DE3382658T2

DE3382658T2 - Glycolytische promotoren fuer regulierte proteinexpression: protease-inhibitor.

Info

Publication number: DE3382658T2
Application number: DE8383304668T
Authority: DE
Inventors: Glenn Hitoshi Kawasaki; Richard Grant Woodbury
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1982-08-13
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2003-08-13
Also published as: IL69465A; DE3382658D1; JP2991670B2; JP2694134B2; AU3304893A; JPS5991886A; AU577259B2; AU1870088A; AU658973B2; DE3382821T2; EP0103409A2; JPH08224092A; EP0103409A3; AU1770083A; JP2509163B2; DE3382821D1; JPH1045799A; EP0103409B1

Description

Die Fähigkeit, eine Expression fremder, d. h., exogener, DNA in einzelligen Mikroorganismen zu erhalten, stellte eine Möglichkeit zur Verfügung, bequem lange Polypeptidketten von Interesse herzustellen. Beinahe sofort wurden unterschiedliche Polypeptide, beispielsweise das kleine Hormon Somatostatin, und anspruchsvollere Polypeptide, beispielsweise Insulin, Interferone, Thymosin und eine Vielzahl von Impfstoffen mit Kapsidproteinen, hergestellt und darüber in der Literatur berichtet. Die ersten Arbeiten wurden zum großen Teil in dem Bakterium E. coli durchgeführt, das zum Gegenstand intensiver Untersuchungen geworden ist, weil die Wissenschaftler mit vielen Aspekten seiner genetischen Struktur und seiner Eigenschaften vertraut waren. Die anfängliche Aufmerksamkeit richtete sich daher auf die Erzeugung fremder Proteine in E. coli. Sobald die Fähigkeit, E. coli als einen Wirt zu verwenden, etabliert war, regten die Grenzen und Nachteile der Verwendung von E. coli die Verwendung anderer Wirte an.
Ein Wirt, der besonders attraktiv zu sein schien, weil ihm viele der Mängel von E. coli fehlten, war Hefe. Hefe ist jedoch ein Eukaryont und hat daher ein anspruchsvolleres genetisches System. Darüber hinaus ist über das Hefegenom weniger bekannt als über das von E. coli. Um Hefe als einen Wirt für die Erzeugung von Proteinen, die für Hefe fremd sind, zu verwenden, war eine Anzahl von Entdeckungen erforderlich, und es mußten neue Materialien verfügbar gemacht werden.
Zuerst war ein Replikationssystem erforderlich, das Stabilität in Hefe zur Verfügung stellte, entweder als ein extrachromosomales Element oder mittels Integration in das Hefechromosom. Zusätzlich mußten die mit Transkription und Expression zusammenhängenden regulatorischen Funktionen entwickelt werden, um die Expression eines gewünschten Proteines zu gestatten. Darüberhinaus bestand Unsicherheit darüber, ob fremde DNA-Sequenzen transkribiert und translatiert werden würden, und, wenn sie exprimiert würden, ob die resultierenden Polypeptide in der Hefezelle überleben würden. Darüberhinaus blieb die Wirkung der fremden Proteine auf die Lebensfähigkeit der Hefezelle zu bestimmen, sowie die Wirkung von rekombinanter DNA (RDNA) auf Mitose, Sporulation und vegetatives Wachstum.
Es hat daher beträchtliche Bemühungen gegeben, neue RDNA- Systeme in Hefe zu entwickeln, die eine regulierte Expression eines Proteines von Interesse sowie eine hocheffiziente Produktion eines solchen Proteines erlauben würden.
Hitzeman et al. J. Biol. Chem., 255:12073-12080 (1980) beschreiben ein Plasmid mit einem 3-Phosphogyceratkinase (PGK)-Gen aus Hefe und begleitende regulatorische Signale, fähig zur Expression in Hefe. Andere interessante Referenzen umfassen Clifton et al., Genetics, 88:1-11 (1978); Clark und Carbon, Cell, 9:91-99 (1976); Thomson, Gene, 1:347-356 (1977); Holland und Holland, J. Biol. Chem., 254:5466-5474 (1979); Holland und Holland, ibid. 254:9830-9845 (1979); Nasmyth und Reed, Proc. Hat. Acad. Sci., 77: 2119-2123 (1980); Broach et al, Gene, 88:121-133 (1979), und Williamson et al., Nature, 283:214-216 (1980).
EP-A-073657 offenbart ein extrachromosomales Element, das zur Replikation in Hefe fähig ist und das einen Hefepromotor enthält, der zur Regulation der Transkription eines glycolytischen Proteins fähig ist, wobei dem Promotor stromabwärts ein Gen folgt, das ein anderes Protein als das, das normalerweise von einem solchen Promotor reguliert wird, exprimiert.
Chandra et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 103(2) (1981), Seiten 751-758, offenbaren ein im wesentlichen unglycosyliertes Pavian Pre-Pro-α-1-Antitrypsin.
Alber und Kawasaki, J. Molecular and Applied Genetics, Band 1(5) (1982), Seiten 419-434, offenbaren die Sequenz des Triosephosphatisomerase-Genes und -Promotors.
Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 78 (11) (1981), Seiten 6826-6836, offenbaren die Sequenz von humanem α-1-Antitrypsin.

Figurenbeschreibung

Die Fig. 1A und 1B sind cDNA-Sequenzen von zwei Formen des für humanes α-1-Antitrypsin kodierenden Genes.
Fig. 2 zeigt die Restriktionkarten der Plasmide CTEA32 und CAT1.
Fig. 3 ist ein Diagramm des Elektrophoresechromatogramms, das gereinigtes, erfindungsgemäß erzeugtes α-1-Antitrypsin zeigt.
Fig. 4 zeigt die Restriktionskarte des Plasmides C1/1.
Fig. 5 zeigt die DNA-Sequenz der multiplen Restriktionsstellen von pUC13.
Fig. 6 zeigt die Restriktionskarte des Plasmides pUCα1, das die DNA-Sequenz aus Fig. 1 enthält.
Fig. 7 ist die Restriktionskarte des Plasmides HAT4.
Es werden neue Hefepromotoren zur Verfügung gestellt, die die Transkription von Genen aus dem glycolytischen Abbauweg kontrollieren und bei der regulierten Erzeugung von für Hefe fremden Proteinen Verwendung finden. Promotoren von besonderem Interesse umfassen die Promotoren für Triosephosphatisomerase, Pyruvatkinase, Phosphoglucoseisomerase, Phosphoglyceratmutase, Hexokinase 1, Hexokinase 2, Glucokinase, Phosphofructokinase und Aldolase sowie das glycolytische Regulations-Gen. Der Proteaseinhibitor, α-1-Antitrypsin aus Säugetieren, wird unter Verwendung des Promotors für Triosephosphatisomerase exprimiert.
Es werden Verfahren und Zusammensetzungen für die regulierte effiziente Expression von fremder DNA in einem Hefewirt bereitgestellt. (Fremde DNA ist DNA, die natürlicherweise im Wildtyp nicht auftritt, insbesondere DNA von einer anderen Art, die normalerweise mit dem Wirt keine genetische Information austauscht.) Es werden neue Promotoren verwendet, die in den glycolytischen Abbauweg involviert sind und für ein hohes Maß von Proteinproduktion sorgen, so daß ein wesentlicher Anteil der Gesamtproteinproduktion der Hefezelle dem interessierenden Protein gewidmet werden kann. Darüberhinaus werden mit der Regulation der Produktion von glycolytischen Enzymen verbundene regulatorische Mechanismen geschaffen, so daß die Produktion der erwünschten Produkte moduliert werden kann. Weiterhin kann die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten werden, um die Effizienz und die Menge der Expression zu steigern.
Promotoren von Interesse sind jene Promotoren, die in die Expression von Triosiphosphatisomerase und Pyruvatkinase involviert sind, die durch das glycolytische Regulationsgen GCR1 kontrolliert werden. Die Gene des glycolytischen Abbauweges umfassen Hexokinase 1 und 2 (HXK1,2) Phosphoglucoseisomerase (PGI), Triosephosphatisomerase (TPI), Phosphoglyceratkinase (PGK), Phosphoglyceratmutase (GPM), Pyruvatkinase (PYK), Phosphofructokinase (PFK), Enolase (ENO), Fructose-1,6-diphosphataldolase (FDA), Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GLD) und Glycolyse-Regulationsprotein (GCR).
Die Promotoren können unter Verwendung einer Genbank mit großen Hefe-DNA-Fragmenten erhalten werden. Durch Einführen der Fragmente in entsprechende Vektoren, insbesondere Schaukelvektoren mit Replikons für Prokaryonten und Hefe, kann man die Hefe-DNA leicht amplifizieren und in ein Bakterium klonieren und dann die Hefe-DNA zur Komplementation in Hefemutantenzellen einführen. Auf diese Weise können Hefefragmente identifiziert werden, die auxotrophe Läsionen oder Mutationen in einem Hefewirt komplementieren.
Von besonderem Interesse ist ein Wirt, der sowohl in dem glycolytischen Abbauschritt von Interesse als auch einem getrennten biochemischen Weg, der von einem Marker in dem Vektor komplementiert wird, auxotroph ist. Sobald ein DNA-Segment mit dem gewünschten Gen etabliert ist, kann man mit verschiedenen Verfahren reklonieren, um das DNA-Segment zu verkürzen und ein Segment bereitzustellen, das in erster Linie das Gen von Interesse in Verbindung mit seinen regulatorischen Signalen für Transkription und Expression enthält.
Um den Promotor beizubehalten, ist es wichtig, daß das Initiatormethionin bestimmt wird und dieses Kodon für die Entwicklung der Strategie zum Einführen der fremden DNA stromabwärts vom Promotor verwendet wird. Zum Bereitstellen einer Stelle zum Einführen der fremden DNA können verschiedene Verfahren verwendet werden, so daß sie unter die regulatorische Kontrolle des Promotors aus dem glycolytischen Abbauweg gelangt.
Wo eine Restriktionsstelle günstigerweise einem Initiatormethionin-Kodon benachbart ist, kann das glycolytische Gen an dieser Stelle gespalten werden und die DNA mit Bal31 über verschiedene Zeiträume abgebaut werden, um so bis zum oder hinter das Initiatormethionin-Kodon abzubauen oder das Initiatormethionin-Kodon beizubehalten.
Wo es keine günstige Restriktionsstelle gibt, können andere Spleiß-Verfahren, beispielsweise Primer-Reparatur, verwendet werden. Ebenso kann durch Anwenden von in vitro-Mutagenese eine Restriktionsstelle in Nachbarschaft zum Initiatormethionin eingeführt werden, die für die ersten Aminosäuren des gewünschten Proteines kodiert. In jedem Fall wird ein linearisiertes DNA-Fragment erhalten, das den intakten Promotor für das glycolytische Produkt hat und normalerweise weitere DNA-Sequenzen einschließt, beispielsweise ein intaktes Replikon, einen oder mehrere Marker, oder ähnliches.
Beispielhaft für das oben angegebene Verfahren ist die Entwicklung eines Vektors mit dem Promotor für das TPI1-Gen. Der beispielhafte Vektor CV13 hat Replikons oder Replikationssysteme aus pBR322 und dem 2u-Plasmid aus Hefe, sowie das LEU2-Gen; er wurde für die Insertion eines Hefefragmentes, von dem gezeigt worden war, daß es das TPI1-Gen enthält, verwendet. Dies wurde durch Doppelselektion mit einer Hefemutante, die leu&supmin;, tpi&supmin; war, erreicht. Es wurde festgestellt, daß das TPI1-Gen eine einzelne KpnI-Stelle hat. Der Vektor wurde an der KpnI-Stelle gespalten und dann mit der Doppelstrang-Exonuklease Bal31 unterschiedlich lang behandelt, um die DNA bis ungefähr zum f-met-Kodon abzubauen. Dann wurden Linker insertiert, die die gewünschten Restriktionsstellen bereitstellten. Anschließend konnte fremde DNA insertiert werden, die eine Sequenz mit einem f-met-Kodon in der entsprechenden Position für die Initiation bereitstellte. Alternativ kann die fremde DNA unter Verwendung des f-met-Kodons des TPI1-Genes exprimiert werden.
Ähnliche Verfahren können mit den anderen genannten glycolytischen Genen durchgeführt werden, um die mit diesen Genen assoziierten Promotoren bereitzustellen. Die PYK-Sequenz hat eine günstige XbaI-Stelle für die Restriktion, wo unter kurzzeitiger Verwendung von Bal31 ein paar zusätzliche Basen entfernt werden können, so erforderlich, um bis zum oder über das Methionin-Kodon hinaus abzubauen. Von besonderem Interesse ist die Verwendung des GCR-Promotors, um die Expression der anderen in den glycolytischen Abbauweg involvierten Gene zu kontrollieren. Bei Verwendung des GCR-Genes in Verbindung mit anderen glycolytischen Promotoren, die der Expression von Fremd-DNA regulieren, kann man die anderen Promotoren an- oder abstellen, um so die Expression der fremden DNA zu regulieren. Daher kann man den Fortlauf des vegetativen Wachstums zulassen, bis eine gewünschte Zelldichte erreicht ist, bevor man die Produktion des gewünschten Polypeptides erlaubt.
Bei Verwenden entsprechender Auxotrophe kann man weiter die Expression der interessierenden Polypeptide durch Wahl des entsprechenden Nährmediums regulieren. Wo der gewählte Promotor durch das besondere Nährmedium aufgrund eines metabolischen Blocks reprimiert ist, kann ein Wechsel des Nährmediums die Expression induzieren. Weiterhin kann die Aktivität einer Anzahl von Promotoren des glycolytischen Abbauweges durch Repression oder Aktivierung der Expression durch das GCR-Gen oder andere regulatorische Kontrollen beeinflußt werden. Weiterhin können die regulatorischen Signale von GCR verwendet werden, das als Regulator für die Expression von GCR fungierende Polypeptid zu titrieren. Durch Vektoren, deren Kopienzahl gesteuert werden kann, kann man die Aktivität des GCR-Wildtyp-Genes variieren.
Um Expression zu erhalten, wird eine extrachromosomale Konstruktion mit Elementen hergestellt werden, die eine Anzahl von verschiedene Funktionen definierenden Sequenzen hat. Eine Funktion ist das Replikationssystem, das einen Teil eines Vektors bildet. Eine andere Funktion ist ein Promotor selbst oder in Verbindung mit der Fremd-DNA. Andere Funktionen umfaßt Expressionsinitiatoren und -terminatoren. Weiterhin werden selektierbare Marker vorhanden sein.
Bei der Entwicklung eines entsprechenden Vektors werden gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise, sowohl ein Replikationssystem für Hefe als auch ein Replikationssystem für einen Prokaryonten vorgesehen (Schaukelvektor). Das Replikationssystem für Hefe kann eines sein, das für die stabile Beibehaltung eines extrachromosomalen Elementes sorgt oder eines, das eine ausreichende Lebensdauer der DNA in dem Wirt bereitstellt, so daß eine annehmbare Wahrscheinlichkeit der Integration der DNA in den Wirt besteht. Die Integration kann durch Bereitstellen einer mit der Wirts-DNA homologen Sequenz stark gefördert werden, um so Rekombination zu ermöglichen. Im allgemeinen wird die homologe Sequenz mindestens ungefähr 800 bp, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 2000 bp haben. Daher können entweder Integration oder ein autonomes Replikationssystem, wie z. B. die Verwendung des ARS1-Genes, verwendet werden, um für die Beibehaltung der Fremd-DNA in dem Hefewirt zu sorgen. Das gewählte Replikationssystem sollte für eine brauchbare Kopienzahl, gewöhnlich größer als 1, bevorzugt größer als 5, sorgen. Eine große Vielzahl von Replikationssystemen auf einer großen Vielzahl prokaryontischer Vektoren ist verfügbar, beispielsweise pBR322, pACYC184, pSC101, pMB9, usw. Alternativ können eine oder mehrere Kopien der DNA-Konstruktion in das Wirtschromosom integriert werden. Die Replikationssysteme können außerdem bedingt reguliert werden, und sind gewöhnlich temperaturempfindlich, so daß die Replikation durch Veränderung der Temperatur an- und abgestellt werden kann.
Zusätzlich zu dem Replikationssystem werden ein oder mehrere selektierbare Marker vorhanden sein, wobei gewöhnlich mindestens ein Marker zusätzlich zur Fremd-DNA vorhanden ist, die als ein Marker dienen kann. Gebräuchliche Marker umfassen biocidale Marker, die eine antibiotische Resistenz bereitstellen, und solche, die Resistenz gegen Toxine und Schwermetalle zur Verfügung stellen. Ebenso ist es nützlich, einen auxotrophen Wirt zu verwenden und durch Komplementation Prototrophie bereitzustellen. Zusätzlich zu den gerade beschriebenen konventionellen Selektionssystemen sind die erfindungsgemäßen glycolytischen Gene besonders wünschenswerte Marker, da sie bei Verwenden von Zuckern als selektiven Substraten in entsprechenden Mutanten-Wirtsstämmen eine Selektion bereitstellen können.
Andere Gene können für eine Vielzahl von Zwecken ebenfalls in das extrachromosomale Element inseriert werden. Wo eine Integration in das Wirtsgenom gewünscht wird, kann eine homologe Sequenz für einen besonderen Bereich des Wirtsgenomes in das extrachromosomale Element einbezogen werden. Wo die Amplifikation einer oder mehrerer Sequenzen gewünscht wird, können Gene, von denen bekannt ist, daß sie für eine solche Amplifikation sorgen, beispielsweise die Dihydrofolatreduktase-Gene, die auf Methotrexatbelastung reagieren, oder Metallothionein-Gene, die auf Schwermetallbelastung antworten, in das extrachromosomale Element einbezogen werden, flankiert von den zu wiederholenden DNA-Bereichen. Weitere regulatorische Signale können ebenfalls einbezogen werden, z. B. Zentromere, autonom replizierende Segmente usw.
Um die interessierenden Promotoren zu isolieren, können Klone von chromosomaler Hefe-DNA durch ungezielte Verdaus oder mechanisches Scheren des Hefegenomes hergestellt werden. Die Gegenwart des gewünschten Genes wird dann durch Einführen eines homogenen Klones von einem Hefefragment in einen auxotrophen Wirt zur Komplementation bestimmt. Wünschenswerterweise kann das Klonierungsvehikel ein weiteres Gen haben, das eine weitere Basis für die Selektion bietet, so daß eine Doppelselektionstechnik verwendet werden kann. Die Mutanten sind im wesentlichen unfähig, auf einem limitierten Wachstumsmedium zu wachsen, so daß man auf die Gegenwart des gewünschten glycolytischen Genes durch Wahl des Mediums selektieren kann. Nach der Isolierung des Hefefragmentes mit dem gewünschten Gen kann das Fragment subkloniert werden, um überflüssige flankierende DNA-Bereiche zu entfernen und ein Fragment bereitzustellen, das leichter manipuliert werden kann. Das kleinere Fragment, das das gewünschte Gen enthält, mit einer Größe von weniger als ungefähr 500 Basenpaaren kann dann weiter kloniert werden, eine Restriktionskarte kann erstellt werden und es kann sequenziert werden, um so eine nützliche Quelle für die gewünschten Promotoren und die Insertion der Fremd-DNA bereitzustellen. Wie gezeigt, können auch die Promotoren selbst nützlich sein, wenn sie als Titrationsmittel für Repressoren oder Aktivatoren dienen, wo es wünschenswert ist, die Produktion eines bestimmten Enzymes in einem Hefewirt zu modulieren. Die Fremd-DNA kann von jeder Herkunft sein, entweder natürlich auftretend oder synthetisch, entweder prokaryontisch oder eukaryontisch. Von besonderem Interesse sind Säugetiergene, die eine Poly(aminosäure) exprimieren, d. h., ein Polypeptid oder Protein, das eine physiologische Aktivität hat. Poly(aminosäuren), die in Hefe hergestellt werden, können in einem unterschiedlichen Ausmaß durch Glycosylierung modifiziert sein, wobei die Glycosylierung nicht auftreten kann oder an Stellen auftreten kann, die sich von denen in natürlich auftretenden Säugetierpolypeptiden unterscheiden, oder in einem unterschiedlichen Ausmaß mit anderen Sacchariden. Es ist daher von großem Interesse, in der Lage zu sein, Polypeptide herzustellen, die von den natürlich auftretenden Polypeptiden hinsichtlich Ausmaß und Art der Glycosylierung unterschiedlich sind und in vielen Fällen auf eine oder mehrere Weisen abweichen, wie bei den Aminosäuresequenzen, wo Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren auftreten können. Die Säugetiergene können von einer großen Vielzahl von Säugetierquellen stammen, beispielsweise Haustieren (z. B. Rind, Schwein, Schaf und Pferd) und Primaten, z. B. Menschen und Affen.
Als ein Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemäßen Promotoren zum Herstellen einer aktiven Polypeptidzusammensetzung, das aus einer Reihe von Gründen auch von einem besonderen Interesse ist, wird ein Proteaseinhibitor beschrieben und hergestellt. Der Proteaseinhibitor hat die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie humanes α-1-Antitrypsin und ist zum Inhibieren einer Anzahl proteolytischer Enzyme fähig. Das humane α-1-Antitrypsin- Gen scheint innerhalb eines 9,6 kb EcoRI-DNA-Fragmentes im humanen Genom zu liegen. Die reife mRNA scheint ungefähr 1400 Nukleotide zu haben. Eine humane α-1-Antitrypsin-cDNA hat die in Fig. 1B gezeigte Sequenz. Die vorherrschende Form von humanem α-1-Antitrypsin ist in Fig. 1A gezeigt. Andere natürlich auftretende Formen (Polymorphismen) sind bekannt.
Die Sequenzierung der für α-1-Antitrypsin kodierenden chromosomalen DNA ist von Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 6826-6830 (1981), und von Chandra et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 103, 751-758 (1981) beschrieben worden, deren Offenbarungen hier durch Verweis einbezogen werden. Ein Primatengen für α-1-Antitrypsin kann mittels der von Chandra et al., ibid., beschriebenen DNA-Klonierungsverfahren erhalten werden. Das für die vorherrschende Form von humanem α-1-Antitrypsin kodierende Gen, das aus einer humanen cDNA-Bank unter Verwendung der Paviansequenz als Hybridisierungsprobe isoliert worden ist, ist in Fig. 1A gezeigt.
Das humane α-1-Antitrypsin hat eine BamHI-Restriktionsstelle, die das Schneiden des Genes unter Entfernen der Information für eine einzelne Glutaminsäure von dem reifen Protein erlaubt. Es können verschiedene Schemata angewendet werden, um das humane α-1-Antitrypsin-Gen einem glycolytischen Promotor benachbart einzuführen, so daß es von dem Promotor reguliert wird. Wo der Promotor keine günstige Restriktionsstelle in der Nähe des f-met-Kodons hat, kann das glycolytische Gen gespalten werden und bis zum Promotor mit Bal31 abgebaut werden. Stromabwärts von dem Promotor kann dann ein Linker eingefügt werden, um ein günstiges kohäsives Ende oder ein stumpfes Ende zum Verbinden mit dem humanen α-1-Antitrypsin-Gen bereitzustellen. Der Linker kann außerdem ein oder mehrere Kodons für Aminosäuren am N-Terminus des α-1-Antitrypsin-Genes bereitstellen, die den natürlich auftretenden Aminosäuren entweder gleich oder unterschiedlich davon sein können.
Das Gen für humanes α-1-Antitrypsin kann dann in das extrachromosomale Element flußabwärts vom glycolytischen Promotor insertiert werden, wo ein f-met-Kodon für die Initiation der Expression des humanen α-1-Antitrypsines vorgesehen ist.
Beispielsweise kann die für α-1-Antitrypsin (im folgenden "AT") kodierende cDNA in einen Expressionsvektor insertiert werden, z. B. CTEA32 (Fig. 2), der den Hefepromotor für Triosephosphatisomerase (TPI) in die BamHI-Stelle des Schaukelplasmides CV13 (Broach J.R., Strathern J.N., Hicks J.B., Gene, 8:121-133 (1979)) insertiert enthält. Nach Entfernung der TPI-Struktursequenzen durch Bal31-Verdau von der KpnI-Restriktionsstelle innerhalb des für TPI kodierenden Bereiches wurde ein synthetischer DNA-Adaptor in den TPI-Promotor ligiert (Alber et al., J. Molec. Applied Genet., 1, 419-434 (1982)). Dieser Adaptor enthielt ein ATG-Kodon für die Translationsinitiation, gefolgt von der Sequenz GAGGATCC. Das GAG-Kodon spezifiziert einen Glutaminsäurerest, der die erste Aminosäure des natürlich auftretenden humanen AT's ist. Der GGATCC-Teil des Adaptors ist eine Schnittstelle für die BamHI-Endonuklease und erlaubt es, den Rest der humanen AT-DNA-Sequenz in diesen Vektor zu spleißen.
Die BamHI-Stelle von CTEA32 wurde so konstruiert, daß sie "im Raster" mit dem Rest des AT-Strukturgenes lag, um so die Expression eines Polypeptides zu gestatten, wenn ein BamHI- Fragment der klonierten cDNA entsprechend in CTEA32 insertiert wird. Das Plasmid, das aus CTEA32 plus dem AT-Gen besteht, wird CAT1 genannt (Fig. 2).
Diese DNA-Konstruktion, die das Gen für humanes AT stromabwärts von einem Hefetriosephosphatisomerase (TPI)-Promotorfragment angeordnet enthält, wurde in die Hefestämme N501-B und GK100 transformiert. Transformation in Hefe ist von Beggs, Nature, 275, 104-109 (1978), beschrieben worden. Das Durchmustern der transformierten Hefestämme durch immunologische Tests (Kompetitionstests und ELISA-Tests, unter Verwendung von Antikörpern gegen α-1-Antitrypsin) bestätigten die Gegenwart großer Mengen von humanem AT in Hefe, die vom Plasmid CAT1 gemacht wurden. Der "Wildtyp"-Hefestamm, N501-1B (beschrieben von Kawasaki et al., Biochem. Bionhys. Res. Comm., 108, 1107-1112 (1982)), produzierte, wenn er mit CAT1 transformiert wurde, 1,8 mg α-1-Antitrypsin pro Gramm lösliches Protein (oder 0,18% α-1-Antitrypsin), wenn er bei 30º auf einem synthetischen Minimalmedium (modifiziertes Wickerham's Medium) mit 6% Glucose gezüchtet wurde. Ein Hefemutantenstamm, GK100, erzeugte unter den gleichen Wachstumsbedingungen, wenn er mit CAT1 transformiert worden war, 10-15 mg α-1-Antitrypsin pro Gramm lösliches Protein (oder 1-1,5% α-1-Antitrypsin). Die Stämme N501-1B und GK100 tragen jeweils ein defektes LEU2-Gen, das die selektive Beibehaltung von CV13 und CV13-abgeleiteten Plasmiden (z. B. CAT1), die jedes ein funktionelles Leu2-Gen enthalten, auf Minimal- und Leucin-freien Medien erlaubt. Wenn sie auf Minimalmedium nur mit CV13 als Kontrolle wachsen gelassen werden, erzeugen N501-1B und GK100 kein nachweisbares AT. AT kann daher spezifisch vom CAT1-Plasmid erzeugt worden sein.
Da GK100 signifikant mehr AT als N501-1B erzeugt, ist es bevorzugt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die AT-Produktion durch GK100 beschränkt. Es kann wünschenswert sein, Mutationen in GK100 zu verwenden, die zu einer Überproduktion von AT führen.
Eine Immunadsorptionssäule, die nach dem Verfahren von Cuatrecasas, P. J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970) hergestellt wurde, wurde durch kovalentes Anheften Affinitäts-gereinigter Ziegenantikörper gegen humanes AT an CNBr-aktivierte Sepharose hergestellt. Aufgebrochene GK100-Hefezellen wurden mit 3 Volumina Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7.2, enthaltend 0,5 M NaCl, extrahiert, und die Extrakte wurden auf die Säule aufgetragen. Das von der Hefe erzeugte humane AT (0,5-1,0 mg) wurde mit 3M NaSCN von der Säule eluiert. Nachdem das Material dialysiert worden war, um das Salz zu entfernen, wurde es mittels Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat analysiert; die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Auf der Grundlage der relativen Wanderung der Proteine in dem Gel wurde das ungefähre Molekulargewicht von humanem α-1-Antitrypsin, hergestellt in Hefe, mit 42000 bis 43000 Dalton bestimmt. Natürlich auftretendes humanes AT hat ein Molekulargewicht von ungefähr 54000 Dalton, mit einer Kohlenhydratzusammensetzung von ungefähr 16 Gew.-%, wie gezeigt von Hodges et al., J. Biol. Chem., 254, 8208-8212 (1979). Es scheint daher, daß das Hefe-erzeugte AT unglycosyliert oder im wesentlichen unglycosyliert sein kann und ihm die in dem natürlich auftretenden Protein vorhandenen Kohlenhydratteile fehlen können.
Alternativ können andere Expressionsvektoren konstruiert werden, die ein für α-1-Antitrypsin kodierendes Segment enthalten. Solche Expressionsvektoren können mit dem Fachmann bekannten Verfahren unter Verwendung erhältlicher DNA-Konstruktionen konstruiert werden. Ein bevorzugter Vektor ist das Plasmid C1/1, das stabiler als CV13 und CV13-abgeleitete Vektoren, beispielsweise CAT1, ist. C1/1 wurde aus dem Plasmid pJDB248 (Beggs,J., Nature, 275, 104-109 (1978)) konstruiert. Die pMB9-Sequenzen wurden aus pJDB248 durch Partialverdau mit EcoRI entfernt und durch pBR322-DNA ersetzt, die mit EcoRI geschnitten worden war. Die Restriktionskarte von C1/1 ist in Fig. 4 gezeigt. Das C1/1-Plasmid enthält die gesamte 2-Mikron-DNA aus Hefe (S. cerevisiae), mit einer pBR322-Insertion an einer EcoRI-Stelle. Es enthält außerdem das LEU2-Gen. Daher kann der Hefe-TPI-Promotor mit dem Adaptor in die einzige BamHI-Stelle im Tc®- Gen von C1/1 insertiert werden. Die AT-Sequenz, die an ein Transkriptions-Terminatorfragment aus dem Hefe-TPI-Gen angeheftet ist, kann in die BamHI-Stelle stromabwärts vom TPI-Promotor insertiert werden. Das resultierende Plasmid, HAT4, kann dann in der oben beschriebenen Weise in N501- 1B und GK100 transformiert werden.
Die Sequenz der ersten 10 Aminosäuren in dem in Hefe erzeugten AT kann als identisch mit den ersten 10 Aminosäuren des natürlich auftretenden humanen AT's bestätigt werden:
Das in Hefe erzeugte AT enthält nicht das Initiationsmethionin, das durch das ATG-Start-Kodon spezifiziert wird. Die Hefezelle prozessiert das Methionin weg, um die Aminosäuresequenz von natürlichem humanen AT zu erzeugen.
Die erfindungsgemäß produzierten Polypeptide mit AT-Aktivität können für die Behandlung einer genetischen AT-Defizienz und anderen Krankheitszuständen, die mit einem unzureichenden AT-Spiegel zusammenhängen, nützlich sein. Daher können Zustände wie Emphyseme und andere Lungenerkrankungen, die mit einem progressiven Abbau des Rippenfells (lungsac) zusammenhängen, behandelt werden, beispielsweise chronische obstruktive pulmonale Erkrankungen oder das Adult Respiratory Distress Syndrome. Nicht-genetisch bedingte Emphyseme können ebenso behandelt werden, beispielsweise Emphyseme, die aus starkem Rauchen resultieren. Zustände, die nicht notwendigerweise auf die Lungen beschränkt sind, können ebenfalls behandelt werden, beispielsweise zystische Fibrose und Arthritis. Für eine Übersicht über AT-Defizienz, siehe Gadek, J.E., und R. Crystal, "Alpha-1-Antitrypsin Deficiency", The Metabolic Basis of Inherited Disease, J.B. Stanbury, J.B. Wyngaarden, D.S. Fredrickson, McGraw-Hill, N.Y. Seiten 1450-67 (1982).
Das α-1-Antitrypsin kann als ein Antigen für die Erzeugung polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen humanes α-1- Antitrypsin, zur Einführung in einen Wirt mit einer Defizienz für α-1-Antitrypsin oder zum Modulieren der proteolytischen Aktivität in einem Säugetierwirt verwendet werden. Das α-1-Antitrypsin kann insbesondere an Menschen verabreicht werden, um ein α-1-Antitrypsin zu ersetzen, das durch Tabak und anderen Rauch inaktiviert (oxidiert) worden ist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern gemischt werden. Bevorzugt werden die Polypeptide intravenös oder durch Inhalation verabreicht. Während die effektiven Dosierungen mit der Schwere des Zustandes und dem Gewicht der Person variieren können, sind Dosierungen im Bereich von 0,5-10,0 g/Woche eines
Polypeptides, das intravenös verabreicht wird, in vielen Fällen wirksam. Geringere Dosierungen können wirkungsvoll sein, wenn das Verfahren der Verabreichung die Inhalation ist. Eine orale Verabreichung kann ebenfalls wirksam sein, vorausgesetzt, das AT ist in Kapseln oder überzogenen Trägern vor einem vorzeitigen Abbau im Verdauungstrakt geschützt.
Die folgenden Beispiele stellen spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, jedoch ist es nicht beabsichtigt, die Erfindung darauf zu beschränken.

BEISPIEL 1

Stämme

Isogene Stämme mit Mutationen im PGI1, PGK1, GPM1, PYK1 und GCR1 wurden durch Ethylmethansulfonat (EMS)-Mutagenese von S. cerevisiae (S.c.) X2180-1A (MATa SUC2 CUP1 gal2, aus dem Berkeley Yeast Stock Center) erhalten. 35000 unabhängige Klone wurden auf YEP-3% Glycerin-2% Ethanol wachsen gelassen und dann durch Replikaplattierung auf ihre Unfähigkeit, auf YEP-4% Dextrose zu wachsen, durchmustert (Tabelle 1).
Die Identifizierung spezifischer Läsionen wurde durch Komplementationstests mit bekannten Glycolysemutanten (Ciriacy und Breitenbach, J. Bacteriol., 139:152-60 (1979)) durchgeführt, wobei mindestens 15 zusätzliche Komplementationsgruppen durch Heterozygotenkreuzung von Mutantenstämmen gefunden wurden. Enzymtests (Clifton et al., Genetics, 88:1-11 (1980)) bestätigten die glycolytischen Defekte in pgi1-, pgk1-, gpm1-, pyk1- und gcr1-Mutanten.
Von S. cerevisiae X2180-1A wurde durch EMS-Behandlung eine LEU2-Mutante erhalten, die mit X2180-1B (einem isogenen MATα-Stamm) gekreuzt wurde, um N501-1B (MATα leu2 SUC2 CUP1 gal2) zu erzeugen. Cycloheximid(cyh2)- und Canavanin(can1)- Resistenzen wurden dann als spontane Mutationen von N501-1B selektioniert. Die Glycolyse-Mutanten wurden mit N501-1B gekreuzt, um eine Reihe isogener leu2-Stämme zu erzeugen, deren jeder in einer einzelnen glycolytischen Funktion oder GCR1 defekt ist.
Eine tpi1-Mutante, S. cerevisiae GLU77, wurde mit N551-1A (MATα leu2 SUC2 CUP1 gal2) gekreuzt; die aus dieser Kreuzung erhaltenen Stämme wurden zweimal mit N501-1B gekreuzt, um einen tpi1 leu2-Stamm zu erzeugen, N587-2D, der hinsichtlich des genetischen Hintergrundes den anderen Glycolyse-Mutanten ähnlich ist.
Mutationen in drei Glucose-phosphorylierenden Enzymen führen zu einem Stamm, der unfähig ist, auf Dextrose als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, und der gegen eine Katabolitrepression durch 2-Desoxyglucose und Glucosamin resistent ist. N517-6C (hxk1 hxk2 glk1 leu2 can1-100 cyh2 ade2-1) wurde von einem hxk1 hxk2 glk1-Stamm, D308.3, durch Untersuchen auf Glucosamin-resistente Sporenkolonien erhalten. Die Defekte bei den Glucose-kinasierenden Aktivitäten wurden durch Tests bestätigt. Tabelle 1 Komplementations-Gruppen von glu&supmin;-Derivaten von X2180-1A Gen Anzahl der Mutanten 60 weitere Mutanten, die nicht in den Komplementationsgruppen sind 27 sterile glu&supmin;-Stämme
Es wurden 35000 Kolonien durchmustert (EMS Mutagenese mit 50% Überlebenden)
Der homothallische diploide Stamm S. c. AB 320 war die Quelle für den Hefe-DNA-Pool (Nasmyth und Reed, Proc. Nat. Acad. Sci., 77:2119-2123 (1980)) und wurde in einigen Experimenten als Kontrolle verwendet.
Das Triosephosphatisomerase-Gen (einschließlich der stromaufwärts gelegenen Sequenzen mit den regulatorischen Signalen) sieht wie folgt aus:
Die stromaufwärts vom Pyruvatkinase-Gen gelegene Sequenz mit den regulatorischen Signalen lautet wie folgt:

Durchmustern der Klonbank

Die leu2-Glycolysemutanten wurden mit einem Hefe-DNA-Pool transformiert, der in pYE13, einem Plasmid mit hoher Kopienzahl, das ein selektierbares LEU2-Wildtyp-Gen trägt (Broach et al., Gene, 8:121-133 (1979)), insertiert war. Die glycolytischen Gene wurden durch Komplementation erhalten, bei der gleichzeitig für Wachstum auf Glucose und Leucin-Prototrophie selektioniert worden war. Es wurde ein synthetisches Medium verwendet, das Hefestickstoffbase, 4% Glucose und die folgenden Supplemente enthielt: pro Liter 40 mg Adenin, 20 mg Arginin, 50 mg Aspartat, 10 mg Histidin, 60 mg Isoleucin, 40 mg Lysin, 10 mg Methionin, 60 mg Phenylalanin, 50 mg Threonin, 40 mg Tryptophan, 50 mg Tyrosin, 20 mg Uracil und 60 mg Valin.
Die Transformanten wurden auf Leucin-freiem Medium gereinigt und dann auf einem nicht-selektiven Medium (YEPGE) wachsen gelassen, um die mitotische Segregation der Plasmide zu ermöglichen. Stämme, bei denen die leu2- und Glycolysemutanten- Phänotypen cosegregierten, was durch Replikaplattieren auf selektivem Medium bestimmt wurde, wurden auf die Aktivität der glycolytischen Enzyme getestet. Es wurden Hefe-DNA-Präparationen gemacht, und der E. coli-Stamm RR1 transformiert, wobei auf Ampicillinresistenz selektioniert wurde, um die Gegenwart von Plasmid-DNA in diesen glycolytischen Hefetransformanten zu verifizieren.

Enzym-Tests

Die transformierten Hefestämme wurden selektiv auf Minimalmedium mit 8% Glucose (Adenin wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mg/l zugesetzt) wachsen gelassen. Die Wildtyp-Kontrolle, N501-1B, wurde auf dem gleichen Medium plus Leucin (100 mg/l) wachsen gelassen. Die Glycolyse-Mutantenstämme wurden auf YEP-5% Glycerin-1% Lactat wachsen gelassen. Übernacht-Kulturen wurden mit frischem Medium versetzt und 4 h bei 30º aerob wachsen gelassen, bevor sie geerntet wurden. Die Zellen wurden zweimal mit Wasser gewaschen und in 50 mM K&sub2;HPO&sub4;, 2 mM EDTA, 3 mM 2-Mercaptoethanol (eingestellt auf pH 7,4 mit HCl) resuspendiert. Extrakte wurden durch 2 min Schütteln (Vortexen) der Zellen mit einem gleichen Volumen Glasperlen (0,45 mm Durchmesser) bei hoher Geschwindigkeit erhalten. Der Zelldebris wurde durch 15 min Zentrifugation bei 4º in einer Mikrofuge entfernt. Die Enzyme wurden wie von Clifton und Breitenbach, sunra, beschrieben, getestet. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Biuret-TCA-Verfahren bestimmt.

BEISPIEL 2

Um die Aktivität der verschiedenen glycolytischen Gene in den Transformanten zu bestimmen, wurden die verschiedenen Enzyme getestet und die Ergebnisse der Transformanten mit den Mutanten- und Wildtyp-Stämmen verglichen. Die gcr1-Mutante hatte 5 bis 10% des Wildtyp-Spiegels der meisten glycolytischen Aktivitäten (veranschaulicht durch PGI, Aldolase und Enolase) und wächst auf Glucosemedien sehr schlecht. Im Gegensatz dazu hatten die GCR1-Transformanten beinahe Wildtyp-Spiegel der Enzyme und waren hinsichtlich des Wachstums auf Glucosemedien praktisch identisch mit dem Wildtyp. Die anderen Glycolyse- Mutanten hatten weniger als 5% der normalen Spiegel ihrer jeweiligen Enzymaktivitäten. Wenn sie jedoch mit einem komplementierenden Plasmid mit hoher Kopienzahl transformiert wurden, waren die spezifischen Enzymaktivitäten im Vergleich zu Wildtyp-Spiegel wesentlich erhöht (typischerweise 5- bis 10-fach höher). Die folgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2 Vergleich der glycolytischen Aktivitäten im Wildtyp, Mutanten- und transformierten Stämmen Enzym Aktivitäten Verhältnis: Wildtyp a Mutante b Tranformante c Transf/Wt Wildtyp a gcrl Mutante d GCR1 Transf c Aldolase Enolase
a Wildtyp ist N501-1B.
b Die entsprechenden Mutantenstämme sind N543-9D (pgi1 leu2), N587-2D (tpi1 leu2), N548-8A (pgk1 leu2), N583-2C (gpm1 leu2), und N549-3A (pyk1 leu2).
c Die Aktivitäten der Transformanten sind Durchschnitte für viele verschiedene Isolate. Die Zahlen in den Klammern geben die Anzahl untersuchter unabhängiger Transformanten an.
d Der gcr1 leu2-Mutanten-Stamm ist N525-2C.

BEISPIEL 3

Um zu zeigen, daß die Überproduktion der glycolytischen Enzyme für den mutationsbedingten Effekt spezifisch war, der durch das jeweilige Plasmid komplementiert wurde, wurden Tests auf 10 verschiedene glycolytische Proteine mit den verschiedenen Transformanten durchgeführt. Die folgende Tabelle 3 gibt die Ergebnisse für eine Transformante für jedes der 6 verschiedenen Glycolysegene an, die im Detail untersucht worden waren. Tabelle 3 RELATIVE ENZYMAXTIVITÄTEN DES WILDTYPS UND TRANSFORMIERTER STÄMME GLYCOLYTISCHE ENZYME Stämme Transformante
Die GCR-8-Transformante ergab nahezu Wildtyp-Spiegel für alle 10 Enzyme, während die PGI-19-, TPI-10-, PGK-2-, GPM-2- und PYK-1-Transformanten ihre jeweiligen glycolytischen Proteine überproduzierten, aber nicht andere Enzyme.
Es wurde festgestellt, daß die Plasmide leicht segregierten (typischerweise 5-50% Segregation in einer voll gewachsenen Kultur selbst unter dem Selektionsdruck der Leucin-Prototrophie), so daß die untersuchten Kulturen wahrscheinlich Zellen mit einem Bereich hinsichtlich der Anzahl der Plasmide enthalten. Von TPI1 und PYK1 ist durch Komplementation in E. coli und/oder Sequenzierung gezeigt worden, daß es sich um die Strukturgene handelt.

BEISPIEL 4

Die Nutzung des Promotors für TPI1 für die Herstellung von humanem α-1-Antitrypsin wurde wie folgt demonstriert. Es wurde das Plasmid CV13 verwendet. CV13 kann durch Selektion von Hefe mit einer durchschnittlichen Kopienzahl von 10 pro Zelle beibehalten werden. CV13 setzt sich zusammen aus pBR322, dem Replikon aus dem 2u-Plasmid und dem Hefe LEU2- Gen. Das TPI1-Promotorfragment wurde durch Schneiden des TPI1-Genes an der einzigen KpnI-Stelle (Basen 511 bis 518) erhalten; und die daraus resultierende linearisierte DNA wurde dann 4 bis 5 min mit Bal31 behandelt, um die TPI1- Struktursequenzen zu entfernen. Anschließend wurden Linker, entweder EcoRI, HindIII oder BamHI, insertiert. Die Linker werden dann durch das entsprechende Restriktionsenzym gespalten, um so kohäsive Enden für die Insertion des humanen α-1-Antitrypsin-Genes bereitzustellen. Das humane α-1-Antitrypsin-Gen wurde mit BamHI gespalten, das an dem 5'-Terminus des kodierenden Stranges so spaltet, daß die Information für ein einzelnes Glutaminsäurekodon vom reifen Protein entfernt wird. Es wurden 4 verschiedene Konstruktionen hergestellt, wie in der folgenden Tabelle 4 gezeigt wird. Anhand dieser Tabelle kann festgestellt werden, daß das Glutaminsäurekodon in drei der Konstruktionen mit einem Initiatormethionin durch die Kodons für Alanin und Prolin ersetzt worden ist.
Nach Ligieren der humanen α-1-Antitrypsin-Konstruktion in das Plasmid CV13 wurde das resultierende Plasmid in S. c. N501-1B transformiert. Die resultierenden Hefezellen wurden auf synthetischem Minimalmedium wachsen gelassen. Tabelle 4 Plasmid N-terminale Aminosäure Orientierung in CV13 im Uhrzeigersinn gegen d. Uhrzeigersinn met ala pro + hAT, aber ein Teil des TPI-Promotors fehlt * Rest von ungefähr 400 Aminosäuren des humanen α-1-Antitrypsins
Die die humanen α-1-Antitrypsin-Gene enthaltenden Hefezellen wurden durch 2 bis 3 min heftig Schütteln (Vortexen) mit Glasperlen (0,45 mm) mit hoher Geschwindigkeit aufgebrochen. Der Extraktionspuffer enthielt 50 mM K&sub2;HPO&sub4;, 2 mM EDTA, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF (pH 7,4). Der Zelldebris wurde durch Zentrifugation entfernt; die Extrakte enthalten 3 bis 4 mg/ml Protein, wie durch Lowry-Tests festgestellt wurde.
Die Gegenwart von humanem α-1-Antitrypsin wurde unter Verwendung eines RIA's bestimmt, wobei Tritium-markiertes humanes α-1-Antitrypsin und gegen dieses Protein gerichtete Antikörper verwendet wurden. Die folgende Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 5 Kompetitions-Test für α-1-Antitrypsin Plasmid Tritium Zerfälle durchschnittliche Zerfälle Gesamt-Protein [ug] %Gesamt-Protein Kontrollen** Zerfälle
* Plasmide wurden im Hefestamm N501-1B wachsen gelassen. Es wurden 100 ul des Extraktes getestet.
** Es wurde nicht-radioaktives α-1-Antitrypsin mit 100 ul Hefeextrakt (330 ug Protein) gemischt.
Aus den oben angegebenen Ergebnissen ist offensichtlich, daß ein immunologisch aktives Produkt erhalten wird, das in der Lage ist, mit natürlich auftretendem humanen α-1-Antitrypsin um die Antikörper gegen das native Protein zu konkurrieren. Die Expression des α-1-Antitrypsin-Genes wird weiter durch den TPI-Promotor reguliert, weil, wie ersichtlich ist, kein α-1- Antitrypsin erzeugt wird, wenn ein Teil des TPI-Promotors entfernt ist. Zusätzlich ist die Produktion des Säugetierproteins humanes α-1-Antitrypsin in der obigen Untersuchung nicht optimiert worden, so daß die Ergebnisse eine Minimalproduktion des Produktes anzeigen, die weiter gesteigert werden kann. Daher ist festgestellt worden, daß der TPI-Promotor ein effektiver Promotor für die effiziente Erzeugung hoher Ausbeuten an Expressionsprodukten von Fremd-DNA ist.

BEISPIEL 5

Reinigung von Alpha-1-Antitrypsin aus Hefe GK100 Hefeextrakten

Durch kovalentes Anheften Affinitäts-gereinigter Antikörper gegen humanes α-1-Antitrypsin an CNBr-aktivierte Sepharose im Einklang mit dem Verfahren von Cuatrecasas, J. Biol Chem., 245, 3059 (1970) wurde eine Immunadsorptionssäule hergestellt. Aufgebrochene GK100-Zellen wurden mit 3 Volumina Phosphat-gepufferter Salzlösung pH 7,2, die 0,5 M NaCl enthielt, extrahiert und auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 3 M NaSCN eluiert und das wiedergewonnene Material mittels Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat analysiert. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in Fig. 3 gezeigt. Spur 1 enthielt eine Mischung von Molekulargewichtsstandard: a) Phosphorylase B, 97000 Dalton; b) Rinderserum Albumin (BSA), 65000 Dalton; c) Ovalbumin, 43500 Dalton; d) Carboanhydrase, 30000 Dalton; e) Sojabohnentrypsin-Inhibitor, 20000 Dalton; und f) α-Lactalbumin, 14000 Dalton. Spur 3 enthält von Hefe erzeugtes AT, gereinigt durch Immunadsorption, Molekulargewicht ungefähr 42000 Dalton. Spur 7 ist eine Probe natürlich auftretenden AT's, erworben von Sigma Chemical Company, stark mit Blutproteinen kontaminiert. Ein Hauptbestandteil von Spur 7 ist humanes α-1-Antitrypsin, Molekulargewicht 54000 Dalton.

BEISPIEL 6

Aktivität von in Hefe erzeugtem Alpha-1-Antitrypsin gegen Serinproteasetrypsin

Als Kontrolle wurden 10 Mikroliter (1 Mikrogramm) einer Lösung von 100 Mikrogramm/ml Trypsin, 100 Mikrogramm (100 Mikroliter) Rinderserumalbumin und 100 Mikroliter 0,05 Molar Trispuffer, pH 8,0, enthaltend 1 mM Benzoylarginoyl-p-nitroanilid, gemischt, und die zeitabhängige Zunahme der Absorbtion bei 405 nm wurde in einem Spektralphotometer gemessen. Der Absorbtionswert dieser Lösung wurde als Standard für 100% Trypsinaktivität verwendet. Drei zusätzliche Proben wurden jeweils zweifach laufen gelassen, jede enthaltend 1 ul Trypsin und 25 ul AT-Lösung plus 175 ul Puffer bzw. 100 ul α-1- Antitrypsin plus 100 ul Puffer bzw. 200 ul α-1-Antitrypsln. Alle Proben enthalten gleiche Substrat- und Rinderserumalbumin-Konzentrationen. Die Ergebnisse zeigen, daß bei Verwenden von 25 ul AT 73% der Trypsinaktivität zurückblieben, bei 100 ul AT 41% der Trypsinaktivität blieb und bei 200 ul α-1-Antitrypsin 26% der Trypsinaktivität zurückblieben. Dies zeigte, daß durch Erhöhen der Spiegel des in Hefe erzeugten AT die Trypsininhibitoraktivität ebenfalls zunahm.

BEISPIEL 7

Erzeugung von Alpha-1-Antitrypsin mit Hefeplasmiden mit erhöhter genetischer Stabilität

Erhöhte AT-Spiegel können unter Verwendung von C1/1 erhalten werden, einem Plasmid, das genetisch stabiler als CV13 ist. Das C1/1-Plasmid enthält die gesamte 2-Mikron-DNA aus S. cerevisiae und kann daher seine eigene Replikation und Aufrechterhaltung in Hefe in Abwesenheit einer Selektion auf einem genetischen Marker fördern. Das C1/1-Plasmid hat außerdem eine einzelne BamHI-Stelle, die im Tc®-Gen angeordnet ist. C1/1 tragende Transformanten können in E. coli infolge ihrer Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz und in Hefe aufgrund ihrer Leucinprototrophie selektioniert werden. C1/1 enthält pBR322 in eine EcoRI-Stelle der 2-Mikron-DNA insertiert und trägt das von J. Beggs, Nature, 275, 104-109 (1978), beschriebene LEU2-Gen.
Der Hefe-TPI-Promotor (aus CTEA32) mit dem synthetischen DNA- Adaptor (oben beschrieben) wurde als ein BglII-BamHI-Fragment (ungefähr 900 Basenpaare) in die BamHI-Stelle von C1/1 insertiert. Diese Insertion erzeugte eine einzelne BamHI-Stelle, in die das humane AT-Gen für die Expression in Hefe gespleißt werden konnte. Wenn das AT-Gen (Fig. 1A) insertiert ist, wurde das resultierende Plasmid wie im Plasmid CAT1 ein ATG- Initiationskodon, gefolgt von einem GAG (Glutaminsäurekodon) haben, um die Erzeugung einer reifen humanen AT-Proteinsequenz in Hefe zu erlauben.
Ungefähr 700 Basenpaare des 3'-flankierenden Bereiches des Hefe TPI-Genes wurden nach der humanen AT-Sequenz angehängt, um die Transkriptionstermination zu unterstützen. Diese "Terminations"-Fragmente sind Sequenzen von der XbaI- bis zu der EcoRI-Stelle in dem Plasmid pTPIC10 ((T. Alber und G. Kawasaki, J. Molec. Applied Genet., 1, 419-434 (1982)).
Die Hefeterminationssequenzen wurden an das humane AT-Gen unter Verwendung des Vektors pUC13, der multiple Klonierungsstellen hat, in die die Terminator- und AT-DNA's getrennt insertiert werden können, angehängt. Das Plasmid pUC13 wurde wie in Vieira, J., und Messing, J., Gene, 19, 259-268 (1982) für die Vektoren pUC8 und pUC9 beschrieben, konstruiert. Das Plasmid pUC13 enthielt die in Fig. 5 gezeigte multiple Klonierungsstelle am Start des lacZ-Genes. Um das humane AT-Gen mit dem TPI-Transkriptionsterminator zu verbinden, wurde der AT-cDNA-Klon (Fig. 1) als ein PstI-Fragment in pUC13 an dessen einzelner PstI-Stelle insertiert. Dem AT-Gen folgten eine XbaI-Stelle und eine EcoRI-Stelle in der multiplen Klonierungssequenz. Zwischen dieser XbaI- und EcoRI-Stelle von pUC13 wurde der Hefe-TPI-Terminator als ein 700 Basenpaar XbaI- EcoRI-Fragment aus pTPIC10 insertiert. Das resultierende Plasmid, pUCα1+FG1, enthielt ein humanes AT-Gen mit einem HefeTranskriptionsterminator (siehe Fig. 6). Ein synthetischer EcoRI-BamHI-DNA-Adaptor wurde dann an die EcoRI-Stelle des Plasmides angefügt, um eine BamHI-Stelle am 5'-Ende des Hefeterminators zu erzeugen. Durch Verwendung dieses Adaptors konnte die Sequenz aus humanem AT- und Hefeterminator durch Schneiden mit BamHI, wodurch ein Fragment von ungefähr 2100 Basenpaaren freigesetzt wurde, entfernt werden. Dieses BamHI- Fragment wurde in das Plasmid C1/1 insertiert, das den TPI-Promotor mit dem BamHI-Adaptor enthält. Das resultierende Plasmid, HAT4, hat den TPI-Promotor, ATGGAGGATCC-Adaptor, das humane AT-Gen (von der BamHI-Stelle) und den TPI-Terminator in C1/1 inserTiert. Die Topologie von HAT4 ist in Fig. 7 gezeigt.
HAT4 wurde in N501-1B und GK100 transformiert. Auf Minimalmedium mit 6% Glucose waren bei einer Zelldichte von beinahe 3 g/l (Naßgewicht) 2 bis 3% des löslichen Hefeproteins α-1-Antitrypsin. Weil HAT4 C1/1 enthielt, war dieses Plasmid in einer Vielzahl reicher Medien einschließlich YEPD (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glucose) aufrechterhaltbar (stabil). Auf reichem Medium wurden noch 2 bis 3% AT erzeugt, jedoch bei einer höheren Zelldichte von 10 bis 20 g/l (Naßgewicht).
Das Plasmid HAT4 wurde ohne Selektion in N501-1B bei über 30 Zellteilungen auf reichem Medium beibehalten, wobei mehr als 70% der Zellen das Plasmid enthielten. In GK100 wiesen mehr als 95% der Zellen HAT4 nach 30 Teilungen auf reichem Medium auf. Die Vorteile einer Verwendung von HAT4 im Vergleich zu CAT1 waren 1) eine größere Plasmidstabilität, 2) höhere AT- Spiegel, ausgedrückt als %-Gesamtprotein, 3) viel größere Ausbeuten von Zellen pro Liter als Folge der Verwendung reichen Mediums, und 4) niedrigere Kosten des reichen Mediums im Vergleich zu synthetischen (Leucin-freien) Medien. Der Hefemutantenstamm GK100 ist bei der American Type Cultur Collection, Rockville, Maryland, mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC Nr. 20669 hinterlegt worden.
Durch die oben dargelegten Ergebnisse ist offensichtlich, daß Hefepromotoren effizient für die Erzeugung fremder Proteine durch Regulation der Expression der Fremd-DNA in Hefe verwendet werden können. Es ist festgestellt worden, daß die Promotoren starke Promotoren sind, die ein hohes Ausmaß der Expression bereitstellen können. Weiterhin scheint es, daß die Messenger ausreichend stabil sind, um so einen signifikanten Grad der Translation in das gewünschte Expressionsprodukt zu erlauben. Darüberhinaus kann durch Verwendung der glycolytischen Promotoren und der entsprechenden Nährmedien die Expression der Fremd-DNA moduliert werden. Auf diese Weise kann die Erzeugung der Fremd-DNA an- und abgeschaltet werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren für die Verwendung von Hefe als effizienter Wirt bei der Erzeugung von Fremdproteinen bereitgestellt, wobei die Produktion moduliert werden kann. Zusätzlich kann man durch die Verwendung glycolytischer Regulationsgene eine Vielzahl glycolytischer Promotoren an- und abschalten.

Claims

1. Zur Replikation in Hefe fähiges extrachromosomales Element mit einem Marker für die Selektion in einem Hefewirt, das einen Hefepromotor enthält, der die Transkription der Triosephosphatisomerase reguliert, wobei der Promotor in der folgenden Sequenz vorhanden ist:

oder die der Pyruvatkinase, wobei der Promotor in der folgenden Sequenz vorhanden ist:

wobei dem Hefepromotor in jedem Fall stromabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Protein mit Proteaseinhibitionsaktivität kodiert und von dem Promotor reguliert wird.

2. Extrachromosomales Element nach Anspruch 1, wobei dem Promotor ein Gen folgt, das eine Proteaseinhibitoraktivität exprimiert und die Aminosäuresequenz von humanem α-1- Antitrypsin hat.

3. Extrachromosomales Element nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine cDNA für humanes α-1-Antitrypsin ist.

4. Extrachromosomales Element nach Anspruch 1, das einen Triosephosphatisomerase-Terminator umfaßt.

5. Verfahren zum Herstellen eines Proteins mit Proteaseinhibitionsaktivität, umfassend: das Einführen eines extrachromosomalen Elementes nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einen Hefewirt und Wachsenlassen des Hefewirtes in einem entsprechenden Medium und Isolieren des exprimierten Proteins.

6. Hefezelle, enthaltend ein extrachromosomales Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Kefezelle, enthaltend in das Genom der Hefezelle integriert mindestens einen Teil eines extrachromosomalen Elementes nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Teil mindestens den Promotor und die DNA-Sequenz umfaßt.

8. Plasmid HAT4, gekennzeichnet durch die in Fig. 7 gezeigte Restriktionskarte.

9. Plasmid CATI, gekennzeichnet durch die in Fig. 2 gezeigte Restriktionskarte.

10. Plasmid pUCα1, gekennzeichnet durch die in Fig. 6 gezeigte Restriktionskarte.