DE3250073C2 - Verwendung der antibakteriellen Mittel LL-C23024alpha, beta und jota zur Bekämpfung von Nematoden und Coccidiosis-Infektionen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den Gegenstand der Patentansprüche.

Die Erfindung betrifft insbesondere neue Verwendungen von antibiotischen LL-C23024α, β und jota, die durch Fermentierung des Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. NRRL 12515 unter kontrollierten Bedingungen erhalten werden (nach Stammpatent DE 32 38 316 C2).

Das Antibiotikum LL-C23024α hat folgende Struktur

Das Antibiotikum LL-C23024β unterscheidet sich von bekannten Verbindungen aufgrund seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften, u.a. durch seine Mikroanalyse, seine optische Rotation, sein IR-Spektrum, sein ¹³C-NMR-Spektrum und sein ¹H-NMR- Spektrum.

Das Antibiotikum LL-C23024β hat die folgende postulierte Struktur

wobei R₁ und R₂ verschieden sind und jeweils ausgewählt sind unter H und CH₃.

Die obige, postulierte Struktur beruht auf der Elementaranalyse, der optischen Drehung, dem mittels Felddesorptionsmassenspektroskopie ermittelten Molekulargewicht, dem Schmelzpunkt, dem Infrarot(IR)-Spektrum, dem ¹³C-kernmagnetischen Resonanz(¹³C-NMR)-Spektrum und dem protonenmagnetischen Resonanz(¹H-NMR)-Spektrum. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Beispielen genauer angegeben und sind in den Zeichnungen dargestellt; es zeigen:

Fig. I das IR-Spektrum von LL-C23024β in KBr;

Fig. II das ¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23024β; 20 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard;

Fig. III das ¹H-NMR-Spektrum von LL-C23024β; 80 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard.

C-NMR-Spektrum von LL-C23024β (TpM relativ zu TMS)
Chemische Verschiebung (TpM)
Anzahl der Kohlenstoffatome
10,5
1
11,0	1
12,2	1
17,0	1
17,7	1
17,9	1
22,3	1
26,1	1
26,8	1
27,6	1
30,2	1
32,0	1
33,3	1
33,7	2
33,8	2
36,5	1
36,8	1
39,0	1
39,9	1
45,5	2
57,1	1
59,1	1
60,7	1
66,9	1
67,6	1
70,2	1
71,3	1
72,9	1
74,9	1
75,1	1
79,9	1
80,8	1
82,1	2
84,5	1
84,7	1
85,6	1
86,9	1
95,8	1
96,9	1
97,7	1
107,5	1
179,2	1
Gesamtzahl d. Kohlenstoffatome	46

LL-C23024 jota ist ein Polyäther-Antibiotikum mit äußerst starker Wirkung gegen Coccidia. Es ist mindestens um das 10fache potenter als die meisten anderen, bekannten Polyäther. Die Werte des Felddesorptionsmassenspektrums zeigen, daß es ein Molekulargewicht von 930 hat. Dieser Befund in Verbindung mit dem ¹³C-NMR-Spektrum gestattet die Voraussage einer möglichen Summenformel von C₄₈H₈₂O₁₇. LL-C23024 jota scheint vier Methoxygruppen aufzuweisen sowie den gleichen Zucker, der im Polyäther-Antibiotikum X-14868A (US-PS 4 278 663) beobachtet wurde, sowie eine Carboxylgruppe. Bei dem einzigen anderen Polyäther-Antibiotikum mit einem Molekulargewicht von 930, das bisher beschrieben wurde, handelt es sich um das Antibiotikum A28695B (Hedroxyseptamycin) [J. Antibiotics 33(2), 252 (1980)], welches sich hinsichtlich seiner strukturellen und biologischen Eigenschaften signifikant von dem erfindungsgemäßen Antibiotikum unterscheidet. Die obigen Beobachtungen beruhen auf der Elementaranalyse, der optischen Drehung, dem berechneten Molekulargewicht mittels Felddesorptionsmassenspektroskopie, dem IR-Spektrum, dem ¹³C- NMR-Spektrum und dem ¹H-NMR-Spektrum. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in den Beispielen im Detail erläutert und in den Zeichnungen dargestellt; es zeigen:

Fig. IV das IR-Spektrum von LL-C23024 jota in KBr;

Fig. V das ¹H-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; 80 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard;

Fig. VI das ¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; 20 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard;

Fig. VII das ¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; (expandierte Skala: 0-50 TpM), 20 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard;

Fig. VIII das ¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; (expandierte Skala: 50-110 TpM), 20 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard.

Das ¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota wurde in deuteriertem Chloroform (CDCl₃) bei einer Feldstärke von 20 MHz erhalten. Die Signale mit ihren relativen chemischen Verschiebungen, in Teilen pro Million (TpM), relativ zu Tetramethylsilan (TMS) und die angenommene Zahl von Kohlenstoffatomen pro Signal sind in Tabelle II zusammengestellt. Für Chloroform wurden Signale bei 75,4, 77,0 und 78,6 beobachtet.

Tabelle II

Bei den Antibiotika LL-C23024α, β und jota handelt es sich um organische Carbonsäuren. Sie sind somit fähig, Salze mit nichttoxischen, pharmazeutisch akzeptablen Kationen zu bilden. Es können daher Salze gebildet werden, indem man das Antibiotikum in Form der Freien Säure mit stöchiometrischen Mengen von Kationen, zweckentsprechend in einem neutralen Lösungsmittel, vermischt. Als Kationen kommen dabei beispielsweise Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Ammonium in Frage sowie organische Aminkationen, wie Tri-(niederalkyl)-amin (z. B. Triäthylamin, Triäthanolamin) und Procain. Die kationischen Salze des Antibiotikums LL-C23024β sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, relativ unlöslich in Wasser und löslich in den meisten herkömmlichen, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Heptan, Äther und Benzol.

Das Antibiotikum in Form der freien Säure ist ihren pharmazeutisch annehmbaren, nichttoxischen Salzen äquivalent.

Die Antibiotika LL-C23024β und jota sind in vitro gegen grampositive Bakterien aktiv, wenn sie mittels des Standard-Agarverdünnungsverfahrens untersucht werden. Die als minimale Hemmkonzentration (MIC) in mcg/ml ausgedrückten Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt. Die Antibiotika LL-C23024β und jota sind bei Konzentrationen von 256 mcg/ml oder weniger nicht wirksam gegenüber gramnegativen Organismen.

in vitro antibakterielle Aktivität von LL-C23024β
Organismus
MIC (mcg/ml)
Staphylococcus aureus Smith
64
Staphylococcus aureus SSC 80-11	64
Staphylococcus aureus SSC 80-32	64
Staphylococcus aureus SSC 80-38	64
Staphylococcus aureus LL-14	64
Staphylococcus aureus LL-45	64
Staphylococcus aureus LL-27	128
Staphylococcus aureus ATCC 25923	64
Streptococcus pyogenes C203	1
Streptococcus β-hemolytic Keller T623	8
Streptococcus pneumoniae 78-1	8
Enterococcus SSC-80-62	64
Enterococcus SSC-80-63	128

in vitro antibakterielle Aktivität von LL-C23024 jota
Organismus
MIC (mcg/ml)
Enterococcus OSU 75-1
1
Enterococcus SM 77-15	1
Staphylococcus aureus SSC 79-18	1
Staphylococcus aureus FU 79-19-2	2
Micrococcus lutea PCI 1001	1
Staphylococcus aureus Smith	0,5
Staphylococcus aureus ATCC 25923	0,5

Wie aus den obigen Daten hervorgeht, inhibieren die Antibiotika LL-C23024α, β und jota das Wachstum bestimmter grampositiver Bakterien und sind somit als topische oder Oberflächen-Antiseptika in Waschlösungen für die Haut, für Ausrüstungsgegenstände, für Wände, Fußböden und dergl. brauchbar.

Es wurde darüber hinaus festgestellt, daß die antibakteriellen Mittel LL-C23024α, β und jota in vivo wirksam sind, und zwar als Anticoccidia-Mittel bei Geflügel. Das wird durch die nachfolgenden Tests erläutert.

2 Tage vor der Inokulation wird mit Medikamenten behandeltes Futter, welches die Wirkstoffe mit unterschiedlichen Dosisniveaus enthält, verschiedenen Gruppen von 1 Tag alten Testküken angeboten. Das während des gesamten Tests verwendete Geflügelfutter ist folgendermaßen hergestellt worden:

%
Vitamin-Aminosäure-Prämix
0,5
Spurenmineralien	0,1
Natriumchlorid	0,3
Dicalciumphosphat	1,2
gemahlener Kalkstein	0,5
stabilisiertes Fett	4,0
getrocknetes Alfalfa, 17% Protein	2,0
Maisklebermehl, 41% Protein	5,0
Menhadenfischmehl, 60% Protein	5,0
Sojabohnenölmehl, 44% Protein	30,0
gemahlener, gelber Mais, fein, zum Auffüllen auf	100

Das in der obigen Futterzusammensetzung verwendete Vitamin- Aminosäure-Prämix ist aus der folgenden Formulierung hergestellt. Die Quantitätsangaben beziehen sich dabei auf Einheiten/kg der fertigen Futterzusammensetzung.

Butyliertes Hydroxytoluol|125,0 mg
dl-Methionin	500,0 mg
Vitamin A	3300,0 IE
Vitamin D₃	1100,0 ICE
Riboflavin	4,4 mg
Vitamin E	2,2 IE
Niacin	27,5 mg
Panthothensäure	8,8 mg
Cholinchlorid	500,0 mg
Folsäure	1,43 mg
Menadion-natriumbisulfat	1,1 mg
Vitamin B₁₂	11,0 mcg
gemahlener, gelber Mais, fein, zum Auffüllen auf	5,0 g

Die Testküken werden dann inokuliert, und zwar durch direkte Inokulation in den Kropf jedes Kükens unter Verwendung eines gemischten Inokulums von 5000 sporenbildenden Oocyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl Oocyten von Eimeria tenella zur Erzeugung einer 85 bis 100% Mortalität bei nichtbehandelten Kontrolltieren. Die Küken haben während der gesamten Testdauer freien Zugang zu Futter und Wasser. 7 Tage nach der Inokulation werden die Tests abgebrochen. Die Vögel werden gewogen, getötet und ihr Intestinaltrakt wird hinsichtlich Läsionen untersucht. Die in den folgenden Tabellen V und VI zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß bei den infizierten Küken eine verbesserte Überlebensrate erreicht wird, wenn ihrem Futter 10 TpM oder mehr der Antibiotika LL-C23024β oder jota zugesetzt sind. Die Ergebnisse zeigen ebenso eine signifikante Unterdrückung von intestinalen Läsionen, die durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina verursacht sind.

Durch die folgenden Tests wird die nematocide Aktivität demonstriert.

Beispiel A Bewertung von Testzusammensetzungen hinsichtlich der nematociden Aktivität unter Verwendung der freilebenden, hermaphroditischen, mikrobivorösen Nematode Caenorhabditis elegans II

Bei den folgenden Tests werden C. elegans zur Bestimmung der nematociden Aktivität der Fermentationsbrühe und der geernteten Maische verwendet. Dieser Organismus wird ebenfalls zur Bewertung von LL-C23024α und LL-C23024β verwendet, um deren nematocide Aktivität zu bestimmen.

Bei diesen Tests handelt es sich bei der Fermentationsbrühe um die bei der Fermentation erhaltene Mischung von Flüssigkeit und Feststoffen, die entnommen wird, bevor die Feststoffe, d. h. die geerntete Maische, von der Flüssigkeit abgetrennt wird. Bei der geernteten Maische handelt es sich um die Feststoffe, die nach der Abtrennung zurückbleiben.

Zur Bewertung der geernteten Maische werden die Feststoffe der geernteten Maische in destilliertem Wasser im Verhältnis 1 : 1 dispergiert. Die Fermentationsbrühe wird so, wie sie ist, verwendet und enthält sowohl Flüssigkeit als auch Feststoffe.

Bei den vorliegenden Bewertungen wird C. elegans in einem C. briggsae Maintenance Medium aufbewahrt. Das Maintenance- Medium ist im Handel erhältlich und weist die folgende Zusammensetzung auf.

C. briggsae Maintenance Medium(1)
Komponente
mg/l
Anorganische Salze
CaCl₂ · 2 H₂O	220,50
CuCl₂ · 2 H₂O	6,50
Fe(NH₄)₂(SO₄)₂ · 6 H₂O	58,80
KH₂PO₄	1225,50
KOH	(a)
MnCl₂ · 4 H₂O	22,20
ZnCl₂	10,20
Andere Komponenten @	N-Acetylenglucosamin	15,00
Adenosin-3′-(2′)-phosphorsäure · H₂O	365,00
Cytidin-3′-(2′)-phosphorsäure	323,00
D-Glucose	1315,00
Glutathion, reduziert	204,00
Guanosin-3′-(2′)-PO₄Na₂ · H₂O	363,00
Magnesiumcitrat · 5 H₂O (dibasisch)	915,00
Kaliumcitrat · H₂O	486,00
DL-Thioktsäure	3,75
Thymin	126,00
Uridin-3′-(2′)-phosphorsäure	324,00
Aminosäuren @	L-Alanin	1395,00
L-Arginin	975,00
L-Asparaginsäure	1620,00
L-Cystein-HCl · H₂O	28,00
Gl-Glutamat (Na) · H₂O	550,00
L-Glutamin	1463,00
Glycin	722,00
L-Histidin	283,00
L-Isoleucin	861,00
L-Leucin	1439,00
L-Lysin-HCl	1283,00
L-Methionin	389,00
L-Phenylalanin	803,00
L-Prolin	653,00
L-Serin	788,00
L-Threonin	717,00
L-Tryptophan	184,00
L-Tyrosin	272,00
L-Valin	1020,00
Vitamine @	p-Aminobenzoesäure	7,50
Biotin	3,75
Cholindihydrogencitrat	88,50
Cyanocobalamin (B¹²)	3,75
Folinat (Ca)	3,75
Myo-inosit	64,50
Niacin	7,50
Pantethein (Pantethine)	3,75
Pantothenat (Ca)	7,50
Pterolyglutaminsäure	7,50
Pyridoxalphosphat	3,75
Pyridoxamin 2 HCl	3,75
Pyridoxin HCl	7,50
Riboflavin-5′-PO₄(Na) · 2 H₂O	7,50
Thiamin HCl	7,50

Literatur:
(1) E.L. Hansen, Proc. Soc. Exp. Bio. & Med. 121, 30-393 (1966);
Bemerkungen:
(a) So viel, wie nötig, um den pH auf 5,9 ± 0,1 einzustellen.

Für die Bewertungen wird eine Lochplatte mit einer Reihe von kleineren Löchern verwendet. 25 ml der Fermentationsbrühe, der 1 : 1 Wasser/geerntete Maische-Suspension oder einer wäßrigen Acetonlösung von LL-C23024α oder LL-C23024β, enthaltend 31,25 bis 500 TpM der Testverbindung, werden unter aseptischen Bedingungen in gesonderten Schächten deponiert. Jedem Schacht werden dann 25 ml des C.elegans Maintenance Mediums, enthaltend 10 bis 20 adulte Würmer plus Larven verschiedenen Alters plus Eier, zugesetzt. Die Platten werden anschließend in einen Abzug placiert und 48 h nach der Inokulation untersucht, um die Geschwindigkeit und den Grad der nematociden Aktivität der Testzusammensetzungen zu beurteilen. Die erhaltenen Daten sind im folgenden aufgeführt. In den Fällen, in denen bei der Fermentationsbrühe eine Aktivität beobachtet wird, wird die Brühe weiter verdünnt, um ein 1 : 4 Brühe/C.elegans-Verhältnis zu schaffen.

Tabelle VII

Die bei diesen Bewertungen verwendete Aktivitätseinteilung ist wie folgt:

Aktivitätslegende
8 = keine Bewegungsfähigkeit (scheinbar tot)
7 = merklich reduzierte Bewegungsfähigkeit
6 = verringerte Bewegungsfähigkeit
0 = normale Bewegungsfähigkeit der Species

Beispiel B Bewertung von LL-C23024α als nematocides Mittel gegen infektiöse Larven⁺⁺ von Wiederkäuernematoden

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird die Bewertung von LL-C23024α als nematocides Mittel gegen infektiöse Larven von Wiederkäuernematoden durchgeführt, wobei folgende Nematodenspecies anstelle von C.elegans verwendet wurden: Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus axei, T. colubriformis; sowie der Essigälchenwurm, Turbatrix aceti. Die erhaltenen Daten sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
⁺⁺ Larven im dritten Häutungsstadium.

In den folgenden Tabellen bezieht sich die Aktivitätseinteilung auf die zuvor aufgeführte Aktivitätslegende.

Beispiel C Bewertung der nematociden Aktivität des Antibiotikums LL-C23024α gegen Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera bei Mäusen

Bei den folgenden Tests werden weibliche, weiße Swiss- Webstermäuse mit Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera infiziert und 3 Wochen gehalten, um die Infektionen sich entwickeln zu lassen.

Nach diesem Zeitraum des Haltens werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Gruppen von vier aufgeteilt. Die Gruppen werden in getrennte Käfige placiert. Anschließend wird ein mit Medikamenten behandeltes Futter angeboten, welches von etwa 31,25 TpM bis 4000 TpM der Testverbindung enthält. Das Futter wird den Mäusen eine Woche lang ad libitum angeboten. Wasser wird ebenfalls ad libitum während der Testperiode zur Verfügung gestellt. Während der Behandlungsperiode werden die Ausscheidungen der Mäuse untersucht, um zu bestimmen, ob Würmer ausgeschieden werden. Bei allen behandelten Gruppen wurde festgestellt, daß sie Würmer ausscheiden. Dadurch wird eine nematocide Aktivität bei allen Konzentrationen der Verbindung gegenüber beiden Nematoden angezeigt. Am Ende der einwöchigen Behandlung mit medikamentiertem Futter werden die Mäuse getötet und die Inhalte der intestinalen Trakte der Mäuse werden auf Würmer untersucht. Die erhaltenen Werte sind im folgenden als prozentuale Verringerung von Würmern, verglichen mit infizierten, nicht-medikamentierten Kontrolltieren, ausgedrückt.

Bei diesen Tests wurden rohe Fermentationsbrühen bewertet, welche vor Ernte der Maische erhalten wurden und welche 1000 bis 4000 TpM des nematociden Antibiotikums enthielten. Das Mäusefutter, welches mit 31,25 bis 500 TpM LL- C23024α, gelöst in einem Aceton/Wasser-Gemisch (1 : 1), behandelt war, wurde ebenfalls bewertet.

Claims (3)

1. Verwendung der Antibiotika LL-C23024α, β und jota zur Bekämpfung von Coccidiosis-Infektionen bei Geflügel, wobei das Antibiotikum LL-C23024α folgende Struktur aufweist: das Antibiotikum LL-C23024 beta durch folgende Parameter definiert ist:(a) eine optische Drehung [α] von +32° ± 2
(0,495%, Methanol) und [α] von +46° ± 2
(0,440%, Chloroform);
(b) eine Elementaranalyse (%) von C 61,55; H 8,79;
(c) einen Schmelzpunkt von 171 bis 173°C;
(d) ein Molekulargewicht gemäß Felddesorptionsmassenspektroskopie von 902;
(e) ein ¹³C-kernmagnetisches Resonanzspektrum in deuteriertem Chloroform bei 80 MHz, welches dem in Fig. II gezeigten entspricht;
(f) ein Infrarot-Absorptionsspektrum in KBr, das dem in Fig. I gezeigten entspricht; und
(g) ein Protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum in deuteriertem Chloroform bei 20 MHz, welches dem in Fig. III gezeigten entspricht,
das Antibiotikum LL-C23024 jota durch folgende Parameter definiert ist:(a) eine optische Drehung [α] = +27° (C 0,724, Methanol);
(b) eine Elementaranalyse (%) von C 61,69; H 8,84;
(c) ein Molekulargewicht gemäß Felddesorptionsmassenspektroskopie von 930;
(d) ein ¹³C-kernmagnetisches Resonanzspektrum in deuteriertem Chloroform bei 80 MHz, welches dem in den Fig. VI, VII und VIII gezeigten entspricht;
(e) ein Infrarot-Adsorptionsspektrum in KBr, welches dem in Fig. IV gezeigten entspricht; und
(f) ein Protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum in deuteriertem Chloroform bei 20 MHz, welches dem in Fig. V gezeigten entspricht,
und wobei die Fig. I bis VIII Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verwendung der in Anspruch 1 definierten Antibiotika LL-C23024α, LL-C23024β oder eines pharmaceutisch akzeptablen Salzes der Verbindungen, Mischungen der Verbindungen oder Salze oder Fermentationsbrühen oder Festkörper der geernteten Maische, aus der die Antibiotika erhalten werden, zur Bekämpfung von Nematoden bei warmblütigen Tieren.

3. Verwendung der Antibiotika LL-C23024β, LL-C23024 jota gemäß Anspruch 1 gemeinsam mit einem eßbaren Träger, wobei die Konzentration des Antibiotikums 0,000025 bis etwa 0,06 Gew.-% beträgt.