NL8002108A - Nieuwe biologisch actieve stof, de bereiding daarvan en deze stof bevattende geneesmiddelen. - Google Patents

Description

9 t VO 129

Nieuwe biologisch actieve stof, de bereiding daarvan en deze stof bevattende geneesmiddelen.

....... De uitvinding heeft betreKKing op een nieuwe biologisch actieve ...

stof, aangeduid met het nummer 41.200 RP, verkregen uit cellen geïsoleerd uit de cultuur van een nieuw microörganisme, aangeduid als Micrococcus sedogenes M 78, werkwijze voor de bereiding daarvan en 5 de geneesmiddelen die haar bevatten.

□e stof 41.200 RP volgens de uitvinding die wordt verkregen na behandelen met lysozyme van cellen geïsoleerd uit Micrococcus sedogenes stam M 78, neerslaan van de verontreiniging met calcium-chloride, verwijderen van de proteïnen door behandeling met fenol 10 gevolgd door een fractionering op een moleculaire zeef bestaat in hoofdzaak uit 11 - 18% aminozuren (van 5,5 - 7,5% alanine], 10 - 17% glucose, 10 - 17% aminosuikers en minder dan 5% nucleïnezuren.

In het algemeen geïsoleerd met een gehalte aan water tussen 2 en 6% is de stof 41.200 RP een in water oplosbaar amorf wit poeder 15 dat koolstof, waterstof, zuurstof, stikstof, fosfor , zwavel, chloor, natrium en calcium bevat. Haar elementaire samenstelling (gebaseerd op de droge stof) is ongeveer: Z% 45 - 47%( H# 7,1 - 7.6¾ 0# 35 - 38% (door verschil) N#4,0 - 5,7¾ P$ 0,9 - 1,2% Cl* 0,1 - 0,4% S#< 0,5: Na# 2,0 - 3,0# 20 Ca# 0,9 - 1,9%.

De werkwijze voor de bereiding van de stof 41.200 RP bestaat in hoofdzaak uit het behandelen door lysozyme onder bepaalde en nader te omschrijven omstandigheden van temperatuur, pH en duur, van een waterige suspensie van cellen (bij voorkeur vooraf gedroogd en even-25 tueel behandeld bij een pH in de buurt van 3 en bij een temperatuur in de buurt van 120°C gedurende 30 - 60 minuten), geïsoleerd uit culturen van Micrococcus sedogenes stam M 78, het isoleren in de zout-vorm van het ruwe produkt uit de vloeibare fase van de verkregen suspensie, het zuiveren ervan door geleidelijk neerslaan van verontrei- - 2 - nigingen met behulp van calciumchloride, vervolgens door een behandeling met fenol om in hoofdzaak het grootste gedeelte van de proteïnen te verwijderen, en tenslotte fractionering oer een moleculaire zeef waarbij de fractie van hoog molecuulgewicht d.w.z. tussen 5.10^ en g 5 5.10 wordt gewonnen.

In het algemeen wordt het lysozyme toegepast in een hoeveelheid van 2 - 20 mg per g toegepaste droge cellen. De behandeling-ger........

schiedt bij een constante pH tussen 6,5 en B, bij voorkeur ongeveer 7, gedurende 1-3 uren, bij voorkeur gedurende 2 uren, waarbij een 10 temperatuur van ongeveer 37°C wordt toegepast onder krachtig roeren.

De vloeibare fase van de verkregen suspensie wordt in het algemeen afgescheiden door centrifugeren en de produkten van kleine molecuulgewichten in oplossing worden verwijderd, hetzij door dialyse door een membraan van geschikte poreusheid, hetzij door ultrafil-15 tratie. De aldus verkregen ruwe stof kan worden geïsoleerd in zout-vorm door lyofiliseren van haar oplossing. In dit stadium van de bereiding bestaat de verkregen stof in hoofdzaak uit proteïnen, nu-clSïnezuren, aminosuikers en minder dan 5% polysacchariden en haar elementaire samenstelling is ongeveer: 20 C: 41,5 - 44,9%; H: 5,6 - 5,9%; 0: 29,4 - 32,2%; N: 11,2 - 12,6%; P: 3,2 - 4,4%; S: 0,1 - 0,5%; Cl: 0,2 - 0,4%. Zwavel bevattende as: 11,4 - 15,4%.

De ruwe stof wordt gezuiverd opgelost in water tot een concen-3 3 tratie van 10 - 40 g/dm , bij voorkeur 20 g/dm door toevoeging van 25 een geconcentreerde calciumchlorideoplossing tot een eindconcentratie 3 3 calciumchloride van 5-50 g/dm en bij voorkeur van 10 g/dm is verkregen. Het gevormde neerslag wordt verwijderd door centrifugeren en de verkregen oplossing wordt gedialyseerd (of geultrafiltreerd) en vervolgens behandeld met een ionuitwisselhars, die een sulfonzuurfunc-30 tie draagt in alkalivorm. De verkregen stof aangeduid met het nummer 32.919 RP kan uit de waterige oplossing door lyofiliseren worden afgescheiden.

De stof 32.919 RP bestaat in hoofdzaak uit 24 - 33% aminozuren, 26 - 33% nucleïnezuren, 11 - 17,5% aminosuikers (bepaald volgens de 35 methode van Elson-Horgan en uitdrukking van de resultaten in glucosami- 800 2 1 08 m - 3 - t * ne] en 2,8 - 4,3% polysacchariden en zijn samenstelling is ongeveer: C: 44 - 48%j H: 5,2 - 6,7%; 0: 29 - 33%; N: 10,0 - 11,6%; P: 2,3 -3,7%; S: <0,5%; Na: 3,0 - 3,8%; Ca: 0,15 - 0,50%.

- De stof 32.919 RP wordt opnieuw gezuiverd door te werken op 5 de volgende wijze:

Een waterige oplossing van de stof 32.919 RP, waarvan de concentratie aan de stof 32.919 RP 10—50^/l· en bij voorkeur 25 g per dm^ bedraagt, wordt gewassen met een gelijk volume van een fenol-water-mengsel (dat bij voorkeur 10% water bevat] gedurende 15 - 60 minuten, 10 bij voorkeur 30 minuten bij een temperatuur van ongeveer 65°C. Na afkaelen wordt de afgescheiden waterige fase gewassen met een gechloreerd oplosmiddel, bij voorkeur chloroform, tot de opgeloste fenol is verwijderd en vervolgens gedialyseerd tegen gedestilleerd water. De waterige fase die de actieve stof bevat, wordt gelyofiliseerd.

15 Het aldus verkregen produkt wordt opgelost in water dat met alkaliacetaat zoals natriumacetaat, op een pH 7 is gebufferd. De al- ___ dus verkregen oplossing wordt onderworpen aan een fractionering op moleculaire zeef van hoge poreusheid zoals "Ultragel Ac A 22" van Industrie Biologique Francaise, "Sepharose 4 B" of "Sepharose CL 4 B" 20 van Société Pharmacia, onder winning van de fractie met hoog mole-cuulgewicht. De stof 41.200 RP wordt vervolgens uit haar oplossing door lyofiliseren geïsoleerd na langdurige dialyse tegen gedeminerali-seerd water.

Het microörganisme Micrococcus sedogenes, stam M 78, waarvan 25 de cultuur onder geschikte omstandigheden de cellen levert, die worden toegepast voor de bereiding van het 41.200 RP, dient te worden beschouwd als een nieuwe soort behorend tot het genus Micrococcus.

Men heeft het geïsoleerd uit een monster aarde afkomstig van Brazilië volgens de gebruikelijke isoleringsmethoden voor microorga-30 nismen. Een monster van deze stam is gedeponeerd in het Northern Regional Research Laboratory van de Verenigde Staten van Amerika,

Department of Agriculture te Peoria, 111 (Verenigde Staten van Amerika] onder het registratienummer NRRL B-3505 op 14 augustus 1968.

Dit laboratorium is gemachtigd de stam aan iedere persoon uit 35 te reiken die op geoorloofde wijze kennis van het onderhavige document heeft verkregen.

pnn o 1 08 - 4 -

De Kenmerken van dit microörganisme zijn vastgelegd overeenkomstig de verschillende identificeringsmethoden samengevat in "Manual of Microbiological Methods", Society of American Bacteriologists, McGraw-Hill Bock Company, New York (1957) alsmede in de 5 volgende werken: J.Dumas, "Bacteriologie Médicale", Editions Médicales Flammarion, Parijs (1951); S.Lambin en A.German, "Précis de Microbiologie", Collection des Précis de Pharmaoie, Masson, Parijs, (1961); H.Cassagne, "Milieux de culture", Editiöns'de la Tourëlle, Parijs (1961); Skerman, "Guide to the Identification of the Genera of 10 Bacteria”, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1967).

De bepaling van het genus is geschied volgens de identifice-ringssleutel van "Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology", 7e editie, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1957).

De bestudering van de morfologische kenmerken van de stam 15 Μ 78 is geschied met statische cultures van 24 uren bij 26°C. Deze cultures bestaan uit coccenvormige gram-positieve cellen, die niet zuur resistent zijn, onbeweeglijk, van 1—- 1,3 y diameter, geïsoleerd of gegroepeerd met twee of vier cellen of als ketens van 4-16 cellen, ofwel in onregelmatige massa’s van 20 - 50 cellen.De aanwezigheid van 20 sporen is niet waargenomen.

De cultures op schuine voedingsagar hebben het uiterlijk van een overvloedig vette bekleding, glad of enigszins ruw, reukloos, niet chromogeen met een zachte consistentie. De cultures op voedingsagar in petrischalen zijn in de vorm van cirkelvormige kolonies, met 25 regelmatige randen met glad oppervlak; deze kolonies zijn afgeplat of licht convex, en meer of minder opaak.

De cultures op glucose bevattende voedingsbouillon zijn matig troebel, zonder pigment, reukloos, met een vlokvormig afzetsel.

Gekweekt op aardappel vormt de stam M 78 een vette, gladde, 30 witgeelachtig zeer bleke bekleding, zonder zwartkleuring door de aardappel noch oplosbaar pigment.

De bestudering van de biochemische eigenschappen is geschied op bij 26°C bebroede cultures. Het geheel der waargenomen resultaten wordt samengevat op onderstaande wijze: 35 80 0 2 1 08 $i * - 5 - - Ademhalingstype: strikt aëroob - Reductie van nitraten tot nitrieten:positief - Chromogenese: negatief - Indole produktie: negatief 5 - HgS-produktie: negatief - Vervloeiing van de gelatine: negatief in 21 dagen - Hydrolyse van de caseïne: positief - Proef met methylrood: negatief - Onderzoek naar acetyl-methyl-carbi- nol (reactie van Voges-Proskauer) negatief 10 - Kuituur op afgeroomde melk: geen coagulatie, geen peptoni- satie,akalinisering van het milieu van pH 6,1 tot 7»5 tussen de 1e en de 21e dag - Temperatuur van optimale ontwikke- ling : ?TC - geen ontwikkeling 15 22°C - goede ontwikkeling 26°C - zeer goede ontwikkeling 30°C - goede ontwikkeling 37°C - matige ontwikkeling J+5°C - geen ontwikkeling 20 - Catalase: positief - Oxydase: negatief - Vorming van zuren uit de'volgende - glucose: negatief gluciden en polyalcoholen (in - galactose: negatief aerobiose en anaerobiose) aangetoond- arabinose: negatief door kleuromslag van fenolrood: - saccharose: negatief - lactose: negatief ^ - mannitol: negatief - glycerol: negatief - Hydrolyse van zetmeel: positief - Milieu met esculine: geen zwartkleuring - Kuituur op milieu, waaraan sterke U % HaCl: middelmatige ont- 30 concentraties UaCl zijn toegevoegd: wikkeling 10 % HaCl: geen ontwikkeling - Gebruik van ureum als enige stik- stofbron: negatief - Urease: negatief 35 - Hydrolyse van de chitine: negatief 800 2 1 08 - 6 - - Culture op autotroof milieu (met (NH^SC^ als enige stikstofbron): geen ontwikkeling; geen vorming van nitrieten uit NH^+.

- ünder navolging van het principe van de methode van Pridham (Journal of Bacteriology, 5£, 107 - 114 (1948)], gebruikt de stam 5 M 78 matig of goed als koolstofbronnen de volgende stoffen: zet meel, ethanol, natriumaoetaat, natriumpropionaat, barnsteenzuur, appelzuur, natriumcitraat, natriumpyruvaat. Niet gebruikt worden of slechts met een slechte ontwikkeling: ribose, arabinose, glucose, lactose, maltose, saccharose, trehalose, glycerol, mannitol, inosi-10 tol, glutaarzuur, natriumtartraat, galacturonzuur.

- Het onderzoek naar stikstofbronnen, die door de stam M 78 voor zijn ontwikkeling bruikbaar zijn, geschiedde volgens deze zelfde methode van Pridham onder toepassing van natriumcitraat als koolstofbron, en onder vervanging van het NH^^PO^ uit het basismilieu door ver- 15 schillende stikstofverbindingen. Onder die omstandigheden worden de volgende verbindingen goed of matig gebruikt: NaNO^, NaNO^, NH^HjPQ^i DL-asparagine, succinimide, glycine, DL-alanine, DL-aspa-raginezuur, DL(+)-glutaminezuur, L(-)-tyrosine, DL-proline. Niet worden gebruikt: adenine, uracil, creatinine, D(+)-glucosamine, 20 sarcosine, L(+)-arginine, DL-methionine, betaine.

Onder verwijzing naar. de identificeringssleutel van "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology”, 7e uitgave, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957, dient vanwege het feit, dat de bestudeerde bacteriecellen geen fotosynthetische pigmenten bevatten, 25 dat zij niet in staat zijn zich te ontwikkelen op een autotroof milieu, dat zij zich vermenigvuldigen door splijting, dat ze sferisch zijn, geïsoleerd in korte ketens of onregelmatige massa's en dat zij geen trichomen bezitten, de stam M 78 onder de orde der Eubacteriales (Buchanan, 1917) te worden geklasseerd.

30 Anderzijds is de bacterie M 78 sferisch, gram-positief, strikt aëroob, reduceert zij nitraten tot nitrieten, is zij niet in staat de gluciden tot anaerobiose te fermenteren en vormt zij geen sporen: vanwege deze eigenschappen dient zij onder de familie der Micrococcaceae (Pribram, 1929) te worden geklasseerd.

35 Deze familie is verdeeld in zes genera, verdeeld in twee groe- 80 0 2 1 oa »- « - 7 - pen volgens het ademhalingstype: dit verschil veroorlooft Klassering van de bacterie M 78 onder de eerste groep omvattend de genera Micrococcus, Staphylococcus, Gaffkya en Sarcina. Deze groep is onderverdeeld in twee ondergroepen gekenmerkt door de wijze waarop de 5 cellen zijn gegroepeerd. De bestudeerde bacteriecellen presenteren zich niet systematisch in de vorm van tetraden of in pakketjes van acht cellen; door deze eigenschap dient de stam M 78 hetzij onder het genus Micrococcus hetzij onder het genus Staphylococcus te worden geklasseerd.

10 Een groot aantal kenmerken en in het bijzonder het feit, dat de stam M 78 niet in staat is gekozen tot anaerobiose te vergisten en dat zij strikt aëroob is, laat verbinding met het geslacht Micrococcus toe.

Om het genus nauwkeuriger te bepalen heeft men voor talloze 15 proeven vergelijkingen uitgevoerd met Staphylococcus aureus 209 P, Neisseria catarrhalis A 152 (IP), Streptococcus faecalis ATCC 8043, Streptococcus faecalis ATCC 9790, waardoor het mogelijk was deze verschillende geslachten met coccenvormige cellen te elimineren en waarvan bepaalde behoren tot andere families dan de Micrococcaceae.

20 Onder de 16 beschreven soorten behorend tot het genus Micro coccus, zijn die waarmee de stam M 78 het meest verwant is, de volgende: Micrococcus varians, Micrococcus caseolyticus en Micrococcus colpogenes.

De stam M 78 verschilt met name van Micrococcus varians door-25 dat zij geen zuren vormt uit glucose, lactose, saccharose, glycerol, mannitol, en dat zij melk niet verzuurt.

Zij verschilt van Micrococcus caseolyticus door de afwezigheid van gelatinevervloeiing, peptonisatie van melk, en de produktie van zuren uit glucose, lactose, mannitol en glycerol.

30 De stam M 78 verschilt eveneens van Micrococcus colpogenes door het essentiële feit, dat zij chitine niet kan hydrolyseren en bovendien urease negatief is.

De bestudeerde stam biedt tenslotte met de beschreven soorten van het genus Micrococcus zodanige verschillen, dat zij als een nieuwe 35 soort moet worden beschouwd.

800 2 1 08 - 8 -

De werkwijze voor de bereiding van de cellen toegepast voor de bereiding van het 41.200 RP bestaat in het kweken van Micrococcus sedogenes,.stam M 78, op een milieu en onder geschikte omstandigheden, en het vervolgens afscheiden van de cellen die zich in de loop van 5 het kweken hebben vermenigvuldigd.

Het kweken van Micrococcus sedogenes, stam M 78, kan geschieden volgens. elke...a.erobe.„kweekraethade.~op. Jnet~opper.ulak<ofondergedom--. — -......

peld , maar laatstgenoemde wordt gemakshalve geprefereerd. Hiertoe past men de ent- en fermentatietechnieken en de verschillende typen 10 toestellen toe, die gangbaar zijn in de fermentatie-industrie.

Het fermentatiemilieu dient in hoofdzaak te bevatten bronnen koolstof, stikstof, fosfors en assimileerbare zwavel, minerale elementen en eventueel groeifactoren, welke elementen alle aanwezig kunnen zijn in de vorm van goed gedefinieerde produkten of in de vorm van 15 complexe mengsels, zoals worden aangetroffen in biologische produkten van verschillende oorsprong.

Als bronnen assimileerbare koolstof kan men koolhydraten toepassen zoals dextrinen, zetmeel of andere koolstofhoudende stoffen, zoals alcoholen [ethanol] of bepaalde organische zuren; melkzuur, 20 citroenzuur. Bepaalde dierlijke of plantaardige oliën zoals reuzel-olie of sojaolie, kunnen met voordeel deze verschillende koolstof-bronnen vervangen of daaraan worden toegegevoegd.

De geschikte assimileerbare stikstofbronnen zijn bijzonder gevarieerd. Zij kunnen zeer eenvoudige chemische stoffen zijn zoals 25 anorganische of organische ammoniumzouten en bepaalde aminozuren. Zij kunnen echter ook aanwezig zijn in de vorm van complexe stoffen die de stikstof in hoofdzaak in de protidische vorm bevatten; caseïne, lactalbumine, gluten en de hydrolysaten daarvan; sojameel, arachide- i meel, vismeel, vleesextracten, gistextracten, oplosbare residu’s af-· 30 komstig van de alcoholdestillatie (distiller’s solubles), maisweek- water.

De zwavel en de fosfor zijn in het algemeen aanwezig in een voldoende hoeveelheid door de bovengenoemde complexe stoffen. Zij kunnen echter eveneens aanwezig zijn in de vorm van sulfaten en fosfa-35 ten.

80 0 2 1 08 - 9 -

Onder de taegevoegde minerale elementen Kunnen enkele een bufferend of neutraliserend effect hebben, zoals de alkali- of aardalkali-fosfaten of de calcium- of magnesiumcarbonaten. Andere leveren het noodzakelijke ionische evenwicht voor de ontwikkeling van Micrococcus 5 sedogenes, stam Μ 78, zoals de alkali- of aardalkalichloriden en de sulfaten of de zink-, kobalt-, ijzer-, koper- en mangaanzouten.

De pH van het vergistingsmilieu- dimt-bij het- begin- van-de cul^*-ture tussen 6,0 en 7,8 te liggen en bij voorkeur tussen 6,5 en 7,5.

De optimale temperatuur voor de fermentatie ligt tussen 25 en 30°C 10 maar een bevredigende produktie wordt verkregen bij temperaturen tussen 20 en 35°C.

De aerering van de fermentatie kan tussen tamelijk ruime waar- 3 den variëren. Er is gevonden dat beluchtingen van 0,3 - 3 dm lucht 3 per dm bouillon per minuut bijzonder geschikt zijn. Het optimale 15 rendement wordt verkregen na 8 - 20 uren kweken bij voorkeur na 15 uren, welke tijd in hoofdzaak afhankelijk is van het toegepaste milieu.

□e pH van het fermentatiemedium aan het eind van het kweken ligt in het algemeen tussen 7,3 en 8,8, en bij voorkeur ligt deze tus-20 sen 8,0 en 8,4.

Het microörganisme Micrococcus sedogenes, stam M 78, wordt vervolgens uit het fermentatiemedium afgescheiden door filtratie of centrifugeren, met voordeel na dit laatste aangezuurd te hebben tot een pH van ongeveer 3 door toevoeging van een anorganisch zuur, zoals 25 chloorwaterstofzuur. Voor de verdere behandelingen kan mende aldus verkregen ruwe cellen gebruiken hetzij een dehydratatie uitvoeren door lyofiliseren of wassen met alcohol of aceton, vervolgens een droging onder verlaagde druk om gezuiverde droge cellen te verkrijgen. Het kan van bijzonder voordeel zijn de verkregen cellen te ver-30 warmen op een temperatuur tussen 120 en 130°C gedurende 30 - 60 minuten voordat zij later worden gebruikt.

De nieuwe stof 41.200 RP volgens de uitvinding bezit opmerkelijke en nuttigs biologische eigenschappen.

Intraveneus, subcutaan, intraperitoneaal of intranasaal toege-35 diend aan muizen, verhoogt de stof volgens de uitvinding op signifi- - 10 - cante wijze de weerstand van de muizen tegen infectie door normaliter dodelijke doses van virulent bacteriestammen zoals Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, en van de vira zoals het encefalomyocarditisvirus, het muizehepatitisvirus, het griepvirus 5 (mensenvirus aangepast aan de muis, type Ao en A2), het herpesvirus en het arbovirus Semliki-Forest. De toegenomen weerstand blijft tenminste 96. uren na de .behandeling-....................

Toegediend langs parenterale weg aan muizen stimuleert het pro-dukt sterk het fagocytaire vermogen van het reticulo-endotheel-systeem 10 en verhoogt ter plaatse van de milt het aantal lymfocyte producenten • van antilichamen. Het oefent een stimulerend effect op de hypersensi-'biliteitsreactie van het vertragingstype en op de functie van antilichamen tegenover deeltjes vormige antigenen.

Bij de muis geënt met tumorcellen (zoals cellen van sarcoom 15 180], begunstigt dit produkt de afstoting van de tumor onder veroorza king van een necrotische reactie.

Onder bepaalde omstandigheden verhoogt het produkt volgens de uitvinding het aantal en/of de cytolytische activiteit van de lymfo-cyten T van de milt tegenover allogene tumorcellen.

20 Bij het dier (muis], afhankelijk van de toegepaste experimen tele systemen en de toedieningswijzen liggen de actieve doses in het algemeen tussen 0,03 en 3 mg/kg, en bij voorkeur tussen 0,3 en 1 mg per kg. In het algemeen is een enkele behandeling voldoende voor het verkrijgen van het gezochte effect gedurende een periode van tenminste 25 48 uren.

Bij de muis is langs intraveneuze weg de letale dosis 50%

(DL_n3 van het 41.200 RP ongeveer 23 mg/kg. bU

In het volgende zijn: - de proteïnen uitgedrukt volgens de analyse van de aminozuren, 30 - is de glucose bepaald volgens de anthronemethode, - is het fosfor bepaald volgens de methode met molybdaat na mineralisatie, - is het gehalte aan nucleïnezuren bepaald door absorptie bij 258 nm,' - de aminosuikers zijn bepaald volgens de- methode van Elson-Morgan 35 en uitgedrukt in glucosamine hetzij door analyse met ninhydrine na 800 2 1 08 - 11 - hydrolyse en afscheiding met behulp van een Biotronik LC B000 E autoanalysator.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de onderstaande voorbeelden.

5 Voorbeeld I

(A) §ereiding_van_de_cellen.

3

Men brengt in een fermentatie-inrichting 170 dm.: - pepton 1200 g - vleesextract 600 g 3 10 - soja-olie 1200 cm 3 - stadswater, aanvullen tot 110 dm .

De pH wordt ingesteld op 6,90 door toevoeging van 10 N natronloog, vervolgens steriliseert men het milieu door doorleiden van stoom bij 122°C gedurende 40 minuten. Na afkoeling is vanwege conden- 15 satie van de stoom gedurende de sterilisatie het volume van de bouil- 3 3

Ion 120 dm ; de pH van het milieu is 6,70. Men ent met 200 cm van een cultuur in een geroerde Erlenmeyer van Micrococcus sedogenes, stam M 76.

De cultuur is ontwikkeld bij 27°C gedurende 14 uren onder roe-20 ren en onder beluchting met steriele lucht; ze is dan geschikt voor enting van de bereidingsculture.

De bereidingscultuur geschiedt in een fermentatie-inrichting 3 van 800 dm beladen met de volgende stoffen: - melkzuur 4 kg 3 25 - sojaolie 2 dm - ammoniumsulfaat 2,4 kg - natriumchloride 2 kg - monokaliumfosfaat 0,4 kg - magnesiumsulfaat, 71-^0 0,8 kg 30 - kopersulfaat, 51^0 0,02 kg - zinksulfaat, 7Η^0 0,012 kg - kobaltchloride, 6hL0 0,008 kg ά 3 - stadswater aanvullen tot 370 dm .

De pH van het milieu wordt ingesteld op 7,10 door toevoeging 3 35 van 2950 cm 10 N natronloog, vervolgens steriliseert men de bouillon λ λ λ o λ na - 12 - door doorleiden van stoom bij 122°C gedurende 40 minuten. Na afkoeling is vanwege de condensatie van de stoom in de loop van de steri- 3 lisatie het volume van de bouillon 400 dm ; zijn pH bedraagt 4,20, 3 en wordt ingesteld op 6,60 door toevoeging van 2100 cm van een wate-5 rige 5 N natronloogoplossing.

3

Men ent vervolgens met 40 dm van de entcultuur uit het 3 fermenteerorgaan van 170 dm als boven beschreven. De cultuur wordt ontwikkeld bij 27°C gedurende 16 uren onder roeren met een turbine roterend met 205 omw./min, en onder beluchten met een volume steriele 3 10 lucht van 15 m /uur.

Aan het eind van de bewerking bedraagt de pH van de cultuur 3 8,20 en het volume van de bouillon 440 dm .

De aldus verkregen mout wordt afgekoeld tot +4°C en zijn pH

3 ingesteld op 3 door toevoeging van 4 dm 5 N chloorwaterstofzuur. De 15 cellen worden geïsoleerd door centrifugeren met 4000 omw./min C2900 g], 3 o

De cellen worden opgenomen met 80 drn ethanol bij -10 C onder roeren gedurende 15 minuten, en vervolgens geïsoleerd door centrifugeren en gedroogd bij 35°C onder verminderde druk [5 mm kwik) gedurende 15 uren.

20 Men verkrijgt aldus 1500 g droge cellen.

(B) Bereiding_van_het^32^919^.

1 kg van de cellen bereid als beschreven onder (A) worden ge- 3 suspendeerd in 40 dm steriel gedestilleerd water, in een reactor uit roestvrij staal voorzien van een dubbele mantel gethermostatiseerd 25 door circulatie van water en met een krachtige centrale roering. De pH wordt ingesteld op 7,0 door toevoeging van 10 N natronloog.

Men voegt vervolgens 2 g lysozyme toe en roert gedurende 2 uren bij 37°C onder periodiek instellen van de pH op 7,0 door toevoeging van 5 N natronloog.

30 Het mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd op een Sharpies machine M16 (twee achtereenvolgende passages bij 17000 omw./min met 3 3 een debiet van 30 dm /uur). De bovenstaande vloeistof (37dm ) wordt

geultrafiltreerd (toestel UFP 20 voorzien van een acrylmembraan IRIS

3042) onder recirculeren van het retentaat en onder toevoeging van 3 o 35 3 x 40 drn gedemineraliseerd water afgekoeld tot +4 C.

800 2 1 08 - 13 - 3

Men wint aldus 7 dm geconcentreerd retentaat en bevrijd van zijn Kleine moleculen (molecuulgewicht Kleiner dan ongeveer 25.000 dalton]. Zijn pH wordt opnieuw ingesteld op 7 door een 5 N natronloogoplos-sing en vervolgens wordt de verKregen oplossing gelyofiliseerd.

5 Men verKrijgt aldus 147 g ruw produKt.

1 3 31 g van dit produKt wordt opgelost in 1550 cm gedeminerali- seerd water bij een temperatuur van ongeveer 20°C onder roeren gedurende 30 minutenj men voegt vervolgens in 5 minuten en onder constant 3 3 roeren 31 cm van een waterige oplossing van 668 g/dm calciumchlori- 10 dedihydraat toe; men handhaaft de roering gedurende 30 minuten. Het gevormde neerslag wordt verwijderd door centrifugeren op een Sharpies laboratoriumtoestel met 40.000 omw./min met een debiet van 5 dm per uur.Bovenstaande vloeistof wordt gedialyseerd over een cellulosemem- braan gedurende 3 dagen bij +4°C tegen 3 x 40 dm^ gedemineraliseerd 15 water.

Het retentaat wordt dan behandeld in een rondbodemKolf door 3 310 cm polystyreensulfonhars Dowex 50 X2 in de natriumcyclus onder roeren gedurende 1 uur; de hars wordt gefiltreerd en gewassen op een 3 filter met 310 cm water.

20 De waswateren worden verenigd met het filtraat en het geheel gelyofiliseerd.

Men verKrijgt aldus 17 g 32919 RP in de zoutvorm waarvan de KenmerKen als volgt zijn: - uiterlijk: wit poeder 25 - compositie: water (Fischer] % - 15,7 droog: - proteïnen % (som van de aminozuren] = 24,6 - polysacchariden % = 3,9 - nuclelnezuren % = 28,9 volgens UV-spectrum - elementairanalyse: C: 46,30%; H: 5,84%; 0: (door verschil] 30,71%; 30 N: 10,04%; P: 3,11%; S: < 0,5%; Na: 3,70%;

Ca: 0,30%.

(C] Zuiyering_van_het_31.219_RP.

25 g van de stof 32.919 RP verkregen onder de omstandigheden 3 van voorbeeld (B] worden opgelost in 1 dm gedemineraliseerd water 3 35 in een reactor van 2 dm , vooiziei van een roerorgaan en een tempera- 3

tuurregelorgaan; men voegt 1 dm van een mengsel van fenol en water άλλο 4 n O

3 - 14 - (109 cm water op 1 Kg fenol) toe. Het mengsel wordt verwarmd op 65°C onder Krachtig roeren. Het roeren wordt gedurende 30 minuten bij dezelfde temperatuur voortgezet. Na snel afKoelen van de reactor met behulp van een ijsbad tot een temperatuur van ongeveer 25°C scheidt 5 men de fasen door centrifugeren bij 3300 g gedurende 30 minuten op 3 een afgeKoelde laboratoriummachine (Jouan type K 63 F; 4 dm inhoud).

3

Men verKrijgt aldus 450 cnr waterige fase; "

De fenolfasë en de tussenfase worden opnieuw geëxtraheerd met 3 o 1 drn gedemineraliseerd water gedurende 30 minuten bij 65UC; na af- 10 Koelen en centrifugeren als boven vermeld verKrijgt men opnieuw 1470 3 cm waterige fase.

De waterige fasen worden verenigd. Fenol wordt verwijderd 3 door twee achtereenvolgende wasbehandelingen met 2 dm chloroform elK. De waterige fase wordt vervolgens geKlaard door centrifugeren gedu- 3 15 rende 30 minuten bij 3300 g. Men verKrijgt aldus 1800 cm waterige fase.

Deze geKlaarde waterige fase wordt vervolgens gedialyseerd o 3 gedurende 3 dagen bij +4°C tegen 3 x 40 dm gedemineraliseerd water. Het retentaat wordt gelyofiliseerd en men verKrijgt aldus 14,5 g 20 van een wit amorf poeder.

3

Men lost 8 g van dit poeder op in 400 cm van een 0,1 M steriele natriumacetaatbuffer bij pH 7 (men lost 136,09 g natriumacetaat 3 voor analyse op in 0,9 dm gedemineraliseerd water en stelt de pH vervolgens in op 7,0 door toevoeging van azijnzuur (d * 1,049) en 3 25 vult aan tot 1 dm ; steriliseren geschiedt door verhitten gedurende 45 minuten op 122°C; deze oplossing wordt verdund tot een tiende met steriel gedemineraliseerd water juist voor het moment van gebruiK).

De verKregen oplossing wordt uitgegoten op een Kolom Sepharose (R) CL 4B (diameter: 13,5 cm, hoogte: 65 cm) aangebracht in een Koude 30 Kamer (+4°C) en opgetroKKen aan 0,1 steriele natriumacetaatbuffer bij pH 7,0. De elutie geschiedt met dezelfde buffer met een debiet van 3 1,33 dm'Vuur onder continu registreren van de absorptie bij 230 nm onder 0,1 cm van het eluaat.

3

Men wint eerst een fractie van 3,13 dm , die wordt geëlimi- 3 35 neerd. De volgende fractie (1,22 dm ), die correspondeert met een 800 2 1 08 λ, 9 - 15 - absorptiepiek van 230 nm wordt gebracht in een buis geregeneerde cellulose Nojax^ en wordt gedialyseerd bij +4°C gedurende 3 dagen tegen 3 3 x 40 dm gedemineraliseerd water en vervolgens wordt het retentaat 3 (1300 cm ) gelyofiliseerd. De verkregen vaste stof wordt opgenomen 3 5 in 93 cm gedemineraliseerd water en de oplossing wordt gedialyseerd met hetzelfde membraan als boven gedurende 48 uren bij +4°C tegen 3 2 x 20 dm gedemineraliseerd-water. Het retentaat wordt gelyofiliseerd.

Men verkrijgt aldus 1,3 g stof 41.200 RP waarvan de kenmerken 10 als volgt zijn; - uiterlijk; wit amorf poeder - UV-spectrum: dit spectrum wordt afgebeeld door fig.l.

- infraroodspectrum: (bepaald met tabletten gemengd met KBr).

Dit spectrum wordt afgebeeld door fig.2 waarop men op de abscis 15 enerzijds de golflengten uitgedrukt in u (bovenste schaal) heeft ' -i afgezet en anderzijds het golfgetal in cm (benedenste schaal) en op de ordonnaat het percentage doorlaatbaarheid.

In onderstaande tabel zijn de belangrijkste infraroodabsorptie-banden van de stof 41.200 RP uitgedrukt in het golfgetal.

20 3420 cm 1 tF (waarvan H_0) 1440 cm 1 ép. 900 cm 1 f -1 1 -1 3280 cm ep. 1405 cm ep. 875 cm f 3090 cm 1 ép. 1375 cm 1 F 800 cm 1 m 2970 cm 1 ép. 1335 cm 1 ép. 775 cm 1 f 2950 cm 1 ép. 1310 cm 1 m 720 cm 1 ép.

25 2920 cm 1 F 1230 cm 1 m 630 cm 1 ép.

2845 cm 1 m 1210 cm 1 ép. 560 cm 1 F (waar- 2680 cm"1 ép. 1160 cm"1 F Van H20) 2100 cm"1 tf 1115 cm"1 F 520 cm'1 ép.

1730 cm 1 ép. 1060 cm 1 tF 480 cm 1 ép.

30 1645 cm 1 tF 1025 cm 1 ép. 450 cm 1 ép.

1545 cm 1 F 945 cm 1 m 400 cm 1 ép.

1460 cm 1 ép. 365 cm 1 ép.

tF * zeer sterk f = zwak F = sterk tf = zeer zwak 35 m 55 middelmatig ép.= schouder 800 2 1 08 - 16 - - samenstelling: water (Fischer) % = 3,8 droog: aminozuur % = 12,3 (waarvan 7% alanine) glucose % = 11,95 nuclelnezuren % = <1,3 (volgens UV-spectrum) 5 aminesuikers % * 16,3 - elementairanalyse: C: 45,58%; H: 7,47%; N: 4,05%; 0: 37%; P·: 1,17%;'Cl: 0,25%; Na:2,36%; Ca: 1,33%; S: <0.5%. ' - - elektroforese.

10 In een gel met 1% agarose met barbitalbuffer bij pH 8,6 en onder een spanning van 6 V/cm migreert het 41.200 RP naar de anode met een snelheid van 11 mm/uur.

(Het produkt wordt aangetoond door het Schiffse reagens na een oxydatie met perjoodzuur of met behulp van Soudan B zwart.)

15 Voorbeeld II

Men werkt als in voorbeeld I (A). Na 16 uren kweken wordt de mout afgekoeld tot 4°C en zijn pH ingesteld op 3 door toevoeging van chloorwaterstofzuur. De cellen worden geïsoleerd door centrifugeren bij 4000 omw./min. De zure celkoek wordt dan verwarmd in een autoclaaf 20 gedurende 45 minuten bij 122°C. Na afkoeling worden de cellen gewassen met ethanol en vervolgens gedroogd.

Door vervolgens te werken als in voorbeeld I (B) en I (C) en onder gebruik van dezelfde hoeveelheden, verkrijgt men 0,45 g stof 41.200 RP in de vorm van een wit amorf poeder, waarvan de kenmerken 25 als volgt zijn: - samenstelling: water (Fischer) % = 6 droog: aminozuren % = 17,7 (waarvan 7,2% alanine) glucose % = 10,5 - nuclelnezuren % * < 3 30 aminesuikers % * 15,2 - elementairanalyse: C: 46,90%; H: 7,32%; N: 5,38%; 0: 35%; P: 1,08%; Cl: 0,18%; Na:2,26%; Ca: 1,83%; S: < 0,5%.

Het infraroodspectrum van dit produkt is identiek aan dat van 35 stof 41.200 RP verkregen in voorbeeld I.

800 2 1 08 - 17 -

De uitvinding heeft eveneens betrekking op de geneesmiddelen, bestaande uit het produkt volgens de uitvinding, en de farmaceutische preparaten die het bevatten, gecombineerd met een of meerdere verdun-ningsmiddelen of toevoegsels die zich ermede verdragen en farmaceu-5 tisch aanvaardbaar zijn en eventueel met tenminste één ander therapeutisch actief produkt zoals een antibioticum.

Bij voorkeur worden deze preparaten parenteraal of intranasaal toegepast.

De preparaten volgens de uitvinding voor parenterale toepas-10 sing kunnen steriele waterige oplossingen, suspensies of emulsies zijn. Als drager in deze laatste gevallen kunnen propyleenglycol, een polyethyleenglycol, plantaardige oliën, in het bijzonder olijfolie en injecteerbare organische esters, b.v. ethyloleaat, worden toegepast. Deze preparaten kunnen eveneens toevoegsels bevatten in 15 het bijzonder bevochtigingsmiddelen, emulgeermiddelen en dispergeer-middelen. Het steriliseren kan op verschillende wijzen worden uitgevoerd b.v. door in het preparaat steriliserende middelen op te nemen. Zij kunnen eveneens worden bereid in de vorm van vaste preparaten, die worden gesteriliseerd door bestraling ί/Q -stralen), die kunnen 20 worden opgelost in steriel water of worden gedispergeerd in elk ander injecteerbaar steriel milieu, eventueel op het moment van gebruik.

De preparaten voor intranasale toediening kunnen steriele waterige oplossingen, suspensies of emulsies zijn die eventueel kunnen worden gecombineerd met een verdraagzaam drijfmiddel.

25 De preparaten volgens de uitvinding zijn bijzonder geschikt in de humane en veterinaire therapie voor de immunologische behandeling (immunotherapie) van kankers, eventueel gecombineerd met een geschikte anti-kankerchemotherapie of in de loop van door laatstgenoemde veroorzaakte afname van de ziekteverschijnselen.

30 De preparaten kunnen eveneens worden toegepast voor het verbe teren van de resistentie tegen virale, bacteriële, fungicide of parasitaire infecties, de natuurlijke afwéer van het specifiek op deze infecties reagerende organisme stimuleren, door intranasale toediening de natuurlijke barrières tegen ademhalingsinfecties versterken, 35 of een bijkomend effect hebben op de specifieke immunisatie gedurende 800 2 1 08 r -15- de bij Komende toediening van een bacterieel, viraal of parasitair vaccin.

Deze preparaten Kunnen ooK de adequate immunologische respónsen bij personen die congenitale immunodeficiënties vertonen of als ge-5 volg van ouderdom of immunosuppressieve behandelingen herstellen.

In de humane therapie zijn de doses afhanKelijK van het beoogde effect en de duur van de - behandeling;-- zij liggen in' het'algemeen -tussen' "· 0,1 en 10 mg per dag voor een volwassene langs parenterale weg.

10 Het volgende voorbeeld illustreert een preparaat volgens de uitvinding.

Voorbeeld:

Men bereidt een oplossing, bevattende 5 g van de stof 41.200 RP in zoutvorm, voorafgaand gesteriliseerd door bestraling met be- 3 15 hulp van /3-stralen, in 100 cm injecteerbare steriele oplossing.

3 3

Deze oplossing wordt aseptisch in ampullen van 5 cm elK met 2 cm per ampul verdeeld. Deze ampullen worden afgedicht. Zij bevatten elK 100 mg actieve stof.

800 2 f 08

Claims (7)

1. De nieuwe stof aangeduid door nummer 41200 EP gekenmerkt, dat zij geïsoleerd uit cellen van de stam Micro'coecus sedogenes M 78 is, is een amorf wit poeder, in watervrije toestand in hoofdzaak bestaande uit: 11 - 18 % aminozuren, 10 - 17 % glucose, 10 -17 % aminosuikers en minder dan 5 l nucleïnezuren en waarvan de ele-mentair-aaalyse ongeveer is: C % = 45 - 17 H % = 7,1 - 7,6 0 % = 35 - 38 N % = 4,0 - 5,7 p % = o,9 - 1,2 Cl l = 0,1 - 0,1)· S < 0,5 Na % - 2,0 - 3,0 Ca % = 0,9 - 1,9 en die immuno-stimulerende eigenschappen bezit.

2. Werkwijze voor het bereiden van de stof lt-200 EP, met het kenmerk, dat men a) een waterige suspensie van cellen van Micrococcus sedogenes stam M 78 (NRRL B-3505) met lysozyme behandelt bij een constante pH van 6,5 - 8, gedurende 1 - 3 uren en bij een temperatuur van ongeveer 37°C, b) een ruw produkt, in zoutvorm uit de vloeibare fase van de verkregen suspensie isoleert en het zuivert door behandeling met calciumchloride waarbij men de stof 32919 EP verkrijgt, c) men de stof 32919 EP zuivert door behandelen van de waterige oplossing met fenol gevolgd door fractioneren op een moleculair-filter onder winning van de fractie met hoog molecuulgewicht, waaruit men de stof 41200 EP isoleert.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men 2 - 20 mg lysozyme/g cellen gebruikt.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men wanneer men de zuivering uitvoert met calciumchloride 5 - 50 g calciumchloride per liter oplossing van het te zuiveren produkt gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men wanneer men de stof 32919 RP in waterige oplossing zuivert men een waterige fenoloplossing, die ongeveer 90 % fenol bevat, gebruikt.

6. Geneesmiddel, met het kenmerk, dat het bestaat uit het Q Λ n 0 1 flfl * - 20 - produkt volgens conclusie 1, eventueel in combinatie met een of meerdere zich ermede verdragende en farmaceutisch aanvaardbare ver-dunningsmiddelen of toevoegsels en eventueel met een of meerdere andere therapeutisch, actieve produkten. 5

7· Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de stof aangeduid met nr. 32919 EP hierin bestaat, dat zij is geïsoleerd uit cellen van de stam Microccus sedogenes M 78» en in hoofdzaak bestaat uit 2b - 33 % aminozuren, 26 - 33 % nucleïnezuren, 11 - 17,5 · % aminozuikers en 2,8 - U,3 % polysacchariden en zijn samenstelling 10 is ongeveer : C % = bb - bQ H % = 5,2 - 6,7 0 % - 29 - 33 Ή % = 10,0 - 11,6 P % = 2,3-3,7 S $ < 0,5 Na % = 3,0-3,8 Ca$& = 0,15- 0,50 800 2 1 08