DE3036131C2

DE3036131C2 -

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Publication number: DE3036131C2
Application number: DE3036131A
Authority: DE
Inventors: Albert Stanley Prof. Yardley Birmingham Gb Jones; Richard Thomas Selly Oak Birmingham Gb Walker; Erik De Prof. Clercq; Gabriel Albert Leuven Be Verhelst
Original assignee: University of Birmingham
Current assignee: University of Birmingham
Priority date: 1979-10-03
Filing date: 1980-09-25
Publication date: 1989-07-06
Also published as: US4382925A; IT8009551A0; IT1209758B; BE885415A; SE8006669L; FR2466472A1; JPS637199B2; CH647245A5; NL8005336A; GB2060604A; GB2060604B; DE3036131A1; CA1173438A; SE445740B; JPS5695198A; FR2466472B1

Description

Die Erfindung betrifft neue Desoxycytidin-Verbindungen, die zur Bekämpfung von Virus-Erkrankungen geeignet sind, und bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen sowie zu deren Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen.

Es sind bereits einige von Desoxycytidin abgeleitete Verbindungen und mehrere von Desoxyuridin abgeleitete Verbindungen bekannt, die Wirkung gegen Viren haben. Ein Überblick über die bekannten Verbindungen findet sich bei E. De Clercq u. Mitarb. in J. Carbohydrates, Nucleosides, Nucleotides, 5 (3), 187-224 (1978); dort können Einzelheiten dazu entnommen werden. Die antivirale Aktivität der meisten dieser bekannten Verbindungen ist nicht sehr spezifisch, denn sie wirken gegen unterschiedliche DNS-Viren, wie beispielsweise Pocken-Virus und Herpes simplex-Virus, etwa gleich stark. Weiterhin ist nachteilig, daß die Toxizität der meisten dieser bekannten Verbindungen, und speziell der gebräuchlichen Standardverbindung 5-Jod-2′-Desoxyuridin, beachtlich ist. Kürzlich wurde zwar schon berichtet, daß E-5-(2- Bromvinyl)-2′-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxyuridin spezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und auch eine vergleichsweise niedrige Toxizität in Zellkulturen zeigen, vergl. E. De Clercq u. Mitarb. in Proceedings National Academy of Science USA, 76, No. 6, 2947-2951 (1979), aber es besteht Bedarf an Wirkstoffen zur Bekämpfung von Viruserkrankungen, die bei mindestens gleich guter spezifischer Wirkung geringere Toxizität aufweisen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue chemische Verbindungen zu schaffen, die sowohl eine hohe spezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und gleichzeitig niedrige Toxizität aufweisen, so daß sie als Wirkstoff in pharmazeutischen Zubereitungen besonders gut geeignet sind und sich hervorragend bei der Bekämpfung von durch das Herpes-simplex-Virus verursachte Erkrankungen bei Menschen und Tieren eignen.

Zur Lösung dieser Aufgabe sind bei der Erfindung die in den Ansprüchen 1 bis 3 angegebenen neuen Desoxycytidin- Verbindungen, und zwar die E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidine, insbesondere das E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxycytidin und das E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin, vorgesehen. Dabei werden noch in den Unteransprüchen 4 bis 6 für die Herstellung der neuen Verbindungen vorteilhafte Verfahren und im Unteranspruch 7 eine pharmazeutische Zubereitung beansprucht.

E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidine sind chemische Verbindungen, die durch die folgende Strukturformel (1) wiedergegeben werden können:

worin Hal ein Halogenatom bedeutet. E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxycytidin, das sich auch als E-5-(2-Bromvinyl)-1-(2′-Desoxy-β-D- erythro-pentofuranosyl)- 4-amino-1,2-dihydropyrimidin-2-on bezeichnen läßt, entspricht der zuvor angegebenen Strukturformel (1), worin Hal Brom bedeutet, und E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin, das auch als E-5-(2-Jodvinyl)- 1-(2′-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-4-amino-1,2- dihydropyrimidin-2-on bezeichnet werden kann, entspricht der vorstehenden Strukturformel (1), worin Hal Jod bedeutet. In der Formel (1) sind die an der Doppelbindung der Halogenvinyl-Seitengruppe ansitzenden Reste in trans- oder E-Konfiguration angeordnet, und der Pyrimidin-Kern befindet sich in beta-Stellung zu dem Pentofuranosyl-Rest.

Die chemische Synthese von Verbindungen der Formel (1) kann in verschiedener Weise vorgenommen werden. Vorteilhaft ist es, wenn so gearbeitet wird, daß ein 2-Halogenvinylrest als E-5-(2-Halogenvinyl)-Seitenkette in das 2′-Desoxycytidin eingeführt wird. Dazu kann man sich vorteilhaft einer dreistufigen Verfahrensweise bedienen, wie sie nachfolgend formelmäßig veranschaulicht ist:

In der ersten Verfahrensstufe wird 5-Quecksilber(II)- chlorid-2′-Desoxycytidin der Formel (2) in Anwesenheit eines Lithiumpalladiumchlorid-Katalysators mit einem Alkylacrylat, wie Ethylacrylat, umgesetzt. Dabei wird das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2′-Desoxycytidin der Formel (3) gebildet. Diese Reaktion läßt sich glatt bei Zimmertemperatur oder etwas erhöhter Temperatur in einem geeigneten Lösungsmittel wie trockenem Methanol, durchführen. Es können auch andere Lösungsmittel, beispielsweise Acetonitril, anstelle von Methanol benutzt werden. Das Reaktionsgemisch wird entsprechend aufgearbeitet, beispielsweise durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel, wie H₂S oder NaHB₄, und anschließender Ausfällung der reduzierten Palladium- und Quecksilbersalze. Man erhält in guter Ausbeute das gewünschte Produkt, das wie in Formel (3) veranschaulicht, eine trans- oder E-Konfiguration hat. Wenn man anstelle von Ethylacrylat den entsprechenden Methylester oder ein sonstiges Alkylacrylat mit niedrigem Alkylrest einsetzt, läßt sich die Reaktion in gleicher Weise durchführen.

Diese erste Reaktionsstufe verläuft analog der Reaktionsstufe, die für die Herstellung von 2′-Desoxyuridin-Derivaten bei Bergstrom und Ogawa in J.A.C.S., 100, 8106 (1978) beschrieben ist. Das Ausgangsmaterial der Formel (2) ist als solches bekannt und wurde von Bergstrom und Ruth in J. Carbohydrates, Nucleosides, Nucleotides, 4 (5), 257-269 (1977) beschrieben.

Als zweite Reaktionsstufe wird das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)- Derivat gemäß Formel (3) hydrolysiert, und man erhält das entsprechende E-5-(2-Carboxyvinyl)-Derivat der Formel (4). Man kann die Hydrolyse unter alkalischen oder sauren Bedingungen durchführen. Es empfiehlt sich jedoch, möglichst nicht unter sauren Bedingungen zu arbeiten, damit jegliches Risiko von unerwünschten Nebenreaktionen (zum Beispiel Abtrennung des Substituenten in der 5-Stellung oder Abtrennung des Zucker-Restes) vermieden wird. Die Hydrolyse unter alkalischen Bedingungen kann man mit unterschiedlichen basischen Reagentien, zum Beispiel KOH, NaOH, K₂CO₃, Na₂CO₃, vornehmen; zweckmäßig benutzt man KOH.

In der dritten Verfahrensstufe wird das E-5-(2-Carboxyvinyl)-Derivat der Formel (4) zu dem als Endprodukt gewünschten E-5-(2-Halogenvinyl)-Derivat der Formel (1) umgesetzt. Dazu wird unter solchen Bedingungen halogeniert, daß die Carboxylgruppe entfernt wird. Zu diesem Zweck kann man beliebige Halogenierungsmittel benutzen, beispielsweise elementares Halogen, Halogenwasserstoffe, Halogen als Sauerstoffsäure oder organische Halogenierungsmittel, zum Beispiel N-Halogensuccinimide. Bevorzugt werden von diesen Halogenierungsmitteln Halogenwasserstoffe und N-Halogensuccinimide, weil damit bisher die besten Ergebnisse erzielt wurden. Man kann als Reaktionsmedium ein geeignetes Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, benutzen.

Die Auswahl des Halogenierungsmittels und des Reaktionsmediums trifft man im Einzelfall unter Berücksichtigung der Löslichkeit und Stabilität des Halogenierungsmittels und der Löslichkeit des eingesetzten Ausgangsmaterials in dem Lösungsmittel. So läßt sich beispielsweise N-Bromsuccinimid mit guten Ergebnissen in wäßrigen Medien verwenden, aber vorzugsweise arbeitet man unter wasserfreien Bedingungen, zum Beispiel in trockenem Dimethylformamid mit N-Jodsuccinimid oder auch mit elementarem Brom oder elementarem Jod. Zwar hat das Carboxyvinyl-Derivat das als Ausgangssubstanz eingesetzt wird, eine relativ niedrige Löslichkeit in Wasser, aber man kann dieses Problem dadurch beheben, daß man diese Substanz zunächst mit wäßrigem Kaliumacetat behandelt und das leicht lösliche Kaliumsalz bildet, oder dadurch, daß man als Ausgangsmaterial direkt eine wäßrige Lösung einsetzt, die in der vorangehenden Verfahrensstufe der Hydrolyse angefallen ist. Die Löslichkeit des Einsatzmaterials in Dimethylformamid ist etwas besser als diejenige in Wasser. Trotzdem sollte man in diesem Fall bevorzugt mit einer Kombination von Kaliumacetat und Halogenierungsmittel arbeiten.

Als Endprodukt dieser dreistufigen Synthese erhält man das gewünschte E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidin in guter Ausbeute. Dieses Endprodukt ist ein beta-Anomer, weil die gewünschte beta-Stellung des Pyrimidin-Kerns zu dem Zucker-Rest schon in dem Ausgangsmaterial vorhanden war. Infolge der gewählten Synthesemethode enthält das Produkt den Halogenrest und den Pyrimidinkern in E-Konfiguration an der Vinyl-Doppelbindung. Aus diesen beiden Gründen ist es vorteilhaft, für die Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen die vorstehende dreistufige Methode zu benutzen.

Eine weitere Synthesemethode für die Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen besteht darin, daß man ein eine reaktive Gruppe tragendes Derivat von 2-Desoxy-D- erythro-pentofuranose, dessen Hydroxylgruppen Schutzgruppen tragen, mit einem Trialkylsilylderivat von E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin kondensiert und danach die Schutzgruppen von den Hydroxylgruppen entfernt. Diese zweite Synthesemethode, die sich durch nachstehendes Formelschema veranschaulichen läßt, ist möglich, jedoch weniger vorteilhaft:

In diesen Formeln bedeutet R eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine Methylgruppe, R¹ ist ein leicht austauschbarer Rest, vorzugsweise zum Beispiel ein Methoxyrest oder ein Chloratom, R² und R³ sind Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen, vorzugsweise beispielsweise p-Toluoylreste; Hal steht für ein Halogenatom, beispielsweise Brom oder Jod, und ∼ bezeichnet alpha- und/oder beta-Konfiguration. Es wird eine Kondensationsreaktion zwischen den Verbindungen der Formeln (5) und (6) durchgeführt.

Die Kondensationsreaktion verläuft gut in Anwesenheit eines Lewissäure-Katalysators, beispielsweise einem Molekularsieb, Zinn(IV)- oder Quecksilber(II)-chlorid oder -bromid, oder Trimethylsilylperfluoralkylsulfonat. Es kann gewünschtenfalls auch ein gegenüber den Reaktionskomponenten und dem Endprodukt inertes Lösungsmittel vorhanden sein, vorzugsweise ein solches Lösungsmittel, in dem die Reaktionskomponenten und der Katalysator ausreichend löslich sind. Als Beispiele für geeignete Lösungsmittel können benannt werden Acetonitril, Benzol, Toluol, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan und Tetrachlorkohlenstoff. Um die Gefahr einer Hydrolyse des Trialkylsilyl-Derivats (Formel 5) sicher auszuschließen, sollte man die Reaktion möglichst in trockener Atmosphäre durchführen. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch; in den meisten Fällen wird man bei Zimmertemperatur oder bei darunter liegender Temperatur arbeiten.

Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen und das Reaktionsgemisch aufgearbeitet worden ist, kann man mit üblichen Methoden, beispielsweise durch Hydrolyse oder Alkoholyse, die Schutzgruppen entfernen.

Bei dieser letztgenannten Art der chemischen Synthese erhält man in der Regel ein Gemisch von alpha- und beta-Anomeren. Dieses Gemisch sollte man auftrennen, da nur das beta-Anomer das gewünschte Produkt ist. Besonders wirksam läßt sich die Trennung durchführen, bevor die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt sind. Man kann dazu fraktioniert kristallisieren und/oder an Silikagel chromatografieren. Da diese Trennoperationen meist wenig bequem und relativ aufwendig sind, ist das beschriebene zweite Syntheseverfahren weniger bevorzugt.

Die dafür als Ausgangssubstanz verwendete Verbindung der Formel (6) ist ein bekanntes früher bereits beschriebenes Produkt, das man beispielsweise aus 2-Desoxy-D- erythro-pentofuranose durch Methylierung der 1-Hydroxylgruppe, Einarbeitung von Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen in 3- und 5-Stellung und erforderlichenfalls durch Austausch der 1-Methoxygruppe durch ein Chloratom herstellen kann (vergl. z. B. C. C. Bath in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, von R. S. Tipson und W. W. Zorbach, eds, Interscience, Bd. 1, 521-522 (1968)).

Die als weiteres Ausgangsmaterial benötigte Verbindung der Formel (5) kann man durch Silierung von E-5-(2-Halogenvinyl)- cytosin mit einem Silierungsmittel, wie beispielsweise Hexamethyldisilazan oder Trimethylchlorsilan oder Mischungen dieser Substanzen herstellen (vergl. bei A. S. Jones u. Mitarb., Tetrahedron Letters, 28, 2459-2460 (1977) für eine vergleichbare Reaktion). Das E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin kann man in einfacher Weise durch Halogenierung, zum Beispiel Bromierung oder Jodierung, von 5-Vinylcytosin und anschließender Eliminierung des Halogenwasserstoffs, beispielsweise HBr oder HJ, durch Behandlung mit Wärme gewinnen (vergl. bei R. C. Bleakley u. Mitarb., Tetrahedron, 32, 2795-2797 (1976) für eine analoge Reaktion bei 5-Vinyluracil). Man kann das E-5- (2-Halogenvinyl)-cytosin jedoch auch als 5-Formylcytosin gewinnen, wenn man 5-Formylcytosin mit Malonsäure zu E-5-(2-Carboxyvinyl)-cytosin umsetzt und nachfolgend halogeniert, beispielsweise in der Weise, wie es zuvor im Zusammenhang mit der ersten Synthesemethode beschrieben wurde.

Untersuchungen haben gezeigt, daß die erfindungsgemäßen E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidine, speziell das E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxycytidin und das E-5-(2′- Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin, eine gute antivirale Aktivität besitzen, die sehr spezifisch gegen das Virus des Herpes simplex wirkt. Darüber hinaus haben sie anscheinend keine Toxizität in Zellkulturen, so daß sich ein besonders günstiger antiviraler Index gegen dieses Virus ergibt und die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders brauchbar macht zur Bekämpfung von durch das Virus herpes simplex verursachte Erkrankungen bei Menschen und Tieren. Verglichen mit dem Stand der Technik ist diese Eigenschaftskombination der spezifischen antiviralen Wirkung und der praktisch fehlenden Toxizität in Zellkulturen für die erfindungsgemäßen Verbindungen überraschend und war nicht vorhersehbar.

In den nachfolgenden Beispielen sind physikalische Konstanten für erfindungsgemäße Verbindungen, hergestellt gemäß der zuvor beschriebenen ersten Synthesemethode, veranschaulicht.

Im Anschluß an die Beispiele für die Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen wird nachstehend über Tests berichtet, die die Wirkung gegen Viren veranschaulichen.

Beispiel 1 a) E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2′-Desoxycytidin (Formel 3)

In einen 250 ml-Rundkolben wurden 5-Chlormercuri-2′-Desoxycytidin (4,62 g, 10 mmol), (Formel 2), Ethylacrylat (6 g, 60 mmol) und 0,1 m Li₂PdCl₄ in trockenem Methanol (100 ml) zusammen eingefüllt, und dann wurde 24 h lang unter Stickstoff gerührt, wobei eine schwarze Suspension entstand. Die Suspension wurde filtriert, und der schwarze Niederschlag wurde gesammelt. Der Niederschlag wurde in Methanol (100 ml) erwärmt und filtriert. Die kombinierten Filtrate wurden mit NaBH₄ behandelt, bis das schwarze Material vollständig ausgefällt und die Lösung farblos geworden war. Nach nochmaligem Filtrieren wurde die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft (bis auf 30 ml), und aus dem Konzentrat kristallisierte das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)- 2′-Desoxycytidin (1,4 g, 43%) aus.

U. V. Spektrum: (Ethanol)
λ _min 237 nm (ε 8.230) λ _max 268 nm (ε 17.430) λ _min 297 nm (ε 8.250) λ _max 327 nm (ε 13.920) bei pH 2; λ _max 221 nm (ε 21.670) λ _min 245 nm (ε 8.560) g _max 275 nm (E 13.730) λ _min 297 nm (ε 8.050) λ _max 326 nm (ε 14.260) bei pH 7.

N. M. R. Spektrum:
S (d₆ DMSO); 8.50 (s, 1H, H-6), 7.57 (d, 1H, vinyl-H, J=16 Hz) 7.42 (s, 2H, NH₂) 6.21 (d, 1H, vinyl-H, J=16 Hz) 6.10 (t, 1H, H-1′) 5.16 (d, 1H, OH-3′) 5.14 (t, 1H, OH-5′) 4.20 (m, 1H, H-3′) 4.13 (g, 2H, CH₂-CH₃) 3.79 (m, 1H, H-4′) 3.62 (m, 2H, H-5′) 2.13 (m, 2H, H-2′) 1.24 (t, 3H, CH₂-CH₃).

Das Ausgangsmaterial, 5-Chlormercuri-2′-desoxycytidin, wurde nach der von Bergstrom und Ruth, J. Carbohydrates, Nucleosides, Nucleotides, 4 (5), 257-269 (1977) beschriebenen Methode erhalten.

b) E-5-(2-Carboxyvinyl)-2′-Desoxycytidin (Formel 4)

Das wie zuvor unter a) beschrieben gewonnene Carbethoxyvinyldesoxycytidin (325 mg, 1 mmol) wurde in einer 0,5 mol/l NaOH-Lösung (40 ml) suspendiert, und es wurde 2 h lang bei Zimmertemperatur gerührt. Die klare Lösung wurde durch Zugabe von Ionenaustauscherharz (Dowex-R-50) in der H⁺-Form auf pH 7 neutralisiert und filtriert. Diese Lösung wurde unmittelbar für die Weiterverarbeitung zu E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxycytidin verwendet.

c) E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxycytidin (Formel 1, Hal=Br)

Eine bei der zuvor unter b) beschriebenen Hydrolyse der Carbethoxyvinyldesoxycytidin-Verbindung (325 mg, 1 mmol) erhaltene Lösung wurde mit N-Bromsuccinimid (178 mg, 1 mmol) behandelt und bei Zimmertemperatur 15 h lang gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel entfernt, und der Rückstand wurde an SiO₂ (50 g) mit CHCl₃-MeOH (80 : 20) als Eluierungsmittel gereinigt. Man erhielt das E-5-(2-Bromvinyl)- 2′-Desoxycytidin (150 mg, 48%, Rf=0,32).

U. V. Spektrum: (Wasser)
λ _max 244 nm (ε 16.090) g _min 280 nm (ε 5.260) λ _max 302 nm (ε 7.610) bei pH 2; λ _max 250 nm (ε 15.830) λ _min 286 nm (ε 6.390) λ _max 292 nm (ε 6.590) bei pH 7; g _max 249 nm (ε 17.360) λ _min 283 nm (ε 7.300) λ _max 292 nm (e 7.660) bei pH 11.

N. M. R.-Spektrum:
δ (d₆ DMSO); 8.10 (s, 1H, H-6) 7.21 (br, 2H, NH₂) 7.05 (d, 1H, vinyl-H, J=13 Hz) 6.70 (d, 1H, vinyl -H, J=13 Hz) 6.10 (t, 1H, H-1′) 5.05 (br, 2H, OH-3′ und OH-5′) 4.10 (m, 1 H, H-3′) 3.75 (m, 1 H, H-4′) 3.60 (m, 2 H, H-5′) 2.10 (m, 2 H, H-2′).

Beispiel 2 a) Es wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1a) beschrieben E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2′-Desoxycytidin hergestellt. b) Durch Hydrolyse, in gleicher Weise wie im Beispiel 1b) beschrieben, wurde E-5-(2-Carboxyvinyl)-2′-Desoxycytidin gewonnen, jedoch mit dem Unterschied, daß nach der Neutralisation und dem Filtrieren das Lösungsmittel im Vakuum aus der Lösung entfernt und der Rückstand über P₂O₅ getrocknet wurde. c) E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin (Formel 1, Hal=J)

Der aus der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufe 2b) resultierende Rückstand wurde in trockenem DMF (20 ml) suspendiert, und es wurde N-Jodsuccinimid (225 mg, 1 mmol) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 4 h lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann in üblicher Weise aufgearbeitet, und es resultierte das E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin (105 mg, 28%).

U. V. Spektrum: (Ethanol)
λ _max 258 nm (ε 17.282) λ _sh 200 nm (ε 7.504) bei pH 7; λ _max 256 nm (ε 15.160) λ _min 293 nm (ε 4.700) λ _max 315 nm (ε 6.216) bei pH 2.

N. M. R.-Spektrum:
δ (d₆DMSO); 8.06 (s, 1 H, H-6) 7.26 (d, 1 H, vinyl-H, J=14 Hz) 7.20 (br, 2 H, NH₂) 6.64 (d, 1 H, vinyl-H, J=14 Hz) 6.08 (t, 1 H, H-1′) 5.11 (d, 1 H, OH-3′) 5.03 (t, 1 H, OH-5′) 4.20 (m, 1 H), H-3′) 3.76 (m, 1 H, H-4′) 3.58 (m, 2 H, H-5′) 2.08 (m, 2 H, H-2′).

Biologische Tests

Nachstehend wird über einige biologische Testreihen berichtet, aus denen die spezifische antivirale Aktivität, die niedrige Toxizität und der hohe antivirale Index der erfindungsgemäßen Verbindungen gezeigt und ersichtlich ist.

Bei diesen Tests wurde die Wirkung von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′- Desoxycytidin und ähnlichen Vergleichsverbindungen auf das Wachstum und die Ausbeute von Viren in Zellkulturen gemessen.

Die folgenden Verbindungen wurden getestet: E-5-(2-Bromvinyl)- 2′-Desoxycytidin und E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin als erfindungsgemäße Verbindungen.

E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)- 2′-Desoxyuridin und 5-Jod-2′-desoxyuridin als Vergleichsverbindungen. Alle Verbindungen waren β-Anomere.

Die Verbindungen wurden gegen das Vaccinia-Virus und gegen drei Stämme von Herpes simplex-1 Virus (Stamm KOS, Stamm McIntyre und Stamm F) getestet. Die Viren wurden in Zellkulturen aus Kaninchennierenzellen (primären Zellen) (PRK) und Fibroblasten der menschlichen Haut (HSF) gezüchtet. Die Technik der Ermittlung des Virenwachstums in den Zellkulturen, die angewendet wurde, ist beschrieben bei De Clercq u. Mitarb., Biochem. Pharmacol. 24, 523-527 (1975).

Test 1

In diesem Test wurde die Inhibierungsaktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidinen und den Vergleichsverbindungen gegen Vaccinia- und Herpes simplex-1-Viren in PRK und HSF-Zellkulturen gemessen. Man ließ die Zellen sich vermehren, bis sie in Plastik-Mikroplatten zusammengewachsen waren.

(PRK, HSF). Wenn die Platten ausgefüllt waren, wurden die Zellen mit 100 CCID₅₀ an entweder Vaccinia-Virus oder Herpes simplex-1-Virus beimpft. Eine CCID₅₀ oder "Zellkultur- Infektionsdosis-50" ist die Dosis an Virus, die erforderlich ist, um 50% der Zellkultur zu infizieren. Eine Stunde nach dem Beimpfen mit dem Virus wurden die zu testenden Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen (im Bereich von 0,001 µg/ml bis 100 µg/ml) zugesetzt. Für jedes Virus-Zell-System wurde die ID₅₀ bestimmt. Die ID₅₀ oder "Inhibierungsdosis-50" ist diejenige Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um den zytopathogenen Effekt auf den Virus auf 50% zu unterdrücken. Der zytopathogene Effekt (CPE) wurde aufgezeichnet, sobald er in den unbehandelten Virus-infizierten Zellkulturen Kompletion erreicht hatte (im allgemeinen 3 Tage, nachdem die Zellen mit dem Virus beimpft worden waren). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt; die darin angegebenen Daten sind Mittelwerte aus drei gesondert durchgeführten Experimenten.

Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, daß die E-5-(2-Halogenvinyl)-2′- Desoxycytidine, die zwar etwas weniger aktiv sind als die Vergleichsverbindungen E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxyuridin, mindestens gleiche Aktivität haben oder sogar stärker aktiv sind gegen Herpes simplex-1 im Vergleich zu der Standard-Vergleichsverbindung 5-Jod-2′-desoxyuridin. Man erkennt weiterhin, daß im Gegensatz zu der Standard-Vergleichsverbindung die erfindungsgemäßen E-5-(2-Halogenvinyl)- 2′-Desoxycytidine eine antivirale Aktivität aufweisen, die sehr spezifisch ist gegen das Virus des Herpes simplex-1. Diese spezifische Wirkung ist etwa die gleiche wie die der E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxyuridin-Vergleichsverbindungen.

Tabelle 1

Antivirale Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK- und HSF-Zellkulturen

Test 2

Es wurde der Inhibiierungs-Effekt von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′- Desoxycytidinen und einer Vergleichsverbindung auf die Virus-Multiplikation von Herpes simplex-1-Virus (Stamm KOS) in PRK-Zellkulturen gemessen.

Nach Ausbildung von einschichtigen Zellrassen aus PRK-Zellen in Petrischalen aus Plastik (Durchmesser: 55 mm) wurde mit Herpes simplex-1 (4,5 log₁₀ PFU/0,5 ml/Petrischale 1 h lang bei 37°C beimpft, und unmittelbar danach wurden 0,1 µg/ml von einer der zu untersuchenden Verbindungen zur Einwirkung gebracht. Dann wurden die Zellkulturen über verschiedene Zeiträume (1, 2 oder 3 Tage lang) bei 37°C bebrütet. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen auf -70°C tiefgefroren, und die Zellhomogenate wurden durch Plaque-Bildung in VERO-Zellkulturen auf ihren Gehalt an Virus untersucht (VERO=eine kontinuierliche Zellinie auf unbehandelten Affenzellen) (VERO=a continuous cell line of green monkey cells). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 in Form der Differenzen an Virus-Ausbeute zwischen den behandelten mit Virus infizierten Zellkulturen und den unbehandelten mit Virus infizierten Zellkulturen angegeben. "PFU" bedeutet Einheiten der Plaque-Bildung.

Tabelle 2

Inhibierungs-Effekt von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidinen gegen Multiplikation des Virus Herpes simplex-1 (Stamm KOS) in PRK-Zellkulturen

Aus Tabelle 2 ist zu ersehen, daß die durch E-5-(2-Halogenvinyl)- 2′-Desoxycytidine bewirkte Reduktion an Virus-Ausbeute vergleichbar ist mit derjenigen, die die Standard-Vergleichsverbindung 5-Jod-2′-desoxyuridin bringt.

Test 3

Es wurde die antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)- 2′-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen gemessen.

Dazu wurden die Inkorporation von bestimmten radiomarkierten DNS-Precursoren in DNS der Zellen und die Wirkung von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidinen sowie Vergleichsverbindungen darauf untersucht. Die Untersuchungsmethode ist beschrieben worden von De Clercq u. Mitarb. in Biochemical Pharmacology, 26, 794-797 (1977) sowie von De Clercq u. Mitarb. in Molecular Pharmacology, 14, 422-430 (1978).

Als DNS-Precursoren wurden (Methyl-³H) (2′-Desoxythymidin) (TdR) und (2-¹⁴C) (2′-Desoxyuridin (UdR) benutzt.

Die Zellen wurden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der zu untersuchenden Verbindungen (im Bereich von 1 bis 200 µg/ml 16 h lang der Einwirkung von 0,12 µCi : 0,01 nmol (Methyl-³H)TdR (je 10⁵ Zellen) oder 14 µCi/250 nmol (2-¹⁴C)UdR (je 10⁵ Zellen) ausgesetzt. Dann wurde die Inkorporation des radiomarkierten Precursors wie beschrieben gemessen, und es wurde der ID₅₀-Wert bestimmt. Der ID₅₀-Wert entspricht der Inhibierungsdosis-50, das heißt derjenigen Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, die Inkorporation von entweder (Methyl-³H)TdR oder (2-¹⁴C)UdR um 50% zu inhibieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen

Man erkennt aus Tabelle 3, daß keines der E-5-(2-Halogenvinyl)- 2′-Desoxycytidine eine Inhibierung der Inkorporation von (Methyl-³H)TdR oder (2-¹⁴C)UdR in zellulare DNS verursacht, sogar dann nicht, wenn die Verbindung in so hoher Konzentration wie 200 µg/ml, die höchste untersuchte Konzentration, verwendet wurde.

Test 4

Es wurde noch der antivirale Index von E-5-(2-Halogenvinyl)- 2′-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen aus den bei den zuvor beschriebenen Tests gewonnenen Meßergebnissen bestimmt.

Der Antiviral-Index wurde als das Verhältnis des ID₅₀-Wertes für die (2-¹⁴C)UdR-Inkorporation in Zell-DNS zu dem ID₅₀-Wert für die Herpes simplex-1 (Stamm KOS) - Virus-Replikation (vergleiche Tabellen 1 und 3) ermittelt.

Die Resultate sind in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Antiviral-Index von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen

Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, daß der Antiviral-Index für die erfindungsgemäße E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidine auf (viel) höher als 2000-3000 ansteigt.

Diese Verbindungen zeigten bei der höchsten untersuchten Konzentration (200 µg/ml) keine Toxizität, der genaue Antiviral-Index konnte nicht exakt berechnet werden.

Aus der vorstehenden Beschreibung ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidine, z. B. E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxycytidin und E-5-(2- Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin, eine exzellente und hochspezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und daß ihre Toxizität in Zellkulturen anscheinend Null ist. Verglichen mit bekannten E-5- (2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidinen haben sie ersichtlich eine höhere Spezifizität gegen das Virus Herpes simplex und eine geringere Toxizität gegen lebende Zellen in Zellkulturen. Wenngleich der absolute Wert ihrer antiviralen Aktivität möglicherweise etwas niedriger liegt als diejenige der bekannten 2′-Desoxycytidine, haben sie den Vorteil, daß ihnen anscheinend jegliche Toxizität in Zellkulturen fehlt, so daß die erfindungsgemäßen Verbindungen wahrscheinlich therapeutische Indeces zu erreichen vermögen, die mindestens ebenso hoch oder sogar noch höher liegen als diejenigen, die die bekannten 2′-Desoxyuridine erreichen. Erfindungsgemäße Verbindungen eignen sich daher hervorragend zur Verwendung bei der Bekämpfung von Virus-Erkrankungen bei Menschen und Tieren und zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen für die Behandlung von durch das Virus Herpes simplex verursachte Erkrankungen.

Pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine erfindungsgemäße Verbindung, zum Beispiel E-5-(2-Bromvinyl)- 2′-Desoxycytidin oder E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin enthalten, können in Form von Pulvern, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, oder auch als Salben oder Pasten formuliert werden; sie lassen sich für parenterale (z. b. intradermale, intramuskuläre, intrathekale) Injektionen, für orale, rektale, intravaginale oder intranasale Verabreichungen benutzen oder für topikale Applikation (z. B. bei Verletzungen der äußeren Haut, der Schleimhaut und des Auges) einsetzen. Solche pharmazeutische Zubereitungen können hergestellt werden dadurch, daß man in üblicher Weise den oder die aktiven Wirkstoffe mit pharmazeutisch verträglichen üblichen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen kombiniert. Zu solchen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen gehören beispielsweise wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsmittel, Dispersionsmittel, Benetzungsmittel und andere für die Formulierung von pharmazeutischen Zubereitungen dem Fachmann bekannte Substanzen. Die pharmazeutischen Zubereitungen können gewünschtenfalls auch noch geeignete Additive, wie Polyethylenglykole, Farbstoffe und/oder Parfüms enthalten.

In den pharmazeutischen Zubereitungen wird der erfindungsgemäße Wirkstoff normalerweise in einer Menge von wenigstens 0,1 Gew.-%/Volumen vorhanden sein. Die bestimmte Konzentation hängt im Einzelfall ab von der zu behandelnden Krankheit und der gewählten Art der Verabreichung. Im allgemeinen hält sich die Konzentration zwischen etwa 0,1% und 100%.

Claims

1. E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidin.

2. E-5-(2-Bromvinyl)-2′-Desoxycytidin.

3. E-5-(2-Jodvinyl)-2′-Desoxycytidin.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in 2′-Desoxycytidin einen Halogenvinylrest als E-5-(2-Halogenvinyl)-Gruppe einführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, daduch gekennzeichnet, daß man 5-Quecksilber(II)-chlorid-2′-desoxycytidin und ein Alkylacrylat mit einem Lithiumpalladiumchlorid-Katalysator zur Reaktion bringt, das resultierende E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2′-Desoxycytidin hydrolysiert und das resultierende E-5-(2-Carboxyvinyl)-2′-Desoxycytidin zu dem E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-Desoxycytidin halogeniert.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein eine reaktive Gruppe aufweisendes Derivat von 2-Desoxy-D-erythropentofuranose, dessen Hydroxylgruppen Schutzgruppen tragen, mit einem Trialkylsilylderivat von E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin umsetzt und danach die Schutzgruppen von den Hydroxylgruppen entfernt.

7. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2 und/oder 3 als Wirkstoff und übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.