DE3033885C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten (= Kultivieren) von Zellen in einem Kulturmedium, das teilchenförmige Mikroträger enthält, wobei die Teilchen im mit Wasser gequollenen Zustand eine Dichte im Bereich von 0,95 bis 1,20 g/ml, vorzugsweise 1,00 bis 1,10 g/ml, und eine durchschnittliche Teilchengröße im Bereich von 100 bis 500 µm haben.

In den letzten Jahren ist das Züchten von Zellen in vitro eine unerläßliche Technik in der Forschung geworden. Durch ein derartiges Züchten von Zellen werden Informationen über die Zellteilung, das Zellwachstum, die Differenzierung, die Struktur, den Metabolismus und das Altern erhalten. Diese Methode ist für Forschung, u. a. auf dem Gebiet der Pflanzenphysiologie, der Zoophysiologie, der Biochemie, der Pathologie, der Histologie, der Immunologie und der Krebsforschung von großer Signifikanz geworden. Diese Methode stellt die Grundtechnik der wissenschaftlichen Disziplin der Zellbiologie dar.

Weiterhin bringt das Züchten von Zellen in vitro den Durchbruch bei der Verwendung im technischen Maßstab, wo die rein technischen Schwierigkeiten des Erhalts einer genügenden Ausbeute von Zellen oder von Zellen abgesonderten Produkten innerhalb begrenzter Materialquellen ein begrenzter Faktor war. Dies trifft beispielsweise auf die Herstellung von Biochemikalien, Arzneimitteln, Hormonen und Virusimpfstoffen zu.

Bei Methoden zum Züchten von Zellen, die Produkte für den medizinischen oder veterinärmedizinischen Gebrauch ergeben sollen, ist man dem Gesetz nach gezwungen, mit normalen, diploiden Zellen zu arbeiten. Die große Vielzahl von Säuretierzellen, die in diesem Zusammenhang am besten untersucht worden sind, erfordern ein festes Substrat, um zur Proliferation imstande zu sein. Man sagt, daß diese Zellen verankerungsabhängig sind. Säugetierzellen, die dazu imstande sind, in freier Suspension zu wachsen (z. B. menschliche HeLa-Zellen oder Hamster-Nierenzellen, BHK-Zellen) sind vom genetischen Gesichtspunkt her gesehen nicht vollständig normal, und sie können bei der Injektion Tumore bewirken.

Bei den klassischen Methoden zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen werden Glas- oder Kunststoffschalen oder Rollflaschen oder Kolben verwendet, in denen es möglich ist, eine Schicht (Monoschichten) der Zellen zu erhalten. Bei der Durchführung einer solchen Technik in größerem Maßstab ist es bislang notwendig gewesen, die Anzahl der Kulturgefäße zu erhöhen. Die Zwischenstufen der Veränderung des Mediums, der Subzüchtung, der Ernte der Zellen etc. haben eine sehr große Anzahl von manuellen Maßnahmen unter sterilen Bedingungen erforderlich gemacht.

Eine klare Verbesserung im Vergleich zu den oben genannten Methoden ist durch Einführung der sog. Mikroträgerkultur erzielt worden. Bei dieser Technik läßt man die Zellen sich an kleinste Teilchen, die in dem Nährmedium durch langsames Rühren suspendiert gehalten werden können, anheften und darauf wachsen. Diese Teilchen bieten eine erheblich größere Oberfläche pro Volumeneinheit des Kulturgefäßes und sie ermöglichen daher die Züchtung von großen Mengen von Zellen in einem einzigen Tank. Bezüglich des Raums, des Arbeitsaufwands und der direkten Betriebskosten bringt diese Technik erhebliche Vorteile sowohl beim Arbeiten im Laboratorium als auch beim Arbeiten in größerem Maßstab mit sich.

Eine Methode unter Verwendung von solchen Mikroträger-Kulturtechniken wird in dem Artikel "Mikrocarrier culture of animal cells" von A. L. van Wezel in "Tissue Culture, Methods and Applications, P. F. Kruse jr. und M. K. Patterson jr., Academie Press (1973), Seiten 372-377, beschrieben. Das in diesem Falle verwendete Trägermaterial besteht aus unlöslichen Perlen aus Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist, welches mit Diethylaminoethyl-Gruppen substituiert ist.

Teilchenförmige Mikroträger sollten die folgenden Eigenschaften haben:

Die Dichte in Gegenwart von Wasser (d. h. im mit Wasser gequollenen Zustand) sollte sich vorzugsweise nicht nennswert von der Dichte der wäßrigen Umgebung unterscheiden, in der das Trägermaterial eingesetzt wird, um eine homogene Suspension von Teilchen unter sorgfältigem Rühren zu erhalten; d. h. im allgemeinen sollte die Dichte im Bereich von 0,95-1,20 g/ml, vorzugsweise 1,00-1,10 g/ml und insbesondere 1,02-1,05 g/ml liegen.

Um eine gleichförmige wirksame Kapazität und eine gleichförmige Adhäsion und ein Wachstum der Zellen zu erhalten, sollten die Teilchen aus einer sehr engen Fraktion hinsichtlich der Teilchengröße bestehen. Im allgemeinen wird eine durchschnittliche Teilchengröße im mit Wasser gequollenen Zustand verwendet, die im Bereich von 100-500 µm, vorzugsweise im Bereich von 100-300 µm, z. B. im Bereich von 150-300 µm, liegt.

Die Teilchen sollten glatt sein (und vorzugsweise eine kugelförmige oder sphäroidale Form haben), um eine zufriedenstellende Zelladhäsion und die geringste mögliche Chance der Zellen zur Verschiebung, wenn die Teilchen miteinander zusammenstoßen, haben. Die Teilchen sollten weiterhin dazu imstande sein, mechanischen Zug- und Druckspannungen im suspendierten Zustand zu widerstehen, so daß sie nicht in kleinere Teilchen zerfallen.

Eine Transparenz erleichtert mikroskopische Untersuchungen der wachsenden Kulturen.

Die Teilchen dürfen gegenüber primären Zellen, ausgebildeten Zellinien und Stämmen von diploiden Zellen von Menschen und Tieren nicht toxisch sein.

Die Fähigkeit der Teilchen aus dem Kultivierungsmedium, andere Komponenten als diejenigen, die beim Mechanismus des Anhaftens der Zellen an den Teilchen teilnehmen, zu absorbieren, sollte vernachlässigbar sein.

Die bekannten Mikroträger sind jedoch bestimmten Begrenzungen unterworfen. So hat es sich beispielsweise bei bestimmten Umständen aus unbekannten Gründen als unmöglich erwiesen, menschliche diploide Zellen auf diesen Trägern zu züchten. Die Bindung zwischen der Zelle und dem Mikroträger mit ionisierbaren Gruppen, welche Bindung am Anfang elektrovalent ist, jedoch sekundär durch andere Typen von Bindungskräften mechanischer und/oder chemischer Natur verstärkt wird, ist nicht immer genügend stark. So kann beispielsweise erwähnt werden, daß bestimmte Typen von Lymphoid-Zellen an diesen Mikroträgern nicht befestigt werden. Weiterhin kann es sein, daß die Zellen sich entweder während des Wachstums oder während der Aufrechterhaltung der Kulturen ablösen. Dies ist beispielsweise beim Züchten einer Anzahl von normalen Fibroblasten beobachtet worden.

Bei anderen Zelltypen hat sich gezeigt, daß diese sich an vorliegende Mikroträger mit einer solchen Festigkeit binden, daß Probleme entstehen, wenn die Zellen zum Ernten davon befreit werden sollen. Die herkömmliche Methode in diesem Zusammenhang ist die Trypsinisierung, d. h. die Behandlung der Kultur mit einem proteolytischen Enzym. Eine zu starke Trypsinisierung führt aber zum Absterben oder zur Beschädigung der Zellen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Züchten von Zellen in einem Kulturmedium zur Verfügung zu stellen, das kugelförmige Mikroträger enthält, die den oben beschriebenen Erfordernissen hinsichtlich der Mikroträger genügen und die weiterhin nicht die oben erwähnten Nachteile von bekannten Mikroträgern haben, die aber auch dazu verwendet werden können, Zellen in solchen Systemen zu züchten, wo bereits vorhandene Mikroträger technische Probleme ergeben.

Die Erfindung baut sich auf der Anwendung der biospezifischen Affinität auf, welche zwischen einerseits bestimmten Polypeptiden und andererseits einem oder mehreren Proteinen, die unter der Bezeichnung Fibronectine bekannt sind und im Serum und in den Membranen des Hauptteils von Zelltypen vorliegen, existiert. Indem man solche Polypeptide an einen Mikroträger anheftet, werden Teilchen erhalten, die in Anwesenheit von Fibronectin zu einer Bindung an Zellen imstande sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger kugelförmige Teilchen einer in Wasser unlöslich, jedoch in Wasser quellbaren, vernetzten, organischen makromolekularen Substanz sind und die Teilchen an ihren Oberflächen kovalent gebundenes Kollagen oder ein Abbauprodukt davon aufweisen.

Die makromolekulare Substanz kann beispielsweise ein Polysaccharid oder ein Protein oder ein Derivat davon sein, das vernetzt worden ist. Beispiele für geeignete Polysaccharide sind Dextran und Agarose und Derivate davon. Beispiele für geeignete Proteine sind Kollagen, Kollagenähnlichkeiten oder Abbauprodukte davon, zum Beispiel Gelatine, wobei die makromolekulare Substanz die gleiche Substanz wie das Kollagen oder ein Abbauprodukt davon sein kann. Die makromolekulare Substanz kann auch ein vernetztes, synthetisch hergestelltes Polymeres sein, das in Wasser unlöslich, jedoch quellbar ist und das gegenüber den Zellen nicht toxisch ist.

Die Vernetzung von makromolekularen Substanzen, die zum Beispiel Aminogruppen oder Hydroxylgruppen enthalten (zum Beispiel Proteine und Polysaccharide), mit mindestens einem bifunktionellen Vernetzungsmittel ist bereits bekannt (vgl. GB- PS 8 54 715, 9 74 054 und 10 13 585). Die makromolekulare Substanz kann auch eine Kombination aus zwei oder mehreren makromolekularen Substanzen sein. Teilchen mit kugelförmiger Form können durch Perl-Polymerisations-Techniken hergestellt werden. In diesem Falle wird das Reaktionsgemisch zu Tröpfchenform in einer inerten Flüssigkeit, die damit nicht mischbar ist, dispergiert. Danach werden die durch die Reaktion in den Tröpfchen gebildeten vernetzten unlöslichen Teilchen gewonnen (vgl. z. B. GB-PS 9 74 054). Die gewünschte Teilchengröße kann erhalten werden, indem man die Größe der Tröpfchen einstellt und indem man die Teilchen fraktioniert, beispielsweise durch Sieben. Das Vernetzungsmittel für makromolekulare Substanzen, die Hydroxylgruppen und Aminogruppen enthalten, kann z. B. eine Verbindung des Typs

sein, worin X, Y und Z jeweils ein Halogenatom, vorzugsweise Chlor oder Brom sind, und A₁ und A₂ jeweils eine geradkettige oder verzweigte aliphatische, gesättigte Kohlenwasserstoffkette, die mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen (z. B. 1-3 Hydroxylgruppen) substituiert ist und die vorzugsweise 3-20 Kohlenstoffatome, z. B. 3-10 Kohlenstoffatome enthält, und die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome (z. B. 1-3 Sauerstoffatome) unterbrochen ist, sind. Als Vernetzungsmittel können auch entsprechende Epoxidverbindungen, die aus der Verbindung (I) oder (II) durch Abspaltung von Halogenwasserstoff erhalten werden, verwendet werden. Beispiel für bifunktionelle Substanzen mit der Formel X · A₁ · Z und entsprechende Epoxidverbindungen, die aus X · A₁ · Z durch Abspaltung von Halogenwasserstoff erhältlich sind, sind z. B. Dichlorhydrin, Epichlorhydrin und 1,4-Butandiol-Diglycid-Äther. Die Vernetzungen können somit z. B. geradkettige oder verzweigte aliphatische gesättigte Kohlenwasserstoffketten, die durch ein oder mehrere Hydroxylgruppen (z. B. 1-3 Hydroxylgruppen) substituiert sein können und die 3-20 Kohlenstoffatome, z. B. 3-10 Kohlenstoffatome enthalten und die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome (z. B. 1-3 Sauerstoffatome) unterbrochen sind, sein. Es sind viele weitere Typen von Vernetzungsmitteln bekannt, zum Beispiel Diisocyanate und Diisothiocyanate. Die Quellkapazität und die Dichte der Teilchen im mit Wasser gequollenen Zustand können variiert werden, indem man unterschiedliche makromolekulare Substanzen und Vernetzungsmittel auswählt und indem man den Grad der Vernetzung variiert.

Erfindungsgemäß wird ein besonderer Vorteil erhalten, wenn man Teilchen verwendet, die Poren haben, welche so klein sind, daß das Kollagen oder ein Abbauprodukt davon zu einem vorherrschenden Ausmaß auf der Oberfläche der Teilchen verbleibt und nicht in die Poren eindringt und daß hochmolekulare Substanzen, die beim Züchten der Zelle gebildet werden, nicht in einem nennenswerten Ausmaß in die Poren eintreten.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das Kollagen oder ein Abbauprodukt davon in Form einer Oberflächenschicht auf ein Teilchen aufgebracht, welches aus einem anderen makromolekularen Material besteht als das Kollagen oder ein Abbauprodukt davon. Erfindungsgemäß wird Kollagen oder seine Abbauprodukte, zum Beispiel Gelatine, verwendet. Gemäß dieser Ausführungsform wird das Kollagen oder ein Abbauprodukt davon an das teilchenförmige Material mit kovalenten Bindungen gebunden, die gegenüber den normalen Kultur- und Waschbedingungen beständig sind. Eine große Anzahl von Methoden zur Erzeugung von kovalenten Bindungen ist in der Literatur in Verbindung mit dem Kuppeln von Polypeptiden an Träger auf einer Polysaccharid- oder Proteinbasis beschrieben worden. Somit ist das Ankuppeln mittels Cyanogenhalogeniden beispielsweise in der US-PS 36 45 852, das Ankuppeln mittels Cyanaten beispielsweise in der US-PS 37 88 948 und das Ankuppeln durch Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen beispielsweise in der DE- OS 28 08 515 beschrieben worden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden als Mikroträger Kollagen oder seine Abbauprodukte, die so vernetzt worden sind, daß die gewünschte Unlöslichkeit in Wasser erhalten wird, verwendet.

Die Zellen werden zum gewünschten Zeitpunkt von dem Träger mit einem proteolytischen Enzym (zum Beispiel Kollagenase, wenn Kollagen oder Gelatine verwendet wird) nach beendigtem Wachstum der Zellen freigesetzt. Insbesondere im Falle von Kollagenase kann eine gute Ausbeute an lebensfähigen Zellen leicht freigesetzt werden (Kollagenase steht mit den Zellen erheblich besser in Einklang als Trypsin).

Die Teilchen können neutral sein, oder sie können zusätzlich zu dem Kollagen oder einem Abbauprodukt davon Ionenaustauschergruppen an der Oberflächenschicht haben. Die Ionenaustauschergruppen können an sich bekannte Anionen oder Kationenaustauschergruppen sein, zum Beispiel Aminogruppen oder Carboxylgruppen.

Wie vorstehend erwähnt wurde, erscheint Fibronectin auf den Zelloberflächen. Bei bestimmten Zelltypen, zum Beispiel bei fransformierten Zellen, ist der Fibronectingehalt niedrig. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf diesen Zelltyp angewendet wird, dann kann das Fibronectin in das System in einer geeigneten Form eingegeben werden, beispielsweise indem man Serum zusetzt oder indem man Mikroträger mit Fibronectin verwendet, welches an das Kollagen oder ein Abbauprodukt davon auf der Außenschicht des Mikroträgers gebunden worden ist.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel Wachstum von Vero-Zellen auf Mikroträgern (Vero ist eine eingerichtete Zellinie, die von Affennierenzellen [Grüner Afrikanischer Affe] herrührt und die im Handel erhältlich ist

Im Autoklaven behandelte Mikroträger (z. B. B IV, vgl. unten) in einer 30 mg Trockensubstanz entsprechenden Menge wurden in einer Petrischale in 10 ml Dulbecco-Medium (Smith, J. D., Freemann, G., Vogt, M. and Dulbecco, R. (1960) Virology 12, 185-196), das 3 mM Glutamin und 10% fetales Kalbsserum enthielt, mit einer Anfangszellkonzentration von 2 · 10⁵ Zellen/ ml suspendiert. Das Wachstum erfolgte in einem CO₂- Inkubator bei 37°C über einen Zeitraum von 160 Stunden, und es wurde dadurch gemessen, daß die Zellkerne mit 0,1% Kristallviolett angefärbt wurden und indem im Mikroskop gezählt wurde. Parallel zu diesem Versuch wurde die Züchtung unter identischen Bedingungen mit Cytodex® 1 (Mikroträger auf auf der Basis von vernetztem Dextran, das mit Diethylaminoethyl- Gruppen derivatisiert worden ist, im Handel erhältlich) bewirkt.

Bei beiden Züchtungstests haben sich ungefähr 2 · 10⁴ Zellen /ml an die Mikroträger nach 18 Stunden angeheftet. Nach 160 Stunden war die Anzahl der Zellen in beiden Kulturen auf wenig mehr als 10⁶/ml erhöht.

Beispiel 2 Ernte von Zellen von den Mikroträgern

0,5 ml Suspension von Mikroträger (von Beispiel B V und Cytodex ® 1) des Beispiels 1 wurden in Zentrifugierröhrchen übertragen. Der Überstand wurde durch leichtes Zentrifugieren (Beschleunigung bis zu 200 × Schwerkraft und Verzögerung, insgesamt 5 Minuten) abgetrennt. Die Mikroträger wurden zweimal mit 1 ml von 0,03% EDTA in Puck-Kochsalzlösung (Puck, T. T., Cieciura, S. J., and Robinson, A. (1958), Journal of Experimental Medicine 108 945-956) und einmal mit 1 ml Puck-Kochsalzlösung ohne EDTA gewaschen.

Nach der letzten Zentrifugierung wurden 1 ml Enzymlösung in Puck-Kochsalzlösung, 0,05% Kollagenase oder 0,05% Trypsin zugefügt. Nach Inkubation über einen Zeitraum von 5 bis 10 Minuten bei 37°C wurde die Zahl der freigesetzten Zellen gezählt (vgl. Tabelle 1).

Tabelle I

Freisetzung der Vero-Zellen von Mikroträgern. Die Meßwerte stellen die Durchschnittswerte von zwei parallelen Tests dar.

Somit wird bei Züchtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine erheblich höhere Ausbeute an freigesetzten Zellen, insbesondere wenn bei der Freisetzung Kollagenase verwendet wird, erhalten.

Beispiel 3 Züchtung von Vero-Zellen auf Gelatin-Sephadex®1 G 50 und Cytodex® 1

0,0375 ml gepackte Mikroträger des Beispiels B II wurden in einem Kolben suspendiert und es wurden 1×10⁵ Zellen/ml Züchtungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 10% fetalem Kalbsserum, 3 mM Glutamin und 20 mM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethan-sulfonsäure)-Puffer) zugegeben. Es wurde bei 37°C in Gegenwart von mit Wasser gesättigter Luft (5% CO₂) wachsen gelassen, und die Kultur wurde mit einem Magnetrührer mit einer Geschwindigkeit von 60 U.p.m. gerührt. Das Züchten der Zellen erfolgte auf Cytodex® 1 bei identischen Bedingungen. Das Wachstum, gemessen als Anzahl von Zellen/ml Kulturmedium, ist in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Es ist von Interesse festzustellen, daß das Wachstum auf Gelatin-Sephadex® G 50 am Beginn des Züchtungsprozesses erheblich rascher war. Die Differenz zwischen den verschiedenen Mikroträgern kann weiter erhöht werden, wenn die Zellkulturen wiederholt nach zwei- bis viertägiger Inkubation reproduziert werden.

Die in diesen Beispielen verwendeten Miktroträger wurden auf folgende Weise hergestellt:

A. Herstellung von aktivierten Mikroträgern

I. 10 g mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran mit der Form von kugelförmigen Teilchen (Sephadex® G 50) wurden auf einem Glasfilter mit Wasser gewaschen und in ein 500-ml-Gefäß mit Wasser zu einem Gesamtvolumen von Wasser plus Teilchen von 300 ml überführt. 12 g Natriumhydroxid gelöst in 15 ml Wasser und 0,1 g Natriumborhydrid wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 60°C erhitzt. 38 ml Epichlorhydrin wurde zugefügt, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang umsetzen gelassen. Danach wurden die Teilchen mit Wasser auf einem Glasfilter gewaschen, und das Wasser wurde durch Absaugen entfernt.

II. 40 ml sedimentierte Teilchen von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran (Sephadex® G 50) oder Teilchen von vernetzter Agarose (Sepharose® CL 4 B) und 20 ml Wasser wurden in ein 250 ml Gefäß übertragen und mit 60 ml einer Cyanogenbromidlösung (80 mg CNBr/ ml H₂O) vermischt. Das Gemisch wurde bei einem pH-Wert von 11,4 6 Minuten lang bei 4°C umsetzen gelassen. Die Teilchen wurden sodann auf einem Glasfilter mit 1000 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen.

B. Kupplung von Proteinen oder Peptiden an aktivierte Mikroträger

1 g Protein (Polypeptid) wurde in 50 ml 0,1 M NaHCO₃, das 0,5 M NaCl in Wasser enthielt (pH 8,0), erforderlichenfalls unter Erhitzen, aufgelöst. Der pH-Wert wurde auf 9,5-10,5 eingestellt. Die Lösung wurde zu Mikroträgern gegeben, die, wie oben unter A angegeben, aktiviert worden waren. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Teilchen abwechselnd mit 0,2 M Na-Acetatpuffer mit 0,5 M NaCl in Wasser (pH 4,5) und 0,2 NaHCO₃ mit 0,5 M NaCl in Wasser (pH 8,0) auf einem Glasfilter gewaschen wurden. Die Flüssigkeit wurde durch Absaugen entfernt.

I. Kollagen (Kollagen Typ I) wurde auf aktiviertes Sephadex® G 50 von A I auf die oben beschriebene Art und Weise gekuppelt.
Ausbeute: 11 mg Kollagen/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 160-200 µm, und die Dichte war 1,03 g/ml.

II. Gelatine (Gelatine Typ III) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an aktiviertes Sephadex® G 50 von A I angekuppelt.
Ausbeute: 4 mg Gelatine/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 160-200 µm, und die Dichte war 1,03 g/ml.

III. Kollagen (Gleiches Produkt wie oben unter I angegeben) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an aktivierte Sepharose® CL 4 B von A II angekuppelt.
Ausbeute: 80 mg Kollagen/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 100-150 µm, und die Dichte war 1,02 g/ml.

IV. Gelatine (gleiches Produkt wie oben unter II angegeben) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an aktivierte Sepharose® CL 4 B von A II angekuppelt.
Ausbeute: 95 mg Gelatine/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 100-150 µm, und die Dichte war 1,02 g/ml.

V. Kollagen (gleiches Produkt wie oben unter I angegeben) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an aktiviertes Sephadex® G 50 von A II angekuppelt.
Ausbeute: 19 mg Kollagen/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 130-150 µm, und die Dichte war 1,04 g/ml.

VI. Gelatine (gleiches Produkt wie oben unter II angegeben) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an Sephadex® G 50 von A II angekuppelt.
Ausbeute: 12,5 mg Gelatine/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 130-180 µm, und die Dichte war 1,04 g/ml.

Die obigen Werte betreffend die Teilchengröße und die Dichte beziehen sich auf Teilchen in mit Wasser gequollenem Zustand.

Claims (4)

1. Verfahren zum Züchten von Zellen in einem Kulturmedium, das teilchenförmige Mikroträger enthält, wobei die Teilchen im mit Wasser gequollenen Zustand eine Dichte im Bereich von 0,95 bis 1,20 g/ml, vorzugsweise 1,00 bis 1,10 g/ml, und eine durchschnittliche Teilchengröße im Bereich von 100 bis 500 µm haben, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger kugelförmige Teilchen einer in Wasser unlöslichen, jedoch in Wasser quellbaren, vernetzten, organischen makromolekularen Substanz sind und die Teilchen an ihren Oberflächen kovalent gebundenes Kollagen oder ein Abbauprodukt davon aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Substanz ein in Wasser unlösliches, jedoch in Wasser quellbares Polymeres ist, welches gegenüber den Zellen nicht toxisch ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen oder das Abbauprodukt davon einer anderen makromolekularen Substanz als das Kollagen oder das Abbauprodukt davon aufgebracht ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mikroträger aus vernetztem Kollagen oder Abbauprodukten davon bestehen.