DE3315678C2

DE3315678C2 -

Info

Publication number: DE3315678C2
Application number: DE3315678A
Authority: DE
Inventors: Gheorghe Coatesville Pa. Us Cioca
Original assignee: Seton Co Newark Nj Us
Current assignee: Seton Co Newark Nj Us
Priority date: 1982-05-26
Filing date: 1983-04-29
Publication date: 1992-06-17
Also published as: FR2527621A1; DE3315678A1; ATA185383A; FR2527621B1; AT393795B; JPS58212447A; US4412947A; JPH0350550B2

Description

Die Erfindung betrifft eine Weiterbildung des in der US-PS 42 79 812 (DE-OS 30 34 273) beschriebenen Verfahrens zur Herstellung eines kohärenten, porösen Kollagenfolienmaterials, wobei natürliches, unlösliches Kollagen gereinigt, mit einer wäßrigen Lösung einer schwach organischen Säure suspendiert und die Suspension unter Bildung eines kohärenten, porösen, nativen Kollagenfolienmatrials gefriergetrocknet wird. Bei diesem Verfahren wird das Kollagen vor der Gefriertrocknung aufgelöst, d. h. die Vernetzungen zwischen den Kollagenteilchen werden aufgebrochen.

Unter dem hier verwendeten Ausdruck "natürliches, unlösliches Kollagen" ist Kollagen zu verstehen, das in einer wäßrigen alkalischen Lösung oder in einer anorganischen Salzlösung nicht ohne chemische Modifizierung gelöst werden kann, und dazu gehören Felle bzw. Häute, Spaltleder und andere Säugetier- oder Reptilienfelle bzw. -häute. Unter dem Ausdruck "natürliches, unlösliches Kollagen" ist insbesondere das Corium (die Lederhaut) zu verstehen, bei dem es sich um die Zwischenschicht einer Rinderhaut zwischen der Narben- bzw. Haarseite und der Fleischseite handelt.

Bei jungen Tieren liegt eine geringe intermolekulare und interfibrillare Vernetzung vor, so daß das Kollagen bis zu einem gewissen Grade löslich ist. Während des Alterungsprozesses tritt jedoch eine intermolekulare und interfibrillare Vernetzung auf, wodurch das Kollagen unlöslich wird.

Die Verwendung von Kollagen in praktisch reiner Form ist bereits für viele Verwendungszwecke vorgeschlagen worden, beispielsweise für Brandwundenverbände, wie in den US-PS 39 39 831 und 35 14 518 beschrieben, und ähnliche medizinische Anwendungen, wie in den US-PS 31 57 524 und 36 28 974 beschrieben.

Die US-PS 36 37 642 ist ein Beispiel für ein Verfahren zum Auflösen von unlöslichem Kollagen und Regenerieren der Faser. Es sind auch bereits weitere Verfahren zur Solubilisierung und Regenerierung von Kollagen unter Verwendung von Enzymen zur Spaltung der intra- und interfibrillaren Bindungen, wie beispielsweise in der US-PS 30 34 852 beschrieben, sowie Verfahren zur Umwandlung von Kollagenfasermassen in ein folienartiges Material, wie beispielsweise in den US-PS 29 34 447 und 29 34 446 beschrieben, vorgeschlagen worden.

Nach den US-PS 39 39 831 und 37 42 955 können medizinische Verbände bzw. Verbandmaterialien aus Kollagen mit darin dispergierten Antibiotika und dgl. hergestellt werden, welche die Abheilung von verbrannter Haut unterstützen.

Außerdem ist in der US-PS 37 42 955 faserförmiges Kollagen vorgeschlagen worden, das hämostatische und wundverschließende Eigenschaften hat. Das Kollagen liegt in Form eines flockigen Faserprodukts vor, das unter Anwendung mechanischer Methoden in nicht-gewebte Gewebe oder Matten (Vliese) umgewandelt werden kann.

Weiterhin ist aus der DE-OS 26 25 289 ein Verfahren zur Herstellung eines sterilen Kollagenprodukts mit filz- bzw. vliesartiger Faserstruktur bekannt, wobei das aufbereitete Rohkollagen durch Umfällung gereinigt, das gereinigte Kollagen entsalzt und das gereinigte und entsalzte Kollagen in einem wäßrigen Medium, wie verdünnter Essig- oder Ameisensäure, gelöst wird. Die Bindungen zwischen den Kollagenteilchen werden hierbei aufgebrochen.

Schließlich betrifft die AT-PS 2 68 532 ein Verfahren zur Herstellung eines Faserkörpers aus Kollagen, wobei ein mikrokristallines Kollagen eingesetzt wird, von dem mindestens etwa 10 Gew.-% aus Bündeln von vereinigten Tropokollageneinheiten bestehen und jedes Bündel eine 1 µm nicht übersteigende Teilchengröße aufweist. Der Durchmesser der Tropokollageneinheiten beträgt ungefähr 25 bis einige 100 Å: Auch hier ist also die Bindung zwischen den Kollagenteilchen aufgebrochen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines kohärenten, porösen Kollagenfolienmaterials unter Anwendung der eingangs angegebenen Verfahrensschritte bereitzustellen, wonach die Integrität des natürlichen Kollagens erhalten bleibt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man natürliches, unlösliches teilchenförmiges Kollagen mit einer Teilchengröße von weniger als etwa 1 mm verwendet.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene poröse Kollagen Folienmaterial (nachstehend auch als "Kollagenschwamm") bezeichnet, ist als Wundverband, Brandwundenverband, hämostatische Folie oder dergl. verwendbar.

Das erfindungsgemäß verwendete, natürliche, unlösliche, teilchenförmige Kollagen stammt vorzugsweise aus einer Rinderhaut, die durch kälken enthaart, zur Herstellung von praktisch reinen, nativen, unlöslichen Kollagenfasern entfettet und bis auf eine Teilchengröße von weniger als 1 mm, vorzugsweise weniger als 0,5 mm, granuliert worden ist. Die Entfettung und Granulierung kann mit Materialien, Vorrichtungen und unter Anwendung von Verfahren erfolgen, wie sie dem Fachmann auf diesem Gebiet an sich bekannt sind. Wichtig ist, daß das zur Herstellung des erfindungsgemäßen Schwammes verwendete fertige, teilchenförmige, native Kollagen seine Vernetzungen, d. h. seine Unlöslichkeit im Wasser, wäßriger Säure, wäßriger Base oder Salz behält, dabei jedoch praktisch rein bleibt, um so die nicht-antigenen und nicht-allergischen Eigenschaften des nativen Kollagens aufrechtzuerhalten.

Nach der Gewinnung des teilchenförmigen, nativen Kollagens in praktisch reiner Form wird das teilchenförmige Kollagen in der wäßrigen Lösung einer schwachen organischen Säure dispergiert. Die wäßrige Lösung der organischen Säure enthält bis zu etwa 5 Gew.-% Kollagen, vorzugsweise bis zu 3 Gew.-% Kollagen in Form von Teilchen. Die zur Herstellung der wäßrigen Säurelösung geeigneten Säuren sind die schwachen organischen Säuren, wie Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Ascorbinsäure, Weinsäure und dgl. Vorzugsweise wird der pH-Wert der wäßrigen Säurelösung auf einen Wert unterhalb 4 eingestellt, um eine gute Dispersion des teilchenförmigen Kollagens zu erzielen. Bei Verwendung von Ascorbinsäure ist eine 1%ige Lösung ausreichend, während bei Verwendung von Essigsäure oder Weinsäure eine 0,5%ige Säurelösung erforderlich ist. Vorzugsweise sollte der pH-Wert der wäßrigen Lösung 3 bis 4 betragen.

Nach der Herstellung der Lösung wird die Lösung mit einer Temperaturerniedrigungsrate von 18 bis 24°C/Stunde eingefroren, so daß die gebildeten Eiskristalle extrem klein sind und die Vernetzungen oder Kollagenketten nicht spalten, so daß die Nativität und natürlichen unlöslichen Eigenschaften des teilchenförmigen Kollagens aufrechterhalten werden. Um die gewünschte Einfriergeschwindigkeit zu erzielen, wird die Kollagendispersion bei -60 bis -70°C in einen Gefrierschrank gegeben.

Die bei einer Anfangstemperatur von -60 bis -70°C eingefrorene Dispersion wird dann in einen Gefriertrockner überführt und bei 1,33×10^-1 bis 1,33×10^-3 Pa vakuumsublimiert. Die Gefriertrocknung dauert 12 bis 24 Stunden bei einer Endtemperatur von etwa 30°C.

Obgleich die Zerstörung der chemischen Bindungen im Kollagen durch Einfrieren verhindert wird, tritt eine gewisse minimale kryogene Zerstörung auf. Diese kryogene Zerstörung sorgt für Stellen auf den Kollagenprodukt für reaktive und assoziative Zentren, die während des Gefriertrocknungsprozesses dieses reaktionsfähig machen, so daß sich die einzelnen Kollagenfasern miteinander verbinden unter Bildung einer zusammenhängenden Folie.

Obgleich reaktive Zentren gebildet werden, behält das Kollagen seine ursprünglichen Eigenschaften, wobei in der Regel die Dreifachhelixkonfiguration der Fibrillen beibehalten wird und die Fibrillen ihre Ausrichtung mit einer axialen Periodizität von etwa 64 nm beibehalten.

Der erfindungsgemäß hergestellte Kollagenschwamm gewinnt seine Integrität in dem spezifischen Gefriertrocknungsverfahren unter Aufrechterhaltung seiner Nativität (seines natürliche Charakters).

In der Regel hat der erfindungsgemäß hergestellte Kollagenschwamm eine Rohdichte von 0,005 bis 0,0065 g/cm³ und vorzugsweise eine Dicke von 5 bis 7 mm.

Es ist klar, daß die Reinheit und Nativität (der natürliche Charakter) des zur Herstellung der Dispersion verwendeten teilchenförmigen Kollagens während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten werden müssen.

Der erfindungsgemäß hergestellte Kollagenschwamm weist wesentliche Vorteile auf, wenn er für medizinische Anwendungszwecke eingesetzt wird.

Der erfindungsgemäße Kollagenschwamm trocknet die Wunde aus und koaguliert die Sekrete unter Aufrechterhaltung seiner Kapillarwirkung und hydrophilen Wirkung auch nach der Aufnahme von Plasma und Sekret. Der Kollagenschwamm verhält sich somit wie eine trockene, nicht- retentive Kruste, die den schnellen Flüssigkeitsablauf erlaubt, so daß die Wunde aufgrund seines Koagulationsvermögens trocken bleibt und er dennoch schmerzfrei für den Patienten leicht von der Wunde entfernt werden kann. Es wurde gefunden, daß der erfindungsgemäße Kollagenschwamm weder an dem Wundauskleidungsgewebe haftet noch das Gewebe durch den Kollagenschwamm negativ beeinflußt wird.

Außerdem ist der Kollagenschwamm mit den meisten Arzneimitteln, wie Antibiotika und dgl., verträglich, so lange die Poren nicht verstopft sind, und er ist verwendbar in Kombination mit anderen Verbänden bzw. Verbandmaterialien. Außerdem schützt der Schwamm die Wunde gegen mechanische Verletzung.

Wegen des hohen Reinheitsgrades des zur Herstellung des Schwammes verwendeten nativen Kollagens und der Reinheit des resultierenden nativen Kollagenschwammes ist der Schwamm nicht-allergisch und nicht-antigen.

Außerdem bietet der erfindungsgemäß hergestellte Kollagenschwamm eine Reihe von physikalischen Vorteilen, da er leicht gelagert und vom Behandlungspersonal leicht gehandhabt werden kann und auch vom Patienten leicht getragen werden kann, ohne daß das Unbehagen auftritt, das normalerweise mit großen Gazeverbänden verbunden ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den nachfolgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

90,8 kg einer frischen, mit Kalk gespaltenen Rinderhaut wurden in einer 272,4 kg Wasser von 20°C und 2,7 kg 37%ige Chlorwasserstoffsäure enthaltenden Holztrommel behandelt. Nach dem Einbringen der Spaltstücke, des Wassers und der Säure wurde die Trommel 4 Stunden lang in Rotation versetzt. Diese Anfangsstufe wurde durchgeführt, um restlichen Kalk von dem Kollagen zu entfernen. Nach der Kalkentfernung wurden die Spaltstücke 3 Stunden lang in der Holztrommel bei einem Flottenverhältnis von 300% mit Wasser gewaschen und das Wasser wurde jede Stunde ausgetauscht. Die gewaschenen Spaltstücke wurden dann mit einem Entfettungsmittel behandelt, in diesem Beispiel mit einer 3%igen Lösung eines nicht-ionischen Tensids. Das Waschen der Spaltstücke wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Holztrommel bei einem Flottenverhältnis von 200% durchgeführt. Die entfetteten Spaltstücke wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur bei einem Flottenverhältnis von 300% mit Wasser gewaschen, wobei jede Stunde das Wasser gewechselt wurde. Die Spaltstücke wurden durch Verschränken in der ausgebreiteten Form getrocknet, so daß überschüssiges Fett entfernt wurde. Das Verschränken wurde 16 Stunden lang bei 60°C durchgeführt. Nach dem Trocknen lag das Kollagen in einer verhältnismäßig reinen Form vor und es wurde bei einem Flottenverhältnis von 300% 2 Stunden lang in ein organisches Lösungsmittel, in diesem Beispiel Petroläther, eingetaucht. Die Spaltstücke wurden getrocknet und zu 38,1 cm × 38,1 cm großen quadratischen Stücken zerschnitten. Die Stücke wurden bis zu einer Teilchengröße von 0,032 bis 0,4 mm pulverisiert und das Pulver wurde mit Petroläther extrahiert und erneut getrocknet, um restliche Öle, Fette oder ähnliche lösliche Hautbestandteile zu entfernen. Das trockene, teilchenförmige, native Kollagen wies die folgende chemische Analyse auf:

Protein\|90,7%
Salzkonzentration (als NaCl)	0,2%
Acidität (Milliäquivalente/g)	68,7
Hydroxypyrolin	10,36%
pH-Wert (1%ige wäßrige Dispersion)	3,5

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des teilchenförmigen Kollagens waren folgende:

β/α-Kettenverhältnis des Kollagens\|34/36
Molekulargewicht (Durchschnittswert)	140 000
Temperaturbereich bis zur Denaturierung	31,7-59,2°C

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 hergestellte natürliche, unlösliche, teilchenförmige Kollagen wurde in einer 0,5gew.-%igen wäßrigen Essigsäurelösung dispergiert. Die Dispersion enthielt 3 Gew.-% des teilchenförmigen Kollagens des Beispiels 1. Der pH-Wert der Dispersion des teilchenförmigen Kollagens betrug etwa 3,5.

Die Kollagendispersion wurde in einen 20 cm × 20 cm große Schale mit einer Tiefe von 10 mm eingeführt.

Die Kollagendispersion in der Schale wurde in einen Gefrierschrank bei etwa -65°C gestellt und bei einer Temperaturerniedrigung mit einer Geschwindigkeit von 18 bis 24°C/Stunde eingefroren, bis sie eine Endtemperatur von -60 bis -70°C erreicht hatte. Die gefrorene Lösung in der Schale wurde in einen Gefriertrockner gestellt und 16 Stunden lang ein Vakuum von 1,33×10^-1 bis 1,33×10^-3 Pa angelegt. Die Kollagenlösung hatte eine Anfangstemperatur von -65°C und nach 16stündiger Vakuumsublimation eine Endtemperatur von 30°C.

Nach dem Erreichen der Endtemperatur von 30°C war der Kollagenschwamm eine zusammenhängende offenzellige Folie mit hämostatischen Eigenschaften, die Wundsekret durch die Dicke des Schwammes transportieren konnte unter Beibehaltung ihrer Kapillarwirkung und hydrophilen Wirkung. Der Kollagenschwamm gemäß diesem Beispiel 2 hatte eine Rohdichte von 0,005 g/cm³ und eine Dicke von 5 mm.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines kohärenten, porösen Kollagenfolienmaterials, wobei natürliches, unlösliches Kollagen gereinigt, mit einer wäßrigen Lösung einer schwach organischen Säure suspendiert und die Suspension unter Bildung eines kohärenten, porösen, nativen Kollagenfolienmaterials gefriergetrocknet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man natürliches, unlösliches teilchenförmiges Kollagen mit einer Teilchengröße von weniger als etwa 1 mm verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man natürliches, unlösliches, teilchenförmiges Kollagen mit einer Teilchengröße von weniger als etwa 0,5 mm verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als schwache organische Säure Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Ascorbinsäure und/oder Weinsäure verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension verwendet, die bis zu etwa 5 Gew.-% teilchenförmiges Kollagen enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension verwendet, die bis zu etwa 3 Gew.-% teilchenförmiges Kollagen enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Säurelösung verwendet, die bis zu 1 Gew.-% Säure enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gefriertrocknen durchführt, indem man die Lösung einfriert durch Temperaturerniedrigung mit einer Geschwindigkeit von 18 bis 24°C/Stunde und die Lösung mindestens 12 Stunden lang bei 1,33×10^-1 bis 1,33×10^-3 Pa vakuumtrocknet.