DE3015030A1 - Neue biologisch aktive substanz, ihre herstellung und die sie enthaltenden arzneimittel - Google Patents

Description

SC 4669

10/We -χ-

RHONE-POULENC INDUSTRIES, Paris

Neue biologisch aktive Substanz, ihre Herstellung und die sie enthaltenden Arzneimittel

Die Erfindung betrifft eine neue biologisch aktive Substanz, welche mit der Nummer 41 200 RP bezeichnet wird, die aus Zellen erhalten wird, die aus der Kultur eines neuen Mikroorganismus isoliert sind, der mit der Bezeichnung Micrococcus sedogenes M 78 benannt wird, das Herstellungsverfahren und die diese enthaltenden Arzneimittel.

Die Substanz 41 2 00 RP gemäß der Erfindung, welche nach der Behandlung der aus dem Micrococcus sedogenes Starra.> M 7 8 isolierten Zellen mit Lysozym, Ausfällung der Verunreinigungen mit Calciumchlorid, Entfernung der Proteine durch Behandlung mit Phenol und anschließend Fraktionierung auf dem Molekularsieb erhalten wird, besteht im wesentlichen aus 11 bis 18 % Aminosäuren (wovon 5,5 bis 7,5 % Alanin sind), 10 bis 17 % Glucose, 10 bis 17 % Aminozucker und weniger als 5 % Nucleinsäuren.

Die Substanz 41 200 RP, welche im allgemeinen mit einem Wassergehalt zwischen 2 und 6 % isoliert wird, ist ein weißes, wasserlösliches, amorphes Pulver, enthaltend Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Chlor, Natrium und Calcium. Seine Elementarzusammensetzung (berechnet auf Trockensubstanz) ist in etwei:

% C = 45 - 47, %H = 7 ,1 - 7,6, % 0 = 35 - 38 (durch Differenz) % N = 4,0 - 5,1) % P = 0,9 - 1,2; % Cl = 0,1 - 0,4,

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BAD ORIGINAL

% S unter 0,5₇ % Na = 2,0 - 3,0., % Ca = 0,9 - 1,9.

Das Verfahren aur Herstellung der Substanz 41200 RP besteht im wesentlichen darin, dass eine wäßrige Suspension von Zellen (welche vorzugsweise getrocknet und gegebenenfalls bei einem pH von etwa 3 und bei einer Temperatur von etwa 120⁰C während 30bis 60 Minuten behandelt worden waren), welche aus Kulturen von Micrococcus sedogenes Stamm M 78 isoliert sind, unter bestimmten und weiter unten präzisierten Bedingungen hinsichtlich Temperatur, pH-Wert und Dauer mit Lysozym behandelt werden, daß das Rohprodukt aus der flüssigen Phase der erhaltenen Suspension in Salzform isoliert und daß es gereinigt wird durch fortschreitende Ausfällung der Verunreinigungen mittels Calciumchlorid, anschließend durch Behandlung mit Phenol zur Entfernung von im wesentlichen des größten Teils der Proteine und schließlich durch Fraktionierung auf einem Molekularsieb; wobei die Fraktion mit hohem Mb lekulargewicht, d.h. zwischen 5 χ 1O⁵ und 5 χ 10⁶ gesammelt wird.

Im allgemeinen wird das Lysozym in einer Menge von 2 bis 2 0 mg pro g eingesetzter Trockenzellen verwendet. Die Behandlung erfolgt bei einem konstanten pH-Wert zwischen 6,5 und 8, vorzugsweise bei etwa 7, während 1 bis 3 Stunden, vorzugsweise während 2 Stunden und bei einer Temperatur von etwa 37^gc, wobei energisch gerührt wird.

Die flüssige Phase der erhaltenen Suspension wird im allgemeinen durch Zentrifugieren abgetrennt und die in ihr befindlichen Produkte mit geringem Molekulargewicht werden entweder durch Dialyse durch eine Membran geeigneter Porosität oder durch Ultrafiltration entfernt. Die so erhaltene Rohsubstanz kann in Salzform durch Lyophilisieren aus ihrer Lösung isoliert werden. In diesem Stadium der Herstellung besteht die erhaltene Substanz im wesentlichen aus Proteinen, Nucleinsäuren, Aminozuckern und

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weniger als 5 % Polysacchariden und ihre Elementarzusammensetzung

ist etwa die folgende:

% C = 41,5 - 44,9, % H = 5,6 - 5,9, %O = 29,4 - 32,2,

% N = 11,2 - 12,6, % P = 3,2 - 4,4, %S = 0,1 - 0,5, %C1=O,2 - 0,4j

% schwefelhaltiger Rückstand = 11,4 - 15,4·.

Die rohe Substanz wird gereinigt in wäßriger Lösung bei einer Konzentration von zwischen 10 und 40 g/l, vorzugsweise 20 g/l, durch Zugabe einer konzentrierten Calciumchloridlösung, bis zur Erzielung einer Endkonzentration an Calicumchlorid zwischen 5 und 50 g/l, vorzugsweise 10 g/1. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, die erhaltene Lösung wird dialysiert (oder ultrafiltriert) und dann mit einem Ionenaustauschharz mit SuIfonsäurefunktion in Alkaliform behandelt. Die erhaltene Substanz, welche mit Nr. 32 919 RP bezeichnet wird, kann aus ihrer wäßrigen Lösung durch Lyophilisieren abgetrennt werden.

Die Substanz 32 919 RP" besteht im wesentlichen aus 24 bis 33 % Aminosäuren, 26 bis 33 % Nucleinsäuren, 11 bis 17,5 % Aminoζuckern (Bestimmung nach der Methode Elson-Morgan und die Ergebnisse sind ausgedrückt in Glucosamin) und 2,8 bis 4,3 % Polysacchariden und ihre Zusammensetzung ist in etwa:

% C = 44 - 48, % H = 5,2 - 6,7, % O = 29 - 33^ %N = 10,0 - 1 U6> % P = 2,3 - 3,7, % S unter 0,5, % Na = 3,0 - 3,8, % Ca = 0,15-0,50

Die Substanz 32 919 RP wird von neuem gereinigt, indem in folgender Weise vorgegangen wird:

Eine wäßrige Lösung der Substanz 32 919 RP, deren Konzentration an Substanz 32 919 RP zwischen 10 und 50 g/l, vorzugsweise 25 g/l beträgt, wird mit einem gleichen Volumen eines Gemisches aus Phenol und Wasser (enthaltend vorzugsweise 10 % Wasser) während 15 bis 60 Minuten,vorzugsweise 30 Minuten, bei einer Temperatur von etwa 65°C gewaschen. Nach dem Abkühlen wird die wäßrige .Phase abgetrennt und mit einem chlorierten Lösungsmittel, vorzugsweise

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Chloroform bis zur Entfernung des gelösten Phenols gewaschen, dann wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die wäßrige, die aktive Substanz enthaltende Phase wird lyophilisiert.

Das so erhaltene Produkt wird in Wasser, das mittels eines Alkaliacetats, wie Natriumacetat, auf pH 7 gepuffert ist, gelöst· Die so erhaltene Lösung wird einer Fraktionierung auf dem Molekularsieb mit hoher Porosität, wie beispielsweise "Ultragel· Ac A 22". von Industrie Biologique Francaise, "Sepharose 4 B", oder "Sepharose CL 4 B" von Societe Pharmacia unterwerfen, wobei die Fraktion mit hohem Molekulargewicht gesammelt wird. Die Substanz 41 200 RP wird dann aus ihrer Lösung durch Lyophilisieren nach verlängerter Dialyse geaen demineralisiertes Wasser isoiiert.

Der Mikroorganismus Micrococcus sedogenes Stamm M 78, dessen Züchtung unter geeigneten Bedingungen die Zellen liefert, welche zur Herstellung von 41 200 RP verwendet werden, ist als eine neue Spezies anzusehen, die zu dem Genus Micrococcus gehört.

Sie wurde aus einer Erdprobe isoliert, die in Brasilien nach den für die Isolierung von Mikroorganismen üblichen Methoden entnommen wurde. Eine Probe dieses Stammes wurde im Northern Regional Research Laboratory des US-Departments of Agriculture in P.eoria, Illinois (USA) hinterlegt, wo sie am 14. August 1968 unter der Nummer NRRL B-35 05 registriert wurde.

Diese Stelle ist authorisiert, den Stamm an Jeden,der von dem vorstehenden Dokument statthaft Kenntnis hat, zu verteilen.

Die Eigenschaften dieses Mikroorganismus wurden in Übereinstimmung mit den verschiedenen Identifikationsmethoden bestimmt, welche in dem "Manual of Microbiological Methods"/ Society of American Bacteriologists, Mc. Graw-Hill Book Company, New York (1957) zusammengefaßt sind sowie in den folgenden Werken J.Dumas, "Bac-

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te'riologie Medicale", Editions Medicales Flammarion, Paris (1951); S. Lambin und A. German, "Precis de Microbiologie", Collection des Precis de Pharmacie, Masson, Paris (1551); H. Cassagne, "Milieux de culture", Editions de la Tourelle, Paris (1961); Skerman, "Guide to the Identification of the Genera of Bacteria", The Wiliams and Wilkins Company, Baltimore (1967).

Die Bestimmung des Genus wurde nach dem Identifikationsschlüssel aus "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7th edition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1957) vorgenommen.

Das Studium der morphologischen Eigenschaften des Stamms M 78 wurde auf statischen Kulturen von 24 Stunden bei 26⁰C bewirkt. Diese Kulturen bestehen aus cocciformen, Gram-positiven, nicht säureresistenten, unbeweglichen Zellen von 1 μ bis 1,3 μ Durchmesser, welche isoliert oder zu zwei oder vier Zellen gruppiert sind oder in Ketten von 4 bis 16 Zellen vorhanden sind oder auch in unregelmäßigen Haufen von 2 0 bis 5 0 Zellen vorliegen. Die Anwesenheit von Sporen wurde nicht beobachtet.

Die Kulturen auf geneigter Nährgelose haben das Aussehen eines reichlichen, fetten Überzugs, glatt oder sehr wenig runzlig, geruchlos, nicht homogen, von weicher Konsistenz. Die Kulturen-auf Nährgelose in Petrischalen liegen in Form von runden Kolonien mit regelmäßigen Rändern und glatter Oberfläche vor; diese Kolonien sind abgeplattet oder leicht konvex und mehr oder weniger opak·

Die Kulturen in Glucos anährboui Hon sind mäßig trüb, ohne Pigment, geruchlos und mit einem flockigen Sediment.

Kultiviert auf Kartoffein, bildet der Stamm M 78 einen fetten, glatten, sehr hellgelb-weißlichen Überzug ohne Schwärzung der Kartoffel oder des löslichen Pigments.

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Das Studium der biochemischen Eigenschaften wurde auf bei 26⁰C inkubierten Kulturen durchgeführt. Die Gesamtheit der beobachteten Resultate ergibt folgendes:
Respirationstyp:

Reduktion von Nitraten zu Nitriten Chromogenese:
Indolprodukt.-i on:
H^S-Produktion:
Verflüssigung der Gelatine: Hydrolyse des Caseins: Test mit Methylrot:
Untersuchung des Acetyl-Carbinols (Reaktion nach Voges-Proskauer):

Strikt aerob Positiv Negativ Negativ Negativ Negativ in 21 Tagen Positiv Negativ

Züchtung auf Magermilch:

Negativ

Keine Koagulation, keine Peptonisation, Alkalischmachen des Milieus von pH 6,1 bis pH 7,5 zwischen dem 1. und 21. Tag Optimale Entwicklungstemperatür:

4⁰C - keine Entwicklung
22°C - gute Entwicklung
26⁰C - sehr gute Entwicklung
30⁰C - gute Entwicklung
37⁰C - mittelmäßige Entwicklung 45⁰C - keine Entwicklung

Katalase: Positiv

Oxidase: Negativ

Bildung von Säuren aus den Gluciden und den Polyalkoholen (aerob und anaerob) entwickelt durch Umschlagen von Phenolrot:

Glucose: Negativ

Galaktose: Negativ
Arabinose: · Negativ

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Saccharose: Negativ

Lactose: Negativ

Mannit: Negativ

Glycerin: Negativ

Hydrolyse der Stärke: Positiv

Aesculin-Milieu: Keine Schwärzung

Kultur auf einem Milieu, das mit großen Konzentrationen von NnCl versetzt ist:

4 % NaCl Mittlere Entwicklung

10 % NaCl Keine Entwicklung

Verwendung von Harnstoff als einzige
Stickstoffquelle: Negativ

Urease: Negativ

Hydrolyse des Chitins: Negativ

Kultur auf autotrophem Milieu mit
(NH₄J₂SO₄ als einziger Stickstoffquelle: Keine Entwicklung, keine

Bildung von Nitriten aus NH₄-IOn

Wenn man im Prinzip der Methode von Pridham ^Journal of Bacteriology, 5_6, 107-114 (1948)7 folgt, so verwertet der Stamm M 78 mittelmäßig oder gut als Kohlenstoffquellen die folgenden Substanzen: Stärke, Äthanol, Natriumacetat, Natriumpropionat, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Natriumeitrat, Natriumpyruvat. Folgende Substanzen werden nicht verwertet oder ermöglichen nur eine geringe Entwicklung: Ribose, Arabinose, Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Glycerin, Mannit, Inosit, Glutarsäure, Natriumtartrat, Galacturons äure·

Die Untersuchung der Stickstoffquellen, welche von dem"Stamm M 78 für seine Entwicklung verwertbar sind, wurde nach derselben Methode durchgeführt, wobei das Natriumeitrat als Kohlenstoffquelle verwendet wurde und das NH.H^PO. des Basismiiieus durch verschiedene Stickstoffverbindungen ersetzt wurde. Unter diesen Bedingun-

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gen werden die folgenden Verbindungen gut oder mittelmäßig verwertet: NaNO , NaNO«, NH₄Ii₂PO₄, DL-Asparagin, Succinimid, Glycin, DL-Alanin, DL-Asparaginsäure, DL(+)-Glutaminsäure, L(-)-Tyrosin, DL-Prolin. Nicht verwertet werden: Adenin,Uracil, Kreatinin, D(+)-Glucosamin, Sarcosin, L(+)-Arginin, DL-Methionin, Betain.

Indem man sich auf den Identif ikationsschlüs.sel von" ßergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7 th edition,The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957 bezieht, ermöglicht die Tatsache, daß die untersuchten Bakterienzellen keine photosynthetischen Pigmente enthalten, daß sie unfähig sind, sich auf einem Milieu für Autotrophe zu entwickeln, daß sie sich durch Teilung fortpflanzen, daß sie sphärisch isoliert in kurzen Ketten oder in unregelmäßigen Anhäufungen vorliegen und daß sie keine Trichome besitzen, den Stamm M 78 in die Ordnung der Eubacterialen (Buchanan, 1917) zu klassifizieren bzw. einzuordnen.

Andererseits ist das Bakterium M 78 sphärisch, Gram-positiv, strikt aerob, reduziert die Nitrate in Nitrite, ist unfähig, die Glucide in Anaerobiose zu fermentieren und bildet keine Sporen: Diese Charakteristika ermöglichen es, es in die Familie der Micrococcaceae (Pribram, 1929) einzuordnen.

Diese Familie ist in 6 Genera unterteilt, welche in zwei Gruppen je nach dem Respirationstyp aufgeteilt sind: Diese Unterscheidung ermöglicht es, das Bakterium M 78 in die erste Gruppe einzuordnen, welche die Genera Micrococcus, Staphylococcus, Gaffkya und Sarcina umfaßt. Diese Gruppe ist in zwei Untergruppen gespalten, welche durch die Art, wie deren Zellen gruppiert sind, charakterisiert sind. Die untersuchten Bakterienζeilen sind nicht systematisch in Tetraden und Bündeln von 8 Zellen vorhanden: Diese Eigenschaft führt dazu, den Stamm M 78 entweder in den Genus Mierococcus oder in den Genus Staphylococcus einzuordnen.

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Eine große Anzahl von Eigenschaften und insbesondere die Tatsache/ daß der Stamm M 78 unfähig ist, die Glucose in Anaerobiose zu fermentieren und daß strikte aerobe Bedingungen vorhanden sind, ^er~ möglicht es, ihn mit dem Genus Mxcrococcus in Zusammenhang zu bringen.

Um eine größere Genauigkeit zur Bestimmung des Genus zu ergeben, hat man für zahlreiche Tests Vergleiche mit Staphylococcus areus 209 P, Neisseria catarrhalis A 152 (IP), Streptococcus faecalis ATCC 8ü43, Streptococcus faecalis ATCC 9790 durchgeführt, was erlaubte diese verschiedenen Genera mit cocciformen Zellen zu entfernen und von denen gewisse, zu anderen Familien als die Micrococcaceae gehören.

Unter den 16 beschriebenen Spezies, welche zum

Genus Micrococcus gehören, denen sich der Stamm M 78 am.meisten nähert, sind die folgenden: Micrococcus varians, Micrococcus caseolyticus und Micrococcus colpogenes.

Der Stamm M 78 differiert insbesondere von Micrococcus varians durch die Nichtbildung von Säuren ausgehend von Glukose, Lactose, Saccharose, Glycerin, Mannit und durch die Nichtsäuerung der Milch.

Er differiert von Micrococcus caseolyticus durch die Abwesenheit von Verflüssigung der Gelatine, Peptonisation der Milch und Erzeugung von Säuren ausgehend von Glucose,- Lactose, Mannit, Glycerin .

Der Stamm M 78 ist auch verschieden von Micrococcus colpogenes durch die wesentliche Tatsache, daß er das Chitin nicht hydrolysieren kann und daß er mehr Urease-negativ ist.

Der untersuchte Stamm weist definitiv mit den beschriebener. Gattungen des ßenus Micrococcus Differenzen auf, die es erlauben, ihn

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als eine neue Spezies anzusehen.

Das Verfahren zur Herstellung der Zellen, welche zur Herstellung von 41 200 RP verwendet werden, besteht darin, den Micrococcus sedogenes, Stamm M 78 auf einem geeigneten Milieu und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und dann die Zellen, welche sich im Verlaufe der Züchtung vermehrt haben, abzutrennen.

Die Züchtung des Micrococcus sedogenes, Stamm M 78 kann nach jeder aeroben Züchtungsmethode auf der Oberfläche oder in der Tiefe bewirkt werden, jedoch ist die letztere aus Gründen der Bequemlichkeit vorzuziehen. Man verwendet zu diesem Zweck die üblichen Beimpfungs- und Fermentationstechniken und die verschiedenen Apparatetypen, welche in der Industrie der Fermentationen üblicherweise im Gebrauch sind.

Das Fermentationsmilieu soll im wesentlichen assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff-", Phosphor- und Schwefelquellen, mineralische Bestandteile und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von wohldefinierten Produkten oder komplexen Mischungen,wie man sie in den biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs finden kann, eingebracht werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate wie die Dextrine, Stärke oder andere kohlenstoffhaltige Substanzen wie Alkohol (Äthanol) oder wie gewisse organische Säuren: Milchsäure, Zitronensäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie Specköl oder Sojaöl können vorteilhaft diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen zugefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschieden. Es können sehr einfache chemische Sub-

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stanzen sein wie mineralische oder organische Ammoniumsalze oder gewisse Aminosäuren. Sie können auch durch komplexe Substanzen, welche den Stickstoff hauptsächlich in Ei;;eißform enthalten, eingebracht werden: Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakte, Hefeextrakte, lösliche Rückstände von der Destillation von Alkohol aus Korn (distiller's solubles), Maisquellwasser (corn-steep),

Der Schwefel und der Phosphor werden im allgemeinen in ausreichender Menge durch die oben erwähnten komplexen Substanzen eingebracht. Sie können auch in Form von Sulfaten und Phosphaten eingebracht werden.

Unter den zugefügten mineralischen Bestandteilen können gewisse einen Puffer- oder neutralisierenden Effekt haben wie die Alkalioder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- oder Magnesiumcarbonate. Andere tragen zum ionischen Gleichgewicht, das während der Entwicklung des Micrococcus sedogenes, Stamm M 78 notwendig ist, bei wie die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallchloride und -sulfate oder die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- oder Mangansalze.

Der pH-Wert des Fermentationsmilieus zu Beginn der Züchtung soll zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Die optimale Temperatur zur Fermentation ist zwischen 25 und 30⁰C, jedoch kann eine befriedigende Erzeugung auch für Temperaturen zwischen 20 und 35⁰C erreicht werden.

Die Belüftung der Fermentation kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Man hat jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft/1 Brühe und pro Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute wird nach 8 bis 20 Stunden Züchtung,vorzugsweise nach 15 Stunden, erreicht, wobei diese Zeit im wesentlichen vom verwendeten Milieu abhängt.

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Der pH-Wert des Fermentionsmilieus bei Beendigung der Züchtung liegt im allgemeinen zwischen 7,3 und 8,8 und es ist vorzuziehen, daß er zwischen 8,0 und 8,4 liegt.

Der Microorganismus Micrococcus sedogenes, Stamm M 78 wird dann aus dem Fermentationsmedium durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt, vorteilhaft nachdem das Letztere bis zu einem pH-Wert von etwa 3 durch Zugabe einer Mineralsäure wie Salzsäure angesäuert wurde. Für die späteren Behandlungen kann _man entweder die so erhaltenen rohen Zellen verwenden oder eine Dehydratisierung durch Lyophilisierung oder durch Waschen mit Alkohol oder einem Keton und dann Trocknen unter vermindertem Druck bewirken, um die gereinigten trockenen Zellen zu erhalten. Es kann besonders vorteilhaft sein, die erhaltenen Zellen einem Erhitzen bei einer Temperatur zwischen 120 und 130⁰C während 30 bis 60 Minuten vor der späteren Verwendung zu unterwerfen.

Die neue Substanz 41 200 RP gemäß der Erfindung zeigt bedeutende und nützliche biologische Eigenschaften.

Intravenös, subcutan, intraperitoneal oder intranasal an Mäuse verabreicht, erhöht die erfindungsgemäße Substanz in bedeutender Weise die Beständigkeit der Mäuse gegen Infektion durch normalerweise tödliche Dosen von virulenten Bakterienstämmen wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Viren wie Virus der Encephalomyocarditis, der Maushepatitis der Grippe (menschliche Viren adaptiert an die Maus, Typ A_ und A₂), des Herpes und des Arbovirus Semliki-Forest. Der erhöhte Widerstandszustand dauert mindestens 96 Stunden nach der Behandlung an. -

Verabreicht auf parenteralem Wege an Mäuse^stimuliert dieses Produkt stark die phagocytäre Kraft des reticulo-endothelialen Systems und erhöht in der Milz die Anzahl der. Lymphocyten, welche

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die Antikörper erzeugen. Es übt eine stimulierende Wirkung auf die Hypersensibilitätsreaktionen vom verzögerten Typ und die Produktion von Antikörpern gegenüber gewissen Antigenen aus.

Bei der Maus, welcher Tumorzellen eingepflanzt wurden (wie die Zellen des Sarcoms 180) begünstigt dieses Produkt die Abstoßung der Tumoren, indem es eine nekrotische Reaktion in ihrem Bereich hervorruft.

Unter gewissen Bedingungen erhöht das erfindungsgemäße Produkt die Zahl und/oder die cytolytische Aktivität der Lymphocyten T der Milz gegenüber den allogenischen Tumorzellen.

Beim Tier (Maus) sind je nach dem angewandten experimentellen System und den Verabreichungswegen die aktiven Dosen im allgemeinen zwischen 0,03 und 3 mg/kg und vorzugsweise zwischen 0,3 und 1 mg/kg. Im allgemeinen genügt eine einzige Behandlung, um den gewünschten Effekt während einer Zeitdauer von wenigstens 48 Stunden zu erreichen.

Bei der Maus beträgt die 50 %-ige letale Dosis (DL₅₀) des 41200 RP bei intravenöser Verabreichung etwa 23 mg/kg.

Im folgenden sind:

- die Proteine nach der Analyse der Aminosäuren ausgedrückt,

- die Glucose durch die Methode mit Anthron bestimmt,

- der Phosphor durch die Molybdat-Methode nach Mineralisierung dosiert,

- der Gehalt an Nucleinsäuren durch die Absorption bei 258 nm bestimmt,

- die Aminozucker nach der Methode von Elson-Morgan bestimmt und in Glucosamin ausgedrückt entweder durch Bestimmung mit Ninhydrin durch Analyse und Abtrennung mittels eines Aut.oanalysators Bio.tronik LC 6000 E.

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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

(A) - Herstellung der Zellen

Man gibt in ein Fermentationsgefäß von 170 1:

Pepton 1200 g

Fleischextrakt 600 g

Sojaöl , 1 200 ecm

Leitungswasser, Auffüllen auf 110 1

Der pH-Wert wird auf 6,90 durch Zugabe von 10 N Natronlauge eingestellt, dann sterilisiert man das Milieu durch Durchleiten von Dampf bei 122°C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen ist das Volumen der Brühe aufgrund der Kondensation des Dampfs im Verlaufe der Sterilisation 120 1; der pH—Wert des Milieus beträgt 6,70. Man

beimpft mit 200 ecm einer bewegten Erlenmeyer-Kultur von Micrococccus sedogenes, Stamm M 78.

Die Kultur wird bei 27⁰C während 14 Stunden unter Rühren

und bei Belüften mit steriler Luft entwickelt; sie ist dann geeignet für die Beimpfung der Erzeugerkultur.

Die Erzeugerkultur wird in einem Fermentationsgefäß von 3 00 1 bewirkt, das mit folgenden Substanzen beschickt ist:

L-Milchsäure 4 kg

Sojaöl 2 1

Ammoniumsulfat 2,4 kg

Natriumchlorid 2 kg

Monokaliumphosphat 0,4 kg

Magnesiumsulfat, 7H₂O ., ... 0,8 kg

Kupfersulfat, 5H₃O 0,02 kg

Zinksulfat, 7H₃O 0,12 kg

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Kobaltchlorid, 6H₂O 0_f008 kg

Leitungswasser, Auffüllen auf 370 1

Der pH-Wert des Milieus wird durch Zugabe von 2950 ecm 10 N Natronlauge auf 7,10 eingestellt, dann sterilisiert man die Brühe durch Durchleiten von Dampf von 122⁰C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen ist das Volumen der Brühe aufgrund der Kondensation des Dampfs im Verlaufe der Sterilisation 400 1; sein pH-Wert beträgt 4,20 und wird durch Zugabe von 2100 ecm einer wäßrigen 5 N Natronlaugelösung auf 6,60 eingestellt.

Man beimpft dann mit 40 1 der Impfkultur aus dem oben beschriebenen 170 1-Fermentationsgefäß. Die Kultur wird bei 27⁰C während 16 Stunden unter Rühren mit einer Turbine mit 205 U/Minute und unter Belüftung mit einem Volumen steriler Luft von 15 m'³ Stunde entwickelt.

Am Ende des Arbeitsganges beträgt der pH-Wert der Züchtung 8,20 und das Volumen der Brühe 4 40 1.

Die so erhaltene Brühe wird auf +4⁰C abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von 4 Liter 5 N Salzsäure auf 3 eingestellt; die Zellen werden durch Zentrifugieren mit 4000 U/Minute (2900 ~g) isoliert.

Die Zellen werden mit 80 1 Äthanol bei -10⁰C aufgenommen, wobei während 15 Minuten gerührt wird, dann werden sie durch Zentrifugieren isoliert und bei 35⁰C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) während 15 Stunden getrocknet. Man erhält so 1500 g trockene Zellen.

(B) Herstellung von 32 919 RP

1 kg der wie unter (A) beschrieben hergestellten Zellen werden in 40 1 sterilem destilliertem Wasser suspendiert, in einem Reak-

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tionsgefäß aus rostfreiem Stahl,das mit einem Doppelmantel versehen ist, der durch Zirkulation von Wasser und energisches zentrales Rühren auf konstanter Temperatur gehalten wird.' Der pH-Wert wird durch Zugabe von 10 N Natronlauge auf 7,0 eingestellt.

Man gibt dann 2 g Lysozym zu und rührt während 2 Stunden bei 37⁰C, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 5 N Natronlauge periodisch wieder auf 7,0 eingestellt wird.

Das Gemisch wird dann auf einer Sharpies M 16 Maschine (2 aufeinanderfolgende Durchgänge von 17000 U/Minute mit einem Verbrauch von 30 l/Stunde) zentrifugiert. Das Überstehende (37 1) wird ultrafiltriert (Apparat UFP 20, ausgestattet mit einer Acrylmembran Iris 3042). indem das Retentat recycliert und 3 χ 40 1 demineralisiertes, auf +4⁰C abgekühltes Wasser zugegeben wird.

Man gewinnt so 7 1 konzentriertes Retentat, das von seinen kleinen Molekülen (Molekulargewicht unter etwa 25000 Dalton) befreit ist. Sein pH-Wert wird durch eine Lösung von 5 N Natronlauge wieder auf 7 eingestellt, dann wird die erhaltene Lösung lyophilisiert.

Man erhält so 147 g Rohprodukt.

31 g dieses Produkts werden in 1550 ecm entmineralisiertem Wasser bei einer Temperatur von etwa 20⁰C unter Rühren während 30 Minuten gelöst; man gibt dann innerhalb-von 5 Minuten und unter weiterem Rühren 31 ecm einer wäßrigen Lösung von 668 g/l Calciumchloriddihydrat zu; man hält das Rühren noch 30 Minuten aufrecht. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren auf der Laboratoriums-Sharples-Maschine mit 40000 U/Minute mit einem Verbrauch von 5 1 Wasser/Stunde entfernt. Das Überstehendewird auf einer Zellulosemembran während 3 Tagen bei +4⁰C gegen 3 χ 40 1 entmineralisiertes Wasser dialysiert. :

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ΊΊ

Das Retentat wird dann in einen Kolben mit 310 ecm Polystyrolsulfonsäureharz Dowex 50 X2, Natriumzyklus unter Rühren während 1 Stunde behandelt; das Harz wird abfiltriert und auf dem Filter mit 310 ecm Wasser gewaschen.

Die Waschwässer werden zu dem Filtrat gegeben und das Ganze wird lyophilisiert.

Man erhält so 17 g 32 919 RP in Salzform, dessen Charakteristika die folgenden sind:

- Aussehen: Weißes Pulver,

- Zusammensetzung: Wasser (Fischer) % = 15,7

- Trockensubstanz - Proteine % (Summe der Aminosäuren) =24,6

- Polysaccharide % = 3,9

- Nucleinsäuren % = 28,9 nach dem UV-Spektrum

= 30,71L Elementaranalyse: % C = 46,30; % H = 5,84, % O (durch DifferenzY

% N = 10,04; % P = 3,11, % S unter 0,5j % Na = 3,70, % Ca = 0,30.

(C) Reinigung des 31 219 RP

25 g Substanz 32 919 RP, welche unter den Bedingungen des Beispiels (B) erhalten wurden, werden in 1 1 entmineralisiertes Wasser, das in einem Reaktionsgefäß von 2 1 enthalten ist, das mit einem Rührer und einer Temperaturregelungsvorrichtung versehen ist,gegeben; man gibt 1 1 eines Gemisches aus Phenol/Wasser (109 can Wasser/1 kg Phenol) zu. Das Gemisch wird auf 65⁰C unter energischem Rühren erwärmt. Das Rühren wird während 30 Minuten bei dieser gleichen Temperatur vorgenommen. Nach raschem Abkühlen des Reaktionsgefäßes mittels eines Eisbades auf eine Temperatur vor. 25°CtreTint- man die Phasen durch Zentrifugieren bei 3300 .g während 3 0 Minuten auf einer gekühlten Laboratoriumsmaschine (Jouan Typ K 63 F, Kapazität 4 I)*

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Man erhält so 450 ecm wäßrige Phase.

Die Phenolphase und die Interphase werden von neuem mit 1 1 entmineralisiertem Wasser während 30 Minuten bei 65⁰C extrahiert; nach dem Abkühlen und Zentrifugieren, wie oben angegeben, erhält man von neuem 1470 ecm wäßrige Phase.

Die wäßrigen Phasen werden vereinigt. Das Phenol wird durch zweimalige aufeinanderfolgende Waschungen mittels jeweils 2 1 Chloroform entfernt. Die wäßrigen Phasen werden dann durch Zentrifugieren während 30 Minuten bei 3300 ~ζ geklärt. Man erhält so 1800 ecm wäßrige Phase.

Diese geklärte wäßrige Phase wird dann während 3 Tagen bei +4°C gegen 3 χ 40 1 entmineralisiertes Wasser dialysiert. Das Retentat wird lyophilisiert und man erhält so 14,5 g eines weißen amorphen Pulvers.

Man löst 8 g dieses Pulvers in 400 ecm sterilem, 0,1 M Natriumacetatpuffer vom pH 7 (man löst 136,09 g Natriumacetat analysenrein in 0,9 1 demineralisiertem Wasser, dann stellt man den pH-Wert auf 7,0 durch Zugabe von Essigsäure (d = 1,049) ein und füllt auf 1 1 auf; die Sterilisation wird durch Erhitzen während 45 Minuten bei 120^cC bewirkt; diese Lösung wird auf ein Zehntel mit sterilem entmineralisiertem Wasser gerade im Augenblick des Gebrauchs verdünnt).

Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule von Sepharose CL 4 B (Durchmesser 13,5 cm, Höhe 65 cm), die in einer Gefrierkammer (+4⁰C) installiert ist und mit sterilem 0,1 M Natriumacetatpuffer vom pH 7,0 gefüllt ist, gegossen. Das Eluieren wird mit demselben Puffer mit einem Verbrauch von 1,33 l/Stunde, wobei kontinuierlich das Absorptionsvermögen des Eluats bei 2 30 nm unter 0,1 cm registriert wird, bewirkt.

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Man sammelt zuerst eine Fraktion von 3,13 1,welche entfernt wird. Die folgende Fraktion (1,22 1), welche einem Absorptionspeais. bei 230 nm entspricht, wird in eine Röhre von regenerierter Cellulose

{R)

Nojax eingeführt und wird bei +4⁰C während 3 Tagen gegen 3 χ 40 1 entmineralisiertes Wasser dialysiert und dann wird das Retentat (1300 ecm) lyophilisiert. Der erhaltene feste Stoff wird in 93 ecm entmineralisiertem Wasser aufgenommen und die Lösung wird mit derselben Membran, wie oben, während 48 Stunden bei +4⁰C gegen 2 χ 20 1 entmineralisiertes Wasser dialysiert. Das Retentat wirdlyophilisiert. Man erhält so 1,3 g Substanz 41 200 RP, deren Charakteristika die folgenden sind:

- Aussehen: Weißes amorphes Pulver

- UV-Spektrum: Dieses Spektrum ist in Figur 1 dargestellt.

- Infrarot- (Bestimmt aus Preßlinger.,vermischt mit KBr) . Spektrum:

Dieses Spektrum ist in Figur 2 dargestellt, wobei man in der Abszisse einerseits die Wellenlängen ausgedrückt in Micron (oberer Rand) und andererseits die Wellen^zanl^en in cm (unterer Rand) aufgetragen hat und auf der Ordinate ist der Prozentsatz Transmission angegeben.

In der folgenden Tabelle sind die hauptsächlichen Banden der Infrarot-Absorption der Substanz 41 200 RP ausgedrückt in Wellenzahlen ausgedrückt in cm zusammengestellt:

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"¹

(cm"¹]

3420 cm ^x SSt-. (von
3280 cm"¹ ScIi.'
3090 cm"¹ Sch:-
2970 cm"¹ Sch ./
2950 cm"¹ Sch

2920 cm"^{1 st}

-1 _m

2845 cm
2680 cm
2100 cm

-1 Sch-'."
-1 ssch/'
-1

1730 cm 1645 cm"¹ 1545 cm"¹ st 1460 cm"¹ Sch

1440 cm 1405 cm' 1375 cm 1335 cm' 1310 cm 1230 cm" 1210 cm' 1160 cm' 1115 cm' 1060 cm" 1025 cm" 945 cm ^-1 Sch
-¹ Sch
-¹ st
^ml Sch
"* m
^-1 m
■1 Sch
-1 st
•1 st

^¹ 3St

^-1 Sch
-1 m

-1

900 cm" £?ch. 875 cm"¹ sch' 800 cm"^{1 m} 775 cm"¹ sch 720 cm"¹ Sch

630 cm"^{1 Sch}

-1 "f-• 560 cm ^jZ- (davon

,"1 Sch

oiO cm

430 cm"^{1 5ch} 450 cm"¹ Sch

"^L

400 cm 3651cm".^{1 Sch}

sst = sehr stark st = stark
m = mittel

sch = schwach
ssch = sehr schwach Sch = Schulter

- Zusammensetzung Wasser: (Fischer) % : 3,8
Trockensubstanz: % Aminosäuren: 12,3 (davon 7 % Alanin)

% Glucose : 11,95

% Nucleinsäure: unter 1,3 (aufgrund des UV-Spektrums ) % Aminozucker : 16,3

- Elementaranalyse:

% C = 45,58 % H = 7,47 % N = 4,85 % 0 =37 % P = 1,17 % Cl= 0,25 % Na= 2,36 % Ca=1,33

% S unter 0,5
~ Elektrophorese:

In einem Gel mit 1 % Agarose mit Barbitalpuffer von pH 8,6 und unter einer Spannung von 6 V/cm wandert das 41 200 RP gegen die Ano-

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de mit einer Geschwindigkeit von etwa 11 mm/Stunde (das Produkt wird mit Schiff 'schein Reagens nach periodischer Oxidation oder mit Soudan-B-Schwarz sichtbar gemacht.

Beispiel 2

Man arbeitet wie in Beispiel 1 (A). Nach 16 Stimden Züchtung wird die Brühe auf 4⁰C abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von Salzsäure auf 3 eingestellt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren mit 4000 U/Minute isoliert. Der saure Zellkuchen wird dann im Autoklaven während 45 Minuten bei 122⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen werden die Zellen mit Äthanol gewaschen und dann getrocknet.

Wenn man dann wie in Beispiel 1 (B) und 1 (C) arbeitet und die gleichen Mengen verwendet, so erhält man 0,55 g Substanz 41 200 RP in Form eines weißen amorphen Pulvers, dessen Charakteristika die folgenden sind:
- Zusammensetzung: Wasser (Fischer) % : 6 Trockensubstanz: % Aminosäuren: 17,7 (davon 7,2 % Alanin)

% Glucose : 10,5
% Nucleinsäuren: unter 3 % Aminozucker: 15,2
-Elementaranalyse:

% C = 46,90 % H = 7,32 % N = 5,38 % O = 35 % P = 1,08 % Cl= 0,18 %Na=2,26 % Ca= 1,83 % S unter 0,5

Das Infrarotspektrum dieses Produkts ist identisch mit demjenigen der Substanz 41 200 RP, welche gemäß Beispiel 1 erhalten wurde.

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Die Erfindung betrifft auch die Arzneimittel, welche aus dem erfindungsgemäßen Produkt bestehen und die pharmazeutischen Zusammensetzungen/ welche es zusammen mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungs- oder Hilfsmitteln und gegebenenfalls mit einem anderen therapeutisch aktiven Produkt, wie einem Antibiotikum enthalten.

Vorzugsweise werden diese Zusammensetzungen parenteral oder intranasal verwendet.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Träger kann man in letzterem Fall Propylenglycol, ein Poiyäthylenglycol, pflanzliche Öle, insbesondere Olivenöl, und organische, injizierbare Ester, beispielsweise Äthyloleat verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsmittel enthalten, insbesondere Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel. Die Sterilisation kann auf mehrere Arten erfolgen, beispielsweise indem der Zusammensetzung sterilisierende Mittel einverleibt werden. Sie können auch in Form von festen Zusammensetzungen, welche durch Bestrahlung (ß-Strahlen) steril gemacht wurden, hergestellt werden, welche dann in sterilem Wasser gelöst oder in jedem anderen injizierbaren sterilen Milieu dispergiert werden können, gegebenenfalls im Augenblick der Verwendung.

Die Zusammensetzungen zur intra-nasalen Verabreichung können sterile wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein., die gegebenenfalls zusammen mit einem verträglichen Mittel assoziiert sein können.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind besonders nützlich in der Human- und der Veterinärtherapie zur immunologischen Behandlung (Immunotherapie) von Carcinom, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten chemotherapeutsichen Anticarcinommittel oder

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BAD

im Verlaufe von Remissionen, welche durch letzteres eingeleitet wurden.

Die Zusammensetzungen können auch zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen virale, bakterielle, fungische oder parasitäre Infektionen verwendet werden, ^um die natürliche Widerstandskraft des Organismus, der spezifisch auf diese Infektionen wirkt,zu stimulieren,durch intra-nasale Verabreichung die natürlichen Sperren gegen Infektionen des Atmungssystems zu stärken oder um auf die spezifische Immunisierung während der gleichzeitigen Verabreichung einer bakteriell wirkenden viralen oder parasitären Vaccine eine unterstützende Wirkung auszuüben.

Diese Zusammensetzungen erlauben auch die adäquaten immunologischen Reaktionen bei Personen, welche angeborene oder als Folge des Alters oder von immuno-suppressorische Behandlungen immunodefiziente Zustände■aufweisen, wiederherzustellen.

In der Humantherapie hängen die Dosen von dem gewünschten Effekt und von der Dauer der Behandlung ab: Sie sind im allgemeinen zwischen 0,1 und 10 mg/Tag für den Erwachsenen bei parenteraler Verabreichung.

Das folgende Beispiel soll eine erfindungsgemäße Zusammensetzung erläutern.

Beispiel

Man stellt eine Lösung her, die 5 g der Substanz 41 200 RP in Salzform,welche vorher durch Bestrahlung mittels ß-Strahlen sterilisiert wurde, in 100 ecm steriler injizierbarer Kochsalzlösung enthält .Diese Lösung wird aseptisch in Ampullen von 5 ecm in einer Menge von 2 ecm/Ampulle verteilt. Diese Ampullen werden verschlossen. Sie enthalten jeweils 100 mg aktiven Wirkstoff.

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Claims (8)

1. Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmam - Or. R. Kuervgsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-ing. «=. Küngseisen - Dr. F. Zumstein jun.

   PATENTANWÄLTE

   8000 München 2 · BräuhausstraGe 4 ■ Telefon Sammel-Nr. 22 53 41 - Telegramnrie Zumpat Telex 5 29 379

   SC 4669
   10/We

   Patentansprüche

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   /^Ns 1. Die neue Substanz, bezeichnet mit der Nummer 41 200 RP, dadurch

   /■'■>„/ gekennzeichnet, daß sie, isoliert aus Zellen des Stammes Micro-

   -■"'·■■" (V£ ft L R-SSCr)

   .J" coccus sedogenes M 7 8/^" ein aHtorpnes weißes Pulver ist, das in wasserfreiem Zustand im wesentlichen aus 11 bis 18 % Aminosäuren, 10 bis 17 % Glucose, 10 bis 17 % Aminozucker und weniger als 5 % Nucleinsäuren besteht, deren Elementarzusammensetzung etwa folgendermaßen ist:

   % C = 45 - 47 % H = 7,1 - 7,6 % O = 35 - 38 % N = 4,0 - 5,7 % P = 0,9 - 1,2 % Cl =0,1 - 0,4 % S unter 0,5 %Na=2,0-3,0 % Ca = 0,9 - 1,9
   und daß sie immunostimulierende Eigenschaften besitzt.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Substanz 41 200 RP, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) eine wäßrige Suspension von Zellen des Micrococcus sedogenes Stamm M 78 (NRRL ß-35 05) mit Lysozym bei einem konstanten pH~'''ert zwischen 6,5 und 8 während 1 bis 3 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37⁰C behandelt,

   b) ein Rohprodukt in Salzform aus der flüssigen Phase der erhaltenen Suspension isoliert und es durch Behandlung mit Calciumchlorid reinigt,um die Substanz 32 919 RP zu erhalten,

   c) die Substanz 32 919 RP durch Behandlung ihrer wäßrigen. Lösung mit Phenol und anschließende Fraktionierung auf dem Molekularsieb die Fraktionen mit hohem Molekulargewicht gesammelt werden, aus denen man die Substanz 41 200 RP isoliert.

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   -t- 3Q1B030
3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen 2 und 20 mg Lysozym/g eingesetzter Zellen verwendet.
4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man, wenn die Reinigung mittels Calciumchlorid bewirkt wird, 5 bis 50 g Calciumchlorid/l Lösung des zu reinigenden Produktes verwendet.
5. 5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man, wenn die Substanz 32 919 RP in wäßriger Lösung gereinigt wird, eine wäßrige Phenollösung,enthaltend etwa 9 0 % Phenol, verwendet.
6. 6. Arzneimittel, enthaltend das Produkt gemäß Anspruch !,gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungs- oder Hilfsmitteln und gegebenenfalls mit einem oder mehreren anderen therapeutisch wirksamen Produkten.
7. 7. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 2, die mit Nummer 32 919 RP bezeichnete Substanz,dadurch gekennzeichnet, daß sie, isoliert aus Zellen des Stammes Micrococcus sedogenes M 7 8 im wesentlichen aus 24 bis 33 % Aminosäuren, 26 bis 33 % Nucleinsäuren, 11 bis 17,5 % Aminozuckerη und 2,8 bis 4,3 % Polysacchariden besteht. Ihre Zusammensetzung ist etwa folgendermaßen:

   %C=44-48 % H = 5,2 - 6,7 %O=29-33 % N = 10,0 - 11,6 % P = 2,3 - 3,7 % S unter 0,5 % Na = 3,0 - 3,8 % Ca = 0,15-0,50
8. 8. Der neue Microorganismus Micrococcus sedogenes, Stamm M 78 (NRRL B-35 05).

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