SE456164B - Forfarande for immobilisering, odling och efterfoljande frigoring av animala celler samt mikroberare av gelatin med absorberade animala celler - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 456 164 ,~ 2 effekt på celltillväxt. Potentíellt tillåter dessa underlag enkel utvinning vid användning i viskösa eller partikelfor- miga media. Dessutom är det möjligt att suspendera pärlorna genom anbringning av ett yttre magnetiskt fält, varvid be- hovet för kraftig omblandning vid användning av bärare med hög densitet minimeras.

Använda material såsom agaros (typ VII), alginsyra (natriumsalt, typ IV), kollagenas (typ I, 190 U/mg) har er- hållits från Sigma. Glutaraldehyd (25 %) har erhållits från Merck AG.

Pharmacia, Sverige, och de magnetiska partiklarna, Fe304 Cytodex och Sepharose CL-68 är produkter från (5 um) har erhållits från Höganäs, Sverige. Arlacel 83 har anskaffats från Atlas Chemical Co, dispas (kvalitet Il, 0,5 U/mg) från Boehringer.

Följande celler har erhållits av Professor 0. Sjögren: de etablerade cellinjerna HeLa och K562 (erytroleukemisk) och de primära cellkulturerna S 157N (humana skinnfibroblaster), S 158A (human njurcarcinom), DMH N49 (koloncarcinom från råtta) och DMH W1073 (koloncarcinom från råtta). Alla celler utom K 562 odlades i Waymouth-media, kompletterade med 20 % kalvfosterserum. K 562 odlades i RPMI-medium med 10 % kalv- fosterserum. Alla media var kompletterade med gentamicin (50 mg/1). , I våra försök att avskiljs celler eftersträvades en alternativ väg, eftersom man med de nya mikrobärarna direkt kan lösa upp underlaget enzymatiskt. Både dispas och kolla- genes löste upp pärlorna, och vid användning av dispas erhölls en klar lösning. I motsats till trypsinbehandling, som in- begriper destruktion av cellytan för att åstadkomma avlägsnande av celler, bör föreliggande sätt lämna hela cellen intakt och livskraftigt, vilket är en fördel, t.ex. när cellerna an- vändes för immunisering eller när analys av ytantigener skall mtföras. Eftersom gelatin är billigt och representerar en "naturligare" yta för cellfastsättning än kommersiellt tillgängliga underlag, synes dessa mikrobärare vara värde- fulla underlag för celltillväxt, vilket även de nedan be- skrivna försöken visar. Lättheten,med vilken celler frigörs, ökar dessa mikrobärarnas fördelar. 10 15 20 25 30 35 . 4seg1§4 3 Uppfinníngen förklaras närmare med hjälp av följande figurer och exempel.

Fig. 1a visar en representativ gelatinpärla, tagen från en kultur av DMH N49 efter 48 timmar.

Fig. 1b visar en gelatinpärla före inokulation.

Fig. 2 visar tillväxten av två primära cellkulturer, S 157N (kurva 1) och DMH W1073 (kurva 2), på gelatinpärlor i en roterande kolv. De angivna värdena representerar medel- värdet för två oellbestëmningar.

Fig. 3 visar frigivning av mikrobärarbundna celler med användning av trypsin (kurva 1), kollagenas (kurva 2) och dispas (kurva 3).

Exempel 1. Gelatin-mikrobärare En gelatinlösning (10 ml; 20 % (vikt/volym), erhållen genom värmning till SÛOC, dispergerades under kraftig om- rörning i 100 ml av en blandning av toluenzkloroform (73/27, volym/volym) innehållande 2 % (vikt/volym) Arlacel 83 vid rumstemperatur. Efter 10 minuter filtrerades blandningen genom ett nylonnät med en maskvidd 100 um, varefter de upp- samlade mikrobärarna överfördes till aceton. Efter noggrann tvättning med aceton indunstades mikrobärarna till torrhet.

För att erhålla pärlor, som motstår högre temperaturer, ut- fördes förnätning med glutaraldehyd. Torra pärlor (1,5 g) bringßdeß attsvälla på nytt i 100 ml vatten, varefter man tillsatte 20 ml 25,% glutaraldehyd. Efter försiktig omrörning i 30 minuter uppsamlades pärlorna och tvättades med 0,15 M NaCl på ett nylonnät, maskvidd 100 pm. Pärlorna disperge- rades i 0,15 M NaCl och autoklaverades vid 120OC i 15 min.

För att erhålla en lämplig storleksfördelning av pärlorna filtrerades de först genom ett nylonnät, maskvidd 250 um, och pärlorna i filtratet uppsamlades på ett nät, maskvidd 100 um. De»överfördes sedan till 0,15 M NaCl och sterilise- rades genom autoklavering vid 12ÛÛC i 15 minuter. Magnetiska mikrobärare erhölls enligt samma förfarande utom att förutom 9 ml 20 % (vikt/volym) 304-partiklar tillsattes före dispergering i den organiska fasen. gelatinlösning 1 g Fe 10 15 20 25 m "Ms ' Qhar-dödats, och man observerade 456 164 J 1 4 Exempel 2. Test för celltíllväxt Före användning tvättades alla mikrobärare med 10 voly- mer medium. Gelatinmikrobärare (0,25 g våt vikt) blandades med 2,5 X 105 celler (S 157N, S 158A, DMH H49 respektive DMH W1073) i 5 ml medium i 10 ml silikonbehandlàde provrör.

De placerades i en C02-inkubator (5 %) vid 3700 och blandades i en skakapparat. Kulturerna kontrollerades dagligen och mediet ersattes om detta var nödvändigt. Gelatinmikrobär- arna, som innehöll Fe304, undersöktes med DMH w49. Pärlor av Sepharose CL-6B, aktiverade med olika mängder CNBr, place- rades i 20 mm petriskålar och blandades med 2,5 x 105 ÛMP WÄ9 celler i 3 ml medium. Cellerna S157N och DMH W1073 fick växa på gelatinmikrobärare (1 g pärlor, vâtvikt) uppslammade i 50 ml roterande kolvar. Utgångskoncentrationen av celler var 35 000/ml respektive 22 000/ml; 60 % av medíets volym ersattes varje dag. För bestämning av antalet celler uttog man dubbel- prov av 1 ml suspension. Efter tvättning med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2+ och Mg2+ inkuberades pärlorna med trypsin (0,1 % PBS med 0,02 % EDTA och utan Ca2+ i 15 minuter vid 370 och Mg2+) och de frigjorda cellerna räknades i en Bürkerkammare.

Ett alternativt sätt att skörda celler.

Efter 6 dygn delades kulturen av DMH W107} från den roterande kolven i } lika stora delar efter tvättning, såsom beskriven i det föregående. De inkuberades med 3 m1 enzymlös- ning, trypsin beskrivet i det föregående och kollagenas (Z mg/ml) i PBS med C82* men utan Mgz* och dispas (4 mg/ml) i Waymouth-medium vid rumstemperatur. Prov togs i intervall och cellkoncentrationen bestämdes.

Exempel 3. Cellfastsättning och celltillväxt I ett preliminärt försök undersöktes celler på sin förmåga att fästa vid olika mikrobärare (tabell 1). Alla É:celler=kunde fastsättas på de olika Pärlorna. Studier på celltillväxt utfördes därefter med de mest lovande mikro- ybärarna, gelatinpärlor med cellerna S 157N och DMH W1073. En :typisk gelatinpärla med fastsatta celler visas i fig. 1a.

.Såsom framgår av fig. 2 finns ingen antydan om att cellerna god tillväxt..

Vi -w- un.. ' 10 15 20 25 456_ 164 Tabell 1 Fastsättning av primära cellkulturer på olika mikrobärare S 157N S 158A DMH N49 DMH W1073 Gelatin + + + + Gelatin (magnetisk) n.t. n.t. + n.t.

CNBr-aktiverad Sepharose CL-68 n.t. n.t. + n.t. n.t. : ej undersökt I fíg. 3 är resultaten från tre olika enzymatiska för- faranden, som leder till avskiljande från gelatinmikrobärare, givna. Det_framgår, att både kollagenas och dispas ger upp- hov till långt högre total cellkoncentration än vad man er- håller genom den vanligen använda trypsinbehandlingen.

Goda mikrobärare för ytberoende celler innefattar de här beskrivna underlagen, medan inneslutning synes vara det bästa alternativet för immobilisering av suspensionskulturer.

Vidare kan inneslutning i ett tredimensionellt nätverk av ytberoende celler, som är absorberade på sina vanliga bärare, vara fördelaktigt, eftersom detta kan ge skydd mot exempel- vis skjuvkrafter. Det kan även vara så, att ytberoende cel- ler, för vilka hittills ingen lämplig mikrobärare finns, kan acceptera polymernätverket som mottagningsyta eller åtminstone förbli livskraftiga, såsom man har visat med trypan-blå- testet. Även om man hittills inte har observerat någon tyd- lig cellökning för de olika inneslutna typerna av celler, förblir de livskraftiga under betydande tid och tillåter att metaboliska studier, enzymatiska omvandlingar eller synteser utföres.

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 456 164 6 ' PATENTKRAV

1. förfarande för immobilisering av animala celler med efterföljande frigöring av cellerna, k ä n n e t e c k n a t av att ytberoende celler odlas på en av gelatin bestående mikrobärare, som är enzymatiskt nedbrylbar utan väsentlig förstöring av cellytorna, och att därefter mikrobäraren ut- sätts för enzymatisk nedbrytning, så att cellerna frigörs intakta.

2. Förfarande enligt patenlkravet 1, k ä n n e t.e c k- n a t av att mikrobäraren är modifierad med ett förnätnings- medel för-att få högre temperaturbeständighet och mekanisk hållfasthet.

3. Förfarande enligt patentkravel 3, k ä n n e t e c k- n'a t av att förnätningsmedlet är glutaraldehyd.

4. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - }, k ä n n e t e e k n a t_ av att mikrobäraren innehåller partiklar av magnetiskt material..

5. förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k- n a t av att det magnetiska materialet i huvudsak består av Fe3Ü¿.

6. Mikrobärare för immobilisering av animala celler, k ä n n e t e c k n a d av att mikrobäraren utgöres av gela- tin'pâ vilken ytberoende animala celler är adsorberade och mikrobäraren är enzymatiskt nedbrytbar utan väsentlig för- störing av cellytorna och att efter enzymatisk nedbrytning av mikrobäraren de frigivna cellerna är intakta.

7. Mikrobärare enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k- n a d av att den är förnätad med ett förnätningsmedel för att få högre temperaturbeständighet oçh mekanisk hâllfasthet.

8. , Mikrobärare enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k- n a d av att förnätningsmedlet är glutaraldehyd.

9. Mikrobärare enligt något av patentkraven 6 - 8, k å n n e t e c k n a d av att den innehåller partiklar av magnetiskt material.

10. Mikrobärare enligt patentkravet 9, k ä n n e t e c k- n a d av att det magnetiska materialet i huvudsak består av Fešoa. W