DE2722031A1

DE2722031A1 - 9-(2-o-acyl-beta-d-arabinofuranosyl)- adenin-verbindungen

Info

Publication number: DE2722031A1
Application number: DE19772722031
Authority: DE
Inventors: David Clarkston Baker
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1976-05-17
Filing date: 1977-05-16
Publication date: 1977-12-08
Also published as: FR2351995B1; JPS535199A; GB1538009A; JPS618076B2; CA1073385A; US4055718A; FR2351995A1; NL7705406A; BE854699A

Description

B. ING. F. WUKSTIIOFF SOOO MÜNCHEN OO DR.K. τ. PKClIMANN SCIIWEIOEHSTHASSE S I)R. ING. D. BKnRENS

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Patentanmeldung

Anmelder: Parke, Davis & Company

Joseph Campau at the River Detroit, Michigan 48232

Titel: 9-(2-0-Acyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin-Verbindungen

709849/0820

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DR. E. ν. PECIIMANK

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1A-49 3692722031

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue 9-(2-0-Acyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin-Verbindungen der allgemeinen Formel

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in der R eine grad- oder verzweigtkettige Alkanoylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen ist. Beispiele hierfür sind die Acetyl-, Propiotyl-, Butyryl- und Isobutyrylgruppe. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können 9-(2-O-Acyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin-Verbindungen der Formel I hergestellt werden, indem man die 3-0-Acyl- und 5-0-Acylgruppen eines 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adeninesters der Formel

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in der R die oben angegebene Bedeutung hat und R' ein Wasserstoff atom oder eine niedere Alkanoylgruppe ist, enzymatisch entfernt. Das Verfahren wird durchgeführt, indem man den Ester mit einem Enzym in einem wäßrigen Medium zusammenbringt bis die 3-O-Acyl- und 5-O-Acylgruppen entfernt sind. Das deacylierte Produkt der Formel I wird durch übliche Verfahren zur Gewinnung und Reinigung aus dem Medium isoliert. Enzyme, die für die Deacylierung geeignet sind, sind solche, die gebildet worden sind vcn Mikroorganismen der Gruppe Actinomycetales, z.B. Bakterien der Familie Mycobacteriaceae, Streptomycetaceae, Actinomycetaceae, Streptosporangiaceae und Actinoplanaceae. Ebenfalls geeignet sind Enzyme, die von Fungi imperfecti gebildet worden sind. Besonders geeignet sind Stämme von Bacillus subtilis. Bacillus subtilis ist als Quelle für das Deacylierungsenzym bevorzugt, da er leicht zugänglich und leicht zu züchten ist. Das Verfahren kann mit Enzymen durchgeführt werden, die gebildet worden sind von Stämmen der folgenden beispielhaften Gruppen und Arten: Streptomyces (mesophil), wie S. viridochromogenes, S. fradiae, S. griseus, S. griseoflavus, S. prasinus, Streptomyces (thermophil), wie S. violaceoruber, Thermoactinomyces vulgaris, S. thermovulgaris; Chainia, wie Actinopycnidium species, Micromonospora-Arten, Nocardia petroleophila, Streptosporangium roseum, Thermopolyspora polyspora, Thermopolyspora glauca, Mycobacterium tuberculosis var. BCG; Mycobacterium phlei; und Cephalosporium und Aspergillus. Die bevorzugte Acylase ist, wie gesagt, die von dem Mikroorganismus Bacillus subtilis gebildete. Die Acylase selbst braucht nicht isoliert zu werden, sondern es kann stattdessen eine Zellpaste, -masse oder Mycel des gewünschten Organismus angewandt werden.

Das wäßrige Medium für die Reaktion (oder Inkubation) wird auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7»5, vorzugsweise 7,0 bis 7,5 gehalten. Das Medium wird bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 45⁰C, vorzugsweise 35 bis 40⁰C gehalten, bis die ge-

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wünschte Deacylierung im wesentlichen vollständig ist, üblicherweise 15 bis 24 Stunden. Die angewandte Menge an Acylase bzw. Mikroorganismus-Zellpaste oder -masse ist nicht kritisch. Da die Deacylierungsgeschwindigkeit von der Menge der vorhandenen Acylase abhängt, ist es günstig und bevorzugt, einen Überschuß an Enzym zu verwenden, d.h. ungefähr äquivalente Mengen an Substrat (Ausgangsester) und Mikroorganismus-Zellpaste oder -masse. Nach vollständiger Reaktion wird das Gemisch üblicherweise durch

Filtration von Feststoffen befreit und die gewünschte Verbindung auf übliche Weise, wie oben angegeben, erhalten.

Die 9-(2-O-Acyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin-Verbindungen sind neue Verbindungen, die als pharmakologische Mittel, besonders als Antivirenmittel gegen Herpesvirus zu oraler, topischer oder parenteraler Verabreichung geeignet sind.

Anti
Ihre Aktivität als -virenmittel kann quantitativ durch

in vitro-Tests nachgewiesen werden unter Anwendung des Plaque-Reduktionsverfahrens, das zuerst entwickelt worden ist von Dulbecco (Proc. Natl. Acad. Sei., Band 38, Seite 747 bis 752) und modifiziert von Hsiung und Melnick (Virology, Band 1, Seite 533 bis 535). Bei diesem Test wird zunächst eine vollständige Zeilmonoschicht auf einer Glastesteinheit gezüchtet. Das Wachstumsmedium wird dann entfernt und der Virus eine bestimmte Zeit auf der Zellmonoschicht adsorbiert. In Abwesenheit eines Antivirenmittels zerstört der Virus gut definierte Zellbereiche, sogenannte Plaques, die makroskopisch sichtbar gemacht werden können, wenn der Vitalfarbstoff Neutralrot zu dem System zugesetzt wird. Um die Hemmwirkung einer gegebenen Verbindung zu bestimmen, wird die zu untersuchende Verbindung in Lösung zu dem Virus-Zellen-System zugegeben und das Ganze mit einer Nähragarschicht, enthaltend Neutralrot bedeckt. Nach der Inkubation werden die Plaques gezählt und die Anzahl der in

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dem System entstandenen Plaques, das die Testverbindung enthält, wird mit der Anzahl verglichen, die in einem Vergleichssystem gebildet worden ist, bei dem lediglich die Testverbindung weggelassen worden ist. Die Hemmaktivität der Testverbindung wird angegeben als prozentuale Reduktion der Plaquezahl auf der Testeinheit, verglichen mit der der Vergleichseinheit.

Wenn sie unter Verwendung von 100 ml (4 Oz) Glasflaschen als Testeinheiten und H. Ep. Nr. 2 Zellen zur Bildung der Monoschicht untersucht wurden, führten die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von ungefähr 15 bis 60 m/ml in Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7 bis 8) typischerweise zu einer vollständigen Reduktion der Plaque-Bildung gegen Herpes simplex.

Die erfindungsgemäßen Ester erinnern strukturell an 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin, von dem bekannt ist, daß es ein Antivirenmittel ist, das gegen Herpesvirus wirksam ist. Es wird berichtet, daß die zuletzte genannte Verbindung in vitro gegen Herpesvirus wirksamer ist als ihr 5'-Benzoylester,während der 5'-Palmitatester in dem gleichen Test inaktiv war (Renis et al., J. Med. Chem., Band 16, Seite 754). Es wird auch berichtet (Repta et al., J. Pharm. Sei., Band 64, Seite 392), daß die Verbindung in Wasser schwer löslich ist (und der enzymatischen Desaminierung zu dem entsprechenden biologisch inaktiven Hypoxanthin unterliegt) und der 5'-Formiatester verhältnismäßig wasserlöslich ist, aber in wäßriger Lösung instabil. Andere,verhältnismäßig schlecht wasserlösliche Ester von 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin sind die in der US-PS 3 651 045 beschriebenen Triester. Es ist daher überraschend, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen im Gegensatz zu den bekannten Verbindungen eine gute Antivirenaktivität besitzen gegen eine enzymatische Des-

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aminierung resistent sind und geeignet sind zur Herstellung wäßriger und nicht wäßriger pharmazeutischer Zubereitungen und leicht in Wasser löslich und/oder lipophil sind. Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen in dieser Beziehung sind: 9-(2-0-Acetyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin und 9-(2-0-Propionyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Zu einer Suspension von 500 mg 9-(2,3,5-Tri-0-acetylß-D-arabinofuranosyl)-adenin ( US -PS 3 651 045 in 50 ml 0,1m Phosphatpuffer pH 7 wurden 500 mg Bacillus subtilis ATCC 6633 Zellpaste oder -lyophilisat (US-PS 3 304 236, Beispiel 9) gegeben und das Gemisch 22 Stunden bei 35 bis 40⁰C gerührt unter periodischer Zugabe von gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung, um den pH auf 7,0 bis 7,5 zu halten. Das inkubierte Gemisch wurde dann in 150 ml Methanol gegossen und das entstehende Gemisch durch Diatomeenerde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch eine 1 χ 30 cm Säule von trockenem Silicagel geleitet und die Säule nacheinander mit Gemischen von 5:95, 10:90 und 20:80 (Vol./Gew.) Methanol-Chloroform eluiert. Das Eluat wurde in 10 ml Anteilen gesammelt und diejenigen, die das gewünschte Produkt enthielten (festgestellt durch DUnnschichtchromatographie) zusammengegeben und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt das gewünschte Produkt 9-(2-0-Acetyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin; X ^⁰¹¹ = 259 nm. Die Struktur wurde durch das NMR-Spektrum bestätigt.

Bei Verwendung von 500 mg 9-(2,3-Di-0-acetyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin anstelle von 9-(2,3»5-Tri-0-acetyl-

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ß-D-arabinofuranosyl)-adenin bei dem oben angegebenen Verfahren erhielt man das gleiche Endprodukt.

Beispiel 2

Bei Verwendung von 500 mg von entweder 9-(2,3,5-Tri-O-propionyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin oder 9-(2,3-Di-O-propionyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin anstelle von 9-(2,3,5-Tri-0-acetyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin in Beispiel 1 erhielt man 9-(2-0-Propionyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin; Fp. 206,5 bis 207,5°C nach Umkristallisieren aus Äthanol, Λ^3^0Η = 259 mn (e= 14 600), Verteilungskoeffizient, 1,55 (Pentanol/Wasser).

Beispiel 5

Bei Verwendung von 500 mg von entweder 9-(2,3>5-Tri-O-isobutyryl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin oder 9-(2,3-Di-O-isobutyryl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin anstelle von 9-(2,3,5-Tri-0-acetyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin in Beispiel 1, erhielt man 9-(2-0-1sobutyryl-ß-D-arabinofuranosyl)■ adenin.

Herstellung der Diacylester

Die 9-(2,3-Di-O-acyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin-Ausgangssubstanzen sind ebenfalls neu. Diese Verbindungen können aus bekannten Substanzen nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.

a) Zu einer Suspension von 26,7 g 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin in 500 ml trockenem Dimethylformamid, enthaltend 16,3 g Imidazol, wurden unter gutem Rühren 18,1 g tert.-Butylchlordimethylsilan, gegeben. Das Gemisch wurde unter Schutz vor Feuchtigkeit 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck bei 50 bis 60°C eingedampft. Der Rückstand wurde in 300 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der verbleibende Sirup

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wurde in 240 ml warmem Chloroform gelöst, die Lösung bis zur Trübung mit Hexan verdünnt und kristallisiert. Es kristallisierte 9-/~5-O-(tert.-Butyldimethylsilyl)-ß-D-arabinofuranosyl^-adenin aus, das abfiltriert, mit Hexan gewaschen und bei 80⁰C unter vermindertem Druck getrocknet wurde; Fp. 157 bis 158°C, O&J^ = +^,1°, *max°^{H = 259 1}^ (£= 15 000).

b) Zu einer Lösung von 15,4 g 9-2f~5-0-( te rt.-Butyldimethylsilyl)-ß-D-arabinofuranosyl7-adenin in 200 ml trockenem Pyridin wurden 9»44 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt, mit 100 g zerstoßenem Eis behandelt und eine weitere Stunde gerührt. Die verbleibende Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 45°C eingedampft und der Rückstand in 250 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wurde mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das verbleibende Produkt 9-/~2,3-Di-0-acetyl-5-0-(tert.-butyldimethylsilyl)-ß-D-arabinofuranosylj-adenin kann als Ausgangsmaterial für das Verfahren c) ohne weitere Reinigung verwendet werden.

c) Das unter b) erhaltene Produkt wird in 300 ml Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung mit 2,3 ml Eisessig und 31»3 g Tetrabutylammoniumfluorid behandelt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird dann über eine 5 x 10 cm Säule mit trockenem Silicagel geleitet. Die Säule wird mit 1 1 Tetrahydrofuran eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 9-(2,3-Di-O-acetyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin; Fp. 138 bis 139 C nach Umkristallisieren aus Aceton, /"<9[_7_D = -4,1° (c = 1 % in Methanol), λ 2?3^0H = 259 nm ( £= 15 000).

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70984970820

d) Aus 15,Og 9-/~5-O-(tert.-Butyldimethylsilyl)-ß-D-arabinofuranosylZ-adenin und 11,1 ml Propionsäureanhydrid in 100 ml trockenem Pyridin erhielt man nach Verfahren b) 9-/~*5-0-(tert.-Butyldimethylsilyl)-2,3-di-0-propionyl-ß-D-arabinofuranosyl7-adenin, das nach Umsetzung mit 31,3 g Tetrabutylammoniumfluorid in 200 ml Tetrahydrofuran und 2,3 ml Eisessig nach dem Verfahren c) 9-(2,3-Di-0-propionyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin ergibt; Fp. 172 bis 173⁰C nach Umkristallisieren aus Aceton,

^^0H

³ = -M° (c = 1 % in Methanol), Λ ^^0H = 259 nm (ε= 15 000). Aus 1,79 g 9-/5*-0-(tert.-Butyldimethylsilyl)-ß-D-arabinofuranosyl7-adenin und 2,34 ml Isobutyrylchlorid in 50 ml trockenem Pyridin erhält man nach Verfahren b) 9-/~5-0-(tert. -Butyldime thylsilyl) -2,3-di-O-i sobutyryl-ß-D-arabinofuranosylj-adenin, das nach Umsetzung mit 3,7 g Tetrabutylammoniumfluorid in 100 ml Tetrahydrofuran und 0,5 ml Eisessig nach dem Verfahren c) 9-(2,3-Di-0-isobutyrylß-D-arabinofuranosyl)-adenin ergibt; Fp. 207 bis 208⁰C nach Umkristallisieren aus Aceton, X ^CH3^0H - 259 nm (£= 15 000).

max

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Claims

DH. ING. F. WUHSTIIOFF

DR. K ν. 1ΈΟΠΜΛΝΝ

DH. ING. D. BEIIHKNS

DIPL.. ING. R. GOETZ

PATENTANWÄLTE

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TELHUailli PHOTKOTPATKIfT «ClOIII

Anspruch

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Anm.: Parke, Davis & Comp.

9-(2-0-Acyl-ß-D-arabinofuranosyl)-adenin-Verbindungen der Formel

MOCH₂

in der R eine grad- oder verzweigtkettige Alkanoylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.

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ORIGINAL INSPECTED