DE69011183T2

DE69011183T2 - Hefestämme für die Herstellung von heterologen reifen Proteinen, besonders von Hirudin.

Info

Publication number: DE69011183T2
Application number: DE69011183T
Authority: DE
Inventors: Tilman Achstetter; Yves Lemoine; Martine Nguyen
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-28
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2010-03-29
Also published as: PT93614B; FR2645174B1; ES2060974T3; FR2645174A1; EP0396436B1; EP0396436A1; ATE109506T1; JPH0372867A; DK0396436T3; US5521093A; CA2013239C; PT93614A; CA2013239A1; DE69011183D1; JP3135550B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbesserung bei der Herstellung von heterologen Proteinen durch rekombinante Hefen, wie z.B. Saccharomyces cerevisiae, und insbesondere bei der Herstellung von Hirudin. Sie betrifft in erster Linie einen neuen Hefestamm, der das transformierte heterologe Protein mit Hilfe eines Vektors bildet, der die Expression des Proteins in reifer Form erlaubt.
Bei den Hefen handelt es sich um einzellige Eukaryonten-Organismen; der Hefe-Genus Saccharomyces umfaßt Stämme, deren Biochemie und Genetik im Labor gründlich untersucht wurden; er umfaßt auch Stämme, die in der Lebensmittelindustrie (Brot, alkoholhaltigen Getränken ...) verwendet werden und die infolgedessen in sehr großer Menge hergestellt werden. Die Leichtigkeit, mit der man die Genetik der Zellen von Saccharomyces cerevisiae manipulieren (verändern) kann, und die lange industrielle Geschichte dieser Species machen daraus einen Wirt der Wahl für die Herstellung (Gewinnung) von Fremd-Proteinen unter Anwendung der rekombinanten DNA-Verfahren.
Wenn man Proteine von industriellem Interesse herstellen will, die in großer Menge gebildet werden sollen, ist es erwünscht, daß sie die gewünschten Eigenschaften beibehalten, daß das Protein in im wesentlichen reifer Form, d.h. frei von jeder Aminosäure oder zusätzlichen Peptidsequenz, die an das Protein fusioniert geblieben ist, gebildet wird. Dies ist insbesondere erwünscht im Falle des Hirudins. Das Hirudin, dessen Hauptquelle die Speicheldrüsen von medizinischen Blutegeln in Form eines Peptidgemisches von 65 bis 66 Aminosäuren sind, ist ein sehr spezifischer und sehr wirksamer Inhibitor für das Thrombin. Es handelt sich dabei um ein sehr interessantes (vorteilhaftes) therapeutisches Mittel, dessen Verwendung in der Klinik eine sehr hohe Reinheit des aktiven Produkts (Wirkstoffes) erfordert.
Eine bestimmte Anzahl von natürlichen Varianten des Hirudins wurde bereits identifiziert und bezeichnet mit HV1, HV2, HV3. Ihre Struktur ist in der Figur 1 angegeben. Danach wurden diese natürlichen Varianten sowie andere (weitere) Analoga auf gentechnischem Wege hergestellt, insbesondere durch Fermentation von Stämmen von S. cerevisiae, wie dies beispielsweise in den europäischen Patentpublikationen EP-A-0 252 854, EP-A-0 273 800 der Anmelderin beschrieben ist.
Wie bereits angegeben, ist die Hefe S. cerevisiae somit besonders interessant (vorteilhaft) für die Herstellung von heterologen Proteinen, d.h. von Proteinen, die weder von der Hefe in natürlicher Weise gebildet werden noch für ihr Wachstum erforderlich sind. Diese Hefe ist nämlich selbst in der Lage, einige Proteine in das Kulturmedium in korrekt behandelter Weise, d.h. in einer reifen Form, zu sekretieren. Man findet beispielsweise in dem Kulturmedium eines Stammes von Saccharomyces cerevisiae vom sexuellen α-Typ das α-Sexual-Pheromon.
Das α-Sexual-Pheromon der Hefe ist ein Peptid mit 13 Aminosäuren. Kurjan und Herskowitz (1982, "Cell" 30 933- 934) haben das Strukturgen des Vorläufers des α-Pheromons (MFalphal) kloniert und aus der Sequenz dieses Gens abgeleitet, daß dieser α-Faktor aus 13 Aminosäuren synthetisiert wurde in Form eines pre-pro-Protein-Vorläufers aus 165 Aminosäuren. Der Vorläufer enthält eine Amino-terminale hydrophobe Signal-Sequenz aus 19 Resten, gefolgt von einer Sequenz "pro" aus 64 Aminosäuren, die drei Glycosylierungs-Stellen enthält, auf die ihrerseits folgt die Sequenz Lys-Arg, die vier Kopien des α-Faktors vorangeht, die durch Abstandhalter-Peptide voneinander getrennt sind.
Es wurde gezeigt, daß die Signal-Sequenz im Bereich des endoplasmatischen Retikulums durch eine spezifische Peptidase wirksam gespalten (geschnitten) wird. Die Sequenz "pro" unterliegt einer im endoplasmatischen Retikulum initiierten N-Glycosylierung. Die erste Stufe der proteolytischen Spaltung wird bewirkt durch das Produkt des Gens KEX2, d.h. durch die Endoprotease yscF im Bereich der spezifischen Signale Lys-Arg oder Arg-Arg. Diese Reifung findet wahrscheinlich im Golgi-Apparat (Golgi-Komplex) statt. Es wurde eindeutig nachgewiesen, daß Stämme von S. cerevisiae, die Mutationen in dem Gen KEX2 ausgesetzt waren, nicht mehr eine aktive Form des Killer-Proteins (Leibowitz und Wickner (1976), PNAS, USA, 2061-2065) oder des α-Pheromons (Julius et al. (1984), "Cell", 37, 1075- 1089) sekretieren konnten aufgrund einer mangelhaften (fehlerhaften) Reifung dieser Proteine.
Die Erfindung schlägt vor, ausgehend von diesen grundlegenden Arbeiten, ein funktionelles Gen KEX2 in einem Hefestamm, der ein heterologes Protein bilden kann, zu amplifizieren, um ein reifes Protein zu erhalten.
Die Erfindung schlägt insbesondere Mittel zur Erhöhung der Menge an reifem Hirudin, die von einem Hefestamm, wie Saccharomyces cerevisiae sekretiert wird, zu erhöhen durch Förderung des Reifungsprozesses.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein in einer Hefe replizierbares Multicopy-Plasmid, das mindestens den folgenden Block zur Expression eines heterogenen Proteins enthält:
- eine DNA-Sequenz (Str), welche die Signale aufweist, welche die Transkription der für einen Vorläufer des reifungsfähigen Proteins codierenden Sequenz durch die Hefe gewährleistet,
- eine DNA-Sequenz (Spr), die für ein Signal-Peptid pre und/oder ein Peptid pro codiert,
- eine DNA-Sequenz (Scl), die für ein Peptid codiert, das eine Stelle zur proteolytischen Spaltung (Schneiden) durch das Produkt des gesamten Gens KEX2 oder eines Teils desselben aufweist, und
- eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Protein codiert, das zusammen mit der Sequenz Spr den Vorläufer bildet,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Plasmid das gesamte Gen KEX2 oder einen Teil desselben enthält, was zu einer Erhöhung der proteolytischen Aktivität der Endoprotease yscF führt.
Wie oben angegeben, bezieht sich die Erfindung insbesondere auf die Herstellung von Hirudin, insbesondere der Varianten rHV2Lys47.
Das Gen KEX2 kann, wie nachstehend beschrieben, durch Klonierung erhalten werden, wobei man von einer Bank von Hefe-Gesamt-DNA ausgeht. Die Sequenz des Gens ist in der Fig. 2 angegeben. Diese wurde nicht in die Beschreibung aufgenommen, um sie nicht damit zu belasten, es ist jedoch selbstverständlich, daß diese Figur 2 einen integralen Bestandteil der Beschreibung darstellt.
Erfindungsgemäß können verschiedene Fragmente dieses Gens verwendet werden: entweder die Gesamtheit der in der Fig. 2 angegebenen Sequenz ab der Base Nr. 381, die der Gesamtheit der Genom-DNA des Gens KEX2 entspricht; oder nur die funktionelle Sequenz dieses Gens, d.h. diejenige zwischen den Basen Nr. 1349 und 3793 (begrenzt durch die Kodons ATG und TGA für die Initiierung und Terminierung der Translation) in der Fig. 2; oder auch nur ein Teil der codierenden Sequenz, beispielsweise der Abschnitt zwischen den Basen Nr. 1349 und 3488 in der Fig. 2.
Die Anwesenheit des Fragments, das zwischen den Basen Nr. 3790 und 4010 der Fig. 2 am 3-Ende des Segments des Gens KEX2 angeordnet ist, verbessert die Expression des Gens, wobei es die Rolle eines Terminators und Stabilisators für die Konstruktion spielt.
Es ist erwünscht, das Fragment zwischen den Basen Nr. 3488 und 3790 der Fig. 2 zu deletieren, das eine destabilisierende Rolle im Bereich der Messenger-RNA spielen würde.
Die Amplifikation der Expression des Gens kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Bei einer ersten Variante werden eine oder mehrere Kopien des gesamten Gens KEX2 oder eines Teils desselben direkt in das Genom der Hefe integriert. Bei einer zweiten Variante werden eine oder mehrere Kopien des gesamten Gens KEX2 oder eines Teils desselben in den Vektor zur Expression des heterologen Proteins inseriert außerhalb des obengenannten Expressionsblockes. In der nachfolgenden Beschreibung wird insbesondere auf die zweite Variante mehr Wert (Interesse) gelegt.
Das Produkt des Gens KEX2 bewirkt die proteolytischen Spaltungen auf spezifische Weise. Deshalb müssen die Sequenzen Scl unter einer begrenzten Anzahl von möglichen Sequenzen ausgewählt werden. Vorzugsweise wählt man die Peptide Lys-Arg oder Arg-Arg oder auch Ser-Leu-Asp aus. Diesen Sequenzen Scl kann eine Sequenz "pro" vorausgehen oder nicht vorausgehen, d.h. sie können verbunden sein oder nicht verbunden sein mit einem komplexen Sekretionssystem. Wenn nämlich die Stelle für die proteolytische Spaltung durch das Produkt des Gens KEX2 vorhanden ist, kann man erwarten, daß die Reifung des Proteins stattgefunden hat, unabhängig von dem verwendeten Sekretions-System: einer für ein Signal-Peptid pre codierenden Sequenz oder einer solchen Sequenz, die an eine Sequenz pro gebunden ist (Sequenz pre-pro).
Eine besonders interessante (vorteilhafte) Konstruktion für die Bildung von Hirudin ist diejenige, in der die Sequenz pre-pro des α-Pheromons der Hefe mit der Spaltungsstelle (Schnittstelle) Lys-Arg oder gegebenenfalls Arg-Arg verbunden ist. Es ist ferner auch interessant (vorteilhaft) als Sequenz Str einen starken Promotor in der Hefe zu verwenden, um eine beträchtliche Menge an mRNA, die dem Vorläufer des reifungsfähigen Proteins entspricht, zu transkribieren und das Gen KEX2 mit einer maximalen Wirksamkeit auszunutzen. Als starker Promotor kann beispielsweise der Promotor des α-Pheromons der Hefe oder auch der Promotor PGK der Hefe verwendet werden.
Schließlich können die Expressions-Vektoren nach der DNA-Sequenz, die für das reife Protein codiert, eine Terminator-Sequenz der Hefe, beispielsweise diejenige des Gens PGK, aufweisen.
Bei den Expressions-Vektoren handelt es sich im allgemeinen um Plasmide mit autonomer Replikation. Diese Plasmide umfassen Elemente, die ihre Replikation gewährleisten, d.h. einen Replikationsursprung, z.B. denjenigen des Plasmids 2u von Hefe. Außerdem kann das Plasmid Selektionselemente, wie z.B. das Gen URA3 oder LEU2 enthalten, welche die Komplementierung der Hefe-Mutanten ura3 oder leu2 gewährleisten. Insbesondere kann man mit Vorteil das aus seinem Promotor deletierte Gen URA3 verwenden.
Diese Plasmide können außerdem Elemente aufweisen, die ihre Replikation in E. coli gewährleisten, wenn das Plasmid ein Schaukel-Plasmid sein muß, beispielsweise ein Replikations-Ursprung, wie z.B. derjenige von pBR322, ein Marker-Gen, wie Ap und/oder andere Elemente, die dem Fachmann bekannt sind.
Unter allen in Betracht kommenden Hefestämmen verwendet man vorzugsweise die Stämme des Genus Saccharomyces, insbesondere die Species cerevisiae. Wenn der Promotor derjenige des Gens MFalphal ist, ist die Hefe vorzugsweise eine solche vom sexuellen MATalpha-Typ. Man verwendet beispielsweise einen Stamm vom Genotyp ura3 oder leu2 oder einen anderen, der durch das Plasmid komplementiert wird, um die Aufrechterhaltung des Plasmids in der Hefe durch einen geeigneten Selektionsdruck zu gewährleisten.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines reifen heterologen Proteins durch Hefen, bei dem man die erfindungsgemäßen Stämme in einem geeigneten Medium kultiviert (züchtet) und das in das Kulturmedium sekretierte reife Protein abtrennt (gewinnt).
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Sekretion von Hirudin, insbesondere der Varianten rHV2Lys47 in der reifen Form, wobei man von erfindungsgemäßen Hefestämmen ausgeht.
Die nachfolgenden Beispiele erlauben den Nachweis anderer Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung. Diese Beispiele werden durch die beiliegenden Zeichnungen erläutert, wobei zeigen:
- Fig. 1 die Sequenz der Varianten HV1, HV2 und HV3 von Hirudin;
- Fig. 2 die Sequenz der Genom-DNA des Gens KEX2 der Hefe;
- Fig. 3 eine schematische Darstellung des Plasmids pTG2958;
- Fig. 4 eine schematische Darstellung der Struktur der Vektoren M13TG3839 und M13TG3841; und
- Fig. 5 eine schematische Darstellung der Restriktionskarte der verwendeten Fragmente des Gens KEX2.

Beispiel 1: Klonierung des Gens KEX2

Diese Klonierung wird durchgeführt durch phänotypische Komplementierung eines mutierten Stammes kex2-1. Die Mutation des Gens DEX2 äußert sich in einem Hefestamm MAT- alpha durch das Fehlen einer Sekretion von aktivem α-Pheromon und bei einem Hefestamm, der die Killer-RNA (K+) aufweist, durch das Fehlen einer Sekretion des Killer-Toxins. Der Stamm TGY38.1 wird als Empfängerstamm für die Klonierung des Gens KEX2 verwendet. Um diesen Stamm zu erhalten, werden die Stämme 80 (MATa, kex2-1, adeI, ura1, [KIL-k] K- r+) [Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA 94720] und TGY1sp4 (MATalpha, his3, ura3) zunächst alle miteinander gekreuzt. Das erhaltene Diploid TGY33 wird zur Sporenbildung veranlaßt. Eine Spore TGY33.1 wird anschließend charakterisiert, ihr Genotpy ist MATa, his3, ura3, kex2-1. Eine Rückkreuzung wird mit TGY1sp4 durchgeführt Das erhaltene Diploid TGY38 wird zur Sporenbildung veranlaßt. Nach der Keimung wird ein Segregierungsmittel TGA38.1 (MATa, ura3, his3, kex2-1), das eine bessere Transformations-Wirksamkeit aufweist, isoliert.
Ausgehend von einer Hefe-Genombank (durch Sau3A partiell digerierte Chromosomen-DNA-Fragmente, die in die Stelle BamHI von pFL1 inseriert worden sind [S.A. Parent et al., "Yeast" 1 (1985)], wird ein genomischer Klon pTG2809 erhalten. Dieser Klon (eine (K+) unter 10 000 Transformanten URA+ des Stammes TGY38.1) wird isoliert aufgrund seiner Fähigkeit, den funktionellen Mangel (Defekt), der auf die Mutation kex2-1 zurückzuführen ist: die Sekretion eines aktiven Killer-Proteins.
Durch Analysieren der DNA-Sequenz (Fig. 2) wird bestätigt, daß die codierende Sequenz von 2442 Basenpaaren in dem Insert enthalten ist (begrenzt durch die Kodons zur Initiierung und Terminierung der Translation in der Fig. 2). Die Sequenz entspricht der publizierten Sequenz des Gens KEX2 [K. Mizuno et al., "Biochem. Biophys. Res. Comm." 156 (1988)]. Die Analyse der codierenden Sequenz des Gens KEX2 zeigt eine Information, die einem Polypeptid aus 814 Aminosäuren entspricht. Das Protein würde eine putative Signal-Sequenz von 21 Aminosäuren enthalten. Ein hydrophober Abschnitt aus 21 Aminosäuren, der nahe bei dem T-terminalen Abschnitt lokalisiert ist, kann nachgewiesen werden (Position 679-699). Das Fragment EcoRI, welches das Defizit als Folge der Mutation KEX21-komplementiert, codiert für eine verkürzte (verstümmelte) Form am C-terminalen Ende des Produkts des Gens KEX2, die den Abschnitt zwischen den Basen Nr. 1349 und 3488 (Fig. 2) repräsentiert.

Beispiel 2: Konstruktion der Plasmide pTG3848, pTG3855, pTG3887, pTG3890 und pTG3872

A. Konstruktion von M13TG3841

Das Plasmid pTG2958 (Fig. 3) unterscheidet sich wenig von dem Plasmid pTG1833, das in der europäischen Patentpublikation EP-A-252 854 beschrieben ist, welches die für rHV2Asp47 codierende Sequenz trägt. Das Plasmid pTG2958 enthält nicht die künstlich eingeführte Restriktionsstelle HindIII. Das Plasmid pTG2958 enthält:
- ein Fragment von 547 Basenpaaren, das der 5'-Region des Gens MFalphal entspricht (die enthält den Promotor, die für das Signal-Peptid codierende Sequenz, die Region "pro" und eine für das Peptid Lys-Arg codierende Sequenz),
- ein Fragment von 234 Basenpaaren, das die komplementäre DNA von rHV2Lys47 enthält,
- ein Fragment von 243 Basenpaaren, welches den PGK- Terminator von Hefe enthält,
- das Fragment PvuII-EcoRI von pBR322, das unter anderem den Replikationsursprung dieses Plasmids und das Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin (2292 Basenpaare) enthält,
- das Fragment EcoRI-HindIII des Plasmids 2u der Hefe (Form B), welches das Gen LEU2 von Hefe, in einer deletierten und in die Stelle PstI inserierten Form enthält,
- ein Fragment HindIII-SmaI des Gens URA3 von Hefe.
Das Fragment NcoI-NcoI des Vektors pTG2958, welcher die Sequenzen LEU2-d, 2u und URA3 trägt, wird durch das in der europäischen Patentpublikation EP-A-0268501 beschriebene Fragment NcoI-NcoI von pTG2800 ersetzt, das die Sequenzen des Plasmids 2u und des Gens URA3 trägt, die aus seinem Promotor deletiert worden sind (URA3-d) zur Bildung von pTG2877.
Der Vektor M13TG3839 (Fig. 4) stammt aus M13TG103 [M.P. Kieny et al. "Gene" 26 (1983)], in dem das Fragment HindIII-HindIII von pTG2877 in die gleiche Stelle eingeführt worden ist. Eine Restriktionsstelle SalI wird in diesen Vektor stromabwärts von dem Kodon zur Terminierung der Translation der Region, die für rHV2Lys47 codiert, eingeführt durch gerichtete Mutagenese mit Hilfe des folgenden Oligonucleotids:
5' CAATGAAAAATGGTCGACTATCAATCATAG
unter Bildung von M13TG3839 SalI. Dann wird eine Restriktionsstelle SphI stromaufwärts von der Expressionskassette eingeführt durch Eliminierung der Sequenz URA3-d durch gerichtete Mutagenese mit Hilfe des folgenden Oligonucleotids:
5' GACGGCCAGTGAATTGGCATGCTATTGATAAGATTTAAAG
unter Bildung von M13TG3840.
Der Vektor M13TG131 [M.P. Kieny et al., "Gene" 26 (1983)] wird durch PstI gespalten (geschnitten), die Enden werden frei gemacht durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die anschließend wieder miteinander ligiert werden unter Bildung von M13TG3160. Dieser Vektor wird anschließend mit SmaI und EcoRV gespalten (geschnitten) und dann wieder ligiert unter Bildung von M13TG3149.
Das Fragment SphI-SalI von M13TG3840 (wie vorstehend beschrieben), das die Expressions-Kassette rHV2Lys47 (ohne Sequenz zur Terminierung der Transkription) trägt wird in die Stelle SphI-SaII von M13TG3149 eingeführt unter Bildung von M13TG3841 (Fig. 4).

B. Konstruktion des Plasmids pTG3848

Das in der europäischen Patentpublikation EP-A-0252 854 beschriebene Plasmid pTG848 wird durch BglII digeriert, dann wieder ligiert unter Bildung von pTG2886. Das große Fragment HindIII-EcoRI von pTG2886 wird in Gegenwart der Ligase T4 mit dem Fragment HindIII-EcoRI von 2,1 kb des Plasmids pFL1 ligiert [S.A. Parent et al., "Yeast" 1 (1985)], das die Sequenz des Plasmids 2u von S. cerevisiae trägt, unter Bildung des Plasmids pTG2886 LEU2-d, URA3-d. Das Fragment HindIII von 0,9 kb des in der europäischen Patentpublikation EP-A-0258501 beschriebenen Plasmids pTG2800, welches das Gen URA3-d trägt, wird danach in die Stelle HindIII dieses Plasmids inseriert zur Bildung von pTG2886 URA3-d, delta Leu2-d. Das Fragment SmaI-BglII von M13TG131 [Kieny et al., "Gene" 26, 1983], das mehrere Restriktionsstellen aufweist, wird anschließend in dieses Plasmid eingeführt zur Bildung von pTG3828.
Das Plasmid pTG3828 wird durch die Restriktionsenzyme SphI-SalI digeriert, dann wird das Fragment SphI-SalI des Vektors M13TG3841 (Fig. 4) in diese Stelle inseriert zur Bildung des Plasmids pTG3848. Dieses Plasmid enthalt:
- die Sequenz des Gens URA3, die aus seinem Promotor deletiert worden ist,
- den Promotor des Gens MFalphal,
- die Sequenz pre-pro von MFalphal,
- die Sequenz, die für rHV2Lys47 codiert
- den Transkriptions-Terminator des Gens pGK von Hefe
- ein Fragment von pBR322, das die Replikation und Selektion bei Escherichia coli erlaubt,
- ein Fragment des Plasmids 2u, das die Strukturelemente aufweist, die für die Replikation und für die gleichmäßige mitotische Verteilung in der Hefe erforderlich sind.

C. Konstruktion von pTG3855, pTG3887, pTG3890 und pTG3872

Diese Plasmide stammen aus pTG3848, das an der Stelle EcoRI offen ist. Eine künstliche Stelle BamHI wird stromabwärts von dem Stopp-Kodon des Gens KEX2 durch gerichtete Mutagenese mit Hilfe des folgenden Oligonucleotids geschaffen:
5' TAAAAGGGGAGGATCCAATTAATGC 3'
Das Fragment XhoI-BamHI (Koordinaten 538 bis 4011, Fig. 2) von pTG2809, das alle Strukturelemente des Gens KEX2 enthält (Fig. 5[1]), dessen Enden freigemacht worden sind durch die Klenow-DNA-Polymerase, wird in die Stelle EcoRI von pTG3848 inseriert, das der gleichen Behandlung unterworfen worden ist zur Bildung des Plasmids pTG3855. Das Fragment XhoI-EcoRI (Koordinaten 538 bis 3488, Fig. 2) von pTG2809 (Fig. 5[2]), dessen Enden durch die Klenow- DNA-Polymerase freigemacht worden sind, wird in die Stelle EcoRI von pTG3848 inseriert, das der gleichen Behandlung unterzogen worden ist, unter Bildung des Plasmids pTG3887 und des Plasmids pTG3883 entsprechend der Orientierung des Fragments. Im Falle des Plasmids pTG3887 erfolgt die Transkription von KEX2 in die Bakterien-Sequenz (pBR322), die von dem Plasmid getragen wird, während für das Plasmid pTG3883 die Transkription erfolgt in die Sequenz 2u des Plasmids. Um den Abschnitt des Gens KEX2 zwischen der Stelle EcoRI und TGA zu deletieren, wird eine gerichtete Mutagenese durchgeführt unter Verwendung des Oligonucleotids mit der folgenden Sequenz:
5' AAGAGCGGAAACGTATGAATGATTCGATATGTACAGAAAG 3'
Das künstliche Fragment XhoI-BamHI (Koordinaten 538 bis 4011, Fig. 2) von pTG2809, das auf diese Weise transformiert worden ist (Fig. 5 (3)), dessen Enden durch die Klenow-DNA-Polymerase freigemacht worden sind, wird anschließend in die Stelle EcoRI von pTG3848 inseriert, das der gleichen Behandlung unterzogen worden ist, zur Bildung des Plasmids pTG3890. Das Insert EcoRI-EcoRI von pTG2809, welches das Fragment Sau3A-EcoRI des Gens KEX2 enthält (Koordinaten 381 bis 3488, Fig. 2) (Fig. 5 (4)) wird in die Stelle EcoRI von pTG3848 inseriert unter Bildung des Plasmids pTG3872.

Beispiel 3: Herstellung von rHV2Lys47 als Funktion des verwendeten Plasmids

Ein Hefestamm der Species Saccharomyces cerevisiae vom Genotyp MATalpha, ura3-251,373,328,leu2-3,112, his3, pep4-3 wird durch die Plasmide pTG3848, pTG3872, pTG3855, pTG3887 und pTG3890 transformiert nach der Lithiumacetat- Methode [H. Ito et al., "J. Bacteriol.", 153, 1983] und die prototrophen Ura+ werden selektioniert. Sie werden anschließend in einem Erlenmeyer-Kolben bei 30ºC auf einem selektiven Medium (0,7 % stickstoffhaltige Basen für Hefen (Yeast Nitrogen Base), 0,5 % Casaminosäuren und 1 % Glucose) kultiviert. Nach 48-stündiger Kultivierung trennt man Zellen und überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren und die Inhibierungsaktivität für Thrombin wird in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt unter Anwendung des kolorimetrischen Tests (proteolytische Aktivität auf einem synthetischen Substrat, dem Chromozym TH - Boehringer Mannheim). In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Bestimmungen angegeben; jeder Wert entspricht dem Mittelwert von zwei unabhängigen Versuchen. Die Aktivität vom rHV2LyS47 ist ausgedrückt in ATU/A600 der Zellen (1-2x10&sup7; Zellen/ml entsprechend einer Einheit A600 nm). Tabelle 1 Plasmid
Die Anwesenheit des Gens KEX2 auf den erfindungsgemäßen Konstruktionen erlaubt eine Erhöhung der Bildung von rHV2Lys47 in einer aktiven Form um den Faktor 5.

Beispiel 4: Spezifische Aktivität der Endoprotease yscF als Funktion des verwendeten Plasmids

Man gewinnt (trennt ab) die Rohextrakte der Kultur von Hefestämmen, die mit den Plasmiden pTG3848, pTG3855, pTG3883 und pTG3890 nach den vorstehend beschriebenen Verfahren transformiert worden sind. Die spezifische Aktivität der Endoprotease yscF wird nach dem in der Publikation von T. Achstetter und D.H. Wolf (1985) ("EMBO J." 4, S. 173-177) beschriebenen Methode bestimmt. Diese Methode wird leicht modifiziert, man verwendet nämlich im Gegensatz zu diesen Autoren kein Triton.
In der folgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse dieser Bestimmungen angegeben. Die spezifische Aktivität von yscF ist ausgedrückt in mU/mg Protein. Die Proteine werden nach einer kolorimetrischen Methode bestimmt unter Verwendung des im Handel von der Firma BIORAD erhältlichen Kits. Tabelle 2 Plasmid KEX 2-Form spezifische Aktivität
Die Anwesenheit des Gens KEX2 auf den erfindungsgemäßen Konstruktionen erlaubt die Erhöhung der spezifischen Aktivität der gebildeten Endoprotease yscF. Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, daß das Fragment zwischen der Stelle EcoRI von KEX2 und dem TGA (ab der Base 3488 bis zur Base 3790, Fig. 2) eine destabilisierende Rolle im Bereich der Messenger-RNA spielen würde. Dagegen würde das Fragment TGA-BamHI (ab der Base 3790 bis zur Base 4010; Fig. 2) eine Terminator-Rolle spielen und so die Konstruktion stabilisieren. Die mit Hilfe des Plasmids pTG3890 erhaltene Form der Endoprotease yscF entspricht somit einer Form, deren spezifische Aktivität gegenüber der Vergleichs-Form erhöht ist.

Claims

1. Multicopy-Plasmid, das in einer Hefe replizierbar ist, das mindestens den folgenden Block zur Expression eines heterologen Proteins enthält:

- eine DNA-Sequenz (Str), welche die Signale aufweist, welche die Transkription der für einen Vorläufer des reifungsfähigen Proteins codierenden Sequenz durch die Hefe gewährleistet,

- eine DNA-Sequenz (Spr), die für ein Signal-Peptid pre und/oder ein Peptid pro codiert,

- eine DNA-Sequenz (Scl), die für ein Peptid codiert, das eine Stelle zur proteolytischen Spaltung (Schneiden) durch das Produkt des gesamten Gens KEX2 oder eines Teils desselben aufweist, und

- eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Protein codiert, das zusammen mit der Sequenz Spr den Vorläufer bildet,

dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid das gesamte Gen KEX2 oder ein Teil desselben enthält, was zu einer Erhöhung der proteolytischen Aktivität der Endoprotease yscF führt.

2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten Protein um Hirudin handelt.

3. Plasmid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Hirudin um die Variante rHV2Lys47 handelt.

4. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es den Teil des Gens KEX2 enthält, dessen Sequenz in der Fig. 2 dargestellt ist.

5. Plasmid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die funtionelle Sequenz des Gens KEX2 zwischen den Basen Nr. 1349 und 3793 in der Fig. 2 enthält.

6. Plasmid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es die funtionelle Sequenz des Gens KEX2 zwischen den Basen Nr. 1349 und 3488 in der Fig. 2 enthält.

7. Plasmid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es den Teil des Gens KEX2 zwischen den Basen Nr. 538 und 4010 in der Fig. 2 enthält und daß daraus die Sequenz zwischen den Basen Nr. 3488 und 3790 in der Fig. 2 deletiert ist.

8. Plasmid nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Segment des Gens KEX2 an dem 3'-Ende ein Terminator-Fragment aufweist, das der Sequenz zwischen den Basen Nr. 3790 und 4010 in der Fig. 2 entspricht.

9. Plasmid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz zwischen den Basen Nr. 3790 und 4010 in der Fig. 2 eine Stabilisatorrolle spielt.

10. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz Scl eine Sequenz ist, die für ein Peptid Lys-Arg oder Arg-Arg codiert.

11. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz Str ein starker Promotor in der Hefe ist.

12. Plasmid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um den Promotor des α-Pheromons von Hefe handelt.

13. Plasmid nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz Spr die Sequenz pre-pro des Gens MFalphal von Hefe ist.

14. Plasmid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Sequenz Spr eine Sequenz folgt, die für ein Peptid Lys-Arg oder Arg-Arg codiert.

15. Hefestamm, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 14 enthält.

16. Stamm nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um einen Stamm von Saccharomyces cerevisiae handelt.

17. Verfahren zur Herstellung von reifem Hirudin durch Hefen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem geeigneten Medium einen Hefestamm nach einem der Ansprüche 15 bis 16 kultiviert (züchtet) und das erhaltene reife Hirudin daraus gewinnt (abtrennt).

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Hirudin um die Variante rHV2Lys47 handelt.