DE3039132C2 - Verfahren zur stereospezifischen Herstellung von Carbamylderivanten von α-Hydroxysäuren - Google Patents
Verfahren zur stereospezifischen Herstellung von Carbamylderivanten von α-HydroxysäurenInfo
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-
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Description
H-C
-O
O = C
in der R eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder aliphatische Gruppe.bedeutet, mit
Hilfe eines enzymatisch wirksamen Präparats hydrolysiert, das aus homogenisierter Kälberleber
erhalten oder aus einem der Mikroorganismusstämme Agrobacterium radiobacter NRRL 11291, Bacillus
Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearo thermophilus
NRRL D 11079, Pseudomonas sp CBS 145.75, Pseudomonas sp CBS 146.75, Pseudomonas sp
ATCC 11299, Pseudomonas desmolytica NCI B 8859. Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 oder Pseudomonas
putida ATCC 12633 gebildet worden ist.
Die lirfindung betrifft ein Verfahren zur stcreospezitischen
Herstellung von Carbamylderivaten von a-Hydroxysäuren durch enzymatische Hydrolyse eines in
5-Stellung substituierten 2,4-Oxazolidindions der allge-R
meinen Formel (I):
R
R
MC O
O = C
C=O
(I)
1!
in der R eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder aliphatische Gruppe ist.
Aus Journal of the American Chemical Society, 1965, Seite 4588 bis 4592, ist es bekannt, daß 2,4-Oxaholidindione
zu Carbamylderivaten von a-Hydroxysäuren und schließlich zu α-Hydroxysäuren gespalten werden
können. Die dort angegebene Spaltung verläuft jedoch nicht stereospezifisch.
Da es häufig erwünscht ist, Hydroxysäuren einer bestimmten Konfiguration, insbesondere D-Hydroxysäuren
zu erhalten, besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe es
möglich ist. aus substituierten 2,4-Oxazolidindionen
stereospezifisch D-Carbamylderivate von Hydroxysäuren zu erhalten.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man das in 5-Stellung substituierte 2,4-Oxa^olidindion mit Hilfe
eines enzymatisch wirksamen Präparats hydrolysiert, das erhalten worden ist aus homogenisierter Kälberleber
oder gebildet worden ist von einem der Mikroorganismusstämme Agrobacterium radiobacter NRRL
11291, Bacillus Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearo
ihermophilus NRRL B 11079, Pseudomonas sp CBS 145.75, Pseudomonas sp CBS 146.75, Pseudomonas sp
ATCC 11299, Pseudomonas desmolytica NCI B 8859, Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 oder Pseudomonas
putida ATCC 12633.
Bei dem erfindungsgemällen Verfahren gehen die
Verbindungen der allgemeinen Formel I, d.h. die in 5-Stellung substituierten 2,4-Oxazolidindione eine Hydrolyse-Reaktion
ein, durch die der Ring entsprechend dem folgenden Formelschema geöffnet wird:
R O
R O
HC O
O = C C = O + H2O
ν'
HC-OC-NH2
OH
(I)
Die Verbindung der allgemeinen Formel II, die durch
Hydrolyse erhalten wird, ist das Carbamylderivat einei
\-Hydroxysäure aus dem die x-Hydroxysäure erhalten
R
III)
werden kann, indem man die Verbindung Il der weiteren Hydrolyse unterwirft, gemäß dem folgenden
Schema:
ItO(H' (11
(HONII, f H,O
Das 1 nd produkt (III) is ι tue \-l lydrovy säure.
Ks hat sich überraschenderweise als möglich erwie
CH COoIi f CO.- ♦ NH,
OH
OH
(III)
SLMi. in «-Stellung substituierte DI.-2,4-Oxazolidindiuli·
so enzymatisch /u hviimlisieren, daß man nur elit_
D-Carbamyl-a-Hydroxysäure erhält, d.h. nur eines der
beiden möglichen optischen Isomeren. Die freie α-Hydroxysäure der D-Konfiguration kann aus dem
optisch aktiven Carbamyl- Derivat durch einfache Hydrolyse erhalten werden. Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) können leicht aus den entsprechenden Hydroxysäuren durch Umsetzung mit Harnstoff
erhalten werden (Helge Aspelund in Acta Acad. Aboensins Math, and Phys. 22 (7) 12 [1961]).
Ein besonders wichtiger Fall ist die Herstellung von D( — )MandeIsäure der Formel
(IV)
die ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von halbsynthetischen Antibiotika ist.
C C
/■ \ / χ
ONO
H
L
H
L
Dieses Zwischenprodukt wird im allgemeinen hergestellt durch Auftrennung des racemischen Gemisches
mittels Bildung der diastereo-isomeren Salze mit
optisch aktiven natürlichen Basen, wie Brucin. Dieses Verfahren ergibt im günstigsten Falle eine theoretische
Ausbeute von 50%, da das L-Enantiomer racemisiert werden muß, bevor es zurückgeführt wird.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Carbamylderivat von D( —)Mandelsäure vorteilhaft
hergestellt werden durch stereoselektive enzymatische Hydrolyse des entsprechenden 5-Phenyl-2,4-oxazolidindions.
Ein weiterer bedeutender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß das Substrat der
enzymatischen Reaktion spontan unter Hydrolysebedingungen racemisiert, so daß am Ende der Reaktion
das Carbamat der D-Mandelsäure in stöchiometrischer Menge, bezogen auf das Ausgangssubstrat, erhalten
wird.
Die Reaktion verläuft nach dem folgenden Schema
H —C —O —C —NH
Die D( - )Mandelsäure wird dann aus dem D-Mandelsäurecarbamat
durch Hydrolyse in saurer Umgebung erhalten.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah- -in
rens werden die oben angegebenen Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in Kulturmedien gezüchtet,
die Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, Phosphor und Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen
20 und 800C, 10 bis 72 Stunden bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0.
Glucose, Lactat, Acetat, Maiswasser und Lactose können als Kohlenstoffquellen angewandt werden.
Fleisch-Hydrolysate, Casein oder Sojabohnen, Ammoniumsalze, Harnstoff, Hydantoin usw. können als
Stickstoffquelle angewandt werden.
Ein geeignetes Kulturmedium besitzt z. B. die folgende Zusammensetzung:
| Fleischpepton | 5g |
| Fleischextrakt | 5g |
| Glucose | 5g |
| destilliertes Wasser | 1000 ml |
| pH-Wert | 7,0 bis 7,2 |
Das D(-)Carbamat der Hydroxysäure kann direkt in den Fermentationsmedien, die das entsprechende
DL-2,4-Oxazolidindion enthalten, hergestellt werden, oder es kann hergestellt werden mit Hilfe einer
mikrobiellen Paste in Form von ruhenden Zellen oder unter Verwendung von Extrakten. Die Enzymkomplexe,
die erfindungsgemäß angewandt werden, werden aus der bakteriellen Paste durch übliche Verfahren, wie sie
in der Enzymologie angewandt werden, extrahiert.
Zu diesem Zweck werden die Zellen mit Hilfe geeigneter Vorrichtungen wie French Pressure-Cell
Press, Maiuon Gaulin Homogenizer, Rotationsdisintegretoren
usw. oder mit Hilfe von Ultraschall aufgebrochen.
Die Hydrolyse des in 5-Stellung substituierten DL-2,4-Oxazolidindions kann durchgeführt werden
durch Zugabe des Enzyms in einer der folgenden Formen zu dem Reaktionsgemisch:
Frische Zellen,
lyophilisierte Zellen,
mit Toluol behandelte Zellen,
acetonhaltiges Pulver oder
rohe oder gereinigte Extrakte.
lyophilisierte Zellen,
mit Toluol behandelte Zellen,
acetonhaltiges Pulver oder
rohe oder gereinigte Extrakte.
Eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung kann erreicht werden durch Immobilisieren der
Enzyme durch Zusammenbringen mit makromolekularen Verbindungen unter Bildung chemischer Bindungen
mit der Matrix oder ionischer Bindungen oder durch physikalische Immobilisierung.
Das Verfahren der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Fleischpepton
Fleischextrakt
Fleischextrakt
5g
3g
3g
Glucose
destilliertes Wasser
destilliertes Wasser
5g
1000 ml
1000 ml
Der pH-Wert wurde mit Hilfe von Soda auf 7,2 eingestellt und das Medium in Mengen von jeweils
100 ml in 500-ml-K.olben gegeDen. Nach 30 Minuten
langem Sterilisieren bei 1100C wurden die Kolben mit einer Kultur von Pseudomonas CBS 145.75 von einer
Schräge, enthaltend das gleiche Medium mit 2% Agar (DlFCO), beimpft und 24 Stunden bei 300C unter
kreisförmigem Bewegen (220 UpM) inkubiert.
1 m! dieser Vorkultur (optische Dichte bei 550 nm = 0,250; Verdünnung 1 : 10) wurde jeweils in 5 500-ml-Kolben,
enthaltend 100 ml des gleichen Mediums, gegeben und die Kultur wurde unter kreisförmigem Bewegen
(220 UpM) 24 Stunden bei 30cC inkubiert (optische
Dichte bei 550 nm = 0,450; Verdünnung 1 : 10).
Die Zellen wurden dann gewonnen, in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und schließlich in
100 ml 0.1 m Pyrophosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,7, enthaltend 2 g DL-5-Phenyl-2,4-oxazolidindion,
bei einer Temperatur von 50° C suspendiert.
Nach 70stündiger Inkubation unter diesen Bedingungen war die Hydrolyse zu dem D-Mandelsäurecarbamat
vollständig, wie durch polarimetrische Analyse des
Reaklionsgemisches nachgewiesen werden konnte.
Das Carbamat wurde nach Entfernung der Zellpaste durch Abzentrifugieren aus dem Reaktionsgemiscii
gewonnen, dann abgekühlt und der pH-Wert mit konz. HCI auf 2,5 eingestellt. Der so erhaltene Niederschlag
wurde abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt 1,8 g Carbamat,
das durch das IR- und NMR-Spektrum sowie die Elementaranalyse identifiziert wurde.
Die spezifische optische Drehung der alkoholischen Lösung des wie oben erhaltenen Carbamats betrug
[«] -141. Der Schmelzpunkt betrug 169°C unter Zersetzung.
1.4 g des Carbamats wurden in 100 ml Wasser suspendiert und dann 4 Stunden unter Rückflußbedingungen
erhitzt. Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde angesäuert und mit Äthyläiner extrahiert und die
organische Phase unter Vakuum zu Trockne eingedampft. Man erhielt 1,10 g der rohen Mandelsäure
[α] - 120 (optische Reinheit 76%).
Nach dem Umkristallisieren aus Wasser zeigte das rohe Produkt die folgenden Werte; Fp 1300C und
[α] —154,5 in Wasser, gegenüber Fp 133°C und
[λ] — 158, wie sie in der Literatur für D( — )Mandelsäure
angegeben sind.
1 g Aceton-haltiges Pulver von homogenisierter
Kälberleber wurde zu einer Lösung gegeben, enthaltend 500 mg DL-5-Phenyl-2,4-oxazolidindion in 50 ml 0,1 m
Pyrphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,5.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde 40 Stunden bei 30°C inkubiert. Das D-Mandelsäurecarbamat
wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen.
Man erhielt 380 mg rohes Carbamat mit einer spezifischen optischen Drehung [λ] £ -136 in Äthanol.
Dann wurde das rohe Carbamat der sauren Hydrolyse unterworfen und die Mandelsäure wie in
Beispiel 1 extrahiert. Man erhielt 300 mg rohe D-Mandelsäure [λ] - 116 (optische Reinheit 73,5%).
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur stereospezifischen Herstellung von Carbamylderivaten von oc-Hydroxysäuren, d a durch gekennzeichnet, daß man ein in 5-Stellung substituiertes 2,4-Oxazolidindion der allgemeinen Formel
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