DE3031161C2

DE3031161C2 -

Info

Publication number: DE3031161C2
Application number: DE3031161A
Authority: DE
Inventors: Roger Pavillons-Sous-Bois Fr Deraedt; Vesperto Maisons-Alfort Fr Torelli; Jean Paris Fr Vacher
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1979-08-17
Filing date: 1980-08-18
Publication date: 1988-09-29
Also published as: HU180376B; FI68844C; FI68844B; GB2057448B; SE8005309L; IE801737L; FR2463777B1; ATA420880A; FR2463777A1; GB2057448A; AU529528B2; IT8049507A0; FI802462A7; NL8004600A; CA1140111A; BE884794A; JPS5659800A; DE3031161A1; PT71700B; AT373902B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Patent ansprüche, darunter das (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]- 5α-pregnan-20-ol und seine Additionssalze mit organischen oder Mineralsäuren.

Unter Additionssalzen mit Säuren kann man die Salze nennen, die gebildet werden mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasser stoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefel säure, Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Benzoesäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Citronen säure, Oxalsäure, Glyoxylsäure, Asparaginsäure, Alkansul fonsäuren, wie die Methansulfonsäure, und Arylsulfonsäuren, wie die Benzolsulfonsäure.

Das (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5α-pregnan-20-ol ist ein Produkt, das bisher nicht beschrieben worden ist. Das (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5a-pregnan-20-ol sowie dessen Additionssalze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren be sitzen interessante pharmakologische Eigenschaften, wie es die Ergebnisse der nachstehend in dem experimentellen Teil angegebenen Tests zeigen; sie stimulieren insbesondere die Abwehrkräfte des Organismus, wobei sie vor allem die Bil dung von IgE (Immunoglobuline E) potenzieren.

Das (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5α-pregnan-20-ol sowie dessen Additionssalze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren können somit für die Behandlung von autoimmunen Krankheiten verwendet werden, die von einem Mangel an bestimmten Lympho cyten herrühren, ob es sich um nicht-spezifische Krankheiten des Bindegewebes eines gegebenen Organs handelt, wie z. B. die rheumatische Arthritis oder der systemische ery thematöse Lupus, oder ob es sich um spezifische Krankheiten eines Organs handelt, wie die Thyreoiditis, der Pymphygus oder die hämolytische Anämie.

Die erfindungsgemäßen Produkte können somit als Behandlungs adjuvans bei der antikanzerösen Antibiotherapie und Chemo therapie verwendet werden.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten erfindungs gemäß das (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5α-pregnan-20-ol sowie dessen Additionssalze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren.

Diese Zusammensetzungen können insbesondere auf bukkalem, rektalem und parenteralem Weg verabreicht werden.

Sie können fest oder flüssig sein und in üblicher Weise in der Humanmedizin verwendeten pharmazeutischen Formen vorlie gen, wie z. B. einfachen oder dragierten Tabletten, Gel kapseln, Granulaten, Suppositorien und injizierbaren Präpara ten. Sie werden nach üblichen Methoden hergestellt.

Der oder die Wirkstoffe können hierbei üblicherweise in der artigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten Ex zipienten einverleibt werden, wie Talk, Gummiarabikum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nicht-wäßrige Träger, Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole, verschie dene Netz-, Dispergier- oder Emulgiermittel und Konservie rungsmittel.

Die Verabreichungsdosis variiert entsprechend der zu behan delnden Erkrankung, dem jeweiligen Patienten, dem Verab reichungsweg und dem in Betracht gezogenen Produkt. Sie kann z. B. zwischen 1 und 100 mg/Tag bei oraler Verabreichung an den Erwachsenen betragen.

Als Gruppe R in dem anspruchsgemäßen Herstellungsverfahren kann man z. B. die Carbobenzyloxygruppe oder die Carbo-tert.-butyloxygruppe verwenden. Die Erfindung be trifft insbesondere ein Verfahren, das dadurch gekennzeich net ist, daß die Schutzgruppe R der Carbobenzyloxyrest ist.

Das anspruchsgemäße Herstellungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zwischen dem (20S)-3α-Amino-5α-pregnan-20-ol und der Aminosäure der Formel II in Gegenwart eines Kondensationsmittels statt findet.

Das Kondensationsmittel hat natürlich den Zweck, die Säure funktion der Aminosäure der Formel II

zu aktivieren. Als Kondensationsmittel kann man ein Carbo diimid der Formel

R₁ - N = C = N - R₂

verwenden, worin R₁ und R₂, die gleich oder verschieden sein können, einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls Träger eines Dialkylaminorestes, darstellen, oder R₁ und R₂ einen Cycloalkylrest bedeuten.

Unter diesen letzteren kann man z. B. das Dicyclohexyl carbodiimid oder das 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbo diimid nennen.

Man kann auch ein Alkylchlorformiat, wie z. B. das Methyl- oder Äthylchlorformiat, verwenden. Man kann auch ein Alkyl pyrophosphit, wie z. B. das Äthylpyrophosphit, einsetzen.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren, das da durch gekennzeichnet ist, daß man als Kondensationsmittel das 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid verwendet.

Als Mittel für die Abspaltung verwendet man vorzugsweise Wasserstoff in Gegenwart von Palladium.

Die Salzbildung findet nach klassischen Verfahren, z. B. durch Zugabe von Säuren, statt.

Das verwendete Ausgangsprodukt, nämlich das (20S)-3α-Amino- 5a-pregnan-20-ol, ist ein bekanntes Produkt (siehe Merck Index, 9. Ausgabe, Rubrik 4144).

Wie sich durch Versuche zeigen läßt, besitzen anspruchsgemäße Verbindungen eine überraschende überlegene Wirkung gegenüber dem 3α-N-(2-Aminoethanoyl)-amino-5α-pregnan-20-on ("LH 1") dessen immunostimulierende Wirkung in Chem. Abstract 89, 105731e, beschrieben ist.

In den nachstehend beschriebenen Versuchen stellt das Pro dukt A die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Ver bindung (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5α-pregnan-20-ol dar. Das Produkt X ist das in Chem. Abstract 89, 105731e beschriebene 3a-N-(2-Aminoethanoyl)-amino-5α-pregnan-20-on.

1) Rosettentest mit roten Blutkörperchen vom Schaf

Dieser Test ist beispielsweise in der DE-OS 31 46 117 (der gleichen Anmelderin) auf Seite 31 beschrieben. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

ProduktDosis je Tier in mg/kg p. o.

A2 Xinaktiv bei 5

2) Adjuvans des anaphylaktischen Schocks

Dieser Test wird in derselben DE-OS 31 46 117, Seite 30/31 beschrieben. Dabei erhält man folgende Ergebnisse:

ProduktDosis je Tier in mg/kg

A0,5 Xinaktiv bei 5

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5α-pregnan-20-ol (Hydrochlorid und Base) Stufe A: (20S)-3α-[(Benzyloxycarbonylaminoacetyl)-amino]- 5α-pregnan-20-ol

Man löst 5,2 g (20S)-3α-Amino-5a-pregnan-20-ol und 5,2 g N-Carbobenzyloxyglycin in 150 cm³ Chloroform und 15 cm³ Pyridin. Man rührt die Lösung in einem Eisbad unter Stick stoff und gibt 3,9 g 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid-hydrochlorid zu. Nach 1 h gibt man erneut 310 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid zu, beläßt 1/2 h unter Rühren in dem Eisbad und verdünnt darauf mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung. Man filtriert Unlöslichkeiten ab, filtriert getrennt mit einer Natriumcarbonatlösung, mit Wasser, mit normaler Chlor wasserstoffsäure und mit Wasser und trocknet anschließend bei 50°C. Man erhält so 5,1 g unlösliches Material. Die Chloroformphase wird vom Filtrat abgetrennt, dann mit Wasser, mit normaler Chlorwasserstoffsäure und mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trockene destilliert. Man erhält 4,6 g eines zur Hälfte kristallisierten Rückstands. Die Unlös lichkeiten (5,1 g) und der trockene Extrakt (4,6 g) werden vereinigt und unter Rückfluß von 25 cm³ Methanol angeteigt. Man kühlt, saugt ab, wäscht mit Methanol und trocknet bei 50°C. Man erhält so 7,05 g des gewünschten Produktes, Fp.= 250 bis 252°C, das man als solches bei der folgenden Stufe verwendet. Eine analytische Probe, Fp.=254°C, wird durch Umkristallisieren in Essigsäure erhalten

Stufe B: (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5α-pregnan-20-ol- hydrochlorid

Man löst in der Wärme 7 g des in Stufe A erhaltenen Produkts in 150 cm³ Essigsäure. Man rührt die erhaltene Lösung unter Einleiten von Stickstoff, läßt auf 45°C abkühlen und gibt 700 mg Palladium in einer Menge von 10% auf Aktivkohle zu. Man ersetzt das Einleiten von Stickstoff durch ein schwaches Einleiten von Wasserstoff. Nach 1 h ersetzt man den Wasser stoffstrom durch einen Stickstoffstrom und setzt das Ein leiten 15 min fort. Man filtriert dann den Katalysator ab und spült mit Essigsäure. Man dampft das Filtrat zur Trockene ein. Man löst das kristallisierte Produkt in 50 cm³ Methanol. Durch Zugabe von 4 cm³ einer 5,5N Chlorwasserstoffsäurelösung in Äthanol fällt das gewünschte Produkt aus.

Man verdünnt die Suspension mit 50 cm³ absolutem Äthanol, engt zur Hälfte ein und beläßt eine Nacht bei +5°C. Man saugt ab, wäscht mit Äthanol und trocknet. Man erhält 4,43 g des gewünschten Produkts.

Das mit 0,5 cm³ einer 5,5N Chlorwasserstoffsäurelösung in Äthanol versetzte und auf ein geringes Volumen eingeengte Filtrat ergibt eine zweite Fraktion von 0,35 g an gewünschtem Produkt. Man erhält das gewünschte Produkt in reiner Form, Fp.=271°C nach Umkristallisieren in 80%igem Äthanol; [α] = +19,5°±1° (1%, Pyridin in 10% Wasser).

Stufe C: Herstellung der Base

Man verwendet das in Stufe B erhaltene, rohe Hydrochlorid. Das rohe Hydrochlorid wird in warmem Wasser gelöst. Durch Zugabe eines Überschusses an 2N Natronlauge fällt die Base aus. Man saugt sie ab, wäscht sie mit Wasser, trocknet sie und kristallisiert sie in Methanol um.

Man erhält das gewünschte Produkt in reiner Form, Fp.=296°C; [α] = +25°±1° (1%, Pyridin in 10% Wasser).

Beispiel 2 Pharmakologische Untersuchung des Produktes von Beispiel 1 in Form seines Hydrochlorids, das nachstehend als "Produkt A" bezeichnet wird, im Vergleich zu Levamisol

Das Levamisol ist ein gut bekanntes Produkt (Merck Index, 9. Ausgabe, Rubrik 8949), das immunoregulatorische Eigen schaften besitzt [vgl. Cancer. Research 35, 927 (1975) oder New England Journal of Medicine 289, 1148 (1973)].

A - Potenzierung der IgE-Bildung

Man immunisiert weibliche Mäuse mit einem Gewicht von 28 bis 30 g auf subkutanem Weg mit mit Aluminiumoxid vermisch tem Ovalbumin an den Tagen 0 und 14 und entnimmt ihnen am Tag 21 Serum für die Bestimmung der gebildeten Antikörper IgE. Die jeweiligen injizierten Mengen an Antigen (Ovalbumin) und Adjuvans (Aluminiumoxid) werden derart ausgewählt, daß die Bildung von Antikörpern minimal ist.

Die zu untersuchenden Produkte werden auf subkutanem Weg 3 h vor der ersten Immunisierung verabreicht.

Die Dosierung der IgE wird mit Hilfe des Tests der passiven kutanen Anaphylaxie durchgeführt. Dieser Test besteht darin, bei einem Tier durch intravenöse Verabreichung des Antigens eine Antigen-Antikörper-Reaktion an einer kutanen Stelle hervorzurufen, an der zuvor die bei einem anderen Tier mit dem gleichen Antigen hergestellten Antikörper injiziert worden sind. Diese Reaktion wird mit einem gleichzeitig mit dem Antigen injizierten Farbstoff sichtbar gemacht. Es tritt an der Stelle der Injektion der Antikörper ein gefärbter Fleck auf, ein Zeichen für das Bersten sensibilisierter Zellen und die Erhöhung der hieraus resultierenden kapillaren Permeabilität. Man sucht die größte Verdünnung des Serums, die einen Flecken mit einem Durchmesser von 11 bis 13 mm bei sämtlichen Tieren ergibt. Die adäquate Serumverdünnung wird auf intradermischem Weg in einem Volumen von 0,1 ml an männliche Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 250 g in den Rückenbereich verabreicht. 48 h später er halten die Tiere auf venösem Wege 0,5 ml einer Lösung von 0,5% Ovalbumin und 1% Evansblau in isotonischer Natriumchlo ridlösung. 30 min nach dieser Injektion werden sie durch Ausblutenlassen getötet und es wird der Durchmesser des blauen Flecks auf der gewendeten Haut gemessen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:

Produkt A 0,5 mg/kg auf subkutanem Weg. Levamisol20,0 mg/kg auf subkutanem Weg.

Schlußfolgerung: Bei diesem Test ist das Produkt A wesent lich stärker immunostimulierend als das Levamisol.

B - Chronische Arthritis mit dem Adjuvans

Die Injektion des Adjuvans vom Freund-Typ (Mycobacterium butyricum in einer Menge von 6 mg/ml in Bayol 55) in eine Hinterpfote ruft bei der Ratte eine primäre inflammatorische Läsion hervor und nach einer Latenzdauer von 13 bis 15 Tagen die Auslösung sekundärer Inflammationen, die die nicht injizierte Hinterpfote sowie die Vorderpfoten, den Schwanz und die Ohren betreffen.

Diese sekundäre Arthritis ist vergleichbar mit einer rheuma tischen Arthritis beim Menschen, wenn man die Intervention von auto-immunitären Reaktionen unter ihren bestimmenden Faktoren berücksichtigt.

Männliche Ratten mit einem Alter von 42 bis 50 Tagen erhalten eine intraplantare Injektion von 0,10 ml Freund-Adjuvans. Die Behandlung beginnt an dem Tag der Injektion des Adjuvans und dauert bis zur Tötung der Tiere am 17. Tag.

Die Bewertungskriterien für die Aktivität der Substanzen sind im allgemeinen:
die Gewichtszunahme der Tiere, die immer ziemlich proportional zur Intensität der Arthritis gehemmt ist;
die Volumenvergrößerungen der injizierten und nicht injizierten Hinterpfoten im Verhältnis zum Durchschnittsvolumen der entsprechenden Pfoten der normalen Vergleichstiere;
die Arthritis der Vorderpfoten, deren äußerst kleines Volumen sich nicht für eine plethysmometrische Messung eignet und somit subjektiv von 0 bis 3 entsprechend der In tensität der Inflammation bewertet wird;
die Arthritis der Ohren und des Schwanzes, mit 1 oder 0 entsprechend der Anwesenheit oder Abwesenheit von Knötchen bewertet.

Bei der vorliegenden Untersuchung wurde vor allem die Wirkung im Hinblick auf sekundäre Inflammationen, d. h. auf die Arthritis der nicht-injizierten Hinterpfote, die Arthriten der Vorderpfoten und die Inflammationen der Ohren und des Schwanzes beobachtet.

Man suchte die aktive Dosis, die die sekundären Inflammationen zu zumindest 50% vermindert. Die Ergebnisse sind wie folgt:

Produkt Aaktive Dosis 1 mg/kg (subkutaner Weg) Levamisolaktive Dosis 50 mg/kg (bukkaler Weg).

Schlußfolgerung: Das Produkt A ist somit im Hinblick auf die sekundären Phänomene der Arthritis durch das Adjuvans sehr aktiv, während eine sehr hohe subtoxische Dosis an Levamisol zur Erzielung eines vergleichbaren Effekts erforderlich ist.

Beispiel 3 Beispiel für pharmazeutische Zusammensetzungen

Man stellte Tabletten der folgenden Formulierung her:

Produkt von Beispiel 1 (Hydrochlorid)10 mg Exzipient (Talk, Stärke, Magnesiumstearat) quantum satis für1 Tablette.

Claims

1. (20S)-3α-[(Aminoacetyl)-amino]-5α-pregnan- 20-ol der Formel I und dessen Additionssalze mit organischen oder Mineralsäuren.

2. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend als Wirkstoff zumindest eine Verbindung gemäß Anspruch 1.

3. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen ge mäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Funtumidin oder (20S)-3α-Amino-5α-pregnan-20-ol mit einer Aminosäure der Formel II worin R eine durch Hydrogenolyse abspaltbare Schutzgruppe bedeutet, in Gegenwart eines Kondensationsmittels umsetzt, von der erhaltenen Verbindung der Formel III die Gruppe R abspaltet, und die erhaltene Verbindung der Formel I gewünschtenfalls mit einer Säure in das Salz umwandelt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Schutzgruppe R den Carbobenzyloxy-Rest darstellt und mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium abgespalten wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Kondensationsmittel 1-Äthyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid einsetzt.