DE1095465B - Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Cobalaminen - Google Patents

Description

• Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Cobalaminen Patent 1046 258 bezieht sich auf die Verwendung eines Mikroorganismus der GattungNocardia, insbesondere des Stammes Nocardia rugosa, zur mikrobiologischen Erzeugung von Cobalaminen, wobei die Nährflüssigkeit gegebenenfalls oberflächenaktive Mittel enthält.
• Die zur Erzeugung der Cobalaminanaloge verwendeten Stämme sind Mutanten der von Di Marco und Spalla (Giorn. Microbiol., 4, 24, 1957) beschriebenen Art Nocardia rugosa. Die Mutantenstämme wurden durch Bestrahlung des Ausgangsstammes mit ultraviolettem Licht erhalten. Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit zur Ansammlung des B-Faktors und anderer Vitamin-Bl,-ähnlicher Substanzen aus, die zu der Gruppe der »unvollständigen Faktoren« (Kon, S. und Pawelkiewicz, J., Biosynthesis of Vitamin B" Analogues, Symposium XI, Congress of Biochemistry, Wien 1958) gehören. Die Anwesenheit dieser Faktoren in den Kulturen der Mutantenstämme kann durch den Unterschied zwischen ihren wachstumsfördernden Wirkungen auf E. coli 113/3, der auf alle Faktoren anspricht, und auf L-leichmannii 7830, der nur auf Vitamin B" anspricht, sowie durch Papierchromatographie oder Elektrophorese und Bioautographie mit E. coli 11313 nachgewiesen werden.
• Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer Cobalamine (Vitamin-B"-Analoge) durch die durch Zusatz bestimmter Verbindungen modifizierte Gärung der Nährsubstrate mit Mikroorganismen der Art Nocardia rugosa. Ferner betrifft die Erfindung die Isolierung dieser Cobalamine von den Substraten durch Elektrophorese und Gegenstromextraktion.
• Das neue Verfahren zur Herstellung der Cobalamine besteht im Vergären eines 2,3-Diamino-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin oder 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol oder 2,4,5-Triaininotoluol oder 5(6)-Amino-6(5)-methylbenzimidazol enthaltenden Nährsubstrats mit Mikroorganismen der Art Nocardia rugosa. Ein erfindungsgemäßes Cobalamin hat eine Vitamin-B1.-ähnliche Wirksamkeit; es ist von Vitamin Bl, durch Chromatographie oder Elektrophorese trennbar.
• Es werden bekannte Gärungsverfahren angewendet. Vorzugsweise wird nach dem Submersverfahren mit Durchlüftung gearbeitet, beispielsweise nach dem Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1068 429, wobei man jedoch je nach dem gewünschten Analog dem Substrat 2,3-Diamino-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin oder 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol oder 2,4,5-Triaminotoluol oder 5(6)-Amino-6(5)-methylbenzimidazol zusetzt.
• Die verwendeten Extraktionsverfahren sind ebenfalls den in der genannten Auslegeschrift beschriebenen ähnlich, jedoch wird zur Abtrennung von Vitamin B" und anderen in dem Rohextrakt enthaltenen Substanzen der Cobalamingruppe je nach dem herzustellenden Analog ein anderes Verfahren angewendet. Da die in Frage kommenden Methoden in hohem Maße von den Eigenschaften der neuen erfindungsgemäß erhaltenen Analoge A, B und C abhängig sind, werden zunächst diese Eigenschaften beschrieben.
• Analog A Bei Zusatz von 2,3-Diaminotetrahydronaphthalin erzeugen Kulturen von Nocardia rugosa ein Cobalamin (Analog A), das sich von dem Vitamin Bl, durch folgende Eigenschaften unterscheidet: 1. Das chromatische Rf in sek.Butylalkohol-Essigsäure-Wasser nach der Methode von Ford u. a. (j. Ford, E. S. Holdsworth, S. Kon, Biochein. J., Nr. 59, S. 86, 1955) ist deutlich höher als das des Vitamins B" (RfIRf B12 # 1,2).
• 2. Der Verteilungskoeffizient zwischen 240/,iger wäßriger Ammoniumsulfatlösung und 1-Butanol ist größer als 1 (Verteilungskoeffizient von Bl, = 1). 3. Durch Säurehydrolyse des Analogs freigesetztes Benzimidazol verhält sich bei Papierchromatographie wie 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol (Rf --0,78; Rf des aus Vitamin B12 erhältlichen 5,6-Dimethylbenzimidazols = 0,7,4). Das Absorptionsspektrum des gleichen Hydrolyseprodukts, das nach der Papierchrornatographie eluiert wurde, hat die für das 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol charakteristischen Absorptionsspitzen bei 281 und 289 m#t, während das aus Vitamin B" erhältliche Dimethylbenzimidazol Absorptionsspitzen bei 275,5 und 283 m#L hat.
• Das Verfahren zum Abtrennen des in dem Rohextrakt ebenfalls enthaltenen Vitamins Bi. beruht auf der Eigenschaft 2., nämlich dem Unterschied zwischen den Verteilungskoeffizienten der beiden Substanzen in dem aus n-Butanol und einer 2411/#gen Ammoniumsulfatlösung bestehenden Zweiphasensystem.
• Das Verfahren wird in einer automatischen Einrichtung durchgeführt, die jener ähnlich ist, die von Craig (L. C. Craig, Anal. Chem., Nr. 22, S. 1346, 1950; L. C. Craig, W. Hausmann, E. H. Ahrens, E. Harfenist, ebd., Nr. 23, S. 1236, 1951) beschrieben wurde und 200 Röhren aufweist, wobei die obere Phase im Kreislauf geführt wurde. Die Trennung ist vollständig, wenn die beiden dem Analog A bzw. dem Vitamin B" entsprechenden farbigen Schichten klar voneinander getrennt erscheinen.
• Der Gehalt der Röhren wird durch Chromatographie kontrolliert. Die nur das Analog enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Zu der Alkoholphase wird ein Lösungsmittel zugesetzt, das die Löslichkeit des Cobalamins herabsetzt, so daß dieses mit Wasser extrahiert und mit der wäßrigen Phase vereinigt werden kann. Aus der wäßrigen Salzlösung wird das Analog mit zur Extraktion von Cobalaminen, d. h. von Vitamin-13,-ähnlichen Substanzen geeigneten Lösungsmitteln, beispielsweise Phenol oder Naphtholen, ihren Homologen oder Halogenderivaten, allein oder im Gemisch mit anderen Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, extrahiert. Dann wird es mit Azeton oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel auf einem Adsorptions- oder Filtrationsmittel auf der Grundlage von Kieselerde ausgefällt, aus dem es mit Alkoholen, die eine niedrige Anzahl von Kohlenstoffatomen haben, gelöst wird. Die alkoholische Lösung wird mit Wasser gemischt, der Alkohol verdampft und das Analog aus der wäßrigen Lösung durch Zusatz von 3 bis 4 Volumen Azeton ausgefällt.
• Das so erhaltene Analog zeichnet sich durch seine biologische Wirksamkeit als Wachstumsfaktor für Mikroorganismen, welche Vitamin Bi. brauchen, aus.
• Wie das Vitamin B12 fördert das Analog A das Wachstum von höheren Tieren, die auf einer Vitamin-B,2-armen Diät gehalten werden.
• Analoge B und C Bei Zusatz von 2,4,5-Triaminotoluol bilden Kulturen von Nocardia rugosa zusammen mit Vitamin B12 zwei andere Cobalamine (Analoge B und C), die sich von dem Vitamin Bi. durch folgende Eigenschaften unterscheiden: a) Bei der Säurehydrolyse geben beide Analoge B und C eine Substanz ab, die an ihrem chromatographischen Verhalten, ihrer Fluoreszenz und ihrem Absorptionsspektrum bei verschiedenen pH-Werten als 5(6)-Methyl-6(5)-aminobenzimidazol erkennbar ist. Ferner wird eine nicht definierte Substanz gebildet, die ein höheres clircmatographisches Rf, gelbe Fluoreszenz und eine Absorptionsspitze bei 260 mtL hat und die ebenfalls in ähnlich sätirebehandelten Lösungen von 5(6)-Methyl-6(5)-aminobenzimidazol gefunden wird.
• b) Elektrophoreseverhalten: Die beiden Analoge B und C unterscheiden sich von dem Vitamin BU deutlich durch ihr elektropositives Verhalten in 0,5 n-Essigsäurelösungen und voneinander durch ihre verschiedenen Beweglichkeiten zur Kathode.
• c) Chromatographisches Verhalten: Bei der Chromatographie auf Papier in sek.Btitylalkohol-Essigsäure-Wasser nach j. E. Ford u. a. können die beiden Analoge B und C von dem Vitamin B" infolge ihrer geringeren Wanderungsgeschwindigkeit (Rf IRf B" = 0,45) unterschieden werden.
• d) Absorptionsspektrum: Das Absorptionsspektrum der Analoge B und C unterscheidet sich von dem des Vitamins B" in der Zone zwischen 260 und 330 m#t. In dieser Zone sind zwei Absorptionsbanden bei 278 bzw. 300 bis 305 mp. erkennbar, deren relative Intensität sich mit dem pH-Wert verändert, während die Bande bei 300 bis 305 m#t bei pH > 3,6 klarer wird. Das Absorptionsspektrum ermöglicht auch eine Unterscheidung der beiden Analoge voneinander. Beispielsweise hat das stärker elektropositive Analog bei pH 3,6 eine sehr deutliche Spitze bei 278 m#L und einen Absatz bei 295 bis 305 m#t,'während das weniger elektropositive Analog bei 278 und 300 m[i zwei Spitzen von gleicher Intensität zeigt. Dieses Spektralverhalten bestätigt ebenfalls, daß in den Analogen 5(6)-Methyl-6(5)-aminobenzimidazol anwesend ist, dessen Ultraviolettspektrum bei einem sauren pH-Wert zwei Spitzen bei 270 und 278 m#t und bei einem alkalischen pII-Wert eine einzige Spitze bei 295 mix zeigt.
• e) Biologische Wirksamkeit: Die beiden neuen Analoge B und C sind als Wachstumsfaktoren für alle Mikroorganismen wirksam, die Vitamin B,2 brauchen, was durch das Verfahren nach B. D. Davis, E. Mingioli (j. Bacteriol., Nr. 60, S. 17, 1950) für E. coli 113 ',!3, durch das Verfahren nach U. S. P. IV, Third suppl. Revision: 15, 1951, für Lactobacillus leichmannii 7830, durch das Verfahren von S. H. Hutner, L. Provasoli und G. Filfus (Am. N. j. Acad. Sci, Nr. 56 (5), S. 856, 1953) für Ochromonas malhamensis und durch das Verfahren von S. H. H u t n e r u. a. (angeführt von Glick in Methods of Biochemical Analysis, Bd. II, S. 81, 1957) für Euglena gracilis var. bacillaris festgestellt wurde.
• Wie das Vitamin B" fördern die beiden Analoge B und C in gleichem Maße das Wachstum von höheren Tieren (Ratten, Hühnern), die auf einer Vitamin-13,-armen Diät gehalten wurden. Eine derartige Wirkung wird nach 4- bis 5wöchiger Behandlung bei einer zweimal wöchentlichen subkutanen Verabreichung von 5 bis 40 y pro kg Körpergewicht und oraler Verabreichung von 20 bis 80,y pro kg der Diät erzielt. Beträchtliche Mengen der beiden Substanzen finden sich selbst nach Unterbrechung der Behandlung in dem Serum, der Leber und der Niere. Außerdem erweisen sich die Analoge B und C bei der Behandlung von Patienten wirksam, die an perniziöser Anämie, Megaloblastanämie oder Pernicosiformanämie (nach Gastrektomie) leiden und bewirken dabei eine beträchtliche Erhöhung der Anzahl der Reticulazyten, des Hämoglobinwertes und der Anzahl der Erythrozyten sowie eine Herabsetzung des Globularwertes bei ähnlichen Dosen, wie sie bei Vitamin B,2 angewendet werden.
• Die Trennung der beiden Analoge von dem in dem Rohprodukt enthaltenen Vitamin B12 und voneinander wird unter Ausnutzung ihrer verschiedenen elektrochemischen Eigenschaften mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt, dasvon H. Dellweg, E. Becker, X. Bernhauer (Biochem. 2, Nr. 328, S. 88, 1956) beschrieben wurde. Aus den nach der Elektrophorese erhaltenen 0,5 n-Essigsäurelösungen werden beide Analoge B und C nach Verfahren gewonnen, die jenen ähnlich sind, die nach der Gegenstromextraktion für das Analog A angewendet wurden. Im allgemeinen muß die Elektrophorese der die weniger elektropositive Verbindung enthaltenden Fraktion wiederholt werden, damit diese einwandfrei von der anderen abgetrennt wird.
• Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

  Beispiel 1

  Nährsubstrat

  4 % Malzextrakt,

  4 0/0 Glukose,

  1,50/, N-Z-Amin,

  0,511/0 Maisquellwasser,

  0,501, CaCO"

  0,51)10 (NH4)2S04

  0,10/, NaC1,

  10millionstel % COC)2'

  .Nach Sterilisieren und Kühlen auf 33'C werden 501 Substrat mit 100 cm' einer Suspension geimpft, die durch Waschen einer Kultur auf einem Kuchen aus Nähragar erhalten wurde. Die Masse wird 25 bis 40 Stunden bei 33'C vergoren und dabei mit 30 bis 50 1 durchgeblasener Luft/min durchlüftet und mit 150 bis 300 Uimin gerührt. Wenn die Trübung der Kultur einem Trockenge-,vicht von 3 bis 5 mgl'cm3 entspricht, wird die erhaltene Kultur zum Impfen eines größeren Substratvolumens in einem Gärbehälter verwendet.
• Das in dieser Stufe verwendete Substrat hat die oben angebene Zusammensetzung zuzüglich 100 bis 400 y,/cm3 2,3-Diaminotetrahydronaphthalin, das nach Sterilisation in wäßriger Lösung oder durch 2stündige Berührung mit 950/,igem Alkohol zugesetzt wird.
• Nach vollständiger Durchführung der Gärung erhält man 45 1 einer vergorenen Maische, die nach Zusatz von 0,5 % NaCN 30 Minuten lang in einem Autoklav bei 120'C erhitzt werden. Das Mycelium wird durch Abschleudern und Waschen in Wasser abgetrennt, wobei die Waschablaugen der klaren Flüssigkeit zugesetzt werden, die dadurch auf ein Volumen von 48 1 gebracht wird. Diese Flüssigkeit wird mit 620 cm3 Kresol gesättigt und zuerst mit 30/,igem und dann mit 20/,igem Kresol im Gemisch mit Tetrachlorkohlenstoff in einemVolumenverhältnis von 40: 60 extrahiert. Nach Zusatz von 34 (1f, Pyridin zu dem Extrakt wird das Gemisch zweimal mit demselben Volumen Wasser gerührt. Die Vitamin Bl, und das Cobalaminanalog enthaltende wäßrige Lösung wird über ein ammonisches quaternäres Anionaustauscher-Kunstharz geführt. Das Vitamin B" und das Cobalaminanalog bleiben im Effluenten und werden nach Zusatz des zum Waschen des Harzes verwendeten Wassers, wie vorstehend beschrieben, durch Behandlung mit Kresol und Chloroform aus dem flüssigen Effluenten extrahiert.
• Bei Zusatz von Azeton und Äther zu dem Extrakt erhält man einen flockigen Niederschlag, der nach Zusatz von einem Adsorptions- oder Filtrationsmittel auf der Grundlage von Kieselerde auf einem Filter aufgefangen und in 150 cm' Wasser gelöst wird. Die Lösung enthält 200 mg Vitamin B" und Cobalaminanaloge. Diese werden auf 200 cm3 mit Cyanursäure behandeltem ammonischem quaternärem Anionaustauscher-Kunstharz adsorbiert und von diesem Harz mit einer 50/,igen Essigsäurelösung eluiert.
• In dieser Stufe, tritt kein Aktivitätsverlust ein. Nach der Extraktion mit Kresol und Tetrachlorkohlenstoff, Umfällen und Filtrieren mit einem aus Kieselgur bestehenden Adsorptions- und/oder Filtrationsmittel, wie vorstehend beschrieben, wird der Niederschlag in Methanol gelöst, die Lösung auf 20 cm3 eingeengt, 48 Stunden bei 5'C gelagert, filtriert und mit 25 cm3 'Wasser behandeft. Dann wird die Lösung auf 20 cm3 eingeengt und mit 70 cm3 Azeton versetzt. Von der Lösung werden 120 mg Kristalle, welch Vitamin B12 und das neue Analog A enthalten, abgetrennt und zu auf ähnliche Weise erhaltenen 101 mg zugesetzt. Dann werden sie in einer Einrichtung nach Craig der Gegenstromtrennung unterworfen, wobei in jedes Rohr je 25 cm3 n-Butanol und 2401/,ige wäßrige (NH,),SO,-Lösung eingesetzt werden.
• Die Substanz wird in den ersten fünf Rohren gelöst. Nach 334 Durchläufen wird in den Rohren 81 bis 115 die nur das gewünschte Analog enthaltende Fraktion und in den Rohren 51 bis 80 ein Gemisch von Vitamin B" und dem neuen Analog erhalten.
• Der Inhalt der Rohre 81 bis 115 wird zusammengefaßt. Aus der Alkoholphase wird das Cobalaminanalog durch Zusatz von 1 Volumen Tetrachlorkohlenstoff und Schütteln mit Wasser extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird der wäßrigen Phase zugesetzt und das Gemisch auf 1190 cm3 mit einem Gehalt von 116 mg Cobalamin eingeengt.
• Die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, Ausfällung und Umkristallisation des Analogs A werden nach Verfahren durchgeführt, die den vorstehend beschriebenen ähneln. Man erhält 80 mg nadelartige rote Kristalle mit einem Gehalt von 8004 Cobalamin.

  Beispiel 2

  Nährsubstrat

  4 Oio Glukose,

  2 0.;;!o Laktose,

  01/0 Pepton,

  0,240/,) Hefeextrakt,

  0,2 % X H, P 0,

  0,5 % NaH,PO4,

  1 % NaC1,

  10millionstel % CoC1.-

  Die Gärung erfolgt ähnlich, wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei jedcch an Stelle von 2,3-Diaminotetrahydronaphthalin 100y/cm3 2,4,5-Triaminotoluolhydrochlorid zugesetzt werden.
• Nach vollständigem Vergären der Maische werden alle Cobalamine, nämlich das Vitamin B" und die Analoge B und C, ähnlich, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert.
• Man erhält 129,4 mg Kristalle mit einem Gehalt von 82,7 mg eines Gemisches von Bl, und den beiden elektropositiven Cobalaminanalogen B und C. je 40 mg dieses Gemisches werden in 4 cm3 0,5 n-Essigsäure gelöst und in eine Kolonne zur Elektrophorese auf Papier nach Dellweg (a. a. 0.) eingebracht. Die Einrichtung wird 48 Stunden lang einer EMF von 1000 V ausgesetzt, worauf die die elektropositiven Faktoren enthaltenden Schichten am Ende der Zellulosekolonne deutlich erkennbar sind. Dann wird der Strom abgeschaltet und werden die Schichten einzeln mit 0,5 n-Essigsäure eluiert.
• Aus den vereinigten Lösungen aller Elektrophoreseverfahren werden nach den im Beispiel 1 beschriebenen Methoden die Cobalaminanaloge B und C mit Kresol extrahiert und aus Wasser und Azeton umkristallisiert. Man erhält nadelförmige Kristalle, die bei 37'C unter Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet werden.
• Aus der am stärksten elektropositiven Fraktion gewinnt man 26,8 mg Kristalle (Gehalt 86,5 "/,). Die weniger elektropositive Fraktion wird erneut der Elektrophorese unterworfen, um die etwa noch darin enthaltenen kleineren Mengen des stärker elektropositiven Faktors zu beseitigen.
• Schließlich erhält man 39,9 mg Kristalle von 83,040/,.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE-1. Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Cobalaminen unter Verwendung von Mikroorganismen des Stammes Nocardia rugosa nach Patent 10,16 258, dadurch gekennzeichnet, daß der Nährflüssigkeit ein 2,3-Diamino-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin oder 5,6-Tetrahydrc,#benzolbenzimidazol oder 2,4,5-Triaminotoluol oder 5(6)-Amino-6(5)-methylbenzimidazol zugesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung nach dem Submersverfahren mit Durchlüftung erfolgt.