DE2140322A1 - Neues Antibiotikum - Google Patents

Description

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft,I Basel/Schweiz

Neues Antibiotikum

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums durch Gärung, Isolierung und Reinigung, sowie seine Verwendung als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel. Das neue Antibiotikum unterscheidet sich von den bereits bekannten Antibiotika durch seine Wirkungen auf spezifische Bakterien in Verbindung mit seinen physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung des Antibiotikums X-5108 in reiner Form, in verdünnten Formen sowie als rohes Konzentrat. Das neue Antibiotikum ist wirksam gegen verschiedene Microorganismen wie gramm-positive und grammnegative Bakterien und bewirkt eine ausgeprägte Wachstumsförderung beim Geflügel, unabhängig davon, ob dieses Antibiotikum in roher oder in reinerer Form vorliegt.

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Das als Antibiotikum X-5108 bezeichnete neue Antibiotikum wird durch eine neue Spezies von Streptomyces, nämlich Streptomyces sp X-5108, erzeugt. Die neue Antibiotikum erzeugende Streptomycete wurde aus einer Bodenprobe, die in Bermuda gefunden wurde, isoliert. Eine lebensfähige Kultur des mit der Laborbezeichnung 'Streptomyces sp X-5IO8, Subkultur 3191-2" genannten Organismus wurde in der American Type Culture Collection Rockville, Maryland hinterlegt, wo diese Kultur der ATCC Sammlung unter der Registrierungsnummer 21386 beigefügt worden ist. Die hier beschriebene und als Streptomyces sp X-5108 bezeichnete Streptomyces Spezies umfasst alle Streptomycesstämme, die das Antibiotikum X-5108 erzeugen und die nicht eindeutig von dem Stamm ATCC 21386 und seiner Subkulturen, Mutanten und Varianten, unterschieden werden können. Die Bezeichnung "Mutant" bezieht sich auf Mutanten, die von dem beschriebenen Organismus auf verschiedenen Wegen hergestellt werden können, wie z.B. durch chemische,mutationsbeeinflussende Mittel, Ultravioletstrahlen, Röntgenstrahlen, Phagenaussetzung usw. Die Eigenschaften des Antibiotikums X-5108 werden hier beschrieben und in Kenntnis dieser Eigenschaften ist es leicht, diejenigen Stämme, die Antibiotikum X-5108 erzeugen, von den anderen zu unterscheiden.

Es folgt eine allgemeine Beschreibung des Organismus Streptomyces sp X-5108, ATCC 21386, die auf charakteristischen Eigenschaften, wie Wachstumsstärke, Farbe, Morphologie usw. basiert. Die Farbkennzeichnungen und die Farbfächerzuordnungen sind im allgemeinen diejenigen, die vom International Streptomyces Project (ISP): Shirling, E.B. and D. Gottlieb, ±966, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intl. J. Systematic Bact. l6: 313-340 vorgeschlagen worden sind. In der anschliessenden Beschreibung der charakteristischen Merkmale und der Morphologie wurden als Media diejenigen benützt, die durch Difco Laboratories für das ISP hergestellt wurden. Identifizierung und Zusammensetzung der Media sind in

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Tabelle 1 angegeben.

Die Parbenbezeichnungen stammen aus den folgenden vier Quellen:

ISCC-NBS U.S. Department of Commerce, 1955, "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names", National Bureau of Standards Circular 555, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C; Tresner, N.D. and E.J. Backus, 1965, "System of color wheels for streptomycete taxonomy," Appl.Microb.,11: 335-358; Eckerstrom, R. and CE. Poss, 1958, Color Harmony Manual, 4th Edition, Container Corporation of America, Chicago, Illinois} H. Prauser, 1964. "Aptness and Application of Colour Codes for Exact Description of Colours of Streptomycetes", Z. AlIg. Mikrobiologie, 4 (1): 95-98.

Stärke des Wachstums

Die Kultur erzeugt ein gut entwickeltes und verzweigtes Substratmycel und charakteristisches Luftmycel in vielen Media. Das submers wachsende Mycel weist eine erhobene, harte und grobe Oberfläche auf und ist, abhängig vom Nährmedium,farblos, gelb, gelb-braun oder olive-braun. Am Rande des Wachstums in Malzhefe-Agar-Extrakt (ISP Medium 2) befinden sich braun-schwarze Flecke.

Luftmycel und/oder en masse Sporenfarbe

Das Luftmycel ist massig entwickelt, besitzt eine samtartige Oberfläche und ist grau-weiss, hell (d) und mittel-grau (2 fe) und gelblich-grau (2 de) gefärbt, mit einem dünnen weissen Rand am Beginn des Wachstums. Die Luftmycelfarbe (Tresner-Backus Parbpalette) ist Gy in ISP Medium 2 bis W-gy in ISP Media 4 und 5· Es werden konzentrische Ringe erzeugt und es

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creten oft Kolonien auf. Der Farbton ordnet die Kultur den Grau-Serien zu (Pridham). In Tabelle 2 werden einige Eigenschaften des Streptomyces sp X-5IO8 mit denjenigen anderer Glieder der Grau-Serien verglichen.

Morphologie

Am Luftmycel gebildete Sporenketten verzweigen monopodisch und sympodisch und bilden gerade Ketten, Schlingen, Haken, langgezogene und unregelmässige Spiralen (3-4 Drehungen) oder sind besenartig angeordnet. Die Ketten können lang oder kurz sein, besitzen aber meistens mehr als 10 Sporen. In den meisten Media werden Sclerotia festgestellt. Die Sporen sind länglich oval _und von zylindrischer Form (phalangiform-Tresner). Wie durch Elektronenmikroskopie festgestellt wurde (Tomatenpaste-Agar, 10 Tage bei 28⁰C) ist die Sporenoberfläche glatt und ohne Ornamentierung.

Physiologie Lösliches Pigment

Spuren von braunem Pigment werden in Hefeextrakt-MaIzextrakt-Agar (ISP Medium 2) erzeugt, aber nicht in ISP Media 3, 4 und 5-

Farbe der Unterseite

Bei 7 bis 21 Tagen in ISP Media 2, 4 und 5 wird ein gelber bis gelb-brauner und grüner Farbton gebildet. In Dr. Prauser's Farbskala besitzen die in 7 Tagen erzeugten Farben der Unterseite die Bezeichnungen G 004b, Co 5m mit farblosem Rand (Medium 2), und Co 5a, Co 5b ( Media 4 und 5). Zusatz von Alkali oder Säuren verursacht keine Aenderung in der Farbe der Unterseite.

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Verschiedene physiologische Reaktionen

Die Kultur ist chromogen (liefert Melanin) in Pepton-Eisen- und Tyrosin-Agars, sowie in Trypton-Hefe extrakt- Brühe. In Tabelle 3 werden einige der Eigenschaften der Streptomyces sp X-5IO8 Kulturen angegeben. Nitrate in organischer Nitratbrühe werden nicht reduziert; Stärke wird aktiv hydrolisiert und Gelatine ist nach 14 Tagen nur sehr gering verflüssigt. In Tabelle 4 sind verschiedene andere physiologische Reaktionen des . Streptomycetes angegeben. Die Kohlenstoffquellenausnützung gemäss Pridham und Gottlieb [J. Bact., 56, 107-114 (1948)] ist wie folgt (11 Tage bei 28⁰C): gute Ausnützung von 1-Arabinose, d-Fructose, d-Mannit, 1-Rhamnose, d-Raffinose und Sukrose; schlechte Ausnützung von d-Xylose, i-Inosit und keine von Cellulose. Weitere Angaben bezüglich des Kohlenstoff-Stickstoff Ausnützungsverhalten der Streptomycete werden Tabelle 5 gegeben. Das Wachstum der Kultur ist gut zwischen 24°C bis J57°C, aber nicht gut bei 42°C oder 5O⁰C.

Auf Grund der Sporenornamentierung, der allgemeinen Morphologie und der Verzweigung der Sporophoren, der en masse Farben vieler Media und gewisser biochemischer und physiologischer Reaktionen, lässt sich schliessen, dass Streptomyces X-5IO8 sich von allen in der Literatur beschriebenen Kulturen der Grau-Serie unterscheidet.

Die Kultivierung des Microorganismus Streptomyces sp X-5IO8 zur Herstellung des gewünschten Antibiotikums X-5IO8 kann unter Benutzung verschiedener Gärungsmethoden durchgeführt werden» Im allgemeinen können folgende Grundmethoden im Flaschen- sowie im Gärkesselverfahren benützt werden. Bei der Flaschengärung wird eine Oese voll Sporen einer Schrag-Agar-Kultur in 100 ml Nährlösung, die in einem 500 ml Erlenmeyerkolben enthalten ist, eingeimpft und während 7 Tagen bei 28°C

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In einem Drehschüttler bebrütet. Am 3ten, 5ten und 7ten Tag werden aseptisch volle Brüheproben für in vitro Versuche gezogen. In gleicher Weise wird das Inokulum zur Erzeugung grösserer Volumina von Brühe zuerst in für Belüftung, Probenziehen usw. geeigneten 6 Liter Erlenmeyer Schüttelkolben oder 19 Liter Pyrexflaschen hergestellt. Anschliessend wird diese Brühe in Gärkessel überführt. Flaschen und Gärkessel werden mittels steriler Luft, die durch das Gärmedium geleitet wird, belüftet. In Kesseln wird eine zusätzliche Bewegung mittels mechanischer Rührer bewirkt. Um das Schäumen zu unterbinden, werden Antischaummittel wie Schweineschmalz, Sojabohnenöl usw. eingesetzt.

Streptomyces sp X-5IO8 kann in verschiedenen flüssigen Kulturmedia kultiviert werden. Besonders geeignete Media zur Herstellung des neuen Antibiotikums enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Stärke, Glucose, Melassen, u.dgl., eine assimilierbare Stickstoffquelle , wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Haisquellwasser, Ammoniumsalz, und anorganische Kationen und· Anionen, wie Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Sulfat, Phosphat, Chlor/usw. Spurenelemente,wie Kobalt, Kupfer, Eisen, Molybdän, Bor usw., " werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile den Media zugeführt .

Die Wirksamkeit des Antibiotikums X-5IO8 kann in vitro durch die Hemmzone gegen das gramm-positive Bakterium Bacillus E, in der gewöhnlichen 'cup-plate" Agar-Diffusion-Methode gemessen werden. Alternativ dazu kann auch das gramm-positive Bakterium Bacillus Simplex benützt werden. Beide Bakterien bilden Hemmzonen von ungefähr 20 mm mit einer willkürlich definierten 1 Einheit/rnl-Lösung. Bei dieser Versuchsmethode, wird eine Kultur des untersuchten-Microorganismus in einer Nährbrühe wie z.B. Trypticase Soja-Brühe während 24 bis ^Jf2 Stunden bei

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28°C in einem Drehschüttler kultiviert (100 ml Medium in einem 500 ml Erlenmeyerkolben). Man benützt eine Konzentration von 0,25 bis 0,5 Prozent, um die 4 ml Kernschicht anzuimpfen, welche auf 20 ml eines vorgehärteten Agar-Grundnährboden gegossen wird, der in einem 100 ml Becher oder einer verfügbaren Kunststoff-Petrischale enthalten ist. Bevor man die Schalen mit der Testlösung, welche das Antibiotikum enthält, füllt, werden sie während wenigstens zwei Stunden gekühlt. Man bebrütet dann die Schalen während 18 Stunden bei 35°C und misst den Zonedurchmesser mit einer Genauigkeit von 0,5 mm. Anschliessend werden die Wirksamkeiten aus Standardkurven in Einheiten pro ml berechnet.

Die bevorzugten Media und die Antibiotikumsausbeuten, die sie in der Schüttelflasehe undim belüfteten Gärkessel zur Folge haben, sind in den Tabellen 6 bis 9 angegeben. Die in diesen Tabellen zusammengefassten Daten zeigen, dass komplexe stickstoffhaltige Stoffe von verschiedenen Quellen die Antibiotikumbildung fördern, wie z.B. Pflanzenmaterial (Sojabohnen oder Baumwollsamenmehl, Hafermehl, Tomatenpaste, lösliche Rückstände von der Maisgärung); tierische Stoffe (Fischmehl, Fleischmehlauszug, Aminosäurehydrolysat) und mikrobiologisches Zellmaterial (Torulahefe).

Zahlreiche Kohlenstoffquellen erlauben ein gutes Wachstum und Antibiotilcumbildung, wie z.B., Glukose, Glycerin, Dextrin und Maisstärke. Zusätzlich zu den in natürlichen Media stets anwesenden anorganischen Salzen kann manchmal das Beifügen von Salzen,wie Kaliumphosphat, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, oder Spurenelement en das Wachstum und die Antibiotikum ausbeute steigern (abhängig von den Bestandteilen, die sich schon im Grundmedium befinden). Eines der bevorzugten Media für die Herstellung, von Antibiotikum X-5IO8 in grossen Gärkesseln enthält 1 Prozent entfettetes Baumwollsamenmehl, 0,5 Prozent Konzentrat von Maisquellwasser, 1 Prozent Maisstärke,

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0,1 Prozent KpHPCK und 0,1 Prozent Calciumcarbonat.

Streptomyces sp X-5108 wachsen auch gut und erzeugen Antibiotikum in gewissen chemisch definierten synthetischen Media mit Ammoniumsalzen, Nitraten oder Aminosäuren (Glutamat, Arginin, Glycin) als Stickstoffquellen, mit Glukose, Dextrin, Stärke, Citrat, Acetat u.dgl. als Kohlenstoffquellen, ergänzt mit Salzen ,wie Kaliumphosphat, Calciumcarbonat und Magnesiumsulfat, und mit Spurenelementen, die Pe ,Cu ,Mn , Co und Zn enthalten. Die Ergebnisse der Gärung von Streptomyces sp X-5108 in verschiedenen synthetischen Media sind in Tabelle angegeben. Wie aus Tabelle 10 hervorgeht, sind im allgemeinen die Antibiotikumsausbeuten in synthetischen Media nicht so hoch wie in komplexen stickstoffhaltigen Media.

Die Herstellung des Antibiotikums X-5108 wird durch eine starke Belüftung des Gärungsmediums erhöht. Zusätzlich kann die Herstellung des Antibiotikums X-5108 bei irgend einer Temperatur, die ein befriedigendes Wachstum des Microorganisrnus fördert, stattfinden. Zum Beispiel wurde Streptomyces sp X-5108

bei 24°, 28°, 30° und 32°c in Schüttelflaschen kultiviert. Die Prüfung auf gebildetes Antibiotikum nach 3, 4, 5 und 6 Tagen zeigt, dass bei irgend einer Temperatur zwischen 24 bis 32^OC ungefähr dieselbe maximale Ausbeute erreicht werden konnte. Jedoch wurde die maximale Ausbeute bei 3O⁰C und 32⁰C in 3-4 Tagen erreicht, während man 4 Tage bei 28°C und 5-6 Tagen bei 24°C brauchte. Gewöhnlich liegt die optimale Herstellungszeit des Antibiotikums X-5108 zwischen 2 bis 10 Tagen. Während der Gärung bleibt normalerweise das Gärungsmedium annähernd neutral oder etwas sauer. Der sich schliesslich einstellende pH-Wert ist teils vom anwesenden Puffer und teils vom anfänglichen pH-Wert des Mediums, v/elcher vorzugsweise vor der Sterilisation annähernd neutral ist, abhängig.

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Wenn die Gärung vollendet ist, können verschiedene Methoden benützt werden., um das Antibiotikum X-5IO8 zu isolieren und zu reinigen.Geeignete Isolations- und Reinigungsmethoden umfassen die Lösungsmittelextraktionsmethoden, wie z.B. die Extraktion in Portionen oder in flüssig-flüssig Extraktionskolonnen, die unter kontinuierlicher Gegenstromverteilung arbeiten, und die Gelpermeationchromatographie in einem nichtwässerigen System.

In einem bevorzugten Verfahren erhält man das Antibiotikum X-5IO8 aus dem Kulturmedium durch Abtrennung des Mycels und der ungelösten Peststoffe von der Gärbrühe mittels üblicher Methoden ,wie Filtrierung oder Zentrifugierung, Das Antibiotikum X-5IO8 wird dann aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe extrahiert durch portionsweise Extraktion oder Extraktion mittels Gegenstromverteilung. Die Lösungsmittelextraktion kann in einem pH-Bereich von 3 bis 7*5 durchgeführt werden. Als Lösungsmittel werden wasserunlösliche Ester ,wie A'ethylacetat, Amylacetat, Butylacetat und ähnliche aliphatische Ester, wobei Butylacetat bevorzugt wird, benützt. Eine bevorzugte Lösungsmittelkombination für die unter Gegenstromverteilung arbeitende Reinigungsmethode besteht aus einer Mischung von Aethylacetat, Isopropanol und einer 0,1 M wässerigen sekundären Natriumphosphatlösung.

Die letzte Reinigung des Antibiotikums X-5IO8 kann durch Gelpermeationschromatographie erreicht werden. Diese Reinigungsmethode kann durch Adsorption von vorgereinigten Zubereitungen des Antibiotikums, wie z.B. durch Lösungsmittelextraktionsmethoden erhaltene Zubereitungen, an quervernptzt^n oder polymerisierten Dextrangelen durchgeführt werden. In einem bevorzugten Aspekt dieser letzten Reinigungsmethode wird die vorgereinigte antibiotische Zubereitung an Sephadex LH-20 chromato- , graphiert unter Eluierung mit Alkohol.

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Nach der Filtrierung oder der Zentrifugierung des Gärmediums können Dünnschicht- oder Papierchromatographiemethoden zur Analyse des Antibiotikums X-5IO8 angewendet werden. Wegen der Farbcharakteristika des Antibiotikums, können die Flecken durch die Fluoreszenzmethode sichtbar gemacht werden; zusätzlich kann auch mit Vorteil die Bioautographie benützt werden. Die Chromatographie kann an Papier durchgeführt werden, wird aber vorzugsweise an Silikagel-Glasplatten vorgenommen. Das für die Dünnschi cht ehr ornat ogr amme benützte Lösungsmittelsystem besteht aus Chloroform, Methanol und wässerigem Ammoniumhydroxyd .

Das neue erfindungsgemässe Antibiotikum X-5108 besteht nach Reinigung aus einer gelben amorphen Substanz. Kationische Salze des Antibiotikums können hergestellt werden, indem man dem Antibiotikum X-5108 eine physiologisch geeignete anorganische oder organische Base zusetzt. Zu den Salzen des Antibiotikums X-5108, die hergestellt werden können, gehören die Alkalimetallsalze ,wie die Natrium- und Kaliurnsalze, und Erdalkalimetallsalze,wie das Calciumsalz,

Diese Salze können erzeugt werden, indem man wässerige Lösungen von Alkalimetall- und Erdalkalimetallhydroxyden benützt. Demgemäss bilden Lösungen des Antibiotikums X-5103 in wässerigem Natriumhydroxyd, wässerigem Kaliumhyiroxyd oder Calciumhydroxyd die Natrium -,Kalium- bzw. Calciumsalze. Diese Salze dienen denselben biologischen Zwecken wie das Antibiotikum selbst. Weil die Salzlösungen des Antibiotikums X-5108, besonders das Natriumsalz, viel stabiler sind als die Lösungen des Antibiotikums, das nicht in Salzform vorliegt, ist es vorzuziehen, leicht alkalische Puffer für die Reinigung durch Gegenstromverteilung zu verwenden und ammoniakalische Lösungsmittelmischungen für die DünnschichtChromatographie zu benützen, wobei man auf diese Art die Konzentration des Antibiotikums

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in der Lösung auf ein Minimum herabsetzt.

Das Antibiotikum enthält die Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff in den folgenden Gewichtsprozenten:

Antibiotikum X-5108 Natriumsalz

Kohlenstoff	63.63	61.48
Wasserstoff	7.8I	7.81
Stickstoff	3.48	3.32
Sauerstoff (durch
Differenz)	25.08	24.45
Natrium		2.94

Das Antibiotikum X-5108 ist lö.slich in Alkoholen ,wie z.B. Methanol, Aethanol, 1- und 2-Propanol und tert.-Butyl-Alkohol,in mit Wasser nicht mischbaren Estern, wie z.B. Aethylacetat, Amylacetat, Butylacetat und ähnlichen aliphatischen Estern, und Chloroform. Das Antibiotikum ist unlöslich in Wasser. Das Natriumsalz des Antibiotikums X-5108 ist löslich in Wasser, in niederen Alkoholen,wie Methanol, Aethanol, Isopropanol und Butanol, und N,N-Dimethylformamid ist leicht löslich in Amylalkohol, Tetrahydrofuran und Dioxan, ist sehr leicht löslich in Aceton, Amylacetat, Butylacetat und Aethylacetat und ist unlöslich in Benzol, Chloroform und Aethyläther.

Nachstehend werden verschiedene physikalische Eigenschaften des Antibiotikums X-5108 angegeben:

Die optische Drehung des Natriumsalzes vom Antibiotikum X-51OÖ ist [cc]q⁵ = -82,d (Aethanol, c = 0,52).

- Das IR-Absorptionsspektrum des Antibiotikums X-5103 209 8 08/200 6

in einer KBr Pille wird im Spektrum 1 dargestellt.' Das Antibiotikum zeigt eine charakteristische Absorption im Infrarotbereich des Spektrums bei den folgenden Wellenlängen, die in cm~ ausgedrückt sind:

Breite Bande bei 3400,
Starke Bande bei l66o,
Breite Bande bei I58O,
Wichtige Banden bei I58O, I38O, 1250, 1100, 1040 und 995·

Das IR Absorptionsspektrum des Natriumsalzes vom Antibiotikum X-5108 in einer KBr Pille wird im Spektrum 2 dargestellt. Das Natriumsalz zeigt eine charakteristische Absorption im InCrarotbereich des Spektrums bei den folgenden in cm~ ausgedrückten Wellenlängen:

Breite Bande bei 3400,

Wichtige Banden bei 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 und

1000.

Das UV Absorptionsspektrum des Antibiotikums X-5108 bei verschiedenen pH Werten wird im Spektrum 3 dargestellt. Im UV Spektrum erscheinen Maxima bei:

0.1 N HOl i * _max 33t η,μ (E^_m = 403)

■ ^61O)

- 206 -μ (E^_m ... 500)

pH 7 Puffer: (isopropanol/KgHPO	2098	08	max max	327 231	πΐμ mμ	(Elcm ν lcm	= 423) = 660)
0.1 N KOH:		max	327	ΤΛμ	v lcm	= 416)
		max	231	mμ	(Elcm	- 647)
	/20	06

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Das magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums X-5IO8 wird im Spektrum 4 gezeigt. Das Spektrum wurde unter Benützung von CDCl, als Lösungsmittel und Tetramethylsylan (TMS) als interner Standard aufgenommen. Das Spektrum zeigt wichtige Signale bei 0,92 £ , im Bereich zwischen 1,66 und bei 3jl6 und 3,43 ^und im olefinischen Bereich.

Wie in Tabelle 11 gezeigt, besitzt das Antibiotikum X-5IO8 ein breites antimikrobielles Spektrum. Es wurde durch die bereits beschriebenen "cup-plate" Agar-Diffusion Methode bestimmt.

Das Antibiotikum X-5108 zeigt eine geringe orale und parenterale Toxizität, eine ausgeprägte Wirksamkeit gegen Streptoeoccen sowohl systemisch (oraler Weg) als auch lokal (subkutaner Weg), Aktivität gegen Pneumococcen und in Caecal Coccidiose. In Mäusen ist das Antibiotikum oral und subkutan relativ atoxisch

₀ Werte =>2000 bzw. 1320 mg/kg). Das Antibiotikum ist oral ₅₀ = 52 mg/kg) und subkutan (CD₅₀ = 44 mg/kg) aktiv gegen Streptococcus pyogenes, gegen Diplococcus pneumoniae 807 mg/kg p.o. und 283 mg/kg sbc) sowie gegen die gramm-negative Proteus vulgaris Infektion.

Das Antibiotikum X-5108 bewirkt eine Steigerung des Geflügelwachstums und verursacht eine Erhöhung des Futternutzeffekts bei Tieren. Dementsprechend wird gemäss einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung das Antibiotikum X-5108 als aktiver Bestandteil neuer und nützlicher Präparate angesetzt, welche nach Verfütterung an Geflügel ein schnelleres Wachstum und eine erhöhte Putterausnützung zur Folge haben. Die Verabreichung dieser Präparate wird gewährleistet, indem man ernährungstechnisch ausgewogenes Geflügelfutter herstellt, das sowohl die an.ein Tiernahrungsmittel gestellte Anforderungen erfüllt, als auch die Zufuhr des Antibiotikums X-5108 als wachstumsförderndes Mittel bewirkt.

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Wenn das Antibiotikum zur Herstellung von Wachstumsfördernden Präparaten benützt wird, verwendet man als antibiotischen Bestandteil entweder das Antibiotikum selbst oder irgend ein physiologisch geeignetes kationisches Salz davon, vorzugsweise das Natriumsalz. In den folgenden Ausführungen betrifft die Bezeichnung Antibiotikum X-5108 das Antibiotikum X-51OÖ selbst sowie dessen physiologisch geeignete . kationischen Salze

Die wachstumsfördernden erfindungsgemässen Präparate, welche das Antibiotikum X-5108 als aktive© Bestandteil enthalten, können durch verschiedene Methoden hergestellt werden. Gemäss einer dieser Methoden wird das Antibiotikum direkt einem essbaren nicht-toxischen Träger zugegeben. Vorzugsweise ist der Träger eine für die Geflügelernährung wertvolle Substanz, wobei Geflügelfutter mit grosser Nährungskraft besonders bevorzugt ist. Falls das Antibiotikum dem Putter direkt zugegeben wird, kann das Vermischen nach bekannten Methoden durchgeführt werden. Zum Beispiel werden die das Geflügelfutter bildenden Nahrungsmittel entweder einzeln oder gesamthaft in eine Mischvorrichtung eingeführt und das Antibiotikum zugefügt. Man mischt ,bis das Produkt die Bestandteile in gleichmässiger Verteilung enthält.

Die als Geflügelfutter verwendeten und zum Zwecke dieser Erfindung als Träger für das Antibiotikum X-5108 benützten Nahrungsmitteln können verschiedenartig sein in Abhängigkeit von den spezifischen Bedürfnissen der gefütterten Geflügelart und von der Verwendung dieser Tiere.Jedoch enthalten diese Putter meistens Proteirfe, wie Fischmehl, Sojabohnenmehl, Mais, Erdnussprodukte und dergleichen, und Kohlehydratquellen, wie Getreide, grobes und feines Mehl, Zucker und dergleichen. Zusätzlich können die Mineral- und Vitaminbedürfnisse derrTiere; . durch Zufügen von Mineralien, wie Natrium-,Kalium-; Magnesium*?^ >;■ Calciumcarbonat usw. und Vitaminen ,wie Vitamin A, Bj~, D und;"· ^r Thiamine, zum Putter gewährleistet werden. Das Futter kann na- -, türlich noch andere übliche Futterzusätze enthalten. :- -

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In einer bevorzugten Methode zur Herstellung der erfindungsgemässen wachstumsfördernden Präparate wird der aktive Bestandteil, das Antibiotikum X-5IO8, in eine konzentrierte Vormischung eingearbeitet, welche dann dem Gefliigelfutter zugegeben werden kann. Bei der Herstellung einer Vormischung in fester Form, welche das Antibiotikum X-5IO8 enthält, kann jeder geeignete Träger oder Zusatzstoff als inerter Bestandteil dienen, vorausgesetzt, dass er dem antibiotischen Zusatz gegenüber inert ist und auf das Geflügel, dass das Putter erhält, nicht-toxisch wirkt. Viele feste Stoffe erfüllen diese Anforderungen und können deshalb für den Zweck der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Repräsentative Vertreter solcher Peststoffe sind Mineralienquellen,wie gemahlene Muscheln, essbare Getreidearten, im Handel befindliche Tierernährungsstoffe aus Pflanzen, dem Meer oder Tieren, Maismehl, Zitrusmehl, Sojabohnenmehl, Fischmehl, Fleischreste, getrocknete Gärungsreste und dergleichen.

Das Antibiotikum X-5IO8 kann mit einem oder mehreren der vorstehend erwähnten Stoffen zu einem Brei, in Körnchenform, oder irgend eine gewünschte Verabreichungsform mittels jeder bekannten und geeigneten Methode verarbeitet werden. Das Präparat kann z.B. durch feine Zerteilung oder durch Pulverisierung der aktiven und inerten Bestandteile mittels eines im Handel vorhandenen Mählwerkzeug^Sergestellt werden. Wenn der Futterbestandteil nicht bereits beim Mahlen oder beim Pulverisieren vorliegt, kann das entstehende Präparat in irgend ein geeignetes Futtermittel eingebracht werden.

Die Menge des Antibiotikums, welche nötig ist, um die gewünschte Wachstumsförderung bzw. Erhöhung des Futternutzeffektes zu bewirken, kann innerhalb der weiter unten angegebenen Werte schwanken. Wenn das erfindungsgemässe Präparat zur Wachstumsförderung benützt wird, enthält es vorzugsweise einen Geflügelfutterzusatz mit 0,0001 bis 0,01 Gewichtsteile der

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Aktivsubstanz, d.h. des AntibiotikumsX-5108 oder eines physiologisch geeigneten Salzen davon, pro 100 Gewichtsteile Futter. Konzentrationen des Antibiotikums X-5108, die höher sind als 0,01 Gewichtsteile pro 100 Gewichtsteile Putter verursachen im allgemeinen keine besseren Wirkungen als diejenigen, die mit einer Konzentration von 0,01 Gewichtsteile pro 100 Gewichtsteilen Futter erhalten werden. Dementsprechend ist es nicht vorteilhaft, Mengen von aktiven Bestandteilen zu benützen, die grosser sind als 0,01 Gewichtsteile pro 100 Gewichtsteile Putter. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht Jk das neue wachstumsfördernde Präparat in einem Geflügelfutterzusatz mit 0,0005 bis 0,0025 Gewichtsteile des aktiven Bestandteils Antibiotikum X-5108 pro 100 Gewichtsteile Putter.

Wie bereits erwähnt, umfasst das bevorzugte Verfahren der Erfindung die Herstellung einer konzentrierten Vormischung, die als aktiven Bestandteil das Antibiotikum X-5108 enthält. Die Herstellung einer Vormischung, welche später dem Futter zugegeben werden kann, stellt eine geeignete Methode dar, um das wachstumsfördernde Präparat einzusetzen und sichert eine gute Verteilung des aktiven Bestandteils im Futter. Die Menge von Antibiotikum X-5108, die in der Vormischung vorhanden ist, " ist für die Durchführung der Erfindung nicht kritisch. Das Ziel der Erfindung wird, unabhängig vom Gehalt des Antibiotikums X-5108 in der Vormischung, dadurch erreicht, dass man eine Menge der Vormischung benützt, die fähig ist, ein verabreichbares Futter zu erzeugen, welches einen oben erwähnten wirksamen Gehalt an Antibiotikum X^51O8 besitzt. Die Vormischung ' ist eine geeignete Art, das Präparat dem Futterhersteller oder dem Geflügelzüchter zu liefern, wobei dieser dann angemessene Mengen der Vormischung mit dem vorhandenen Geflügelfutter mischen kann, um ein verabreichbares Futter zu erzeugen, welches einen wirksamen Gehalt an Antibiotikum X-5108 besitzt.

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Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung* Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentzahlen auf Gewichtsverhältnisse. Die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben«

Beispiel. 1 Gärung von Streptomyces sp X-510.8

Eine Sporensuspension von Streptomyces sp X~51O8 aus einer Agar-Sehräg-Kultur wird in eine belüftete 20 Liter Pyrexflasche eingeimpft, welche 15 Liter Nährmedium der folgenden Zusammensetzung enthalt:

1$ Sojabohnenmehl
1$ brauner Zucker
0,25$ getrockneter Rückstand von Maisquellwasser

0,1$ ₃

0,5$ Schweineschmalz als Antischaummittel.

Nach vier Tagen Wachstum bei 28° unter Belüftung wird das faserige Wachstum in einen]58O Liter Gärkessel aus rostfreiem Stahl, welcher 230 Liter Nährmedium der folgenden Zu-. sammensetzung enthält, überführt:

1$ entfettetes Baumwollsamenmehl (ProfIo) 1$ Maisstärke

0,25$ getrockneter Rückstand von Maisquellwasser 0,1$ CaCO,

0,1$ K₂HPO₄

und Schweineschmalz als Antischaummittel.

Vor der Einimpfung wird der pH-Wert des Mediums auf 6,8 eingestellt. Der Kessel wird belüftet und man lässt das

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Wachstum .sich während 5 Tagen entwickeln. Anschliessend wird der Inhalt des Gärungskessels mit Hilfe einer Diatomeenerde (Hyflo Filter Cell) filtriert. Das Filtrat wird auf pH 3,5 eingestellt und mit anderthalb Volumxia Butylacetat extrahiert. Der klare Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 4o° zu einem braunen Sirup eingeengt, welcher nach Behandlung mit Petroläther das Antibiotikum X-5108 in Form eines festen Puders ergibt mit einer Wirksamkeit von 120 Einheiten Bacillus E pro mg.

Beispiel 2

Reinigung des Antibiotikums X-5108 durch portionsweise Lösungsmittelextraktion

Die portionsweise Lösungsmittelextraktion wird mit 11 Liter Gärungsanteilen durchgeführt, die in vitro eine Wirksamkeit gegen B* Simplex von 130 Einheiten/ml aufweisen. Die filtrierte Brühe wird mit Butylacetat bei pH 7,5 extrahiert. Der organische Extrakt wird mit Wasser gewaschen, auf Temperaturen unterhalb 50° sehr schnell eingeengt^ und zu der erhaltenen wasserfreien Lösung wird Diäthylnatriummalonat zugefügt, um den pH-Wert auf 9,0 zu bringen. Der gebildete gelbe Niederschlag wird filtriert und mit Butylacetat gewaschen. Er wird dann zwischen Wasser und Butylacetat verteilt und der pH-V/ert auf 4 eingestellt. Die organische Phase wird getrennt und wie oben erwähnt behandelt, mit der Ausnahme, dass Diäthylnatriummalonat zugefügt wird, bis pH 8,5 erreicht wird. Dieser zweite Niederschlag wird nochmals angesäuert und mit frischem Butylacetat extrahiert. Der Extrakt wird dann mit Darco G-6o behandelt, und das Natriumsalz des Antibiotikums X-5108 wird schliesslich, durch Zugabe von Diäthylnatriummalonat, bis der pH-Wert 8,0 erreicht ist, gefällt . Das auf diese Weise erhaltene gelbe Natriumsalz weist nach Waschen und Trocknen eine Wirksamkeit gegen B. Simplex von 430 Einheiten/mg auf. Die oben erwähnte Extraktionj

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2U0322

methode wird im folgenden Isolierungsschema zusammengefasst: Isolierungsschema des Antibiotikums X-5108

Stufe 1

Stufe 2

Stufe 3

Stufe 4

II3OO Liter vollständiger Brühe (5-6 Tageausbeute) JMan filtriert die Zellen mit Hilfe von Hyflo

98OO Liter filtrierte Brühe (pH 7,5) !(Wenn nötig stellt man den pH mit H₃PO₂, ein); φ Man extrahiert mit 2J5OO Liter Butyiacetat

2200 Liter "1. Butylacetat"

JMan wäscht zweimal mit 94 Liter Wasser;

IMan engt sehr schnell ein

300 Liter "1. Butylacetat-Konzentrat"

Man gibt Diäthylnatriummalonat zu, bis der pH 9 erreicht ist (ca. 1 bis 1,5 Liter von 1,7 N); Man filtriert den Niederschlag und wäscht mit 4 Liter Butylacetat

Stufe 5

¹¹1. Niederschlag"

Man löst in 94 Liter Wasser, stellt den pH mit

5^iger Phosphorsäure auf 4 ein; Man extrahiert zweimal mit Butylacetat (75+38 Liter)

Stufe 6

102 Liter "2. Butylacetat"

Man wäscht zweimal mit je 8 Liter Wasser; Man engt sehr schnell ein

15 Liter "2. Butylacetat-Konzentrat"

Stufe 7 JMan gibt Diäthylnatriummalonat zu bis zum pH 3,5J {Man filtriert den Niederschlag und wascht mit 4 Liter Butylaeetat

Stufe 8

'2. Niederschlag'

Man löst in 76 Liter Wasser und stellt den pH-Wert

mit 15$iger Phosphorsäure auf 5 ein;

Man extrahiert zweimal mit Butylacetat (57+28 Liter)

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2U0322

Stufe 9

79 Liter "?. Butylacetat"

Man wäscht zweimal mit 8 Liter Wasser;

Man engt sehr schnell ein

15 Liter "J>. Butylacetat-Konzentrat"

Stufe 10 Man rührt mit 50 g Darco G-βθ während 1 Stunde bei Raumtemperatur;
Man filtriert und engt sehr schnell ein

8 Liter " 4.Butylacetat"

Stufe 11 Man gibt Diäthylnatriummalonat zu, bis der pH 5,0 ist;

Man filtriert den Niederschlag, wäscht mit 4 Liter Butylacetat, dann mit 4 Liter Petroläther (30-60°), man trocknet bei 56° und 0,5 mm während 36 Stunden

Natriumsalz des Antibiotikum X-5108 als gelber amorpher Peststoff.

Beispiel 3

Reinigung von Antibiotikum X-5108 durch Gegenstromverteilung Apparatur:

Zahl der Röhrchen 200

Volumen der oberen

Phase 40 ml

Volumen der unteren

Phase 40 ml

Beladung;

g des Antibiotikums X-5108,erhalten durch Lösungsmittelextraktion der rohen Gärungsbrühe, in 40 ml der oberen Phase gelöst.

Lösungsmittelsystem:

Aethylacetat, Isopropanol, wässerige 0,1 M sekundäre Natriumphosphatlösung 12:9:20 V/V.

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Verteilungscharakteristika

Zahl der Ueberführungen 200

Röhrchen mit maximaler Konzentration nach 200 Ueberführungen 159

Verteilungsverhältnis 3,88

Verfahren;

Die Fraktionen 15O-I7O werden vereinigt und 1- Butanol wird zugefügt, um das Antibiotikum in die organische Phase zu extrahieren. Die wässerige Phase wird verworfen, und die organische Phase viermal mit Wasser gewaschen. Schliesslich wird das Wasser azeotropisch entfernt und das Produkt durch Beifügung von Petrol .äther gefällt. Es werden 3 g der anti-

biotischen Substanz erhalten mit einer biologischen Wirksamkeit, die zweimal grosser ist als die des. Ausgangsprodukts,

Beispiel 4

Reinigung des Antibiotikums X-5108 durch Chromatographie an Sephadex IH-20

Eine äthanolische Lösung von 300 mg einer bereits durch Gegenstromverteilung gereinigte Probe des Antibiotikums wird durch eine Natriummethoxydlösung auf pH 8-9 eingestellt (angefeuchtetes Indikatorpapier) und auf eine «uvor mit J5A Alkohol äquilibrierte Sephadex LH-20 Kolonne (290 χ 4l mm) gebracht. Die Kolonne wird mit 3A Alkohol eluiert, wobei die das Antibiotikum enthaltene Hauptzone bei einem Auslaufvolumen von 950-1200 ml auftritt. Die nächsten Fraktionen enthalten mehrere gefärbte Zonen mit geringer biologischen Aktivität. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zu einem Konzentrat eingeengt, welchem Aether und Petroläther zugefügt werden, um das Antibiotikum zu fällen. Der erhaltene gelbe Feststoff, d.h. das Natriumsalz des Antibiotikums X-5108, zeigt nur einen Fleck

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im Dünnschichtehromatogramm, R„ = 0,19 (Silicagel F-254,Nachweis durch U.V. Licht) und R_f =
Nachweis durch Bioautographie).

weis durch U.V. Licht) und R_f = 0,29 (Siüeagel/Kieselguhr,

Beispiel 5 Herstellung des Antibiotikums X-5108 aus dem Natriumsalz

0,464 g des durch Chromatographie an Sephadex LH-20 erhaltenen Natriumsalzes des Antibiotikums X-5108 werden in 4,6 ml

fc Eiswasser gelöst, worauf 10 ml Aethylacetat zugefügt v/erden, um ein 2-Phasensystem zu bilden. Zu dieser in einem Scheidetrichter enthaltene Mischung wird 1 ml primäre Natriumphosphatlösung (50 g NaHpPOj^H₂O in 100 ml Wasser) zugefügt. Der am Anfang sich bildende Niederschlag wird durch Schütteln gelöst. Die wässerige Phase, wird ausgeschieden und die organische Phase wird viermal mit je einem Volumteil Eiswasser gewaschen,und das Wasser wird azeotropisch entfernt. Das Konzentrat (2 ml) wird mit zwei Volumteilen Aethylacetat verdünnt, und Diäthyläther wird tropfenweise bis zur Trübung zugegeben . Sehliesslich werden JO ml Petroläther zugefügt. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert und ergibt nach Trocknen bei Raumtempera-

W tür das Antibiotikum X-5108.

Beispiel 6

Messung der wachstumsfördernden Wirkungen des Antibiotikums X-5108 _s

Man stellt ein Grundnährungsmittel her, welches die folgenden Bestandteile in den nachstehend angegebenen Mengen enthält:

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' Gewichtsprozente

Gemahlener gelber Mais 56,075

Fleisch und Knochenmehl (50$ Protein) 4,000

Fischmehl (6o# Protein) 4,000

Sojabohnenmehl (50$ Protein) 28,000

Entwässertes Alfalfamehl 1,000

Tierfett 4,000

Methionin 0,200

Kaliumphosphat 0,250

Calciumcarbonat 1,200

Jodsalz 0,250

Vitaminzusatz 1,000

Zusätzliche Mineralienspuren 0,025

Zu diesem Nahrungsmittel wird Antibiotikum X-5108 in einem Verhältnis von 50 mg Antibiotikum pro kg Ration zugegeben.

Die Wachstumsfördernde Wirkung des Antibiotikums X-5108 wird dadurch festgestellt, dass man Geflügel erlaubt ad libitum das Nahrungsmittel mit antibiotischem Zusatz zu fressen. Man benützt einen Tag alte Cornish Brathuhnkücken beiderlei Geschlechts. Im Test werden 10 Hühner (5 männliche und 5 weibliche) pro Versuchsgruppe eingesetzt. Es wurde Vorsorge getroffen, dass das Ergebnis beeinflussende Faktoren, wie Licht, Heizung, Lage ausgeglichen werden. Die Tiere werden während 2 Wochen beobachtet, wobei das Gesamtgewicht jeder Gruppe mehrmals während dieser Periode festgestellt wird, und die einzelnen Gewichte am Ende der 14 Tage gemessen werden. Der Futterverbrauch wird festgehalten,und die Steigerung des Futternutzeffekts wird im Vergleich zur Kontrollgruppe berechnet.

Gleichzeitig wird ein Kontrollversuch in der oben beschriebenen V/eise durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, dass man den Hühnern, die in der Kontrollgruppe benützt werden,

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erlaubt ad libitum an einem Nahrungsmittel zu fressen, welches dieselbe Nahrungsbestandteile aber keinen Zusatz von Antibiotikum X-5108 enthält.

Die durchschnittliche Zunahme für jede Versuchsgruppe wird durch die durchschnittliche Zunahme der Kontrollgruppe dividiert und der Quotient wird mit 100 multipliziert, wobei sich eine prozentuale Gewichtszunahme ergibt. Die Zunahme ist der Unterschied zwischen dem Körpergewicht des Huhns am Ende des 2 Wochenversuchs und dem Körpergewicht im Alter von 1 Tag.

(Durchsch.Endgew.-Durchsch♦Anfangsgew.d .Versuchsgr.)

■ ■' ' ' X. J-OO =

(Durchsch.Endgew.-Durchsch.Anfangsgew.d.Kontrollgr.)

5 prozentuale Gewichtszunahme

Die Ergebnisse des Versuchs sind in der folgenden Tabelle 12 zusammengefasst.

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Tabelle 12

O CO GO O CO "^ to O O CD

Antibiotikum Zusatz (mg/kg Futter)	Antibiotikum X-5IO8	2-Wochen Zunahme* g+2SE**	Antibio tikum X-5IO8	% Zunahme	Antibio tikum X-5IO8	Futternutz effekt	Antibio tikum X-5IO8	Futternütz- effektsver- besserung %	Antibio tikum X-5IO8
Kontrolle	50	Kontrolle	185+12	Kontrolle	120	Kontrolle	I.39	Kontrolle	+12
0	I54+8	100	I.55

ro

* Durchschnitt von 4o Kücken

** Standard-Abweichung vom mittleren Wert

O OJ N)

Die vorstehende Tabelle 12 zeigt, dass die Kücken, die mit dem Hühnerfutter, welches 50 mg Antibiotikum X-5108 pro kg Putter enthält, gefüttert werden, ein schnelleres Wachstum aufweisen als diejenigen des Kontrollversuchs. Gleichzeitig nützen die gleichen Tiere ihr Futter besser aus, was durch einen 10J& besseren Putternutzeffekt gezeigt wird.

Beispiel 7

Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wird einschliesslich der Kontrolle mit demselben Nahrungsmittel wie in Beispiel 5 mehrmals wiederholt. In diesen Versuchen wird der Gehalt an Antibiotikum X-5108 verändert. Die Versuchshühner werden mit Nahrungsmittel gefüttert, welches den aktiven Bestandteil in einem Verhältnis von 5,10,25,50 und 100 mg pro kg Putter enthalten. Die Wiederholung der Versuche bestätigt die Ergebnisse. In dem Kontrolltest füttert man vier Versuchsgruppen von je 10 Tieren mit einem Nahrungsmittel ohne antibiotischen Zusatz. In allen Versuchen wird die Wachstumsgeschwindigkeit während einer 2-Woehen-Periode mit derjenigen der Kontrollgruppe verglichen. Der Futterverbrauch wird festgehalten,und es werden Verbesserungen im Putternutzeffekt berechnet im Vergleich zu demjenigen des Kontrollversuches. Tabelle IJ stellt die Ergebnisse dieser Versuchsserien dar.

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Tabelle 13

Antibio tikum Zusatz mg/kg	Zahl der Tiere	2-Wochen Zunahme, ε·	% Zunahme	Futter nutz effekt	Futter nut z- effekts- verbes- serung %
Kontrolle Antibioti kum X-5108 50	48 24	149 175	100 117	1,54 1,37	+12
Kontrolle Antibioti kum X-5108 50	30 .18	152 173	100 114	1,47 1,38	+7
Kontra! Ie Antibioti kum X-5108 25	30 18	146 180	100 123	1,59 1,37	+16
Kontrolle Antibioti kum X-5108	48 18	149 183	100 123	1,51 1,39	+9
Kontrolle Antibioti kum x-5108 10	48 18	149 185	100 124	1,54 1,41	+13
Kontrolle Antibioti kum x-5108 100	48 18	149 182	100 122	1,54 1,33	+14

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2.U0322

Tabelle 1 ISP Wachstumsmedia

Medium 1; Trypton-Hefe extrakt Brühe

Bacto-Trypton (Difco) 5*0 g

Bacto-Hefeextrakt (Difco) 3,0 g

Destilliertes Wasser 1,0 Liter

pH 7jO bis 7j2 vor dem Autoklavieren

Man verteilt 5 ml Brühe in Reagenzgläser mit einem Durchmesser von 20 mm oder mehr.

Medium 2: Hefeextrakt-Malzextrakt Agar

Bacto-Hefeextrakt (Difco) 4,0 g

Bacto-Malzextrakt (Dico) 10,0 g

Bacto-Dextrose (Difco) 4,0 g

Destilliertes Wasser 1,0 Liter Einstellen vom pH auf 7,3 und Zugabe

von Bacto Agar 20,0 g

Man verflüssigt das Agar durch Dampfbehandlung während 15-20 Minuten bei 100⁰C.

Man verteilt geeignete Mengen für die Schrägkultur in wenigstens 6 Reagenzgläser pro Kultur. Man sterilisiert im Autoklaven.Man benützt gekühlte Reagenzgläser für die Schrägkultur.

Medium ~$: Hafermehl Agar

Hafermehl 20,0 g

Agar . 18,0 g

20 g Hafermehl in 1000 ml destilliertem Wasser werden während 20 Minuten gekocht oder mit Dampf behandelt.

Man filtriert durch ein Käsetuch.

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Man gibt destilliertes Wasser zu, um das Filtratvolumen wieder auf 1000 ml zu bringen. Man fügt eine Lösung mit Spüren von Salzen bei; (1,0 ml Lösung von je 0,1 g FeSO₄-TH₂O, MnCl₂;4HgO und ZnSOh-THpO in 100 ml destilliertem Wasser). Der pH wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt. Man fügt 18 g Agar bei; man.verflüssigt durch Dampfbehandlung während 15 bis 20 Minuten bei 100⁰C.

Medium

Anorganische Salze -- Stärke-Agar

Lösung I; Difco lösliche Stärke 10,0 g. Aus der Stärke macht man eine Paste mit einer kleinen Menge kaltem destillierten Wassers und ergänzt auf ein Volumen von 500 ml.

Lösung II;

(wasserfrei) MgSO₄.7H₂O NaCl

CaCO

1,0 g 1,0 g 1,0 g 2,0 g 2,0 g 500 ml

Destilliertes Wasser
Lösung mit Spuren von Salzen (L,0 ml der Lösung wie in Medium J). Der pH kann zwischen 7iO und 7*4- liegen und braucht nicht eingestellt zu werden, wenn er in diesem Bereich liegt.

Man vermischt die Stärkepaste mit der Salzlösung. Man setzt Agar (Difco) zu 20,0 g

Man verflüssigt das Agar durch Dampfbehandlung während 15-20 Minuten bei 100⁰C.

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Medium 5? Glycerin-Asparagin-Agar

L-Asparagin (wasserfrei) Glycerin K₂HPO₄ (wasserfrei) Destilliertes Wasser

Lösung mit Spuren von Salzen

(1,0 ml der Lösung wie in Medium 3)

Der pH dieser Lösung liegt zwischen 7,0-7:

1,0 g

10,0 g

1,0 g

1,0 Liter

und

braucht nicht eingestellt zu werden, wenn er in diesem Bereich liegt.

Agar

Man verflüssigt das Agar durch Dampfbehandlung ,während 15-20 Minuten bei 10O⁰C

Medium 6; Pepton-Hefeextrakt- Eisen-Agar

Bacto-Pepton-Eisen-Agar wasserfrei

(Difco) Bacto-Hefeextrakt (Difco) Destilliertes Wasser

20,0 g

36,0 g 1,0 g

1,0 Liter

Der pH kann zwischen 7,0 und 7,2 liegen und kann nötigenfalls eingestellt werden. Man verflüssigt das Agar durch Dampfbehandlung während 15-20 Minuten bei 100⁰C.

Medium 7» Tyrosin-Agar

Glycerin L-Tyrosin (Difco) L-Asparagin (Difco) K₃HPO₄ MgSO₄-/ NaCl

(wasserfrei)

15,0 s 0,5 g 1,0 g

0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,01 g

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■,-.■■■ - 31 -

2U0322

Destilliertes Wasser 1,0 Liter

Lösung mit Spuren von Salzen 1,0 ml

der Lösung wie in Medium j5.

Man stellt den pH auf 7,2-7,4 ein.

Bacto-Agar 20,0 g

Man verflüssigt durch Dampfbehandlung
während 15-20 Minuten.

Lösung mit Spuren von Salzen (Benützung wie in Media 3,4,5

und 7 beschrieben)

0,1 g 0,1 g 0,1 g 100,0 ml

FeSO1^,	Wasser
MnCl2*1	(Berger)
fH20
M2O
ZnSO^-TH2O
. Destilliertes
Tomatenoaste -
- Agar

Glukose 10,0 g

K₂HPO^ 1,0g

Tomatenpaste 20,0 g

Wilson's Pepton 1,0 g

CaCO, 2,0 g

Agar 15ίΟ g

Leitungswasser 1000,0 ml

Man sterilisiert während 30 Minuten unter
einem Druck von 3 Atm.
Der pH werd auf 6,9 eingestellt.

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O CO co

ro σ ο CD

Tabelle 2

Vergleich zwischen den Eigenschaften von Streptomyces X-5108, und denjenigen anderer Spezien der

Grau-Serien

	Strepto	S.anti-	S.aureo-	S.griseo-	S.purpure0-	S.viridi-	S.sp. Rivett
	myces	bioticus	faciens	luteus	fuscus	faciens	& Peters
	X-5108	Pfizer	Lederle	Umezawa	Waksman		No. 11
		15784-1	A-377
	Sm
Sporen	RA
oberfläche	Gy	Sm	Sm	Sm	Sm	Sm	Sm
Morphologie		RA	RA	RA	RA	RA	RA
Farbe	+	Gy	Gy	Gy	Gy	Gy	Gy
Melanin
erzeugung	x-5108	+	-	-	+	-	+
Erzeugtes		Oleando-	Chlortetra-	Griseo-	Anti-tricho-	Tetra	Streptolin
Antibiotikum		mycin	cyclin	lutein	monas	cyclin
Kohlenstoff	+
quelle:
Glucose	+	+			+	+	+
d-Xylose	+	+	+	+	+	-	—
1-Arabinose		+	+	-	+	—
1-Rhamnose	+	+	-	-	-	-	-
d-Fructose		+	+	+	-	+	+
d-Raffinose	+	—	—	—	—	—	-
d-Mannit	licht	+	—	+	-	—	-
i-Inosit	iurchgef.	_	—	-	—	-	—
Salicin
	-	-	-	-	-	+
Galactose	+	+	+	+	+	+

Γ\

Daten über andere Kulturen als Streptomyces X-5108 stammen aus der Literatur.
Sm = glatt im Elektronenmikroskop; RA = retinaculum-apertum; Gy = Grau-Serien; + = Wachstum;
- = keine Ausnützung.

O CJ NJ NJ

2U0322

Tabelle 3

Wachstumseigenschaften von Streptomyces sp X-5IO8

[Bebrütung: 14 Tage. Temperatur: 28⁰CJ

Medium	Stärke des	Luftmycel	Lösliches	Farbe der
(Peststoff)	Wachstums	und/oder	Pigment	Unterseite
		Sporen
Czapek's	gut	Luftmycel	leicht	gelblich
Sucrose		weisslich	dunkel
Agar		Spor.gut,	braun
		weiss
Asparagin-	gut	Luftmycel	keines	orange
Dextrose-		flockig bis		bis
		pulverig,		hellgelb
		weiss,
		Sporulierung
		rauchgrau
Tomaten-	gut	Luftmycel	keines	orange-
paste-Pep-		weiss bis		leder-
ton-Agar		hellgrau;		farben
		Spor.gut,
		grau
Stärke-	gut	Sporulierung	keines	orange-
Agar		gut,rauch		gelb
		grau,weisser
		Rand
Krainsky's-	gut	Luftmycel	keines	zitronen
Glukose-		weiss,Spor.		gelb
Agar		gut, wird
		rauchgrau
Mycophil	gut	keine Spo	leicht	gelblich
Agar (BBL)		rulierung	dunkel
, Hefe extrakt-	gut	keine Spo	dunkel	gräulich
Nähr-Agar		rulierung		bis gelb
				braun
Glycerin-Agar	mittel-	feucht,	keines	leicht
	mässig	Cremefarbe		gelb
	bis gut
	(10 Tage)

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21 A0322

Kartoffel	gut	keine Spo	schwarz
stückchen		ruli e rung
Karotten	gut	keine Spo
stückchen		ruli e rung

Das Wachstum ist auch gut in den folgenden flüssigen Media: Tryptonbrühe (dunkles lösliches Pigment; negativ Indol J Tage) PDA Nahrungsbrühe, Czapek-Sukrosebrühe, Krainsky-Glukosebrühe und Calciumcitrat-Glycerlnbrühe.

Das Wachstum während 8 Tagen in diesem Medium war gut bei Temperaturen von 24°C, 28°C, ^2°C und 57°C, aber nicht bei 42° C.

209808/20 0 6

Tabelle 4 Physiologische Reaktionen von Streptomyces sp X-5108

Medium	Bebrütungszeit	Stärke des Wachstums	Physiologische Reaktion
Organische Nitratbrühe	8 Tage	massig,keine Sporen	keine Nitrat reduzierung, Icein Gas
Organische Nitratbrühe	13 Tage	gut; dunke1 pigmentiert	keine Nitrat reduzierung, kein Gas
Gelatine (15#) bei 18° C'	5 Tage	massig;dunk les lösliches Pigment	keine Gelatine- verflüssigung
Gelatine (15#) bei 18° C	12 Tage	massig bis stark wachsend; braun-schwarz gefärbt; keine Sporen	leichte Verflüssi gung
Pepton-Eisen Agar (Klig- ler)	14 Tage	gut; sehr leichte Sporulierung	chromogenisch (Melaniner zeugung)
Lakmus Milch	6 Tage	massiges Wachs tum an der Oberfläche	Laianus farbe un verändert; kein Gerinnen oder Abscheiden
Lakmus Milch	13 Tage	massiges Wachstum an der Ober fläche; kei ne Sporen	hell-bräun liche Farbe; kein Gerinnen oder Abschei den
Dorset Ei Agar	3 Tage	gut; weiss- liche Spo rulierung
Dorset Ei Agar	10 Tage	sehr gutes Wachstum; meistens hell grau sporu- liert	leicht dunkles Pigment

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2H0322

Tabelle 5

Kohlenstoff und Stickstoffquellenausnützung von Streptomyces sp X-510b^r

[Bebrütung: 14 Tage Temperatur 28°C]

Kohlenstoff	Ausnützung '	Kohlenstoffquelle	Ausnutzung
quelle
1-Arabinose	1	Acetat	3
1-Rhamose	3	Citrat	2
d-Xylose	3	Malat	2
d-Mannit :	3	Oxalat	1
i-Inosit	3	Salicylat	0
Glukose	3	Succinat	2
Fructose	3	Tartrat	0
Sucrose	3	Phenol (0.1$)	0
Raffinose	3
Stärke	0-1	Stickstoffquelle
d-Ribose	3	(NH^)2S0^	1
d-Galactose	3	NaNO	1
d-Mannose	3	Na Nitrit	1
Cellobiose	3	Acetamid	1
Lactose	3	Asparagin	3
Maltose	3	Tyrosin	3
Dextrin	0	dl-Tryptophan	2
Dulcit	0	Gegenkontrolle	0-1
Erythrit	0
Sorbit	1
Glycerin	0-1

3 = gute Ausnutzung, 2 "= massige Ausnützung, 1 = schlechte Ausnützung, 0 = keine Ausnutzung. Gegenkontrolle, kein Kohlenstoff ergibt 0.

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Sporensuspensionen in destilliertem Wasser werden für Einimpfungen benützt und stammen aus Schräg-Tomaten-Agar-Kulturen. Die Ausnützung von kohlenstoff- und stickstoffhaltigen Verbindungen wird in dem folgenden Grundmedium geprüft;

KH₂PO₄ 2,38 g MnCl₂'4H₂0 0,0079 g

K₂HPO₄ 5,65 g ZnSO₄.7H₂O 0,0015 g

MgSO₄-7H₂O 1,00 g Agar 15 g

CuSO₄-5H₂O 0.0064 g destilliertes 1 Liter

Wasser

PeSO₄*7H₂0 0.0011 g pH des Mediums auf 6,8 bis

7,0 eingestellt

Um Kohlenstoffquellen in diesem Grundmedium zu prüfen werden 2,64 g pro Liter (NH₄)pS0₄ als übliche Stickstoffquelle zugefügt. Die Kohlenstoffquellen werden in einer Konzentration von Vfo zugegeben, mit Ausnahme der Natriumsalze der organischen Säuren, welche in einer Konzentration von 0,15$ benützt werden. Um Stickstoffquellen zu prüfen, benützt man die synthetische Agar-Grundlage mit 1$ Stärke und einer Stickstoffquelle in einer Konzentration von 0,1 g Stickstoff pro Liter.

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2H0322

Tabelle 6

Einfluss des Nährbodens auf das Antibiotikum, welches mittels Streptomyces sp X-510Q' in Schüttelflaschen erzeugt wird.

Alle Media enthalten

Dextrin, 0,1$ K HPO₂, und 0,1$ ml einer wasser: suspension von Streptomyces X-5108 eingeimpft.

GaCO,.Pro 100 ml Medium wird 1 ml einer wässerigen Sporen-

Versuch No.	Alle Stickstoffquellen werden in einer Kon zentration von Vfo zu gefügt ausser No.17 und No. 23 (2fo)	Alter in Tagen	5	Antibiotische Wirksamkeit in E Einheiten pro ml
1	Pleischmehlauszug	6	50
2 -	BY-100 (Commercial Solvents Corp.)	5	45
3	Proflo (Traders Oil Mill Co.)	5	23
4	Hafermehl (Quaker Oats Co.)	5	32
5	Soyalose (entfettetes Soj abohnenmehl)	5	30
8	Protein enthaltendes Erdnussrnehl	5	41
9	Protein enthaltendes Kokosnussmehl	5	. 50
10	Tomatenpaste Peststoffe	5	57
11	Leinsamenmehl	5	37
12	Maismehl	5	33
13	Trockenextrakt aus Brennereirückständen (H. Walker)	5	74
14	Soludri (Schenley Distillers)	5	51
15	Fischmehl (Gorton's)	5	25
16	Fischresten (Wilkinson)	5	16
17	Milchzucker-Albumin-Mischung 5	50
19	Getrocknete Torulahefe	38

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2H0322

20	National-Hefe-Autolysat	5	16
21	Sojaenzym Hydrolysat	5	33
22	Weizenprotein Säure- Hydrolysat (Huron Mills)	5	12
23	Homogenisierter konden sierter Fisch	5	27
24	Protopepton No.· 366 (Wilson Labs)	5	18
25	Maisquellfeststoff	5	26

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- 4ο -

Tabelle 7

Einfluss des Nährbodens auf das Antibiotikum, welches mittels Streptomyces X-5108 in Schüttelflaschen erzeugt VJi rd

Versuch No.	Zusammensetzung des Mediums in %	Alter in Tagen	Antibiotische Wirksamkeit E Einheiten pro ml
1	1 Pleischmehlauszug, 1 Dextrin	4	40
2	1 Getreidegärungsrück stand (BY-IOO),1 Dextrin	4	67
3	1 entfettetes Baumwoll samenmehl (Proflo), 1 Dextrin	4	52
4	1 Pischresten	4	40
5	1 Trockenextrakt aus Brennereirückständen (H.Walker), 1 Dextrin	6	138
7	(^) aber kein CaCO.,	4	19
8	(3) aber kein CaCO7, oder K2HPO4 ->	4	34
9	(8) aber nur 0,25 ProfIo	4	12
10	(8) aber 2,0 Proflo	4	47
11	1 Proflo, 1 Glukose	6	21
12	1 Proflo, 1 Stärke	6	21
13	1 Proflo, 1 Glycerin	4	35
14	1 Proflo, 1 brauner Zucker	4	14
15	1 Proflo, 1 Maltose	4	22
16	1 Proflo, 1 Laktose	4	26
17	1 Proflo, 1 Mannit	6	25

Alle Media enthalten 0,1$ KpHPO^ und CaCO₇, wenn nicht anders angegeben. Pro 100 ml Medium wird 1 ml einer Sporensuspension von Streptomyces sp X-5108 eingeimpft.

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Tabelle 8

ο co co

to ο Q

Einfluss des Nährbodens auf dag Antibiotikum, welches mittels Streptomyces X-5106 in Schüttelflaschen und belüftetenKesseln erzeugt wird.

Wenn nicht anders angegeben, enthält jedes Medium 0,5$ CaCO, und 0,1% K HPO^.

	Zusammenstellung des	Extrakt aus Brennerei- rückständen	Mediums 9	t	Glu kose	Antibiotikumgehalt,B. simplex Einheiten/ml	Kessel, β Tage (Doppelversuch)
Nr.	Tomatenpaste- Peststoffe	1	Mais stärke	0,5	Flaschen, 7 Tage	100, 120
1	1	0	1	0,5	150	71, 46
2	2	2	1	0,5	100	■ 8ö, 119
3	0	1	1	0	91	150, 124
4	1	, 1	1,5	1,5	14O	125, 126
5	1	1	0	0	180	nicht durchgeführt
6	1	0	54

1 ProfIo ,

1 Stärke , 0,1, 0,1 CaCO, K

94

97 (^ Tage)

-KZ-

Tabelle 9 Tankgärungen mit verschiedenen Media

Versuch	Zusammensetzung des	Alter in	Wirksamkeit in
No.a)	Mediums in %	Tagen	E Einheiten/ml
K12	1 Trockenextrakt aus	6	67
	Brennereirückständen,
	1 Dextrin, 0,1 KpHPO2,,
	0,1 CaCO d
Kl?	1 Na-1-Glutamat,l Dex	5	100
	trin, 0,1 getrockneter
	Rückstand von Maisquell
	wasser, 0,15 KpHP04,
	0,05 MgSO4
KIl	1 Tomatenpaste-Peststoffe,	7	200
	1 Trockenextrakt aus
	Brennereirückständen,
	1 Maisstärke, 0,5 Glu
	kose, 0,5 CaCO , 0,1
	K2HPO4 ^
Κ4	0,5 ProfIo , 0,5 Trocken	4	91
	extrakt aus Brennerei-
	rückständen, 0,5 Tomaten
	paste-Peststoffe, 0,5
	Fleischextraktpaste (Pro-
	topepton No. 3öö), 1
	Stärke, 0,1 CaCO , 0,1
	K2HPO4 ·>
K16	1,0 ProflobS 0,5 Mais	K	260
	quellwasser, 1,0 Mais
	stärke, 0,1 CaCO^, 0,1
	K2HPO4 -*

a) KIl, K12 und ΚΓ5 in j58O Liter Gärungskessel aus rostfreiem Stahl, die gewöhnlich mit Ib¹O Liter Medium gefüllt sind. Klo in einem 2100 Liter-Gärungskessel aus Gusseisen (Füllung l400 Liter) und K4 in einem II700 Liter Gärkessel aus Gusseisen (Füllung 89ΟΟ Liter).

b) Proflo ist ein.entfettetes Baumwollsamenprodukt von Traders

Oil Mill Co., Fort Worth, Texas.

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2U0322

Tabelle 10

Erzeugung des Antibiotikums mittels Streptomyces X-5108 in synthetischen Media

Zusammensetzung des Mediums in %	Alter in Tagen	Antibiotische Wirksamkeit in E Einheiten/ml
1,0 Na Glutamat, 1 Dextrin, 0,1 K2HPO4, 0,05 MgSO4	5	7,6
1,0 Aminosäuremischung , 1 Dextrin, 0,1 KpHP04, 0,1 USP Salze No. 1	5	11,5
2) BBL Czapek-Dox Brühe '	5	4,4
1,0 Arginin, 1,0 Dextrin, 0,1 K3HPO4, 0,1 CaCO3, 0,05 MgSO4	6	0,8
1,0 dl-Asparaginsäure, 1,0 Dex trin, 0,1 K HPO4, 0,1 CaCO,, 0,05 MgSO4 ^	6	0,8
0,1 Na Glutamat, 0,6 (NH^)2HPO4, 1 Glukose, 1 Dextrin, 0,1 KpHPO4, 0,1 CaCO , 0,1 KCl, 0,05 MgSO4 ■>	5	6,6
0,33 (NH1J9SO4, 1,5 Glukose, 0,1 Na Citrat, 0,05 Na Acetat, 0,5 NaCl, 0,025 MgSO4-7H0, 0,01 KpHPO4, 0,01 KHpPO., 0,3 CaCO 7 0,001 MnSO4-4h 0, 0,0ö4 ZnSO4-7H 07 1,5 X 10"°	7	20

1) Staley's Sta-Mino B

2) Jfo Sukrose, 0,3^ NaNO

0,001 FeSO₄ (Baltimore Biological Laboratories).

, 0,1 K₀HPO₄, 0,05 MgSO₄₅ 0,05 KCl,

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2H0322

Tabelle 11
Antlmlkrobielle Wirksamkeit des Antibiotikums X-5108

Versuchsorganismus	Durchmesser der Hemmzonen ' in mm	Reines Natriumsals des Antibiotikums X-5108 - 1 mg/ml
Escherichia coli Paecilomyces varioti Mycobacterium phlei Bacillus simplex Pseudomonas aeruginosa Aerobacter aerogenes Streptomyces cellulosae Sarcina lutea Bacillus E Bacillus subtilis Serratia marcescens Candida albicans Penicillium digitatum Saccharomyces cerevisiae Staph. aureus Bodenheimer's bacillus Proteus vulgaris	Rohes Natriumsalz des Antibiotikums X-5108 - 1 mg/ml	18,0 (18,5) 0 (0) 20,227·5 4o,3cs(2O)2) 15,0 (13) 14,319(15,5) 33,0 (2i)5) 29,7CS(22);5) 37,2cnG(32)5) 17,025(1724) ρ 4 15,7 (22,5) Spur (0) 0 0 (0) I5,8cs(i4) 21,7CS (18) l6,722i2(20)^
17,3 (18) 0 (0) 1925.3 39,3cs(20)2) 14,0 (12,5) 12,O17(l4,5) 31,3 (21)3) 27,7CS(21,5)3) 36.3Cns(3D3) l6,022i7(172if) I4,722i7(22) Spur (°) 0 0 (0) 14,5CS(13) 20,8cs (18) i6,321i2(20)3)

1) V/enn zwei Werte für den Durchmesser der Hemmzonen angegeben werden, betrifft der Zweite eine sekundäre undeutlichere Hemmzone. Die Abkürzung es bedeutet, dass der Zonenrand deutlich und scharf ist, cns dass er deutlich aber nicht scharf ist.

2) Bei 0,001 mg/ml Konzentration.

3) Bei 0,1 mg/ml Konzentration für Bacillus E bei 0,01 mg/ml, war der Zonedurchmesser für /306 22 mm.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   << Verfahren zur Herstellung der als Antibiotikum X-5IO8 bezeichneten neuen antibiotisehen Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyees sp X-5IO8 in einer wässerigen Kulturflüssigkeit, die assimilierbare Kohlehydrat- und Stickstoff quellen und anorganische Salze enthält, submers und aerob kultiviert, bis das Medium infolge Bildung des Antibiotikums X-5IO8 eine erhebliche antibiotische Aktivität aufweist, und dann das gebildete Antibiotikum X-5108 aus der Gärlösung abtrennt,

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Micro-organismus Streptomyees Sp. X-5108, ATCC 21586 benützt.

   5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyees sp. X-5108 bei einer Temperatur zwischen 24°C und j52°C kultiviert.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum X-5108 abtrennt indem man das wässerige Medium filtriert, das Piltrat mit einem wasserunlöslichen Lösungsmittel extrahiert, und das Antibiotikum X-5108 aus dem Lösungsmittelextrakt zurückgewinnt.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als wasserunlösliches Lösungsmittel Butylacetat benützt.

   6. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, dass man rohes,aus dem Fermentationsmedium gewonnenes Anti-. " biotikum einer Gegenstromverteilung unterwirft.

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   " ⁴⁶" 2H0322

   7· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man rohes ,aus dem Fermentationsmedium gewonnenes Antibiotikum einer Gelpermeationchromatographie unterwirft.

   8. Verfahren zur Herstellung von Präparaten zur Erhöhung des Putternutzeffektes und zur Förderung des Geflügelwachsturns, dadurch gekennzeichnet, dass man 0,0001 bis 0,01 Gewichtsteile des Antibiotikums X-5108 oder eines physiologisch geeigneten Salzes davon mit 100 Gewichtsteile eines nicht-toxischen inerten Trägers vermischt.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als nicht-toxischen inerten Träger ein Geflügelfutter mit hohem Nährwert benützt.

   10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Alkalimetallsalz des Antibiotikums X-5108 benützt.

   11. Verfahren zur Herstellung von Präparaten zur Erhöhung des Putternutzeffektes und zur Förderung des Geflügelwachsturns, dadurch gekennzeichnet, dass man Antibiotikum X-5108 oder physiologisch geeignete Salze davon, mit einem inerten, nichttoxischen Träger vermischt, wobei eine konzentrierte Vormischung erzeugt wird, die nach Zugabe zu einem üblichen Geflügelfutter ein Futter ergibt, das per 100 Gewichtsteile Futter 0,0001 bis 0,01 Gewichtsteile des Antibiotikums X-5108 oder eines physiologisch geeigneten Salzes davon enthält.

   12. Präparat zur Erhöhung des Futternutzeffektes und zur Förderung des Geflügelwachstums, dadurch gekennzeichnet, dass es Antibiotikum X-5108 oder ein physiologisch geeignetes Salz davon, und einen nicht-toxischen inerten Träger enthält, wobei 0,0001 bis 0,01 Gewichtsteile Antibiotikum X-5108 oder ein Salz davon per 100 Gewichtsteile inertem Träger vorliegen.

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   13· Präparat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht-toxische inerte Träger ein Geflügelfutter mit hohem Nährwert ist.

   14. Präparat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Alkalimetallsalz des Antibiotikums X-5108 vorliegt.

   15. Präparat zur Erhöhung des Putternutzeffektes und zur Förderung des Geflügelwachstums, gekennzeichnet durch eine konzentrierte Vormischung des Antibiotikums X-5108 oder eines physiologisch geeigneten Salzes davon mit einem inerten, nichttoxischen Träger, wobei diese Vormischung nach Zugabe zu einem üblichen Geflügelfutter ein Putter erzeugt, das per 100 Gewichtsteile Putter 0,0001 bis 0,01 Gewichtsteile Antibiotikum X-5108 oder ein physiologisch geeignetes Salz davon enthält.

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   Als Antibiotikum X-5IO8 bezeichnete neue antibiotische Substanz, mit hemmender Wirkung auf das Wachstum grammpositiver und grammnegativer Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine gelbeamorphe Substanz handelt mit folgenden Charakteristiken:

   a) Analyse: Kohlenstoff, 63,63%;

   Wasserstoff, 7,81$; Stickstoff, 5,48$; Sauerstoff, 25,08$ (durch Differenzbildung);

   b) löslich in Methanol, Aethanol, 1- und 2-Propanol, tert.butyl Alkohol, Aethylacetat, Amyläcetat, Butylacetat und Chloroform;

   c) charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum gemäss beiliegender Figur 1;

   d) charakteristisches magnetisches Kernresonanzspektrum gemäss beiliegender Figur 4;

   . und physiologisch geeignete kationische Salze davon.

   1.7. Natriumsalz des Antibiotikums X-5108 nach Anspruch .16, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Salz eine gelbe amorphe " Substanz ist mit folgenden Charakteristiken:

   a) Analyse: Kohlenstoff, 61,48$ Wasserstoff, 7,81$; Stickstoff 3,32$; Sauerstoff, 24,45$ (durch Differenzbildung); Natrium, 2,94$;

   b) löslich in Wasser, Methanol, Aethanol, Isopropanol, Butanol und Ν,Ν-Dimethylformamid;

   c) mit einer optisohen Drehung von

   "⁵ = -82,8 (Aethanol, c = 0,52);

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   d) charakteristisches Infrarot Absorptionsspektrum gemäss beiliegender Figur 2;

   e) charakteristisches Ultra-Violet Spektrum gemäss beiliegender Figur 3 mit folgenden Ultra-Violet Maxima:

   ,1 N

   1
   i ^ max 233 ΐημ (E
   lern = 610) 7 Puffer S
   max 206 πΐμ lern = 500) PH ^:·* max 327 mμ 1 cm = 423) N KOH: ^* max lern = 660) 0,1 ^ max
   ^ max 327 ηΐμ ^x lcm = 416)

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