DE3036131A1

DE3036131A1 - Neue desoxycytidin-verbindungen, deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zubereitungen

Info

Publication number: DE3036131A1
Application number: DE19803036131
Authority: DE
Inventors: Erik De Prof. Clercq; Albert Stanley Prof. Yardley Birmingham Jones; Gabriel Albert Leuven Verhelst; Richard Thomas Selly Oak Birmingham Walker
Original assignee: University of Birmingham
Current assignee: University of Birmingham
Priority date: 1979-10-03
Filing date: 1980-09-25
Publication date: 1981-04-16
Also published as: US4382925A; IT8009551A0; IT1209758B; BE885415A; SE8006669L; FR2466472A1; JPS637199B2; CH647245A5; NL8005336A; GB2060604A; DE3036131C2; GB2060604B; CA1173438A; SE445740B; JPS5695198A; FR2466472B1

Description

Die Erfindung betrifft neue Desoxycytidin-Verbindungen, die zur Bekämpfung von Virus-Erkrankungen geeignet sind, und bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen sowie zu deren Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen.

Es sind bereits einige von Desoxycytidin abgeleitete Verbindungen und mehrere von Desoxyuridin abgeleitete Verbindungen bekannt, die Wirkung gegen Viren haben. Ein Überblick über die bekannten Verbindungen findet sich bei E. De Clercq u.Mitarb, in J. Carbonydrates-Nucleosides, Nucleotides, 5 (3), 187-224 (1978); dort können Einzelheiten dazu entnommen werden. Die antivirale Aktivität der meisten dieser bekannten Verbindungen ist nicht sehr spezifisch, denn sie wirken gegen unterschiedliche DNS-Viren, wie beispielsweise Pocken-Virus und Herpes simplex - Virus, etwa gleich stark. Weiterhin ist nachteilig, dass die Toxizität der meisten dieser bekannten Verbindungen, und speziell der gebräuchlichen Standardverbindung 5-Jod-2'-Desoxyuridin, beachtlich ist. Kürzlich wurde zwar schon berichtet, dass E-5-(2 Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin spezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und auch eine vergleichsweise niedrige Toxizität in Zellkulturen zeigen, vergl. E. De Clercq u.Mitarb, in Proceedings National Academy of Science USA, 76, No. 6, 2947-2951 (1979), aber es besteht Bedarf an Wirkstoffen zur Bekämpfung von Viruserkrankungen, die bei mindestens gleich guter spezifischer Wirkung geringere Toxizität aufweisen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue chemische Verbindungen zu schaffen, die sowohl eine hohe spezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes

130016/0748

simplex haben und gleichzeitig niedrige Toxizität aufweisen, so dass sie als Wirkstoff in pharmazeutischen Zubereitungen besonders gut geeignet sind und sich hervorragend bei der Bekämpfung von durch das Herpes simplex-Virus verursachte Erkrankungen bei Menschen und Tieren eignen.

Zur Lösung dieser Aufgabe sind bei der Erfindung die in den Ansprüchen 1 bis 3 angegebenen neuen Desoxycytidin-Verbindungen, und zwar die E-5-(2-Halogenvinyl)-2^f-Desoxycytidine, insbesondere das E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und das E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, vorgesehen. Dabei werden noch in den ünteransprüchen 4 bis 6 für die Herstellung der neuen Verbindungen vorteilhafte Verfahren und in den Unteransprüchen 7 bis 9 deren Einsatz bei der Bekämpfung von Virus-Erkrankungen beansprucht.

E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine sind chemische Verbindungen, die durch die folgende Strukturformel (1) wiedergegeben werden können:

)H

worin Hai ein Halogenatom bedeutet. E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin, das sich auch als

130018/0748

E-5- (2-Bromvinyl)- 1 - (2¹-Desoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl) ^-amino-l^-dihydropyrimidin-^-on bezeichnen lässt, entspricht der zuvor angegebenen Strukturformel (1), worin Hai Brom bedeutet, und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, das auch als E-5-(2-Jodvinyl)-1-(2'-Desoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-4-amino-l,2-dihydropyrimidin-2-on bezeichnet werden kann, entspricht der vorstehenden Strukturformel (.1) , worin Hai Jod bedeutet. In der Formel (1) sind die an der Doppelbindung der Halogenvinyl-Seitengruppe ansitzenden Reste in trans- oder Ε-Konfiguration angeordnet, und der Pyrimidin-Kern befindet sich in beta-Steilung zu dem Pentofuranosyl-Rest.

Die chemische Synthese von Verbindungen der Formel (1) kann in verschiedener Weise vorgenommen werden. Vorteilhaft ist es, wenn so gearbeitet wird, dass ein 2-Halogenvinylrest als E-5-(2-Halogenvinyl)-Seitenkette in das 2'-Desoxycytidin eingeführt wird. Dazu kann man sich vorteilhaft einer dreistufigen Verfahrensweise bedienen, wie sie nachfolgend formelmässig veranschaulicht ist:

Ethyl_-acrylat Li₂PdCl₄

'(θ

NH₂

OH

Hydrolyse

NH,

XX

NH₂

Halogenierung

Hal

In der ersten Verfahrensstufe wird 5-Quecksilber(II)-chlorid-2'-desoxycytidin der Formel (2) in Anwesenheit eines Lithiumpalladiumchlorid-Katalysators mit einem Alkylacrylat, wie Ethylacrylat, umgesetzt. Dabei wird das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin der Formel (3) gebildet. Diese Reaktion lässt sich glatt bei Zimmertemperatur oder etwas erhöhter Temperatur in einem geeigneten Lösungsmittel, wie trockenem Methanol, durchführen. Es können auch andere Lösungsmittel, beispielsweise Acetonitril, anstelle von Methanol benutzt werden. Das Reaktionsgemisch wird entsprechend aufgearbeitet, beispielsweise durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel, wie H₃S oder NaHB., und anschliessender Ausfällung der reduzierten Palladium- und Quecksilbersalze. Man erhält in guter Ausbeute das gewünschte Produkt, das, wie in Formel (3) veranschaulicht, eine trans- oder E-Konfiguration hat. Wenn man anstelle von Ethylacrylat den entsprechenden Methylester oder ein sonstiges Alkylacrylat mit niedrigem Alkylrest einsetzt, lässt sich die Reaktion in gleicher Weise durchführen.

Diese erste Reaktionsstufe verläuft analog der Reaktionsstufe, die für die Herstellung von 2'-Desoxyuridin-Derivaten bei Bergstrom und Ogawa in J.A.C.S., 100, 8106 (1978) beschrieben ist. Das Ausgangsmaterial der Formel (2) ist als solches bekannt und wurde von Bergstrom und Ruth in J. Carbohydrates-Nucleosides, Nucleotides, 4 (5), 257 269 (1977) beschrieben.

Als zweite Reaktionsstufe wird das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-Derivat gemäss Formel (3) hydrolysiert, und man erhält das entsprechende E-5-(2-Carboxyvinyl)-Derivat der Formel (4).

130016/07AS

Man kann die Hydrolyse unter alkalischen oder sauren Bedingungen durchführen. Es empfiehlt sich jedoch, möglichst nicht unter sauren Bedingungen zu arbeiten, damit jegliches Risiko von unerwünschten Nebenreaktionen (zum Beispiel Abtrennung des Substituenten in der δε teilung oder Abtrennung des Zucker-Restes) vermieden wird. Die Hydrolyse unter alkalischen Bedingungen kann man mit unterschiedlichen basischen Reagentien, zum Beispiel KOH, NaOH, K₃CO , Na CO , vornehmen; zweckmässig benutzt man KOH.

In der dritten Verfahrensstufe wird das E-5-(2-Carboxyvinyl)-Derivat der Formel (4) zu dem als Endprodukt gewünschten E-5-(2-Halogenvinyl)-Derivat der Formel (1) umgesetzt. Dazu wird unter solchen Bedingungen halogeniert, dass die Carboxylgruppe entfernt wird. Zu diesem Zweck kann man beliebige Halogenierungsmittel benutzen, beispielsweise elementares Halogen, Halogenwasserstoffe, Halogen als Sauerstoffsäure oder organische Halogenierungsmittel, zum Beispiel N-Halogensuccinimide. Bevorzugt werden von diesen Halogenierungsmxtteln Halogenwasserstoffe und N-Halogensuccinimide, weil damit bisher die besten Ergebnisse erzielt wurden. Man kann als Reaktionsmedium ein geeignetes Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, Dimethylformamid, DimethyIsulfoxid, benutzen.

Die Auswahl des Halogenierungsmittels und des Reaktionsmediums trifft man im Einzelfall unter Berücksichtigung der Löslichkeit und Stabilität des Halogenierungsmittels und der Löslichkeit des eingesetzten Ausgangsmaterials in dem Lösungsmittel. So lässt sich beispielsweise N-Bromsuccinimid mit guten Ergebnissen in wässrigen Medien verwenden, aber vorzugsweise arbeitet man unter

130016/0 748

wasserfreien Bedingungen, zum Beispiel in trockenem Dimethylformamid mit N-Jodsuccinimid oder auou mit elementarem Brom oder elementarem Jod. Zwar hat das Carboxyvinyl-Derivat, das als Ausgangssubstanz eingesetzt wird, eine relativ niedrige Löslichkeit in Wasser, aber man kann dieses Problem dadurch beheben, dass man diese Substanz zunächst mit wässrigem Kaliumacetat behandelt und das leicht lösliche Kaliumsalz bildet, oder dadurch, dass man als Ausgangsmaterial direkt eine wässrige Lös-ung einsetzt, die in der vorangehenden Verfahrensstufe der Hydrolyse angefallen ist. Die Löslichkeit des Einsatzmaterials in Dimethylformamid ist etwas besser als diejenige in Wasser. Trotzdem sollte man in diesem Fall bevorzugt mit einer Kombination von Kaliumacetat und Halogenierungsmitte1 arbeiten.

Als Endprodukt dieser dreistufigen Synthese erhält man das gewünschte E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidin in guter Ausbeute. Dieses Endprodukt ist ein beta-Anomer, weil die gewünschte beta-Stellung des Pyrimidin-Kerns zu dem Zucker-Rest schon in dem Ausgangsmaterial vorhanden war. Infolge der gewählten Synthesemethode enthält das Produkt den Halogenrest und den Pyrimidinkern in Ε-Konfiguration an der Vinyl-Doppelbindung. Aus diesen beiden Gründen ist es vorteilhaft, für die Herstellung erfindungsgemässer Verbindungen die vorstehende dreistufige Methode zu benutzen.

Eine weitere Synthesemethode für die Herstellung erfindungsgemässer Verbindungen besteht darin, dass man ein eine reaktive Gruppe tragendes Derivat von 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranose, dessen Hydroxylgruppen Schutzgruppen tragen, mit einem Trialkylsilylderivat von E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin kondensiert und danach die Schutzgruppen von den Hydroxylgruppen entfernt. Diese

130018/0748 bad original

zweite Synthesemethode, die sich durch nachstehendes Formelschema veranschaulichen lässt, ist möglich, jedoch weniger vorteilhaft:

In diesen Formeln bedeutet R eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine Methylgruppe, R ist ein leicht austauschbarer Rest, vorzugsweise zum Beispiel ein Methoxyrest

2 3
oder ein Chloratom, R und R sind Schutzgruppen für

die Hydroxylgruppen, vorzugsweise beispielsweise p-Toluoylreste; Hai steht für ein Halogenatom, beispiels-

130016/0748

weise Brom oder Jod, undnj bezeichnet alpha- und/oder beta-Konfiguration.

Es wird eine Kondensationsreaktion zwischen den Verbindungen der Formeln (5) und (6) durchgeführt.

Die Kondensationsreaktion verläuft gut in Anwesenheit eines Lewissäure-Katalysators, beispielsweise einem Molekularsieb, Zinn(IV)- oder Quecksilber(II)-Chlorid oder -bromid, oder Trimethylsilylperfluoralkylsulfonat. Es kann gewünschtenfalls auch ein gegenüber den Reaktionskomponenten und dem Endprodukt inertes Lösungsmittel vorhanden sein, vorzugsweise ein solches Lösungsmittel, in dem die Reaktionskomponenten und der Katalysator ausreichend löslich sind. Als Beispiele für geeignete Lösungsmittel können benannt werden Acetonitril, Benzol, Toluol, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan und Tetrachlorkohlenstoff. Um die Gefahr einer Hydrolyse des Trialkylsilyl-Derivats (Formel 5) sicher auszuschliessen, sollte man die Reaktion möglichst in trockener Atmosphäre durchführen. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch; in den meisten Fällen wird man bei Zimmertemperatur oder bei darunter liegender Temperatur arbeiten.

Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen und das Reaktionsgemisch aufgearbeitet worden ist, kann man mit üblichen Methoden, beispielsweise durch Hydrolyse oder Alkoholyse, die Schutzgruppen entfernen.

Bei dieser letztgenannten Art der chemischen Synthese erhält man in der Regel ein Gemisch von alpha- und beta-Anomeren. Dieses Gemisch sollte man auftrennen, da nur das beta-Anomer das gewünschte Produkt ist. Besonders wirksam lässt sich die Trennung durchführen, bevor die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt sind. Man

130016/0748

'Wl'

- ie—

kann dazu fraktioniert kristallisieren und/oder an Silikagel chromatografieren. Da diese Trennoperationen meist wenig bequem und relativ aufwendig sind, ist das beschriebene zweite Syntheseverfaren weniger bevorzugt.

Die dafür als Ausgangssubstanz verwendete Verbindung der Formel (6) ist ein bekanntes früher bereits beschriebenes Produkt, das man beispielsweise aus 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranose durch Methylierung der 1-Hydroxylgruppe, Einarbeitung von Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen in 3- und 5-Stellung und erforderlichenfalls durch Austausch der 1-Methoxygruppe durch ein Chloratom herstellen kann (vergl. z.B. CC. Bath in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, von R.S. Tipson und W.W. Zorbach, eds, Interscience, Bd. 1, 521-522 (1968)).

Die als weiteres Ausgangsmaterial benötigte Verbindung der Formel (5) kann man durch Silierung von E-5- (2-Halogenvinyl)-cytosin mit einem Silierungsmittel, wie beispielsweise Hexamethyldisilazan oder Trimethylchlorsilan oder Mischungen dieser Substanzen herstellen (vergl. bei A.S. Jones u.Mitarb., Tetrahedron Letters, 28, 2459-2460

(1977) für eine vergleichbare Reaktion). Das E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin kann man in einfacher Weise durch Halogenierung, zum Beispiel Bromierung oder Jodierung, von 5-Vinylcytosin und anschliessender Eliminierung des Halogenwasserstoffs, beispielsweise HBr oder HJ, durch Behandlung mit Wärme gewinnen (vergl. bei R.C. Bleakley u.Mitarb., Tetrahedron, 32, 2795-2797 (1976) für eine analoge Reaktion bei 5-Vinyluracil). Man kann das E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin jedoch auch aus 5-Formylcytosin gewinnen, wenn man 5-Formylcytosin mit Malonsäure zu E-5-(2-Carboxyvinyl)-cytosin umsetzt und nachfolgend Halogeniert, beispielsweise in der Weise, wie es zuvor

130018/0743

■/II-

im Zusammenhang mit der ersten Synthesemethode beschrieben wurde.

Untersuchungen haben gezeigt, dass die erfindungsgemäs-sen E-5-(2-Halogenvinyl)-2¹-Desoxycytidine, speziell das E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und das E-5-(2'-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, eine gute antivirale Aktivität besitzen, die sehr spezifisch gegen das Virus des Herpes simplex wirkt. Darüber hinaus haben sie anscheinend keine Toxizität in Zellkulturen, so dass sich ein besonders günstiger antiviraler Index gegen dieses Virus ergibt und die erfindungsgemässen Verbindungen besonders brauchbar macht zur Bekämpfung von durch das Virus Herpes simplex verursachte Erkrankungen bei Menschen und Tieren. Verglichen mit dem Stand der Technik ist diese Eigenschaftskombination der spezifischen antivirlanen Wirkung und der praktisch fehlenden Toxizität in Zellkulturen für die erfindungsgemässen Verbindungen überraschend und war nicht vorhersehbar.

In den nachfolgenden Beispielen sind physikalische Konstanten für erfindungsgemässe Verbindungen, hergestellt gemäss der zuvor beschriebenen ersten Synthesemethode, veranschaulicht.

Im Anschluss an die Beispiele für die Herstellung erfindungsgemä'Sser Verbindungen wird nachstehend über Tests berichtet, die die Wirkung gegen Viren veranschaulichen.

Beispiel 1

a) E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin (Formel 3)

In einen 250 ml Rundkolben wurden 5-Chlormercuri-2'-Desoxycytidin (4,62 g, 10 mmol), (Formel 2) ₄ Ethylacrylat

130318/0748

(6 g, 60 mmol) und 0,1 m Li-PdCl. in trockenem Methanol (100 ml) zusammen eingefüllt, und dann wurde 24 Std. lang unter Stickstoff gerührt, wobei eine schwarze Suspension entstand. Die Suspension wurde filtriert, und der schwarze Niederschlag wurde gesammelt. Der Niederschlag wurde in Methanol (100 ml) erwärmt und filtriert. Die kombinierten Filtrate wurden mit NaBH. behandelt, bis das schwarze Material vollständig ausgefällt und die Lösung farblos geworden war. Nach nochmaligem Filtrieren wurde die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft (bis auf 30 ml), und aus dem Konzentrat kristallisierte das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin (1,4 g, 43%) aus.

U.V. Spektrum: (Ethanol)

X _m._n 237 „, (£3.230)1^ 268 «n (€ 17.43O)JVj_n 297 r_m (e 8.250) X 327 nm (S 13.920) ot pH 2;), __ 221 no (£21 .670)

245 nm (€3.560) 2 275 p.m (£ 1.3173O) λ . 297'nm

fTiin max ^v ' min

(es.050} A 326 r.m {£ 14.200} ci-_PH7 max '

N .M. R. - Spek truia:

' S (d₆ DWSC); 8.50 (s_f TH_# H-O), 7.57 (d, TK, vinyiic H, J = 10 Hz) 7.42 (s_# 2H₇ NH₂) 6.21 (d, IH, vinyiic H, J = lc Hz) 6.10 (_f, IH, H-I³) 5.10 (d, IH, 0Η-3^ι)5.Η(^ IH, CH-5') 4.20 (^ IK, K-3'} 4.13 (_£/ 2H. CH₂-CH₃) 3.79 (n,, IH, H-4'} 3.62 (^ 2H/H-5') 2.13

(m, 2H, H-2¹) 1.24 (i, 3H₇ CH₉-CHJ.

.A. J

Das Aus-gangsmaterial, 5-Chlormercuri-2'-desoxycytidin, wurde nach der von Bergstrom und Ruth, J.Carbohydrates-Nucleosides, Nucleotides, 4 (5), 257-269 (1977) beschriebenen Methode erhalten.

130016/074 8 "

BAD ORIGINAL

b) E-5-(2-Carboxyvinyl)-2'-Desoxycytidin (Formel 4)

Das wie zuvor unter a) beschrieben gewonnene Carbethoxyviny ldesoxycytidin (325 mg, 1 mmol) wurde in einer 0,5m NaOH-Lösung (40 ml) suspendiert, und es wurde 2 Std. lang bei Zimmertemperatur gerührt. Die klare Lösung wurde durch Zugabe von Ionenaustauscherharz (Dowex-50) in der H -Form auf pH 7 neutralisiert und filtriert. Diese Lösung wurde unmittelbar für die Weiterverarbeitung zu E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin verwendet.

c) Ξ-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin (Formel 1, HaI=Br)

Eine bei der zuvor unter b) beschriebenen Hydrolyse der Carbethoxyvinyldesoxycytidin-Verbindung (325 mg, 1 mmol) erhaltene Lösung wurde mit N-Bromsuccinimid (178 mg, 1 mmol) behandelt und bei Zimmertemperatur 15 Std. lang gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel entfernt, und der Rückstand wurde an SiO₂ ( 50 g ) mit CHCl₃-MeOH (80:20) als Eluierungsmittel gereinigt. Man erhielt das E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin (150mg, 48%, Rf=O,32).

U.V. Spektrum: (Wasser)

X ' 244 rim (ei6.090} λ . 280 nn (£5.200} A 302 nm mox min *■ max

(G7.6lO)ier dH 2; A 250 nm (€15.330) Λ . 285 nm (£ ¹ mcA tnirt

6.390) X 292 nm (£6.590) ar oH 7; Λ 249 r.m (G 17.360) rr.ax ^v ^J tr.ax ^ '

2 . 283 nnt (£7.300) λ 292 nm (€7.c60)i>ei dH 11. ^¹ mm ^v ' jnQX

N.M.Κ. Spektrum:

S (O₆ DMSO); 8.10 (3, IH, H-O) 7.21 (br, 2H_x NH₂) 7.05 (d,-IH, vinyl -H, J= 13 Hz) 6.70 (d, IK, vinyl -H, J = 13 Kz) '" 6.10 {t, IH, K-\') 5.05 (br, 2H_r OK-3¹ or.d CH-5') 4.10 (m, IH, H-3¹) 3.75 (m_r IH,- K-4¹) 3.00 (m, 2K, H-5¹) 2.10 (m, 2H, H-2¹) '

130018/07A8

BAD ORIGINAL

Beispiel 2

a) Es wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 a) beschrieben E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin hergestellt.

b) Durch Hydrolyse, in gleicher Weise wie im Beispiel Ib) beschrieben, wurde E-5-(2-Carboxyvinyl)-2'-Desoxycytidin gewonnen, jedoch mit dem Unterschied, dass nach der Neutralisation und dem Filtrieren das Lösungsmittel im Vakuum aus der Lösung entfernt und der Rückstand über PoO₁- 9^e~ trocknet wurde.

c) E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin (Formel 1, HaI=J)

Der aus der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufe 2b) resultierende Rückstand wurde in trockenem DMF (20 ml) suspendiert, und es wurde N-Jodsuccinimid (225 mg, 1 mmol) hinzu gegeben. Das Gemisch wurde 4 Std. lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann in üblicher Weise aufgearbeitet, und es resultierte das E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin (105 mg, 28%).

U.V. Spektrum: (Ethanol)

X 258 nrn (G 17.232) X , 200 nm^l(£7.504) at pH 7; 2

max ^x ah max

256 nrn (€ 15.160} % . 293 nrr. (£4.700) A 315 nm {G6.2U) bsi pH 2.

N.M.R. Spektrum:

(d"₆ DMSG); 3.Go (s, IH, Η-ό) 7.26 (d, IH, vinyl- H, J = 14 Hz) 7.20 (br, 2K, NH₂) 6.64 (d, υH, νϊ,-y! _■ K, J = 14 fe). 0.03 (f, '1H, H-I') 5.Π (d, IH, OH-3') 5.03 (S-, IH, OK-5¹) 4.20 (m, IH, H-3¹) 3.70 (nv IH, π-4')·3.53 (ra₇ 2H, H-5') 2.QS (m, 2H_r K-2').

13001S/0748

BAD ORIGINAL

Biologische Tests

Nachstehend wird über einige biologische Testreihen berichtet, aus denen die spezifische antivirale Aktivität, die niedrige Toxizität und der hohe antivirale Index der erfindungsgemässen Verbindungen gezeigt und ersichtlich ist.

Bei diesen Tests wurde die Wirkung von E-5-^-Halogenvinyl)^'-Desoxycytidin und ähnlichen Vergleichsverbindungen auf das Wachstum und die Ausbeute von Viren in Zellkulturen gemessen.

Die folgenden Verbindungen wurden getestet: E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin als erfindungsgemässe Verbindungen. E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin und 5-Jod-2'-desoxyuridin (von Ludeco, Brüssel, erhalten) als Vergleichsverbindungen. Alle Verbindungen waren ß-Anomere.

Die Verbindungen wurden gegen das Vaccinia-Virus und gegen drei Stämme von Herpes simplex-1 Virus (Stamm KOS, Stamm Mclntyre und Stamm F) getestet. Die Viren wurden in Zellkulturen aus Kaninchennierenzellen (primären Zellen) (PRK) und Fibroblasten der menschlichen Haut (HSF) gezüchtet. Die Technik der Ermittlung des Virenwachstums in den Zellkulturen, die angewendet wurde, ist beschrieben bei De Clercq u.Mitarb., Biochem. Pharmacol» 24, 523-527 (1975)

Test

In diesem Test wurde die Inhibierungsaktivität von E=5-(2=Halogenvinyl)=2^ll-DesoxYcytidinen und den Vergleichsverbindungen gegen Vaccinia- und Herpes simples=! Viren in. PRK und HSF Zellkulturen gemessene Man iiess die Seilen sich vermehren„ bis sie in Plastik-Mikroplatten zusammen= gewachsen waren„

130018/0748

- ±6—-

(PRK, HSP) . Wenn die Platten ausgefüllt waren, wurden die Zellen mit 100 CCID,-_O an entweder Vaccinia-Virus oder Herpes simplex-1 -Virus beimpft. Eine CCID₅₀ oder "ZeIlkultur-Infektionsdosis-50" ist die Dosis an Virus, die erforderlich ist, um 50% der Zellkultur zu infizieren. Eine Stunde nach dem Beimpfen mit dem Virus wurden die zu testenden Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen (im Bereich von 0,001 ,ug/ml bis 100 ,ug/ml) zugesetzt. Für jedes Virus-Zell-System wurde die ID₁-Q bestimmt. Die ID₅₀ oder "Inhibierungsdosis-50" ist diejenige Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um den zytopathogenen Effekt auf den Virus auf 50% zu unterdrücken. Der zytopathogene Effekt (CPE) wurde aufgezeichnet, sobald er in den unbehandelten Virus-infizierten Zellkulturen Kompletion erreicht hatte (im allgemeinen 3 Tage, nachdem die Zellen mit dem Virus beimpft worden waren). Die Ergebniss-e sind in Tabelle 1 zusammengestellt; die darin angegebenen Daten sind Mittelwerte aus drei gesondert durchgeführten Experimenten.

Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, dass die E-5-(2-Halogenvinyl) ■ 2'-Desoxycytidine, die zwar etwas weniger aktiv sind als die Vergleichsverbindungen E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin, mindestens gleiche Aktivität haben oder sogar stärken aktiv sind gegen Herpes simplex-1 im Vergleich zu der Standard-Vergleichsverbindung 5-Jod-2'-desoxyuridin. Man erkennt weiterhin, dass im Gegensatz zu der Standard-Vergleichsverbindung die erfindungsgemässen E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine eine antivirale Aktivität aufweisen, die sehr spezifisch ist gegen das Virus des Herpes simplex=] Diese spezifische Wirkung ist etwa die gleiche wie die der E-5»(2-Halogenvinyl)-2°-Desoxyuridin-Vergleichsverbindungenο

Tabelle

Antivirale Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK - und HSF - Zellkulturen

Verbindung⁽⁺⁾ Nr.	3D₅₀ $ug/ml)	Vaccinia (PRK)	Vaccinia (HSP)	Herpes s.tmplex-1 Stamm KOS (PM<)	Herpes simplcx-1 Stamm 1<OS (HSF)	Herpes simplex-l Stamm Mclntyro (PRK)	Harpcs siniplex-l Stamm ^F ■ (PRK)
1	10	2	• 0,07	0,07	0,07	0,1
2	7	0,7	0,007	0,01	0,01	" 0,01
3	10	7	0_;l	0,07	0_f07	0,2
4	10	1	0,01	0,02	0,01	0,01
5	0,02	0,2	0,1	0,2	0_;15	0,2

Es waren Verbindung Nr. 1

Verbindung Nr. 2

Verbindung Nr. 3

Verbindung Nr. 4

Verbindung Nr. 5

E-5- (2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin
E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin
E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin
E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin
5-Jod-2'-desoxyuridin

GO CD GO CT)

Test 2

Es wurde der Inhibierungs-Effekt von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycitidinen und einer Vergleichsverbindung auf die Virus-Multiplikation von Herpes simplex-1 - Virus (Stamm KOS) in PRK - Zellkulturen gemessen.

Nach Ausbildung von einschichtigen Zellrasen aus PRK-Zellen in Petrischalen aus Plastik (Durchmesser: 55 mm) wurde mit Herpes simplex-1 (4,5 log_1Q PFU/O,5 ml/Petrisch-ale) 1 Std. lang bei 37 C beimpft, und unmittelbar danach wurden 0,1 ,ug/ml von einer der zu untersuchenden Verbindungen zur Einwirkung gebracht. Dann wurden die Zellkulturen über verschiedene Zeiträume (1, 2 oder 3 Tage lang) bei 37 C bebrütet. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen auf -70° tiefgefroren, und die ZeIlhomogenate wurden durch Plaque-Bildung in VERO-Zellkulturen auf ihren Gehalt an Virus untersucht (VERO = eine kontinuierliche Zelllinie auf unbehandelten Affenzellen) (VERO = a continuous cell line of green monkey cells). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 in Form der Differenzen an Virus-Ausbeute zwischen den behandelten mit Virus infi-zierten Zellkulturen und den unbehandelten mit Virus infizierten Zellkulturen angegeben. "PFU" bedeutet Einheiten der Plaque-Bildung.

130016/074«

■Μ

±9—

Tabelle

Inhibierungs-Effekt von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen gegen Multiplikation des Virus Herpes simplex-1 (Stamm KOS) in PRK-Zellkulturen

Verbindung

(,ul/ml)

Dosis Reduktion an Virus-Ausbeute (^Io(?io ^PFÜ/^mD / verglichen

mit Kontroll-Zellkulturen (Virus-infiziert, unbehandelt)

Tage nach Infektion 12 3

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin 10

E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin 10

5-Jod-2'-desoxyuridin 10

3,8

4,3

4,0

2,9

2,8

2,6

2,2

2,0

1,9

Aus Tabelle 2 ist zu ersehen, dass die durch E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine bewirkte Reduktion an Virus-Ausbeute vergleichbar ist mit derjenigen, die die Standard-Vergleichsverbindung 5-Jod-2'-desoxyuridin bringt.

130016/074

Test 3

Es wurde die antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkultüren gemessen.

Dazu wurden die Inkorporation von bestimmten radiomarkierten DNS-Precursoren in DNS der Zellen und die Wirkung von E-5- (2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen sowie Vergleichsverbindungen darauf untersucht. Die Untersuchungsmethode ist beschrieben worden von De Clercq u. Mitarb, in Biochemical Pharmacology, 26, 794-797 (1977) sowie von De Clercq u.Mitarb, in Molecular Pharmacology, 14, 422-430 (1978).

Als DNS-Precursoren wurden (Methyl- H) (2'-Desoxythymidin) (TdR) und (2-¹⁴C) (2'-Desoxyuridin) (UdR) benutzt.

Die Zellen wurden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der zu untersuchenden Verbindungen (im Bereich von 1 bis 200 ,ug/ml) 16 Stunden lang der Einwirkung von

0,12 ,uCi:0,01 nmol (Methyl-³H)TdR (je 10⁵ Zellen) oder

14 5

14 ,uCi/250 nmol (2- C)UdR (je IO Zellen) ausgesetzt. Dann wurde die Inkorporation des radiomarkierten Presursors wie beschrieben gemessen, und es wurde der ID-- -Wert bestimmt. Der ID_ -Wert entspricht der Inhibierungsdosis-5O, das heisst derjenigen Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, die Inkorporation von entweder (Methyl-

H)TdR oder (2- ⁴C)UdR um 50% zu inhibieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

.-as

Tabelle

Antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl) 2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK - Zellkulturen

Verbindung	ID₅₀ -flag/ml)	(2-¹⁴C)UdR Incorporation in ZaIt DNS
	(Methyl-³H)TdR Incorporation · in ZeItDNS	' >> 200
E-5- (2-βΓση_νΪΏγ1)-2 '-xiesoxy- cytidin	» 200	100 (70)
E-5- (2-BrcKL-vinyl) -2' -desoxy- uridin	100 (70)	>>200
E-5- (2-iod^vinyl) -2' -\desoxy- cytidin	?>200	150 (70)
E-5- (2-Jcd-r/inyl) -2' - desoxy- uridin	80 (70)	(1,2)
5-3 od -2'-ddDxyuridin	(2,5)

N.B. Die in Klammern stehenden Zahlenwerte wurden in gesonderten Experimenten, wie von De Clercq und Mitarb, in Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 76, 2947-2951 (1979) berichtet, gewonnen.

Man erkennt aus Tabelle 3, dass keines der E-5-(2-Halogenvinyl) -2 '-Desoxycytidine eine Inhibierung der Inkorporation von (Methyl-³H)TdR oder (2-¹⁴C)UdR in zellulare DNS verursacht, sogar dann nicht, wenn die Verbindung in so hoher Konzentration wie 200 »ug/ml, die höchste untersuchte Konzentration, verwendet wurde.

130016/0748

Test 4

Es wurde noch der antivirale Index von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK Zellkulturen aus den bei den zuvor beschriebenen Tests gewonnenen Messergebnissen bestimmt.

Der Antiviral-Index wurde als das Verhältnis des ID_C -

14
Wertes für die (2- C)UdR - Inkorporation in ZeIl-DNS zu dem ID₅₀-Wert für die Herpes simplex-1 (Stamm KOS) Virus-Replikation (vergleiche Tabellen 1 und 3) ermittelt.
Die Resultate sind in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Antiviral-Index von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen

Verbindung	Antiviral-I ndex
E-5- (2-3r6r?_v-inyl].-2' -Döoxycytidin E-5- (2-8rom_j/inyl)-2 '-DÄ>xyuridin E-5- (2-3 od_.vinyl) -2'-Ds&xycytidin E-5-(2-J od__yinyl)-2'-Desoxyuridin 5-Jod -2'-de£>xyuridin	» 3000 14300 (10000) Yi 200 0 15000 (7000) (12)

N.B. Vergleiche Fussnote zu Tabelle 3 für die in Klammern angegebenen Zahlenwerte.

Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass der Antiviral-Index für die erfindungsgemässen E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine auf (viel) höher als 2000-3000 ansteigt.

130018/0741

bad

Diese Verbindungen zeigten bei der höchsten untersuchten Konzentration (200 .ug/ml) keine Toxizität, der genaue Antiviral-Index konnte nicht exakt berechnet werden.

Aus der vorstehenden Beschreibung ergibt sich, dass die erfindungsgemässen E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine, z.B. E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, eine exzellente und hochspezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und dass ihre Toxizität in Zellkulturen anscheinend Null ist. Verglichen mit bekannten E-5-(2-Halogenvinyl)-2¹-Desoxyuridinen haben sie ersichtlich eine höhere Spezifizität gegen das Virus Herpes simplex und eine geringere Toxizität gegen lebende Zellen in Zellkulturen. Wenngleich der absolute Wert ihrer antiviralen Aktivität möglicherweise etwas niedriger liegt als diejenige der bekannten 2'-Desoxyuridine, haben sie den Vorteil, dass ihnen anscheinend jegliche Toxizität in ZeIlkultüren fehlt, so dass die erfindungsgemässen Verbindungen wahrscheinlich therapeutische Indeces zu erreichen vermögen, die mindestens ebenso hoch oder sogar noch höher liegen als diejenigen, die die bekannten 2'-Desoxyuridine erreichen. Erfindungsgemässe Verbindungen eignen sich daher hervorragend zur Verwendung bei der Bekämpfung von Virus-Erkrankungen bei Menschen und Tieren und zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen für die Behandlung von durch das Virus Herpes simplex verurs-achte Erkrankungen.

Pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine erfindungsgemässe Verbindung, zum Beispiel E-5-(2-Bromvinyl)-2*-Desoxycytidin oder E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin enthalten, können in Form von Pulvern, Suspens-ionen, Lösungen, Emulsionen, oder auch als Salben oder Pasten formuliert werden; sie lassen sich für parente-

130018/0748

•JA·

rale ( z.B. intradermale, intramuskuläre, intrathekale) Injektionen, für orale, rektale, intravaginale oder intranasale Verabreichungen benutzen oder für topikale Applikation ( z.B. bei Verletzungen der äusseren Haut, der Schleimhaut und des Auges) einsetzen. Solche pharmazeutische Zubereitungen können hergestellt werden dadurch, dass man in üblicher Weise den oder die aktiven Wirkstoffe mit pharmazeutisch verträglichen üblichen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen kombiniert. Zu solchen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen gehören beispielsweise wässrige oder nicht-wässrige Lösungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsmittel, Dispersionsmittel, Benetzungsmittel und andere für die Formulierung von pharmazeutischen Zubereitungen dem Fachmann bekannte Substanzen. Die pharmazeutischen Zubereitungen können gewünschtenfalls auch noch geeignete Additive, wie Polyethylenglykole, Farbstoffe und/oder Parfüms enthalten.

In den pharmazeutischen Zubereitungen wird der erfindungsgemässe Wirkstoff normalerweise in einer Menge von wenigstens 0,1 Gew.-%/Volumen vorhanden sein. Die bestimmte Konzentration hängt im Einzelfall ab von der zu behandelnden Krankheit und der gewählten Art der Verabreichung. Im allgemeinen hält sich die Konzentration zwischen etwa 0,1% und 100%.

130018/0748

Claims

Neue Desoxycytidin-Verbindungen, deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen. Patentansprüche

1. Neue Desoxycytidin-Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidin handelt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin handelt.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin handelt.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in 2'-Desoxycytidin einen Halogenvinylrest als E-5-(2-Halogenvinyl)-Gruppe einführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man 5-Quecksilber(II)-chlorid-2¹-desoxycytidin und ein Alkylacrylat mit einem Lithiumpalladiumchlorid-Katalysator zur Reaktion bringt, das resultierende E-5-(2-Carbethoxyvinyl) -2'-Desoxycytidin hydrolysiert und das resultierende E-5-(2-Carboxyvinyl)-2'-Desoxycytidin zu dem E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidin halogeniert.

130016/0741?

■ι-

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein eine reaktive Gruppe aufweisendes Derivat von 2-Desoxy-D-erythropentofuranose, dessen Hydroxylgruppen Schutzgruppen tragen, mit einem Trialkylsilylderivat von E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin umsetzt und danach die Schutzgruppen von den Hydroxylgruppen entfernt.

7. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2 und/oder 3 als Wirkstoff und übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.

8. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man wenigstens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2 und/oder 3 mit an sich bekannten pharmazeutisch brauchbaren Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen kombiniert.

9. Verwendung einer E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidins nach Anspruch 1 bei der Bekämpfung von Viruserkrankungen.

130016/0748