigkeit gestreute
Licht aufnehmen unter Erzeugung eines elektrischen Ausgangssignals; Mittel, die
das von dem Fotodetektor ausgesandte elektrische Signal aufnehmen und ein Dichtespektrum
der Intensitätsschwankungen der gestreuten Lichtstrahlung (a power spectrum density
of fluctuation in intensity of scattered light) aufnehmen und Mittel zur Messung
der Antigen-Antikörper-Reaktion auf der Basis des Dichtespektrums.
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Die vorliegende Erfindung beruht auf den folgenden Tatsachen. Die
Intensität von Licht, das gestreut wird durch die Aggregate der bei der Antigen-Antikörper-Reaktion
entstehenden Teilchen verändert sich bzw. schwankt aufgrund der Interferenz des
Lichtes und ein Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung
hängt ab von der Form und Größe der Aggregate oder Teilchen. Daher ist es durch
Nachweis bzw. Untersuchung des Dichtespektrums der Intesitätsschwankungen möglich,
viele nützliche Informationen über immunologische Reaktionen zu erhalten wie das
Auftreten einer Antigen-Antikörper-Reaktionjeine quantitative Information über den
Antigen- bzw. Antikörpergehalt und den Agglutinationszustand der Aggregate von Teilchen
(Durchmesser der Aggregate) aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion. Da die Veränderung
der Intensität des gestreuten Lichtes einfach durch Nachweis des gestreuten Lichtes
mit Hilfe eins Fotodetektors gemessen werden kann, ist es erfindungsgemäß nicht
mehr erforderlich,irgendein
teures Reagens zu verwenden. Da keine
Analyse des Spektrums des gestreuten Lichtes durchgeführt wird, ist es auch nicht
erforderlich ein großes und teures Spektrometer zu verwenden.
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Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird das gestreute Licht homodyn
gemessen und das Verhältnis der Kippfrequenzen (relaxation frequencies) des Dichtespektrums
der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung vor und nach der Antigen-Antikörper-Reaktion
wird aufgezeichnet um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu messen. Dies beruht auf
der Tatsache, daß die Kippfrequenz unmittelbar zusammenhängt mit der Größe der Aggregate
agglutinierter Teilchen.
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Bei einer anderen bevorzugten Arbeitsweise nach der Erfindung wird
das Verhältnis der integrierten Werte des Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen
in einem niedrigeren Ffequenzbereich vor und nach der Antigen-Antikörper-Reaktion
gemessen. Das beruht auf der Tatsache, daß der integrierte Wert des Dichtespektrums
der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes im niedrigeren Frequenzbereich
dicht zusammenhängt mit der Größe der Teilchenaggregate.
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Erfindungsgemäß wird die Schwankung der Intensität des von agglutinierten
Teilchen gestreuten Lichtes gemessen auf der Basis des Dichtespektrums und daher
ist es nicht mehr erforderlichsteure Reagentien und Spektrometer zu verwenden und
es können viele wertvolle Informationen über die Antigen-Antikörper-Reaktion in
sehr kurzer Zeit mit sehr großer Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit erhalten
werden, selbst wenn die Antigen- bzw. Antikörperkonzentration, die gemessen werden
soll1 sehr klein ist.
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Die Erfindung wird an Hand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.
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Fig. 1 ist eine schematische Ansicht, die eine Ausführungsform der
immunologischen Meßvorrichtung nach der Erfindung zeigt.
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Fig. 2 ist eine schematische Ansicht, die den Aufbau eines in Fig.
1 gezeigten Kollimators darstellt.
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Fig. 3 ist eine schematische Ansicht, die die Hauptteile einer anderen
Ausführungsform einer erfindungsgemäßen immunologischen Meßvorrichtung zeigt.
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Fig. 4 und5 sind graphische Darstellungen, die Kurven für das Dichtespektrum
für Teilchen mit Durchmessern von 0,188 Hm bzw. 0,305 Wm zeigen.
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Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen
dem Teilchendurchmesser und der Kippfrequenz des Dichtespektrums zeigt.
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Fig. 7 und 8 sind graphische Darstellungen, die Kurven des Dichtespektrums
für Teilchenkonzentrationen von 0,1 Gew.-% bzw. 0,09 Gew.-% zeigen.
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Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen
der Teilchenkonzentration und der Kippfrequenz angibt.
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Fig. 10 und 11 sind graphische Darstellungen, die Kurven für das Dichtespektrum
vor und nach der Antigen-Antikörper-Reaktion für Antigenkonzentration von 10 4 g/ml
bzw. 10 9 g/ml angeben.
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Fig. 12 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen
der Antigenkonzentration und dem Verhältnis der Kippfrequenzen angibt und Fig. 13
ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Antigenkonzentration
und dem Verhältnis der relativen Schwankungen angibt.
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Fig. 1 ist eine schematische Ansicht, die eine Ausführungsform einer
Vorrichtung zur Messung immunologischer Reaktionen nach der Erfindung zeigt. Bei
dieser Ausführungsform ist eine Lichtquelle vorgesehen, die kohärentes Licht aus
sendet und zwar ein He-Ne-Gaslaser 1, der einen Laserstrahl mit einer Wellenlänge
von 632,8 nm aussendet. Die Lichtquelle kann ein Feststofflaser wie ein Halbleiterlaser
sein. Ein Laserlichtstrahl 2, der von der Lichtquelle 1 ausgesandt wird, wird durch
einen halbdurchlässigen Spiegel 3 in die Lichtstrahlen 4 und 5 aufgetrennt. Der
Lichtstrahl 4 wird durch eine Sammellinse 6 gesammelt und trifft auf die Zelle 7
auf. Die Zelle 7 besteht aus durchsichtigem Quarz.
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Der Lichtstrahl 5 trifft auf einen Fotodetektor 8 wie eine Silicium-Fotodiode
auf. Dann erzeugt der Fotodetektor 8 ein Monitorsignal, das eine Veränderung der
Intensität des von der Lichtquelle 1 ausgesandten Lichtes anzeigt.
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In der Zelle 7 ist eine Testflüssigkeit für eine Antigen-Antikörper-Reaktion
enthalten, die ein Gemisch ist aus einer Pufferlösung, in der feine Teilchen 9 suspendiert
sind und einer Testprobe, enthaltend das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden
Antikörper. Auf der Außenseite der Teilchen 9 sind Antikörper bzw. Antigene gebunden,
die spezifisch mit dem Antigen oder Antikörper in der Testprobe reagieren. Daher
tritt in der Zelle 7eine Antigen-Antikörper-Reaktion ein und es treten Anziehungskräfte
zwischen den Teilchen auf. Wenn die Teilchen miteinander unter Bildung von Aggregaten
agglutiniert sind, ändert sich die Brown'sche Bewegung je nach der Größe und Form
der Aggregate. Lichtstrahlen, die durch die Teilchen 9 in der Zelle 7 gestreut werden,
treffen auf einen Fotodetektor 11 über einen Kollimator 10 auf, der zwei (gegenüberliegende)
Löcher aufweist. Der Fotodetektor 11 besteht aus
einem Fotomultiplier
mit hoher Empfindlichkeit.
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Das Austritts-(Monitor)-signal des Fotodetektors 8 wird über einen
Verstärker mit geringem Rauschen in eine Datenverarbeitungsvorrichtung 11 geleitet,
in die auch das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 über einen Verstärker 15
mit geringem Rauschen und einen Tiefpassfilter 16 geführt. Die Datenverarbeitungsvorrichtung
14 umfaßt eine Analog-Digital-Umwandlereinheit 17, eine schnelle Fourier-Transformator-(FFT)-Einheit
18 und eine Recheneinheit 19 und verarbeitet die Signale wie später näher erläutert
wird, um Meßergebnisse für die Antigen-Antikörper-Reaktion zu erhalten. Die Meßergebnisse
werden in einer Display- bzw.
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Aufzeichnungsvorrichtung 20 angezeigt.
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Das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 zeigt die Intensität des
gestreuten Lichtes an, das aus der Meßzelle 7 austritt und wird normiert durch das
Monitorsignal, das von dem Fotodetektor 8 geliefert wird und über einen kurzen Zeitraum
gemittelt. Dadurch kann eine etwaige Variation der Intensität des Laserlichtstrahls
2 aus der Lichtquelle 1 ausgeschaltet werden. Anschließend wird ein Dichtespektrum
der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes nachgewiesen und der Agglutinationszustand
der Teilchen 9 in der Zelle 7 und damit das Fortschreiten der Antigen-Antikörper-Reaktion
gemessen.
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Fig. 2 ist eine schematische Ansicht, die die Konstruktion des Kollimators
10 der Fig. 1 im einzelnen zeigt. Der Kollimator 10 umfaßt ein Rohr 10a aus einem
opaken, d.h. nicht durchscheinenden Material um den Einfluß von äußerem Licht zu
vermeiden. Darüber hinaus ist die innere Wand des Rohres 10a mit einer nicht-reflektierenden
Schicht überzogen. An beiden Enden des Rohrs 10a sind optische Löcher 1Ob und 10c
vorgesehen.
Wenn die Radien der optischen Löcher 1Ob und 10c al bzw. a2 sind, und der Abstand
zwischen den Löchern Leder Brechungsindex des Mediums innerhalb des Rohres 10a n
und die Wellenlänge des Lichtes)\ ist, folgt der Kollimator 10 der folgenden Gleichung(1)
Erfindungsgemäß wird das Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten
Lichtes nachgewiesen. Das Dichtespektrum kann angegeben werden durch einen Term
der Schwankung aufgrund der Interferenz des Lichtes, die durch die Teilchen hervorgerufen
wird, die über einen Abstand dispergiert sind, der im wesentlichen gleich ist der
Wellenlänge und einen Term der Schwankung der Anzahl der Teilchen, die in das streuende
Volumen eintreten und daraus austreten. Der erste Fluktuations-Term, der auf der
Interferenz beruht, wird als räumliche Schwankung eines Punktmusters beobachtet.
Wenn diese räumliche Schwankung von einem Fotodetektor mit einem breiten lichtempfangenden
Bereich aufgenommen wird, wird das räumliche Mittel über die lichtaufnehmende Fläche
gebildet und daher kann nur eine geringe Schwankung nachgewiesen werden. Bei der
erfindungsgemäßen Arbeitsweise ist das Blickfeld des Fotodetektors 11 durch den
Kollimator 10 mit den optischen Löchern begrenzt, so daß die Fluktuation mit sehr
hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann. Die oben angegebene Gleichung 1
kann erfüllt werden durch Verwendung eines Kollimators 10 mit Löchern mit einem
Durchmesser von 0,3 mm im Abstand von 30 cm, wenn das Medium im Inneren des Kollimators
Luft mit einem Brechungsindex n=1 ist.
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Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform ist der Lichtstrahl 4,
der auf die Zelle 7 auftrifft,senkrecht zu der optischen Achse des Kollimators 10,
so daß der auftreffende Lichtstrahl nicht direkt in den Fotodetektor 11 gelangt.
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Das wird als homodyne Methode bezeichnet. Erfindungsgemäß ist es jedoch
auch möglich, die heterodyne Methode anzuwenden, bei der ein Teil des auftreffenden
Lichtstrahls in den Fotodetektor 11 gelangt. Fig. 3 zeigt eine solche heterodyne
Anordnung. Erfindungsgemäß kann ein Neigungswinkel 8 zwischen dem einfallenden Lichtstrahl
4 und der optischen Achse des Kollimators 10 beliebig bestimmt werden. Bei der homodynen
Anordnung, die in Fig. 1 gezeigt ist, ist das Austrittssignal aus dem Fotodetektor
11 proportional dem Mittelwert des Quadrats E wobei Es die 5 Intensität des elektrischen
Felds des gestreuten Lichtes ist. Bei der heterodynen Anordnung, die in Fig. 3 gezeigt
ist, wird das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 folgendermaßen angegeben (E
+ E t = E 2 + 2E .E + e s e e s s wobei E die Intensität des elektrischen Felds
des direke t auftreffenden Lichtes ist. Da E gar nicht oder nur gee ring schwankt,
verglichen mit der Schwankung des gestreuten Lichtes,ist die Variable des Austrittssignals
aus dem Fotodetektor 11 im wesentlichen gleich dem zweiten Term 2E .E. Das heißt
selbst bei der heterodynen Methode ist e s es möglich, ein Austrittssignal zu erhalten,
das im wesentlichen proportional ist der Intensität Es des elektrischen Felds des
gestreuten Lichtes. Ferner ist zu bemerken, daß der Kollimator 10 nicht auf die
oben beschriebene Ausführungsform beschränkt ist sondern verschiedene Formen besitzen
kann sofern das Blickfeld des Fotodetektors 11 kleiner gehalten werden kann als
ein Punktmuster.
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Im folgenden wird die Verarbeitung des Signals erläutert.
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Das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 wird in die datenverarbeitende
Vorrichtung 14 über den Tiefpassfilter 16 eingegeben und dort zusammen mit dem Austrittsmonitorsignal
aus dem Fotodetektor 8 verarbeitet um das Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen
des gestreuten Lichtes zu erhalten. Die Dichte des Intensitätsspektrums S(f) eines
stationären stochastischen Prozesses x(t) kann folgendermaßen ausgedrückt werden.
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Auf der Basis dieser Gleichung 2 wird die Fourier-Transformation durchgeführt,
um die Dichte des Intensitätsspektrums zu messen. Das Austrittssignal aus dem Fotodetektor
11 wird durch den Verstärker 15 mit geringem Rauschen so verstärkt, daß Signalwerte
einen großen Bereich von Analog-Digital-Ä:krtwandlunspegelstufen abdecken können
und so gequantelte Daten mit Hilfe eines Mikroprozessors berechnet werden, um die
Dichte des Intensitätsspektrums zu messen. Aus der Dichte des Intensitätsspektrums
wird der Zustand der immunologischen Reaktion gemessen bzw. berechnettwie später
näher erläutert wird rund numerisch auf der Displayeinheit 20 angezeigt.
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Die Figuren 4 und 5 sind graphische Darstellungen , die Kurven des
Dichtespektrums zeigen, die erhalten werden, wenn Testflüssigkeiten mit dispergierten
Polystyrol-Latexteilchen mit Durchmessern von 0,188 pm bzw. 0,305 Mm in die in Fig.
1 gezeigte Zelle 7 eingebracht werden. Man erhält Kurven des Dichtespektrums vom
Lorentz Typ. Das zeigt die Interferenz-Komponente des Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen
des gestreuten Lichtes. Aus diesen
Kurven kann man erkennen, daß
die Kippfrequenz des Dichtespektrums umgekehrt proportional ist dem Teilchendurchmesser.
Wie oben erklärt, ist die Schwankung in der Intensität des gestreuten Lichtes eine
Summe der Komponente, die auf der Interferenz von kohärentem Licht beruht und der
Komponente, die auf der Veränderung der Anzahl der Teilchen innerhalb des streuenden
Volumens beruht. Bei der erfindungsgemäßen Arbeitsweise wird hauptsächlich die Komponente,
die auf der Interferenz beruht nachgewiesen. Dann ist die Kippfrequenz des Dichtespektrums,
die definiert ist durch die Frequenz an der Schulter der Dichtespektrums-Kurve1
gleich dem Kehrwert der Zeit, innerhalb derer sich die Aggregate über eine Distanz,
die gleich ist der Wellenlänge1 bewegen. Wenn der Durchmesser der Teilchenaggregate
zunimmt, wird die für die Bewegung erforderliche Zeit länger und damit die Kippfrequenz
niedriger.
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Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen
der Teilchengröße, die auf der Abszisse aufgetragen ist und der Kippfrequenz, die
auf der Ordinate aufgetragen ist, zeigt. Beide Koordinaten sind im logarithmischen
Maßstab. Für Teilchen mit einem Durchmesser von 0,0915 Hm wird eine Kippfrequenz
von etwa 400 Hz beobachtet, für Teilchen mit einem Durchmesser von 0,188 Mm eine
Kippfrequenz von etwa 200 Hz und für Teilchen mit einem Durchmesser von 0,305 Mm
eine Kippfrequenz von etwa 100 Hz. Wie aus der Fig. 6 deutlich hervorgeht, ist die
Kippfrequenz umgekehrt proportional dem Teilchendurchmesser und daher ist es durch
Nachweis der Änderung der Kippfrequenz während der immunologischen Reaktion möglich,
das Vorliegen von Agglutination der Teilchen aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion
und den Grad der Agglutination zu messen.
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Das heißt, wenn die Antigen-Antikörper-Reaktion in der
Zelle
7 stattfindet, werden feine Teilchen miteinander agglutiniert unter Bildung größerer
Aggregate und dadurch wird die Kippfrequenz niedriger.
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Die Figuren 7 und 8 zeigen Dichtespektrums-Kurven, die erhalten worden
sind mit Hilfe von Polystyrol-Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,3 pm,suspendiert
in einer Pufferlösung in Konzentrationen von 0,1 bzw. 0,09 Gew.-%.
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Beide Kurven sind vom Lorentz Typ. Wie oben erläutert ist die Schwankung
der Intensität des gestreuten Lichtes die Summe aus der Interferenz-Komponente aufgrund
der Brown'schen Bewegung der Teilchen und einer nicht-Interferenz-Komponente aufgrund
einer Veränderung der Anzahl von Teilchen in dem streuenden Volumen. Wenn die Anzahl
der Teilchen in dem streuenden Volumen klein ist, wird die Interferenz-Komponente
kleiner und vergleichbar mit der nicht-Interferenz-Komponente. Dann können andere
Komponenten als die Schwankung in der Intensität des gestreuten Lichtes aufgrund
der Brown'schen Bewegung der Teilchen nachgewiesen werden und die Antigen-Antikörper-Reaktion
kann nicht mehr genau gemessen werden. Daher sollte die Konzentration der Teilchen
so bestimmt werden, daß das einfallende Licht in dem streuenden Volumen ausreichend
stark ist und die Interferenz-Komponente größer wird als die nicht-Interferenz-Komponente.
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Fig. 9 zeigt die Beziehung zwischen der Anzahl der Teilchen in einem
mm3 und der relativen Schwankung
Wenn der Durchmesser eines streuenden Körpers konstant ist, wird die relative Streuung
auch über einen verhältnismäßig weiten Bereich der Teilchenkonzentration konstant.
Dies wird experimentell durch die in Fig. 9 gezeigte Kurve bestätigt.
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Die Figuren 10 und 11 zeigen Dichtespektrums-Kurven vor und nach (15
min) der Antigen-Antikörper-Reaktion. Diese Kurven wurden erhalten durch Dispergieren
von Polystyrol-Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,3 pm,an deren Oberfläche
Antiimmunglobulin G (anti-IgG) gebunden war in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert
von 7, die mit Tris-HCl eingestellt worden war1 und Zugabe von Immunoglobulin-G
zu der Suspension in einer Konzentration von 10 4 g/ml bzw. 10 -9 g/ml. Wie aus
Fig. 10 hervorgeht, war im Falle einer Antigen-Konzentration von 10 4 g/ml vor der
Reaktion die Kippfrequenz etwa 50 Hz und nach 15 min war sie auf 10 Hz gesunken.
Im Gegensatz dazu betrug die Kippfrequenz bei einer Antigen-Konzentration von 10
9 g/ml vor der Reaktion etwa 95 Hz und sank nach der Reaktion auf etwa 40 Hz. Daher
erhält man für das Verhältnis F der Kippfrequenz vor und nach der Reaktion die folgenden
Werte.
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F = Kippfrequenz vor der Reaktion Kippfrequenz nach der Reaktion
| Antigen- -4 10 |
| konzentration 10-4 10-7 10-8 10-9 |
| g/ml |
| 5,3 F 5,3 5,0 2,8 1,8 |
Die Beziehung zwischen dem Verhältnis F und der Antigen-Konzentration wird angegeben
durch die in Fig. 12 gezeigte Kurve. In Fig. 12 ist auf der Abszisse die Konzentration
an Antigen und auf der Ordinate das Verhältnis F der Kippfrequenzen angegeben. Auf
diese Weise kann erfindungsgemäß die Antigen-Konzentration gemessen werden durchBil-
dung
des Verhältnisses F der Kippfrequenz vor und nach der Reaktion.
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Aus den in den Figuren 10 und 11 gezeigten Kurven ist ferner zu erkennen,
daß das Verhältnis R der relativen Schwankungen vor und nach der Antigen-Reaktion
zusammenhängt mit der Antigen-Konzentration. Dies wird im folgenden näher erläutert.
In Fig. 1 wird das elektrische Ausgangssignal aus dem Fotodetektor 11, der das gestreute
Licht aufnimmt, durch ein Tiefpassfilter mit der folgenden Durchlaß funktion H(f)
geleitet,
wobei fc die Grenzfrequenz des Tiefpassfilters ist, die ausreichend niedriger ist
als die Kippfrequenz fr. Dann kann eine Veränderung der Schwankung des elektrischen
Ausgangsstroms I aus dem Tiefpassfilter folgendermaßen ausgedrückt werden <Cr12>
= K2 <N> + K2 <N? 2 f /f (4) wobei K eine Konstante ist und N die mittlere
Anzahl von Teilchen in dem streuenden Volumen. Daher kann eine relative Schwankung
in dem aus dem Tiefpassfilter austretenden Strom angegeben werden durch die folgende
Gleichung (5)
wobei 3teine Proportionalitätskonstante ist. Da angenommen werden kann, daß die
Anzahl der Teilchen in dem streuenden Volumen ausreichend groß ist, kann die Gleichung
(5) folgendermaßen geschrieben werden.
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Diese Gleichung zeigt, daß die relative Schwankung berechnet werden
kann durch Berechnung der Kippfrequenz f aus der Dichtespektrums-Kurve. Dann kann
das Verhältnis der relativen Schwankung angegeben werden durch die folgende Gleichung
(7).
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R - relative Schwankung nach der Reaktion (7) relative Schwankung
vor der Reaktion Fig. 13 zeigt die Beziehung zwischen dem Verhältnis R der relativen
Schwankung und der Antigen-Konzentration. Aus dieser Figur geht deutlich hervor,
daß die unbekannte Konzentration eines Antigens berechnet werden kann durch Bildung
des Verhältnis R der relativen Schwankung vor und nach der Antigen-Antikörper-Reaktion.
Das heißt vor der tatsächlichen Messung wird das Verhältnis R der relativen Schwankung
bestimmt durch Verwendung von Standardproben mit bekannten Antigen-Konzentrationen
zur Erstellung einer Eichkurve, die ähnlich der in Fig. 13 gezeigten Kurve ist.
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Dann wird das Verhältnis der relativen Schwankung für die Probe festgestellt
und die zu bestimmende Antigen-Konzentration aus der Eichkurve abgelesen.
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Das Verhältnis R der relativen Schwankung wie es durch Gleichung (7)
angegeben wird, kann berechnet werden als Verhältnis der integrierten Werte der
Dichtespektrums-Kurve in einem niedrigeren Frequenzbereich. Das heißt das Verhältnis
R der relativen Schwankung kann auch entsprechend der folgenden Gleichung berechnet
werden.
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integrierter Wert des Dichtespektrums nach der Reaktion (B) R = (8)
integrierter Wert des Dichtespektrums vor der Reaktion (A)
Wie
aus den Figuren 10 und 11 hervorgeht, werden die integrierten Werte A und B des
Dichtespektrums vor und nach der Reaktion erhalten durch Integration des Dichtespektrums
von 1 von 10 Hz bis 10 Hz. Daher ist der Tiefpassfilter so zusammengesetzt, daß
er diesen Frequenzbereich durchläßt.
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In den Figuren 10 und 11 ist das Verhältnis R der relativen Schwankung
angegeben als Verhältnis der integrierten Werte A und B des Dichtespektrums im niedrigeren
Frequenzbereich. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, das Verhältnis R der relativen
Schwankung bei einer bestimmten Fre-0 quenz im niedrigen Frequenzbereich, z.B. 10
Hz zu messen.
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In einem solchen Falle kann ein Digitalfilter anstelle des schellen
Fourier-Transformators angewandt werden und die gesamte Konstruktion kann sehr einfach
werden und die Bearbeitungszeit sehr kurz Wenn die Größe der Teilchenaggregate verhältnismäßig
gleichförmig ist, wird das Dichtespektrum vom Lorentz'Typ und nimmt ab umgekehrt
proportional zum Quadrat der Frequenz jenseits der Kippfrequenz. Wenn die Aggregatgröße
jedoch unterschiedlich ist, kann eine Überlagerung einer Vielzahl von Dichtespektrums-Kurven
vom Lorentz Typ mit unterschiedlichen Kippfrequenzen beobachtet werden und daher
nimmt die Dichte des Spektrums nicht mehr umgekehrt proportional zu der Frequenz
ab. Das bedeutet, daß eine Verteilung der Aggregatgröße aus einer Konfiguration
der Dichtespektrums-Kurve im höheren Frequenzbereich deutlich werden kann. Solche
Daten konnten nach bekannten Analyseverfahren nicht erhalten werden und sie sind
sehr wertvoll zur Analyse der Antigen-Antikörper-Reaktion.
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Bei der oben beschriebenen Arbeitsweise wurde Immunoglobulin G (IgG)
als zu bestimmendes Antigen verwendet, es
können jedoch auch beliebige
andere Substanzen wie Immunoglobulin A (IgA), IgM, IgD, IgE, Australia-Antigen und
Insulin, die zur Agglutination über eine Antigen-Antikörper-Reaktion führen, verwendet
werden. Ferner wurde bei der oben beschriebenen Arbeitsweise Antikörper an die Oberfläche
der Teilchen gebunden und Antigen in der Probe bestimmt.
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Es kann jedoch auch ein Antikörper in einer Probe bestimmt werden
unter Verwendung von Teilchen, an die Antigen gebunden ist. Ferner wurden bei der
oben beschriebenen Ausführungsform Polystyrol-Latexteilchen verwendet. Es können
jedoch auch beliebige andere organische und anorganische Teilchen wie Glasperlen
u.ä. verwendet werden. Darüber hinaus ist es möglich ,.teilchenförmige Substanzen
zu verwenden, die direkt durch Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet werden. Wenn
z.B. menschliches Villus Gonadotropin (HCG) als Antigen und anti-Sman-Villus-Gonadotropin
(Anti-HCG) als Antikörper verwendet wird, kann der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion
gebildete Komplex direkt als Teilchen verwendet werden. Ferner kann ein Antigen
selbst als Teilchen verwendet werden. Ein Beispiel für eine derartige Antigen-Antikörper-Reaktion
ist die Reaktion, bei der Candida albicans (Hefe) als Antigen und Anti-Candida albicans
als Antikörper verwendet wird. Darüber hinaus können Blutkörperchen, Zellen und
Mikroorganismen als Teilchen verwendet werden.
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Außerdem wird bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform die Messung
ansatzweise durchgeführt, wobei die zu untersuchenden Lösungen nacheinander in die
Zelle gegeben werden. Es kann jedoch auch kontinuierlich gearbeitet werden, wobei
die Antigen-Antikörper-Reaktionsflüssigkeit kontinuierlich durch die Zelle strömt.
Außerdem kann anstelle der beschriebenen Lichtquelle/ die einen Laser mit kohärenten
Licht aussendet, irgendeine beliebige Lichtquelle verwendet werden, die nicht kohärentes
Licht aussendet.
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Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das erfindungsgemäße
Verfahren und die dafür verwendete Vorrichtung zu den folgenden Vorteilen führen:
1) Da es nicht erforderlich ist, Reagentien wie Enzyme und Radioisotope zu verwenden,
die teuer und schwierig zu handhaben sind, kann die Analyse wirtschaftlich und leicht
durchgeführt werden.
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2) Da die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens höher ist als bei anderen immunologischen Analysen, die ohne Markierung
arbeiten, wie die Immuno-Elektrophorese, Immuno-Diffusion und-Sedimentation ist
es möglich, zuverlässige Meßergebnisse mit hoher Genauigkeit zu erhalten.
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3) Da die Messung durchgeführt wird durch Nachweis der Intensitätsschwankungen
des gestreuten Lichtes aufgrund der Brown'schen Bewegung der Teilchen ist es möglich,
genaue Messungen in kurzer Zeit durchzuführen selbst wenn die Menge der zu untersuchenden
Probe außerordentlich klein ist.
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4) Im Gegensatz zu dem bekannten Verfahren bei dem die mittlere Diffusionskonstante
aus derÄnderung der spektralen Breite des gestreuten Lichtes nachgewiesen wird,
ist erfindungsgemäß kein Spektrometer erforderlich. Daher kann die gesamte Meßvorrichtung
klein und billig gehalten werden und es ist ferner möglich, sehr genaue und zuverlässige
Meßergebnisse zu erzielen.
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5) Da die Messung auf dem Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen
der gestreuten Strahlung beruht, ist es möglich, viele wertvolle Informationen über
die Antigen-Antikörper-Reaktion zu erhalten.
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Der vorstehend verwendete Ausdruck "Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen
der gestreuten Strahlung" bedeutet das Dichtespektrum eines durch einen Fotodetektor,
der durch Teilchen gestreutes Licht empfängt, erzeugten Stromes.
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Aufgrund der Brown'schen Bewegung der Teilchen schwankt dieser Austrittsstrom.
Erfindungsgemäß wird das Dichtespektrum dieser Intensitätsschwankungen erzeugt.
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Das Dichtespektrum ist allgemein definiert durch die folgende Gleichung
in der jI2x(f, af) ein mittleres Quadrat in einer Zeitspannung zwischen f und f
+ auf ist und dieses mittlere Quadrat angegeben wird durch
Daher kann das Dichtespektrum beschrieben werden durch die Gleichung (2). Das Dichtespektrum
ist daher ein Maß für die Intensität zwischen f und f + f und hat daher die Dimension
(Amplidude)2/Frequenz, d.h.Ampere²/Hertz. Um die von der Lichtquelle herrührende
Schwankung auszuschalten, wurde das Dichtespektrum mitA?ere2 normiert. Das ergibt
die in den Figuren angewandte Einheit 1/Hertz.