DE10307925A1

DE10307925A1 - Träger für eine Zellkultur und Verfahren zur Kultivierung von Zellen

Info

Publication number: DE10307925A1
Application number: DE10307925A
Authority: DE
Inventors: Akira Yamamoto; Ken Sugo
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2003-09-04
Also published as: GB2386905B; GB0304284D0; FR2836923B1; FR2836923A1; US20070202594A1; US20030162287A1; GB2386905A

Abstract

Beschrieben ist ein Träger (1) für eine Zellkultur, der so ausgebildet ist, dass auf seiner Oberfläche Zellen effizient wachsen. Der Träger (1) umfasst einen partikelförmigen Grundkörper (2), der hauptsächlich aus einem Harzmaterial besteht, und eine Deckschicht (3). Die Deckschicht (3) ist aus Teilchen gebildet, die aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung bestehen. Die Teilchen sind jeweils partiell und oberflächennah in den Grundkörper (2) eingebettet, so dass die Deckschicht (3) die Oberfläche des Grundkörpers (2) mit einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung bedeckt. Der Träger (1) ermöglicht es Zellen, an seiner Oberfläche zu haften und darauf zu wachsen. Der Träger (1) kann für Zellkulturen, insbesondere hochdichte, dreidimensionale Zellkulturen eingesetzt werden. Die Deckschicht (3) kann beispielsweise ausgebildet werden, indem poröse Teilchen, die aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen, in Kollision mit der Oberfläche des Grundkörpers (2) gebracht werden.

Description

Die Erfindung betrifft einen Träger für eine Zellkultur und ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen.

In jüngerer Vergangenheit wurde die Zellkulturtechnologie in unterschiedlichen Industrie- und Forschungsbereichen angewendet. Beispiele für die Anwendung dieser Technologie sind sogenannte das Zell/Gewebe-Engineering, Sicherheitsstudien zu Arzneimitteln und die Herstellung von Proteinen, die in der Behandlung und Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden.

Derzeit wird die Kultivierung von Zellen, insbesondere die Kultivierung von verankerungsabhängigen Zellen eher mit hochdichten, dreidimensionalen Zellkulturen (Suspensionskulturen) als mit Plattenkulturen vorgenommen, um große Mengen an verankerungsabhängigen Zellen effizient zu kultivieren. Während eine Plattenkultivierung mittels einer Kulturflasche erfolgt, wird die dreidimensionale Zellkultivierung mittels Trägern vorgenommen, die als Gerüst für das Zellwachstum dienen.

In solch hochdichten, dreidimensionalen Zellkulturen werden Träger verwendet, die aus Polystyren, DEAE-Zellulose, Polyacrylamid oder dergleichen bestehen.

Bei der Verwendung solcher Träger besteht jedoch das Problem, dass die Zellen häufig nicht in der Lage sind, geeignet an den Trägern zu haften, und selbst wenn die Zellen an den Trägern haften, sie nicht in der Lage sind, auf den Trägern zufriedenstellend zu wachsen.

Angesichts des vorstehend erläuterten Problems besteht die Aufgabe der Erfindung darin, einen Träger für eine Zellkultur anzugeben, auf dem die Zellen effizient wachsen.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch den Träger mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung stellt einen Träger für eine Zellkultur bereit, der es möglich macht, dass an seiner Oberfläche Zellen haften und darauf wachsen. Der Träger umfaßt einen partikelförmigen Hauptkörper, der hauptsächlich aus einem Harzmaterial besteht, und eine auf der Oberfläche des Grundkörpers vorgesehene Deckschicht aus Teilchen, die aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung bestehen, wobei diese Teilchen jeweils partiell und oberflächennah in den Grundkörper eingebettet sind.

Ein solcher Träger für eine Zellkultur kann so ausgebildet werden, dass er eine Vielzahl an Eigenschaften hat, die von einem in einer Zellkultur, insbesondere einer Mikroträger-Kultur verwendbaren Träger gefordert werden.

Ist die maximale Länge der Zelle, die in Anhaftung an den für die Zellkultur bestimmten Träger zu bringen ist, mit L1 (µm) und die mittlere Teilchengröße des Trägers mit L2 (µm) festgelegt, so liegt L2/L.1 vorzugsweise im Bereich von 2 bis 100. Dadurch werden die Zellanhaftung und das Zellwachstum vereinfacht.

In einer vorteilhaften Weiterbildung liegt L2 im Bereich von 50 bis 500 µm. Dadurch werden Zellanhaftung und Zellwachstum weiter vereinfacht.

Vorzugsweise liegt die Dichte des Trägers im Bereich von 0,8 bis 1,4 g/cm³, wodurch es möglich ist, die Träger gleichmäßig in einer Kulturlösung zu suspendieren.

Vorzugsweise liegt die mittlere Teilchengröße des Grundkörpers im Bereich von 50 bis 500 µm. Dies macht es einfacher, den für eine Zellkultur bestimmten Träger mit der gewünschten mittleren Teilchengröße zu erhalten.

Vorzugsweise liegt die Dichte des Grundkörpers im Bereich von 0,8 bis 1,4 g/cm³. Dies macht es einfacher, den für eine Zellkultur bestimmten Träger mit der gewünschten Dichte zu erhalten.

Vorzugsweise liegt die mittlere Dicke der Deckschicht im Bereich von 0,1 bis 5 µm, wodurch es möglich wird, den Grundkörper geeignet zu beschichten und einen Träger der gewünschten Dichte zu erhalten.

Vorzugsweise wird die Deckschicht ausgebildet, indem aus der Calciumphosphat- basierten Zusammensetzung bestehende poröse Teilchen mit der Oberfläche des Grundkörpers kollidieren. Dadurch kann die Deckschicht einfach und zuverlässig ausgebildet werden.

in diesem Fall werden die porösen Teilchen vorzugsweise durch Agglomeration von Primärteilchen hergestellt, die aus der Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung bestehen. Indem so hergestellte poröse Teilchen verwendet werden, kann die Oberfläche des Grundkörpers noch zuverlässiger beschichtet werden, da die porösen Teilchen bei der Kollision mit dem Grundkörper wirkungsvoll zertrümmert werden.

Der erfindungsgemäße Träger eignet sich besonders für die Verwendung in einer Mikroträger-Kultivierung, die eine von unterschiedlichen Zellkultivierungstechniken darstellt.

Die zu kultivierende Zelle ist vorzugsweise eine tierische Zelle. Tierische Zellen können auf unterschiedlichen Gebieten angewendet werden. Durch die Verwendung von tierischen Zellen ist eine wirkungsvolle Herstellung von Proteinen mit komplexer Struktur möglich.

Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen gerichtet. Das Verfahren zeichnet sich durch die Verwendung des oben beschriebenen Trägers aus.

Ferner ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen gerichtet, bei dem eine Kulturlösung, in der die oben beschriebenen Träger mit Zellen suspendiert sind, gerührt wird, um die Zellen zu veranlassen, an den Oberflächen der Träger zu haften und auf diesen zu wachsen. Durch die Kultivierung von Zellen unter Rühren einer Kulturlösung ist es möglich, das Zellwachstum zu verbessern. Bei diesem Verfahren liegt die Rührgeschwindigkeit vorzugsweise im Bereich von 5 bis 100 U/min. Durch Einstellen der Rührgeschwindigkeit auf diesen Bereich kann das Zellwachstum weiter verbessert werden.

In diesen Verfahren werden die Träger vor ihrem Gebrauch vorzugsweise sterilisiert, um die Zellen nachteilig beeinflussende Effekte zu verringern oder gar zu beseitigen, die ansonsten infolge des Wachstums von Mikroorganismen und Schimmelpilzen auftreten. Dadurch wird ein wirkungsvolleres Zellwachstum auf den Trägern erreicht.

Vorzugsweise werden die Träger mittels einer Sterilisationslösung sterilisiert. Dadurch ist es möglich, große Mengen an Trägern effizient zu sterilisieren.

Vorzugsweise ist die Sterilisationslösung eine alkalische Lösung, da eine solche Lösung ausgezeichnete Sterilisationseigenschaften hinsichtlich der Abtötung oder zumindest der Eindämmung von Mikroorganismen und Schimmelpilzen hat.

Angesichts des eingangs beschriebenen Problems haben die Erfinder intensive Forschungen angestellt und herausgefunden, dass durch Ausbilden eines Trägers für eine Zellkultur unter Verwendung einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung, die eine hohe Kompatibilität mit einer Vielzahl von Zellarten hat, es den Zellen ermöglicht wird, zufriedenstellend an der Oberfläche des Trägers zu haften, und es ferner möglich ist, dem Träger die Eigenschaft zu verleihen, dass auf ihm Zellen wachsen.

Da eine Calciumphosphat-basierte Zusammensetzung biologisch inaktiv ist, ist auch die Gefahr einer Schädigung der Zellen äußerst gering. Die Erfindung beruht auf den vorstehend erläuterten Zusammenhängen.

Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf Fig. 1, die ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen, für eine Zellkultur bestimmten Trägers zeigt, die Erfindung im Detail beschrieben.

Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Trägers im Querschnitt. Wie in Fig. 1 dargestellt, hat ein Träger 1 einen partikelförmigen Grundkörper 2, der hauptsächlich aus einem Harzmaterial besteht, und eine Deckschicht 3 aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung. Die Deckschicht 3 befindet sich auf der Oberfläche des Grundkörpers 2. Zellen (verankerungsabhängige Zellen) sind in der Lage, in geeigneter Weise an der Oberfläche des Trägers 1 zu haften und auf ihr zu wachsen. Der Träger 1 kann deshalb für eine Zellkultur eingesetzt werden, insbesondere eine hochdichte, dreidimensionale Zellkultur (Suspensionskultur), die eine hohe Zelldichte erreicht.

Beispiele für eine auf eine solch hochdichte, dreidimensionale Zellkultur ausgelegte Technik sind eine Mikroträger-Kultivierung, eine Schleuder-Kultivierung, eine Umlauf-Schüttel-Kultivierung und eine Rotations-Kultivierung. Unter den genannten Techniken kann der Träger 1 besonders vorteilhaft in der Mikroträger- Kultivierung verwendet werden. Durch Anwenden der Technik auf die Mikroträger- Kultivierung können große Mengen an Zellen hocheffizient kultiviert werden.

Die Mikroträger-Kultivierung ist eine Technik, die es Zellen möglich macht, auf der Oberfläche von Mikroträgern zu wachsen, die als Träger für die Zellkultur dienen und in einer Kulturlösung (flüssiges Medium) unter leichtem Rühren suspendiert werden. Ein für eine Mikroträger-Kultur verwendbarer Träger muss deshalb bestimmte Eigenschaften haben, z. B. eine für das Zellwachstum geeignete Größe, eine relative Dichte, die es den Trägern ermöglicht, in der Kulturlösung gleichmäßig suspendiert zu werden, eine hohe Festigkeit, die verhindert, dass der Träger beim Rühren bricht, etc. Der Träger 1 nach der Erfindung erfüllt diese Anforderungen. So haben die Erfinder herausgefunden, dass durch Beschichten der Oberfläche des hauptsächlich aus einem Harzmaterial bestehende Grundkörpers 2 mit einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung dem Träger 1 die oben beschriebenen Eigenschaften einfach und zuverlässig verliehen werden können.

So kann beispielsweise die relative Dichte des Trägers 1 einfach eingestellt werden, indem der Gehalt an Harzmaterial in dem Grundkörper 2 verändert oder eine andere Art von Harzmaterial zur Ausbildung des Grundkörpers 2 verwendet wird.

Da der Grundkörper 2 partikelförmig, vorzugsweise etwa sphärisch ist, ist auch der Träger 1 insgesamt partikelförmig, vorzugsweise sphärisch. So können die Zellen einfach an der Oberfläche des Trägers 1 mit hoher Regelmäßigkeit haften und auf ihr wachsen. Auch kann der Träger 1 gleichmäßig in einer Kulturlösung suspendiert werden.

Die Teilchengröße des Trägers 1 ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Ist jedoch die maximale Länge einer Zelle, die an dem Träger 1 haften soll, mit L1 (µm) und die mittlere Teilchengröße des Trägers 1 mit L2 (µm) festgelegt, so liegt L2/L1 vorzugsweise im Bereich von 2 bis 100, noch besser im Bereich von 5 bis 50. Insbesondere beträgt L2 vorzugsweise 50 bis 500 µm, noch besser 100 bis 300 µm.

Indem die mittlere Teilchengröße des Trägers 1 auf den oben genannten Bereich eingestellt wird, ist die Oberfläche des Trägers 1 relativ zur Größe einer Zelle ausreichend groß, wodurch die Zellen einfach an dem Träger 1 haften und auf diesem wachsen können. Ist in diesem Zusammenhang die mittlere Teilchengröße des Trägers 1 zu klein, so besteht nicht nur die Gefahr, dass die Zellen nicht gut an dem Träger haften, sondern auch, dass es besonders leicht zu einer Agglomeration zwischen den Trägern 1 kommt. Ist dagegen die mittlere Teilchengröße des Trägers 1 zu groß, so nimmt die Absetzgeschwindigheit des Trägers 1 in der Kulturlösung zu, so dass die später genauer spezifizierte Rührgeschwindigkeit während der Zellkultivierung erhöht werden muss. In diesem Fall kommt es zu einer Kollision zwischen den Trägern 1, wodurch die an den Oberflächen der Träger 1 haftenden Zellen möglicherweise geschädigt werden.

Im Hinblick auf eine noch gleichmäßigere Suspension des Trägers 1 in der Kulturlösung sollte die Dichte des Trägers 1 vorzugsweise nahe bei der von Wasser liegen. Vorzugsweise wird die Dichte des Trägers 1 auf etwa 0,8 bis 1,4 g/cm³, noch besser auf etwa 0,9 bis 1,2 g/cm³ eingestellt. Indem die Dichte des Trägers 1 auf diesen Bereich eingestellt wird, kann eine noch gleichmäßigere Suspension des Trägers 1 in der Kulturlösung erreicht werden.

Form, Größe (z. B. mittlere Teilchengröße), physikalische Eigenschaften (z. B. Dichte) und dergleichen können eingestellt werden, indem Form, Größe, physikalische Eigenschaften etc. des Grundkörpers 2 entsprechend gewählt werden.

Wie oben erwähnt, besteht der Grundkörper 2 des Trägers 1 hauptsächlich aus einem Harzmaterial. Dadurch können Form, Größe, physikalische Eigenschaften etc. des Trägers 1 einfach eingestellt werden.

Um den Träger 1 mit einer oben angegeben mittleren Teilchengröße herzustellen, beträgt die mittlere Teilchengröße des Grundkörpers 2 vorzugsweise etwa 50 bis 500 µm, noch besser etwa 100 bis 300 µm.

Um ferner den Träger 1 mit der oben angegebenen Dichte herzustellen, beträgt die Dichte des Grundkörpers 2 vorzugsweise etwa 0,8 bis 1,4 g/cm³, noch besser etwa 0,9 bis 1,2 g/cm³.

Als Harzmaterial für den Grundkörper 2 können verschiedene Arten von thermoplastischen Harzen und verschiedene Arten von wärmehärtbaren Harzen verwendet werden. Beispiele für solch thermoplastische Harze sind Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyren, Polyimid, Acrylharz, thermoplastisches Polyurethan und dergleichen. Beispiele für verwendbare wärmehärtbare Harze sind Epoxyharz, Phenolharz, Melaminharz, Harnstoffharz, ungesättigtes Polyester, Alkydharz, wärmehärtbares Polyurethan, Ebonit und dergleichen. Es kann eines dieser Harze oder eine Mischung zweier oder mehrerer dieser Harze verwendet werden.

Ferner können solche Harzmaterialien mittels organischer Pigmente, anorganischer Pigmente, Säurefarbstoffen, basischer Farbstoffe und dergleichen gefärbt werden.

Wie oben angegeben, ist auf der Oberfläche des Grundkörpers 2 die Deckschicht 3 aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung vorgesehen. Die Deckschicht 3 ist aus Teilchen 31 gebildet, die aus einer Calciumphosphat- basierten Zusammensetzung bestehen. Die Teilchen 31 sind teilweise in die Oberfläche des Basiskörper 2 eingebettet, d. h. in einen Oberflächenbereich, der die Oberfläche selbst und einen an diese anschließenden Bereich umfasst. Dadurch ist die Oberfläche des Grundkörpers 2 mit einer Calciumphosphat-basierten Verbindung bedeckt.

Indem die Deckschicht 3 auf diese Art ausgebildet ist, besteht eine ausgezeichnete Haftung zwischen ihr und dem Grundkörper 2. Dadurch kann verhindert werden, dass sich die Deckschicht 3 von der Oberfläche des Grundkörpers 2 löst. Auf diese Weise erhält man einen Träger, bei dem der Grundkörper 2 zuverlässig mit einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung bedeckt ist.

Die mittlere Dicke der Deckschicht 3 ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Sie liegt jedoch vorzugsweise bei etwa 0,1 bis 5 µm, noch besser bei etwa 0,5 bis 2 µm. Ist die mittlere Dicke der Deckschicht 3 kleiner als der vorstehend genannte untere Grenzwert, so kann es vorkommen, dass ein Teil der Oberfläche des Grundkörpers 2 des Trägers 1 freiliegt. Übersteigt dagegen die mittlere Dicke der Deckschicht 3 den vorstehend genannten oberen Grenzwert, so wird es schwierig, die Dichte des Trägers 1 auf den weiter oben angegebenen Bereich einzustellen.

Die Oberfläche der Deckschicht 3 und damit des Trägers 1 kann dicht oder porös sein.

Die Art von Calciumphosphat-basierter Zusammensetzung, die in der Erfindung verwendet wird, ist nicht auf eine bestimmte Art beschränkt. So können unterschiedliche Arten von Zusammensetzungen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 verwendet werden. Beispiele für solche Zusammensetzungen sind Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂, Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, CaHPO₄ etc. Es kann eine dieser Zusammensetzungen oder auch eine Mischung zweier oder mehrerer dieser Zusammensetzungen verwendet werden.

Von diesen Zusammensetzungen ist eine Calciumphosphat-basierte Zusammensetzung, die Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) als Hauptkomponente enthält, die geeignetste. Da Hydroxylapatit als biokompatibles Material verwendet wird, besteht bei einem Träger, der eine Deckschicht aus Hydroxylapatit hat, nicht die Gefahr, dass er die Zellen schädigt. Außerdem können die Zellen mit hoher Effizienz an einem solchen Träger haften.

Wird Fluorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆F₂), verwendet, so beträgt der prozentuale Anteil an Fluor in der gesamten Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung vorzugsweise 5 Gew.-% oder weniger. Indem der prozentuale Anteil an Fluor in der gesamten Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung auf 5 Gew.-% oder weniger eingestellt wird, kann ein Eluieren von Fluor aus der Deckschicht 3 und damit dem Träger 1 vermieden oder zumindest minimiert werden. Dadurch ist auch die Gefahr, dass der Träger 1 die Zellen schädigt, beseitigt oder zumindest minimiert, wodurch eine Abnahme der Wachstumseffizienz der Zellen vermieden wird.

Es ist darauf hinzuweisen, dass die oben beschriebenen Calciumphosphatbasierten Zusammensetzungen in einem Nassverfahren, einem Trockenverfahren oder dergleichen synthetisiert werden können. Diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Eine in einem solchen Verfahren synthetisierte Calciumphosphat-basierte Zusammensetzung enthält möglicherweise Restsubstanzen, z. B. Rohmaterialien, und/oder Sekundärprodukte, die in der Synthese erzeugt werden.

Die Deckschicht 3 kann beispielsweise ausgebildet werden, indem poröse Teilchen aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung, im Folgenden einfach als poröse Teilchen bezeichnet, in Kollision mit der Oberfläche des Grundkörpers 2 gebracht werden. Durch Anwenden eines solchen Verfahrens kann die Deckschicht 3 einfach und zuverlässig ausgebildet werden.

Indem die porösen Teilchen mit der Oberfläche des Grundkörpers 2 kollidieren, brechen sie in die Teilchen 31, die eine vergleichsweise geringe Teilchengröße haben. Die auf der Oberfläche angeordneten Teilchen 31 werden bei dieser Kollision partiell in den Grundkörper 2 eingebettet. Der Grundkörper 2 fängt die Teilchen 31 in Folge seiner elastischen Kraft gleichsam auf, wodurch die Teilchen 31 an dem Grundkörper 2 festgesetzt werden.

Die porösen Teilchen werden vorzugsweise hergestellt, indem Primärteilchen aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung agglomeriert werden. Mit solch porösen Teilchen kann die Oberfläche des Grundkörpers 2 noch zuverlässiger beschichtet werden, da diese Teilchen bei der Kollision mit dem Grundkörper 2 noch effizienter zertrümmert werden.

Die mittlere Teilchengröße der porösen Teilchen ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Sie liegt jedoch vorzugsweise bei 100 µm oder weniger. Ist die mittlere Teilchengröße der porösen Teilchen größer als 100 µm, so besteht die Gefahr, dass die Geschwindigkeit der porösen Teilchen bei der Kollision mit dem Grundkörper 2 zu gering ist und die Teilchen deshalb nicht in ausreichendem Maße zertrümmert werden.

Die Kollision zwischen dem Grundkörper 2 und den porösen Teilchen kann beispielsweise mittels eines handelsüblichen Hybridisationsgerätes im trockenen Zustand erfolgen. In diesem Fall sind die Bedingungen beispielsweise so eingestellt, dass das Mischverhältnis von Grundkörpern 2 zu porösen Partikeln etwa 400 : 1 bis 50 : 1 bezogen auf das Gewicht beträgt und die Temperatur innerhalb des Hybridisationsgerätes gleich oder kleiner als die Erweichungstemperatur des Harzmaterials ist, das als Hauptkomponente des Basiskörpers 2 verwendet wird (gewöhnlich 80°C oder weniger).

Die porösen Teilchen, die zum Ausbilden der Deckschicht 3 eingesetzt werden, können in bekannter Weise hergestellt werden, beispielsweise nach dem folgenden Verfahren.

Zunächst wird eine Calciumphosphat-basierte Zusammensetzung in einem bekannten Nassverfahren synthetisiert, um so einen Brei (Schlämme, Aufschlämmung) zu erhalten, in dem kristalline Teilchen (Primärteilchen) aus der synthetisierten Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung (Anfangsmaterial) suspendiert sind. Der Brei wird dann direkt sprühgetrocknet, um granulierte Sekundärteilchen zu erhalten. Alternativ kann dem Brei kann auch ein Zusatz wie ein die Viskosität einstellendes Mittel, aus einer organischen Zusammensetzung oder Fasern bestehende Teilchen, die durch Erwärmen verdampft werden können, oder dergleichen zugegeben werden, worauf der Brei dann sprühgetrocknet wird. Nach Bedarf können die so erhaltenen Sekundärteilchen gesintert werden.

Da die so erhaltenen Sekundärteilchen porös sind, können sie direkt zum Ausbilden der Deckschicht 3 eingesetzt werden.

Sollen Teilchen mit höherer Porosität verwendet werden, so können diese Teilchen beispielsweise wie folgt hergestellt werden.

Zunächst wird ein Brei zubereitet, in dem die in oben beschriebener Weise erhaltenen Sekundärteilchen suspendiert sind. Der Brei wird dann durch Nasspressen, durch Trocknen oder dergleichen in eine Blockform gebracht. Um Poren zu erzeugen, kann dem Brei eine organische Zusammensetzung zugegeben werden, die in dem folgenden Sinterprozess verdampft. Anstatt durch die Zugabe einer solchen organischen Zusammensetzung kann der Porendurchmesser auch durch Einstellen einer Prozessbedingung wie der Sintertemperatur oder dergleichen gesteuert werden. Der so erhaltene Block wird dann bei einer Temperatur gesintert, die im Bereich von 400 bis 1300°C liegt. Ist die Sintertemperatur kleiner als 400°C, so verdampft die zugegebene organische Zusammensetzung möglicherweise nicht vollständig, oder der Block wird nicht ausreichend gesintert. Ist dagegen die Sintertemperatur größer als 1300°C, so wird der resultierende Sinterkörper möglicherweise übermäßig dicht, oder die Calciumphosphat-basierte Zusammensetzung wird zersetzt. Anschließend wird der so gesinterte Block gemahlen und dann klassifiziert, um Teilchen der gewünschten Teilchengröße zu erhalten.

Der Porendurchmesser in dem porösen Teilchen kann eingestellt werden, indem beispielsweise die Größe des Primärteilchens, die Viskosität des Breis, die Art des Zusatzes etc. geeignet gewählt wird. Der Porendurchmesser in dem porösen Teilchen beträgt vorzugsweise 500 bis 100 Å. Die spezifische Oberfläche des porösen Teilchens beträgt vorzugsweise 10 m²/g oder mehr. Durch die Verwendung solcher poröser Teilchen zur Herstellung des Trägers 1 wird erreicht, dass die Zellen effizienter an dem Träger 1 haften und auf diesem wachsen.

Die Erfindung ist nicht auf das oben beschriebene Verfahren zum Ausbilden der Deckschicht und damit zum Herstellen des Trägers 1 beschränkt.

Im Folgenden wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Kultivieren von Zellen beschrieben, d. h. ein Verfahren, das die oben beschriebenen Träger 1 einsetzt.

<1> Zunächst werden die Träger 1 sterilisiert, um die Zahl an Mikroorganismen oder Schimmelpilzen, die an den Oberflächen der Träger 1 existieren, zu verringern oder alle Mikroorganismen und Schimmelpilze abzutöten. Indem die Träger 1 vor ihrem Gebrauch sterilisiert werden, wird die Gefahr, dass Mikroorganismen oder Schimmelpilze die Zellen schädigen, herabgesetzt oder gar beseitigt, wodurch die Zellen effizienter auf den Oberflächen des Trägers 1 wachsen können.

Beispiele für eine geeignete Sterilisationstechnik sind eine mit einer Sterilisationslösung arbeitende Sterilisation, Autoklavsterilisation, Gassterilisation, Strahlungssterilisation etc. Unter diesen Techniken ist die mit einer Sterilisationslösung arbeitende Sterilisation die bevorzugte Technik. Bei dieser Technik werden die Träger in eine Sterilisationslösung eingetaucht oder in anderer Weise mit dieser in Kontakt gebracht. Diese Technik erlaubt es, große Mengen an Trägern 1 effizient zu sterilisieren.

Die erfindungsgemäßen Träger 1 werden durch das Eintauchen in eine Sterilisationslösung oder durch einen anders gearteten Kontakt mit dieser in ihrer Qualität nicht beeinträchtigt, da sie jeweils mit der Deckschicht 3 versehen sind, die aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung besteht, die wiederum inert gegenüber unterschiedlichen Sterilisationslösungen ist. Die erfindungsgemäßen Träger 1 sind somit für ein Sterilisationsverfahren geeignet, das mit einer Sterilisationslösung arbeitet.

Als Sterilisationslösung kann eine alkalische Lösung wie eine wässrige Natriumhydroxidlösung, eine wässrige Kaliumhydroxidlösung, eine wässrige Natriumhypochloridlösung oder dergleichen verwendet werden. Solche Sterilisationslösungen haben ausgezeichnete Eigenschaften, was das Abtöten oder zumindest das Dezimieren von Mikroorganismen und Schimmelpilzen betrifft.

An die Sterilisation anschließend werden die Träger 1 gespült, um die Sterilisationslösung von den Oberflächen der Träger 1 zu entfernen.

<2> Anschließend wird eine Kulturlösung zubereitet, in der die in dem Prozess <1> sterilisierten Träger 1 und Zellen, die an den Trägern 1 haften, suspendiert sind.

In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass im Vorfeld in die Zelle ein Shuttle-Vektor eingebracht wird, der ein Protein-codierendes Gen enthält, so dass ein Zielprotein erzeugt werden kann.

Beispiele für eine anwendbare Zelle sind eine tierische Zelle, eine pflanzliche Zelle, ein Bakterium, ein Virus und dergleichen. Bevorzugt ist eine tierische Zelle. Eine tierische Zelle ist auf unterschiedliche Gebiete anwendbar, und die Verwendung von tierischen Zellen ermöglicht es, effizient ein Protein zu erzeugen, das eine komplexe Struktur hat, z. B. Glykoprotein.

Die Art der Kulturlösung kann in Abhängigkeit der verwendeten Zellart geeignet gewählt werden und ist auf keine bestimmte beschränkt. Beispiele für eine solche Kulturlösung sind Dulbecco's MEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DME (Eagle's Basal Medium), MCDB-104-Medium und dergleichen.

Je nach Anforderung können der Kulturlösung auch ein Zusatz wie ein Serum, ein Serumprotein (z. B. Albumin), verschiedene Arten von Vitaminen, Aminosäuren oder Salze zugegeben werden.

Die zubereitete Kulturlösung wird dann gerührt, um dafür zu sorgen, dass die Zellen an die Oberflächen der Träger 1 anhaften. Nach und nach wachsen dann die an den Oberflächen haftenden Zellen auf den Trägern 1.

Auf diese Weise werden die Zellen kultiviert. Das Rühren der Kulturlösung steigert die Effizienz des Zellwachstums in der Zellkultur.

Die Rührgeschwindigkeit für die Kulturlösung ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Sie ist vorzugsweise auf etwa 5 bis 100 U/min. noch besser auf etwa 10 bis 50 U/min eingestellt. Ist die Rührgeschwindigkeit zu gering, so besteht die Gefahr, dass die Träger 1 in Abhängigkeit beispielsweise ihrer Dichte oder ihrer mittleren Teilchengröße in der Kulturlösung nicht gleichmäßig dispergiert sind, was dazu führt, dass die Zellen nicht zufriedenstellend auf den Oberflächen der Träger 1 wachsen. Ist dagegen die Rührgeschwindigkeit zu hoch, so besteht die Gefahr, dass die Träger 1 übermäßig stark gerührt werden, so dass sie heftig miteinander kollidieren. Dadurch können die an den Trägern 1 haftenden Zellen geschädigt werden.

Die Temperatur (Inkubationstemperatur) der Kulturlösung wird in Abhängigkeit der zu kultivierenden Zellart geeignet eingestellt. Sie ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch normalerweise bei etwa 20 bis 40°C, noch besser bei etwa 25 bis 37°C.

Die gewachsenen Zellen erzeugen ein Zielprotein, das in die Kulturlösung freigesetzt oder innerhalb der Zellen angereichert wird.

<3> Anschließend wird das erzeugte Protein gesammelt. Das in die Kulturlösung freigesetzte Protein kann beispielsweise wie folgt gesammelt werden. Zunächst wird das Rühren der Kulturlösung gestoppt, damit die Träger 1 in der Kulturlösung ausfällen. Dann wird die überstehende Flüssigkeit entfernt. Durch eine geeignete, z. B. chromatografische Behandlung der überstehenden Flüssigkeit kann das erzeugte Protein einfach gesammelt werden.

Wie oben beschrieben, ist die Dichte der Träger 1 nahe bei der von Wasser. Die Trägerdichte nimmt infolge der Haftung und des Wachstums der Zellen insgesamt allmählich zu, wodurch die Träger 1 in der Kulturlösung leicht ausgefällt werden können.

Im Folgenden wird die Erfindung an Hand von Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Zunächst wurden 50 g Nylon-Perlen (Grundkörper) mit einer mittleren Teilchengröße von 150 µm und einer Dichte von 1,02 g/cm³ und 0,25 g Hydroxylapatit- Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 10 µm und einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 zubereitet, wobei die zuletzt genannten Teilchen poröse Teilchen waren, die durch die Agglomeration von Primärteilchen gebildet wurden. Die spezifische Oberfläche der Hydroxylapatit-Teilchen betrug 10 m²/g oder mehr. Der Porendurchmesser in den Hydroxylapatit-Teilchen lag bei etwa 500 bis 1000 Å.
Anschließend wurden die Nylon-Perlen und die Hydroxylapatit-Teilchen einem NARA-HYBRIDISATIONS-SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung 5,5 kW und Nennstrom 23 A) zugeführt. Dieses System wurde dann mit 6400 U/min und bei einer Temperatur im Bereich von 32 bis 50°C fünf Minuten lang betrieben, wodurch die Nylon-Perlen mit Hydroxylapatit beschichtet wurden. Auf diese Weise erhielt man mit Hydroxylapatit beschichtete Träger.
Die so erhaltenen Träger hatten einen mittleren Teilchendurchmesser von 151 µm und eine Dichte von 1,03 g/cm³, wobei die mittlere Dichte der Deckschicht aus Hydroxylapatit 1 µm betrug.

Beispiel 2

Zunächst wurden 50 g Polystyren-Perlen (Grundkörper) mit einer mittleren Teilchengröße von 450 µm und einer Dichte von 1,04 g/cm³ sowie 0,2 g Hydroxylapatit-Teilchen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 und einer mittleren Teilchengröße von 100 µm zubereitet, wobei die zuletzt genannten Teilchen poröse Teilchen waren, die durch die Agglomeration von Primärteilchen gebildet wurden. Die spezifische Oberfläche der Hydroxylapatit-Teilchen betrug 10 m²/g oder mehr. Der Porendurchmesser in den Hydroxylapatit-Teilchen betrug etwa 500 bis 1000 Å.
Anschließend wurden die Polystyren-Perlen und die Hydroxylapatit-Teilchen dem NARA-HYBRIDISATIONS-SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung 5,5 kW und Nennstrom 23 A) zugeführt. Dieses System wurde anschließend mit 8000 U/min und bei einer Temperatur im Bereich von 36 bis 64°C fünf Minuten lang betrieben, wodurch die Polystyren-Perlen mit Hydroxylapatit beschichtet wurden. Auf diese Weise erhielt man mit Hydroxylapatit beschichtete Träger.
Die so erhaltenen Träger hatten eine mittleren Teilchengröße von 452 µm und eine Dichte von 1,05 g/cm³, wobei die mittlere Dichte der Hydroxylapatit- Deckschicht 1,5 µm betrug.

Beispiel 3

Zunächst wurden 400 g Polyethylen-Perlen (Grundkörper) mit einer mittleren Teilchengröße von 50 µm und einer Dichte von 0,92 g/cm³ sowie 4 g Calciumphosphat-Teilchen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,8 und einer mittleren Teilchengröße von 80 µm zubereitet, wobei die zuletzt genannten Teilchen poröse Teilchen waren, die durch die Agglomeration von Primärteilchen gebildet wurden. Die spezifische Oberfläche der Calciumphosphat-Teilchen betrug 10 m²/g oder mehr. Der Porendurchmesser in den Calciumphosphat-Teilen betrug etwa 500 bis 1000 Å.
Anschließend wurden die Polyethylen-Perlen und die Calciumphosphat-Teilchen einem Mischer (von NISSHIN ENGINEERING INC., Produktbezeichnung Hi X200) zugeführt. Dieser Mischer wurde dann bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 75°C 20 Minuten lang betrieben, wobei ein Standardimpeller mit 4000 U/min gedreht wurde, wodurch die Polyethylen-Perlen mit Calciumphosphat beschichtet wurden. Auf diese Weise erhielt man mit Calciumphosphat beschichtete Träger.
Die so beschichteten Träger hatten eine mittlere Teilchengröße von 51 µm und eine Dichte von 0,94 g/cm³, wobei die mittlere Dichte der Deckschicht aus Calciumphosphat 1 µm betrug.

Beispiel 4

Zunächst wurden 50 g Polymethylmethacrylat-Perlen (Grundkörper) mit einer mittleren Teilchengröße von 200 µm und einer Dichte von 1,19 g/cm³ sowie 0,2 g Tricalciumphosphat-Teilchen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,5 und einer mittleren Teilchengröße von 20 µm zubereitet, wobei die zuletzt genannten Teilchen poröse Teilchen waren, die durch die Agglomeration von Primärteilchen gebildet wurden. Die spezifische Oberfläche der Tricalciumphosphat-Teilchen betrug 10 m²/g oder mehr. Der Porendurchmesser in den Tricalciumphosphat-Teilchen betrug etwa 500 bis 1000 Å.
Anschließend wurden die Polymethylmethacrylat-Perlen und die Tricalciumphosphat-Teilchen dem NARA-HYBRIDISATIONS-SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung 5,5 kW und Nennstrom 23 A) zugeführt. Dieses System wurde dann mit 8000 U/min und bei einer Temperatur im Bereich von 38 bis 71°C fünf Minuten lang betrieben, wodurch die Polymethylmethacrylat-Perlen mit Tricalciumphosphat beschichtet wurden. Auf diese Weise erhielt man mit Tricalciumphosphat beschichtete Träger.
Die so erhaltenen Träger hatten eine mittlere Teilchengröße von 204 µm und eine Dichte von 1,2 g/cm³, wobei die mittlere Dicke der Deckschicht aus Tricalciumphosphat 3 µm betrug.

Vergleichsbeispiel

Als Vergleichsbeispiel wurden Nylon-Perlen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 150 µm und einer Dichte von 1,02 g/cm³ als Träger zubereitet.

Bewertung

Vor einem Bewertungstest I und einem Bewertungstest II wurden die in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Träger einer Autoklavsterilisation, einer Gassterilisation mit Ethylenoxid, einer Strahlungssterilisation bzw. einer Sterilisation mittels einer wässrigen Natriumhydroxidlösung (alkalische Lösung) unterzogen. Die in dem Vergleichsbeispiel hergestellten Träger wurden einer Gassterilisation mit Ethylenoxid unterzogen.

Bewertungstest I

Die in den Beispielen 1 bis 4 und in dem Vergleichsbeispiel hergestellten Träger wurden einem Bewertungstest I unterzogen, der nachfolgend beschrieben wird.
1 g Träger und 10 ml Suspension, die 1 × 10⁵ menschliche Knochensarkom- abgeleitete Zellen (Saos2) je Milliliter enthielt, wurden einer Menge von 100 ml Dulbecco's MEM (Kulturlösung) zugegeben.
In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass dem Dulbecco's MEM vorher 10 Vol.-% fötales Rinderserum zugegeben worden war.
Menschliche Knochensarkom-abgeleitete Zellen (Saos2) wurden kultiviert, wobei das Dulbecco's MEM mit 30 U/min bei einer Temperatur von 37°C drei Stunden lang gerührt wurde. Es ist darauf hinzuweisen, dass die maximale Länge einer menschlichen Knochensarkom-abgeleiteten Zelle etwa 20 µm beträgt.
Alle 60 Minuten wurde eine vorbestimmte Menge an Kulturlösung als Probe entnommen, bis seit Beginn der Kultivierung, d. h. seit Beginn des Rührprozesses, 180 Minuten verstrichen waren, um die an den Oberflächen der Träger haftenden Zellen zu zählen.
Das Zählen der Zellen erfolgte nach einem Färbungsverfahren, in dem Trypsin- behandelten Zellen Trypanblau zugegeben wurde. Das Ergebnis dieser Zählung ist in Tabelle 1 angegeben.

Bewertungstest II

Für die in den Beispielen 1 bis 4 und in dem Vergleichsbeispiel hergestellten Träger wurde ein Bewertungstest II durchgeführt, der nachfolgend beschrieben wird.
1 g Träger und 10 ml Suspension, die 1 × 10⁵ Mauscalvaria-abgeleitete Zellen (MC3T3E1) je Milliliter enthielt, wurden einer Menge von 100 ml Dulbecco's MEM (Kulturlösung) zugegeben.
Vorher war dem Dulbecco's MEM 10 Vol.-% fötales Rinderserum zugegeben worden.
Es wurden Mauscalvaria-abgeleitete Zellen (MC3T3E1) kultiviert, wobei Dulbecco's MEM mit 30 U/min bei einer Temperatur von 37°C drei Stunden lang gerührt wurde. Es ist darauf hinzuweisen, dass die maximale Länge einer Mauscalvaria- abgeleiteten Zelle etwa 20 µm beträgt.
Alle 60 Minuten wurde eine vorbestimmte Menge an Kulturlösung als Probe entnommen, bis 180 Minuten nach Beginn der Kultivierung und damit nach Beginn des Rührprozesses verstrichen waren, um die an den Oberflächen der Träger haftenden Zellen zu zählen.
Das Zählen der Zellen erfolgte nach einem Färbungsverfahren, in dem Trypsinbehandelten Zellen Trypanblau zugegeben wurde. Das Ergebnis der Zählung ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, war in beiden Bewertungstests I und II für die Kultur der menschlichen Knochensarkom-abgeleiteten Zellen und die Kultur der Mauscalvariaabgeleiteten Zellen die Zahl an Zellen, die an den in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten erfindungsgemäßen Trägern hafteten, für jede Zellzählung nach Ablauf von 60 Minuten seit Beginn der Kultivierung in absoluten Zahlen größer als die Zahl an Zellen, die an den in dem Vergleichsbeispiel gefertigten Trägern hafteten. Dies bedeutet, dass die in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Träger hinsichtlich der Zellanhaftung besonders geeignet waren. Auch nach Ablauf von 120 und 180 Minuten seit Beginn der Kultivierung war die Zahl an Zellen, die an den in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten erfindungsgemäßen Trägern hafteten, jeweils größer als die Zahl an Zellen, die an den in dem Vergleichsbeispiel gefertigten Trägern hafteten. Außerdem wuchsen die an den in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Trägern haftenden Zellen stärker als die an den in dem Vergleichsbeispiel hergestellten Trägern haftenden Zellen.
Dadurch konnte bestätigt werden, dass die Zellen besonders gut an den in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten erfindungsgemäßen Trägern hafteten und auf diesen wuchsen, und zwar ungeachtet der Zellart. Dagegen zeigten die in dem Vergleichsbeispiel hergestellten Träger eine äußerst schwache Zellanhaftung und ein signifikant schlechteres Zellwachstum.
Wie aus obiger Beschreibung hervorgeht, stellt die Erfindung einen Träger bereit, der eine Vielzahl an Eigenschaften hat, die für einen für eine Zellkultur, insbesondere eine Mikroträger-Kultur bestimmten Träger erforderlich sind. Außerdem kann der erfindungsgemäße Träger zu niedrigen Kosten hergestellt werden.

Claims

1. Träger für eine Zellkultur, der so ausgebildet ist, dass auf seiner Oberfläche Zeilen haften und wachsen, gekennzeichnet durch
einen partikelförmigen Grundkörper, der hauptsächlich aus einem Harzmaterial besteht, und
einer auf der Oberfläche des Grundkörpers vorgesehenen Deckschicht aus Teilchen, die aus einer Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung bestehen und jeweils partiell und oberflächennah in den Grundkörper eingebettet sind.

2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn L1 die maximale Länge der für die Zellkultur vorgesehenen und zur Anhaftung an den Träger bestimmten Zelle in µm und L2 die mittlere Teilchengröße des Trägers in µm ist, L2/L1 in einem Bereich von 2 bis 100 liegt.

3. Träger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass L2 in einem Bereich von 50 bis 500 µm liegt.

4. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass seine Dichte im Bereich von 0,8 bis 1,4 g/cm³ liegt.

5. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Teilchengröße des Grundkörpers im Bereich von 50 bis 500 µm liegt.

6. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte des Grundkörpers im Bereich von 0,8 bis 1,4 g/cm³ liegt.

7. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Dicke der Deckschicht im Bereich von 0,1 bis 5 µm liegt.

8. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht durch Kollision poröser, aus der Calciumphosphatbasierten Zusammensetzung bestehender Teilchen mit der Oberfläche des Grundkörpers gebildet ist.

9. Träger nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die porösen Teilchen durch Agglomeration von aus der Calciumphosphat-basierten Zusammensetzung bestehenden Teilchen hergestellt sind.

10. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er in einer Mikroträger-Kultur verwendbar ist.

11. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine tierische Zelle ist.

12. Verfahren zur Kultivierung von Zellen, gekennzeichnet durch die Verwendung von Trägern, die einen Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfassen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger vor der Zellkultivierung sterilisiert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger mittels einer Sterilisationslösung sterilisiert werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilisationslösung eine alkalische Lösung ist.

16. Verfahren zum Kultivieren von Zellen, gekennzeichnet durch Rühren einer Kulturlösung, in der Träger, die einen Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfassen, suspendiert sind, um das Anhaften der Zellen an den Oberflächen der Träger und damit das Zellwachstum auf diesen Oberflächen zu veranlassen.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Rührgeschwindigkeit im Bereich von 5 bis 100 U/min liegt.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger vor der Zellkultivierung sterilisiert werden.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger mittels einer Sterilisationslösung sterilisiert werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilisationslösung eine alkalische Lösung ist.