DE3329218A1 - Verfahren zur reinigung von s-adenosyl-l-methionin - Google Patents
Verfahren zur reinigung von s-adenosyl-l-methioninInfo
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Description
4
Beschreibung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von
S-Adenosyl-L-methionin (nachstehend als SAM abgekürzt)
und insbesondere ein Verfahren zur wirksamen Isolierung von SAM mit hoher Reinheit aus einer rohes SAM
enthaltenden Lösung.
SAM ist eine wichtige Substanz, die beim Stoffwechsel von Fetten, Proteinen und Kohlenhydraten in vivo beteiligt
ist. In letzter Zeit ist gefunden wurden, daß SAI-I einen therapeutischen Effekt auf Jecur adiposum,
Lipämie, Arteriosklerose, Depressionen und Schlaflosigkeit
ausweist. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer Herstellung von SAM in größeren Mengen.
Zur Reinigung von SAM sind viele Methoden bereits bekannt. Spezielle Beispiele hierfür sind (1) ein Verfahren,
umfassend eine Kombination einer Stufe der Behandlung der SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem
stark sauren Kationenaustauscherharz und einer Stufe der Behandlung mit Aktivkohle (JA-AS 13680/1971)} (2)
ein Verfahren, umfassend die Behandlung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz
(Enzymologie, Band 29, Seite 183); (3) ein Verfahren, umfassend eine Kombination einer
Stufe der Behandlung einer rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz
vom H -Typ und einer Stufe der Behandlung mit Aktivkohle (JA-OS 145299/1981); (4) ein Verfahren,
umfassend die Behandlung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem Chelatharz (JA-AS 20998/1978);
und (5) ein Verfahren unter Verwendung eines Salzes
von SAM mit Picrinsäure oder Picrolonsäure (US-PSen 3 707 536 und 3 954
Das Verfahren (2) ist hinsichtlich der Prozeßstufen einfacher und wirtschaftlicher als die Verfahren (1)S
(4) oder (5)ο Dieses Verfahren hat aber den Nachteil, daß die Abtrennung von SAM von Verunreinigungen und
Fremdmaterialien unvollständig ist und daß auf diese Weise kein SAM mit der für Arzneimittel erforderlichen
Reinheit hergestellt werden kann., Bei dem Verfahren
(3)? das eine Verbesserung gegenüber dem Verfahren (1) darstellt 9 ist zwar die Reinheit des SAM erhöht, doch
wird aufgrund der Tatsach© v daß die Adsorption von SAM
an der Aktivkohle stark ist» das Ausbeuteverhältnis von SAM vermindertο Versuche 9 das Ausbeuteverhältnis
durch Erhöhung der Menge an organischem Lösungsmittel in dem Elutionsmittel zu ©rhöhen3 führen nachteiligerweise
zu einer nicht ausreichenden Abtrennung von SAM von den Verunreinigungen und Fremdmaterialien.
Aufgabe der Erfindung ist ©s daher 9 ein Verfahren zur
Verfügung zu stollen,, durch das SAM mit hoher Reinheit
wirksam isoliert werden kann«
Es wurden ausgedehnt© Untersuchungen in dieser Hinsicht durchgeführt ΰ und ©s xtfurde dabei festgestellt,
daß SAM aus einer roh©s SAM enthaltenden Flüssigkeit wirksam isoliert und gereinigt werden kann, wenn man
eine Kombination einer Stuf© der Behandlung mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H -Typ und
einer Stufe der Behandlung mit einem porösen^ synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel anwendet«,
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung von SAM0 das dadurch gekennzeichnet ist, daß
" 1 man eine rohes SAM enthaltende Flüssigkeit in einen
Reinigungsprozeß einführt, wobei der Reinigungsprozeß ein Serien- bzw. Reihenreinigungsprozeß ist, der in
jeder beliebigen, gewünschten Reihenfolge aus (A) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit
mit einem schwach sauren kationischen Austauscherharz vom H -Typ und (B) mindestens einer Stufe der Behandlung
der Flüssigkeit mit einem porösen, synthetischen Harz-Adsorptionsmittel besteht.
Bezüglich des Herstellungsverfahrens der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit bestehen keine besonderen Begrenzungen.
So kann diese beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß ein Mikroorganismus der Gattung
Saccharomyces,Candida oder Mucor, der SAM erzeugen kann, in einem Methionin enthaltenden Kulturmedium kultiviert
wird, um SAM innerhalb und/oder außerhalb der Mikrobenzellen zu erzeugen, und die Kulturbrühe mit
einem Extraktionsmittel, wie Perchlorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure oder Ameisensäure, extrahiert wird, oder
indem man Adenosintriphosphat und Methionin in Gegenwart von Methionin-Adenosyl-Transferase enzymatisch
miteinander umsetzt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es wesentlich,
daß eine rohes SAM enthaltende Flüssigkeit in der Weise gereinigt wird, daß sie in einen Serien- bzw. Reihen-Reinigungsprozeß
eingeführt wird, der in jeder beliebigen Reihenfolge aus (A) mindestens einer Stufe der
Behandlung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H Typ
und (B) mindestens einer Stufe der Behandlung mit einem porösen, synthetischen Harz-Adsorptionsmittel
besteht.
Die Behandlungsstufe (A) wird folgendermaßen durchgeführt
„
Zuerst wird der pH-Wert der rohes SM enthaltenden
Flüssigkeit gewöhnlich auf 3P5 Ms 695S vorzugsweise
Ms 6,5» eingestellte Wenn der pH-Wert-der rohes SAM
enthaltenden Flüssigkeit zu niedrig istB dann wird die
Adsorption von SAM auf dem Ionenaustauscherharz erschwert.,
Wenn der pH-Wert der Flüssigkeit zu hoch ist, dann wird SAM gegenüber ©iner Zersetzung empfindlich.
. Die Methode der Einstellung des pH-Wertes unterliegt keinen besonderen Beschränkungen» Vorzugsweise wird
die pH~Einst©llung in der Weis© vorgenommen, daß man
eine Kombination aus einer Säure und einem Alkali, die dazu imstande istp einen in Wasser schwer löslichen
oder unlöslichen Niederschlag zu bilden ϋ oder ein
Anionenaustauscherharz (QH==Typ) verwendete
Durch die Kontaktierung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit dem auf die obige Weise ©ingestellten
pH-Wert mit dem schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H -Typ wird SAM0 das eine positive Ladung aufweist,
selektiv auf dom Kationenaustauscherharz adsorbiert. Die Verunreinigungen mit neutraler und negativer Ladung
in der Flüssigkeit werden auf dem Harz nicht adsorbiert.
Das verwendet©,, schwach saure Kationenaustauseherharz
kann ein beliebiges Kationenaustauscherharz mit Carbon-
Ie Beispiel© sind Amberlit© IRC-50 und IRC-80 (Produkte
von Rohm & Haas Co0) sowi© Diaion WISO (ein Produkt der
Mitsubishi Chemical Co05 LtIo)0 Die Kontaktierung kann
durch ein absatzweise durchgeführtes Verfahren oder ein Säulenverfahren ©rfolgeno Das Säulenverfahren wird aufgrund
seiner guten Betriebsfähigkeit und leichten Entfernung der Verunreinigungen bevorzugte
Das auf dem Ionenaustauscherharz adsorbierte SAM wird sodann abgetrennt, indem das Harz mit einer wäßrigen
Lösung einer anorganischen oder organischen Säure mit einem pH-Wert von gewöhnlich nicht mehr als 3,0., vorzugsweise
0,2 bis 2,0, fraktioniert eluiert wird. Die verwendete Säure unterliegt keinen besonderen Beschränkungen.
Beispiele sind Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure und p-Toluolsulfonsäure. Erforderlichenfalls kann
vor der fraktionierten Elution des SAM das Ionenaustauscherharz mit Wasser oder einer verdünnten, wäßrigen
Säurelösung (z.B. mit einem pH-Wert von 3,5 oder mehr) gewaschen werden, um Spuren von darin befindlichen Verunreinigungen
zu entfernen.
Die Behandlungsstufe (B) wird folgendermaßen durchgeführt.
Zuerst wird die rohes SAM enthaltende Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 6,5 oder weniger eingestellt und
wird sodann mit dem porösen, synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert. Die pH-Einstellung und die
Kontaktierung kann in der gleichen Weise wie in der Behandlungsstufe (A) erfolgen. Die Kontaktierung mit
dem Adsorptionsmittel führt zu einer selektiven Adsorption der Amine, von Methylthioadenosin (dem Zersetzungsprodukt von SAM) und Farbstoffen, die Fremdmaterialien
in der Flüssigkeit sind. Durch Auswahl der Bedingungen in der nachstehend beschriebenen Weise können SAM und
die Fremdmaterialien miteinander auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden. In diesem Fall kann das SAM
selektiv abgetrennt werden, indem man das Adsorptionsmittel mit einer wäßrigen Lösung einer anorganischen
oder organischen Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3»5, vorzugsweise 0,2 bis 2,0, fraktioniert
eluiert.
Anorganische und organische Säuren, die hierin verwendet werden können, können die gleichen wie die in der Behandlungsstufe
(A) eingesetzten sein. Ein organisches Lösungsmittel kann zusammen mit der anorganischen oder
organischen Säure verwendet werden, solange es in einer Menge vorliegt 9 die eine gleichförmige Lösung ergeben
kann. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol 9 n-Propanol, Isopropanol, Aceton,
Methylethylketon s, Methylformiat, Ethylacetat, Dioxan
und Toluol« Gewünschtenfalls kann in der gleichen Weise
wie in Behandlungsstuf© (A) das Adsorptionsmittel mit
Wasser oder einer verdünnten,, wäßrigen Säurelösung vor
der fraktionierten Elution gewaschen werden, um etwa vorhandene Spuren von Verunreinigungen zu entfernen.
Das erfindungsgemäß verwendet© ΰ poröse, synthetische
Harz-Adsorptionsmittel ist wasserunlöslich und hat eine große Netzwerkstrukturo Spezielle Beispiele sind
nichtpolare Adsorptionsmittel ΰ aufgebaut auf Styrol/
Divinylbenzol-Copolymeren als Matrix, wie Amberlite
XAD-2 und XAD-4 (Produkt© von Rohm & Haas Co.) sowie
Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 und HP-50 (Produkte
der Mitsubishi Chemical CoOi) Ltd.), und mäßig polare
Adsorptionsmittel auf der Basis eines Polymeren von Acrylsäureester und/oder Methacrylsäureester oder
eines Copolymeren eines solchen Monomeren mit einem nichtpolaren Monomeren0 wie Styrol und Bivinyl»
benzols .als Matrix„ Z0B0 Araberlite ΣΑ0~7 und XAD-8
(Produkte von Rohm & Haas Co „) sowie Diaion HP-ZMG
(Produkt der Mitsubishi Chemical CoO£) Ltd.). Gewünschtenfalls
können diese Adsorptionsmittel in Kombination verwendet werdeno
Diesen Adsorptionsmitteln ist gemein, daß sie Fremdmaterialien
in der rohes SM enthaltenden Flüssigkeit,
wie Amine und Farbstoffe, selektiv adsorbieren. Sie haben jedoch, je nach ihrem Typ, eine selektive Adsorptionsfähigkeit
für SAM. So adsorbieren nichtpolare ' Adsorptionsmittel Fremdmaterialien, jedoch kein SAM,
während mäßig polare Adsorptionsmittel SAM zusammen mit den Fremdmaterialien bei relativ schwacherAzidität
adsorbieren, jedoch bei relativ starker Azidität nur die Fremdmaterialien adsorbieren und das SAM nicht
adsorbieren.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Behandlung
der Stufe (A) und die Behandlung der Stufe (B) jeweils mindestens einmal durchgeführt. Die Reihenfolge
bzw. Sequenz der Behandlungsstufen ist beliebig. Bevorzugte
Beispiele der Reihenfolge sind (1) (A) und dann (B); (2) (B) und dann (A); (3) (A), (B) und dann
(A); und (4) (B), (A) und dann (B). Erforderlichenfalls
können die Behandlungsstufe (A) und/oder die Behandlungsstufe
(B) an diese Beispiele weiter angefügt werden. Bei zunehmender Anzahl der Behandlungsstufen wird
naturgemäß die Wirtschaftlichkeit des Reinigungsprozesses geringfügig vermindert.
Wenn die Behandlungsstufe (B) vor der Behandlungsstufe
(A) durchgeführt wird, dann ist es vom Betrieb her gesehen vorteilhaft, derartige Bedingungen einzustellen,
daß nur die Verunreinigungen auf dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel selektiv adsorbiert -werden,
ohne daß eine Adsorption von SAM erfolgt. Eine spezielie
Technik der Einstellung dieser Bedingungen besteht beispielsweise darin, ein nichtpolares Adsorptionsmittel
zu verwenden oder ein mäßig polares Adsorptionsmittel zu verwenden, und die Kontaktierung bei einer
Azidität eines pH-Wertes von nicht mehr als 3,5, vorzugsweise 0,2 bis 3,0, vorzunehmen.
Wenn die Endstuf© d©s Reihenreinigungsprozesses die Stufe (B) istρ dann ist es möglich s ©in Verfahren anzuwenden
j, bei dem man zuerst das SAM auf dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel adsorbiert und sodann abtrennt
9 oder ein Verfahren;, bei dem man SAM durch das
synthetische Harz=Adsorptionsmittel ohne Adsorption leitete
Die SAM»Lösung9 di© von der beschriebenen Reihenreinigungsstuf©
eluiert worden ist9 wird gewünschtenfalls
unter vermindertem Druck konzentrierte Hierauf wird sie mit einem organischen Lösungsmittel9 wie Methanol,
Ethanol ΰ n-Propanolp Isopropanolg n-Butanol^ Isobutanol,
Methoxyethanolj, Aceton ΰ Methyl© thy Ike ton 9 Methylformiatj,
Ethylform±ats Methylacetat s Ethylacetat, Butylacetat
und Dioxan9 kontaktierto Als Ergebnis kann ein
Niederschlag eines Salzes erhalten werdens das aus SAM
und einer organischen oder anorganischen Säure gebildet worden ist. Alternativ kann ohne Kontaktierung der SAM-Lösung
mit ©inem organischen Lösungsmittel pulverförmiges Salz aus SAM und einer anorganischen oder organischen
Säure erhalten werden., indem man die überschüssige Säur© aus der SAM-Lösung unter Y©rwendung eines Anionenaustauscherharzes
(0Η°=Τγρ) oder eines Alkalis, das dazu
imstande ist9 durch Umsetzung mit der "bei der fraktionierten
Elution von SAM verwendeten Säure ©in Salz zu bilden s entfernt und hierauf das Lösungsmittel bei vermindertem
Druck aus der Lösung abdampft0 bis der Rückstand
trocken isto
Das schwach säur© Ion©naustausch©rharz vom H =Typ wird
in einer Stuf© regeneriert;, wo das SAM daraus eluiert
Xforden isto Es ist daher nicht immer notwendig„ das
Austauscherharz einer speziellen Regenerierungsbehandlung zu unterwerfen*, Es kann lediglich nach Waschen mit Wasser
wiederholt verwendet werden. Andererseits kann das synthetische Harz-Adsorptionsmittel leicht regeneriert
werden, indem man es beispielsweise mit einer 5C$>igen
wäßrigen Methanollösung und hierauf mit Wasser wäscht.
Somit kann erfindungsgemäß SAM mit sehr hoher Reinhei t
wirksam durch einfache Verfahrensstufen und unter Verwendung von leicht zu regenerierenden Substanzen erhalten
werden.
10
10
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
Saccharomyces cerevisiae (IFO 2044) wurde in dem Kulturmedium
von F. Schlenk et al. [Journal of Biological Chemistry, Band 229, Seite 1037 (1957)] kultiviert, um
Mikrobenzellen mit darin angesammeltem SAM zu bilden. 210 g der resultierenden Zellen wurden in 1000 ml 1,5N
Perchlorsäure suspendiert und unter Schütteln bei Raumtemperatur 1 h extrahiert. Sodann wurden die Zellrückstände
durch Zentrifugieren abgetrennt. Kaliumhydrogencarbonat
wurde zu dem Extrakt zugegeben, um den pH auf 5,0 einzustellen. Der resultierende Niederschlag
von Kaliumperchlorat wurde durch Saugfiltration entfernt,
wodurch 1080 ml eines Extrakts mit einem Gehalt von 1,15 g SAM erhalten wurden.
Der Extrakt wurde durch eine Säule geleitet, die mit 200 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes
[Amberlite IRC-50 (H+-Typ), Warenzeichen für ein Produkt
von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001N Essigsäure gewaschen
und mit 0,1N Schwefelsäure fraktioniert eluiert,
wodurch 630 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
Die resultierende SAM=Lösung wurde auf einen pH-Wert
von 4,5 mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz
[Ambeplite IRA-45 (QlT-Typ), Warenzeichen für
ein Produkt von Rohm & Haas Co 0] eingestellt und sodann
durch eine Säul© geleitet 0 die mit 1S5 1 Amberlite
XAD-7 (Warenzeichen für ©in synthetisches Harz-Adsorptionsmittel
vom Acrylat-Typ 9 hergestellt von Rohm &
Haas Co.) gefüllt war0 um SAM zu adsorbieren. Die Säule
wurde mit 2 1 O50001N Essigsäur© gewaschen und sodann
mit 0,1N Schwefelsäure fraktioniert eluiert^ wodurch
1440 ml einer SAM=Lösung erhalten wurden.
Die SAM-Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert,
bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrüge Hierauf wurden 800 ml Iceton zugesetzt^ wodurch ©in Niederschlag von
SAM-sulfat erhalten wurde« Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt 9 in einer geringen Menge Wasser
aufgelöst und sodann lyophilisierts wodurch 1,74 g
SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigt® bei der Papierchromatographie und der
Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM imd sein© Reinheit
sind in Tabelle 1 zusammengestellte
ILe i s ρ i e 1 2
Ein Extrakte enthaltend 19O6 g SAMj, erhalten wie in
Beispiel 19 wurde durch eine Säule geleitet, die mit
200 ml Amberlite IRC=84 (H+-Typ) (Warenzeichen für
ein schwach saures Kationenaustauscherharz, hergestellt von Rohm & Haas Co:o) gefüllt war5 um SAM zu adsorbieren*
Di© Säule wurde mit 400 ml O9OOOIN Salzsäure
gewaschen und sodann mit Salzsäure fraktioniert eluiert, wodurch 640 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
33Z9Z1Ö
Die SAM-Lösung wurde mit Amberlite IRA-45 (OH~-Typ),
einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt und hierauf durch
eine Säule geleitet, die mit 1,5 1 Amberlite XAD-7 (Warenzeichen für ein synthetisches Harz-Adsorptionsmittel,
hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 2 1 O,0001N
Essigsäure gewaschen und hierauf fraktioniert eluiert, indem ein Mischlösungsmittel, bestehend aus 0,1N SaIzsäure·
und Aceton (im Volumenverhältnis von 1:0,1) hindurchgeleitet wurde. Auf diese Weise wurden 1120 ml
einer SAM-Lösung erhalten.
Die SAM-Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. Hierauf
wurde Amberlite IRA-45 (OH~-Typ), ein schwach basisches
Anionenaustaußcherharz, zugesetzt, um den pH-Wert
der Lösung auf 2,0 einzustellen. Das Harz wurde durch Absaugfiltration abgetrennt und das Filtrat bei vermindertem
Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde lyophilisiert und ergab 1,19 g SAM-hydrochlorid als
weißes Pulver. Das Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel
einen einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Ein Extrakt, enthaltend 0,98 g SAM, erhalten wie in Beispiel 1, wurde durch eine Säule geleitet, die mit
200 ml Amberlite XAD-2 (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel vom Styrol/Divinylbenzol-Typ, hergestellt
von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um Fremdmaterialien
zu adsorbieren„ Kaliumhydrogencarbonat wurde zu der SAM-Lösungs,aus
der die Fremdstoff©;, wie oben beschrieben, entfernt worden warens zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,0
einzustellen» Der resultierende Niederschlag von Kaliumperchlorat
wurde durch Saugfiltration entfernt.
Hierauf wurde die SAM~L6sung durch eine Säule geleitet,
die mit 200 ml Amberlite RC-50 (H+-Typ), ein schwach
saures Kationenaustauscherharz, gefüllt war, um SAM zu
adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001N Essigsäure
gewaschen und mit O51N Schwefelsäure fraktioniert
eluiertj wodurch 630 ml einer SAM»Lösung erhalten wurden.
Die resultierende SAM·=·Lösung wurde bei vermindertem
Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug.
Danach wurden 800 ml Aceton zug©geben, wodurch ein Niederschlag
von SAM-sulfat erhalten wurde. Der Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen Wassermenge aufgelöst und lyophilisiert, wodurch
155O g SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden.
Dieses Produkt zeigt© bei der Papierchromatographie
und der Dunnschichtchromatographie mit Silikagel einen
Das Gewinnungsverhältnis von SAM "und seine Reinheit
sind in Tabelle 1 zusammengestellt«,
Bei s ji e 1 4
Mikrobielle Zellen mit darin angesammeltem SM wurden
wie in Beispiel 1 hergestellt0 200 g der mikrobiellen
Zellen wurden in 1000 ml O31N Ameisensäure suspendiert.
Die Suspension wurde 10 min auf 60°C erhitzt und dann sofort abgekühltο Die Zellen wurden durch Zentrifugie-
33292Ί8
ren abgetrennt, wodurch 1020 ml eines Extrakt mit einem
Gehalt an 0,91 g SAM erhalten wurden.
Der Extrakt wurde durch eine mit 200 ml Amberlite XAD-8
(Warenzeichen für ein Acrylat-Adsorptionsmittel, hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllte Säule geleitet, um
Fremdmaterialien zu adsorbieren.
Die SAM-Lösung, aus der die Fremdmaterialien entfernt
worden waren, wurde mit Amberlite IRA-45 (OH~-Typ),
einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und sodann durch eine
mit 200 ml Amberlite IRC-84 (H+-Typ), einem schwach
sauren Kationenaustauscherharz, gefüllte Säule geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml
0,0001N Salzsäure gewaschen und dann mit 0,2N Salzsäure
fraktioniert destilliert, wodurch 710 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
Amberlite IRA-45 (OH~-Typ), ein schwach basisches Anionenaustauscherharz,
wurde zu der SAM-Lösung zur Einstellung ihres pH-Wertes auf 2,0 zugesetzt. Das Harz
wurde durch Saugfiltration entfernt und das Filtrat
unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch 1,01 g SAM-hydrochlorid als weißes Pulver erhalten
wurden. Dieses Produkte zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel
einen einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind in Tabelle 1 angegeben.
630 ml einer SAM-Lösung, erhalten durch Behandlung mit dem Styrol/Divinylbenzol-Adsorptionsmittel und dem
schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H -Typ, wie in Beispiel 3„ wurden durch eine mit 200 ml eines Adsorptionsmittels
vom Acrylat-Typ (AmberIite XAD-7)
gefüllte Säule geleitet, um Fremdmaterialien zu adsor-Meren.
Die SAM-Lösung, aus der die Fremdmaterialien wie oben
beschrieben entfernt worden waren, wurde bei vermindertem Druck konzentriert 3 bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug.
Hierauf wurden 800 ml Aceton zugesetzt, um einen Niederschlag von SAM°sulfat zu bilden. Der Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen Wassermenge aufgelöst und lyophilisiert,, wodurch 1,46 g
SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der
Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen einzigen
Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind in Tabelle 1 aufgeführte
Verfileichsbeispiel I1
950 g eines Extraktes mit einem Gehalt an 0,98 g SAM, erhalten gemäß Beispiel 1 9 wurden mit Kaliumhydrogencarbonat
auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Der
resultierende Niederschlag von Kaliumperchlorat wurde
durch Saugfiltration unter Bildung einer SAM enthaltenden
Flüssigkeit entfernt.
30
30
Die SAM enthaltende Flüssigkeit wurde durch eine mit 200 ml Amberlite XRC-50 (H+=TyP)5 einem schwach sauren
Kationenaustauscherharzj, gefüllte Säule geleitet, um
SAM zu adsorbieren.= Di© Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N
Essigsäure gewaschen und dann mit 0,1N Sulfat fraktio-
niert eluiert, wodurch 610 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
Die SAM-Lösung wurde durch eine mit 200 ml Aktivkohle
*5 für die Chromatographie gefüllte Säule geleitet. Die
Säule wurde mit 600 ml 0,2N Schwefelsäure gewaschen und dann mit einem Mischlösungsmittel, bestehend aus 1,ON
Schwefelsäure und Methanol (1:1, Vol.)» fraktioniert eluiert, wodurch eine SAM-Lösung erhalten wurde.
Die SAM-Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. 800 ml Aceton wurden
zugesetzt, wodurch ein Niederschlag von SAM-sulfat erhalten wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
abgetrent, in einer geringen Wassermenge gelöst und lyophilisiert, wodurch 1,28 g SAM-sulfat als weißes
Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie
auf Silikagel einen einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Beispiel 1 wurde lediglich mit der Ausnahme wiederholt, daß die Behandlung mit dem Amberlite IRC-50 (H+-Typ)
als Reinigungsbehandlung durchgeführt wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
10
Reinheit Ninhydrinreaktion Menge an Gewinnungsvon SAM mit anderen Mate- Methylthio- verh.v.
(%) (+1) rialien als SAM(+2) adenosin SAM (%)
(%) (+3)
| Bsp.1 | 98,1 |
| 2 | 98,0 |
| 3 | 98,0 |
| 4 | 98,1 |
| 5 | 98,5 |
| VgIB.1 | 97,6 |
| CvJ | 56,7 |
| 0,08 | 89 |
| 0,1 | 90 |
| 0,1 | 90 |
| 0,08 | 90 |
| 0,05 | 88 |
| 0,4 | 77 |
| 1,8 | 90 |
Bsp. steht für Beispiel und VgIB. für Vergleichsbeispiel.
(+1) Die Reinheit von SAM wurde durch zweidimensionale Papierchromatographie gemessen.
(+2) Die Ninhydrinreaktion mit anderen Materialien als SAM wurde wie folgt durchgeführt: Eine Probe
wurde durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie auf Cellulose entwickelt und das Vorhandensein von anderen
Flecken als einem Flecken von SAM wurde anhand der Farbbildung mit Ninhydrin erfaßt und wie folgt bewertet.
nicht vorhanden
+ geringfügiges Vorhandensein ++ erhebliches Vorhandensein.
(+3) Die Menge an Methylthioadenosin wurde durch
zweidimensionale Papierchromatographie ermittelt.
Die obigen Ergebnisse zeigen eindeutig, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren SAM mit höherer Reinheit
und mit höherem Gewinnungsverhältnis als bei bekannten Methoden erhalten werden kann«,
Ende der Beschreibung»
35
35
Claims (5)
- IAUS" & WESSERT" 332S218PATENTANWÄLTEDR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OO0 MÜNCHEN 71 · TELEFON OB9/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatdTELEGRAMM KRAUSPATENT3919 WK/MyNIPPON ZEON CO., LTD« Tokyo s JapanVerfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methioninPatentansprüche1„J Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin^ dadurch gekennzeichnet9 daß man eine rohes S-Adenosyl-L°methionin enthaltende Flüssigkeit in einen Reinigungsprozeß einführte wobei der Reinigungsprozeß ein Serien= bzw» Reihenreinigungsprozeß ist, der in jeder beliebigen s gewünschten Reihenfolge aus (A) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem schwach sauren kationischen Austauscherharz vom H -Typ und (B) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem porösen^ synthetischen Harz-Adsorptionsmittel besteht.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (A) die rohes S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, die einen pH-Wert von 3,5 bis 6,5 besitzt, mit dem Kationenaustauscherharz kontaktiert, um das in der Flüssigkeit enthaltene S-Adenosyl-L-methionin auf dem Harz zu adsorbieren, und daß man danach fraktioniert das S-Adenosyl-L-methionin von dem Kationenaustauscherharz unter Verwendung einer wäßrigen Lösung einer Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,0 eluiert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe (B) die das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, um hierdurch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel zu adsorbieren.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe (B) die das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch sowohl S-Adenosyl-L-methionin als auch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorbtionsmittel adsorbiert werden, und daß man hiernach das S-Adenosyl-L-ifethionin von dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel unter Verwendung einer wäßrigen Lösung einer Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,5 fraktioniert eluiert.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe (A) und der Stufe (B) in dieser Reihenfolge besteht. 356» Verfahren nach Anspruch 1 9 dadurch gekennzeichnet , daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe (A), der Stufe (B) und der Stufe (A) in dieser Reihenfolge besteht.7» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reinigungsprozeß aus der Stuf© (B) und der Stufe (A) in dieser Reihenfolge besteht.8e Verfahren nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet 5 daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe (B), der Stufe (A) und d@r Stufe (B) in dieser Reihenfolge besteht«9» Verfahren nach Anspruch 7S dadurch gekennzeichnet, daß man in d@r Stufe (B) di© das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltend© Flüssigkeit g welche eineipH-Wert von nicht mehr als 695 hats mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert s wodurch nur Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werdeno1Oo Verfahren nach Anspruch 8B dadurch gekennzeichnet 9 daß man in ä©r ©rst@n Stuf© (B) di© das rohe S-Adenosyl-L-raethionin ©athaltende Flüssigkeit, welche ©in©n pH-¥®rt von nicht mehr als 6j,5 hat9 mit dem synthetischen Harz·=Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch nur die Fr©mdmat©riali©n in d©r Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert
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