DE1197194B - Herstellung des tumorhemmenden Wirkstoffs Actinogan - Google Patents

Description

• Herstellung des tumorhemmenden Wirkstoffs Actinogan Die Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung eines neuen Actinogan genannten Polysaccharidkomplexes, der tumorhemmende Eigenschaften besitzt. Das Actinogan wird gemäß der Erfindung erzeugt, wenn man als Mikroorganismus Nocardia humifera nov. spec. Nocardia humifera ATCC 13 748 unter üblichen submersen aeroben Bedingungen züchtet.
• Zur Gewinnung des Actinogans selbst kann dieses in üblicher Weise aus der Gärbrühe abgetrennt werden.
• Eine Kultur des Mikroorganismus Nocardia humifera nv. spec. wurde in der American Type Culture Collection, Washington D. C., hinterlegt und in die ständige Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 13 748 aufgenommen. Dieser Organismus wurde aus einer im Staate Colorado, USA.,- -aufgenommenen Bodenprobe isoliert. Er ist durch die Entwicklung eines mäßigen bis starken Nährbodenwachstums gekennzeichnet, das leicht in stäbchenähnliche Teile zerbricht. Das Fehlen der Bildung eines Luftmycels auf einer Vielzahl von Medien ist für diese Kultur gleichfalls charakteristisch. Das anfängliche Wachstum ist farblos bis weiß, weich und feucht. Sowie die Kultur altert, wird das Wachstum schmutzigweiß bis graugelbbraun, aufgerichtet, knötchenförmig bis faltig, von teigig bis lederartiger Konsistenz, während die Ränder faserig werden. Ein hellgelbes bis leicht braunes lösliches Pigment kann in Proteinmedien gebildet werden. Gelegentlich entwickeln alte Kulturen kleine isolierte Flecken oder Abschnitte einer sehr. dünnen, samtartigen weißen bis leicht grauen Ausblühung auf gewissen Medien durch die Ausbreitung des vegetativen Mycels in die kurzen aufgerichteten Fasern an der Luft. Ein übermäßiges Wachstum tritt bei 22 bis 37° C auf. Ein begrenztes Wachstum findet bei 42° C statt. Bei 50° C findet kein Wachstum mehr statt.
• Die mikroskopische Prüfung der bei 28° C gezüchteten Nocardia humifera auf Standardmedien, wie Herz-Infusions-Agar, Trypticase-Sojabohnen-Agar und Glucose-Hefeextrakt-Agar zeigt, daß das Nährbodenwachstum anfänglich fadenförmig und nicht durch Scheidewände unterteilt mit zahlreichen Seitenästen nahezu rechtwinklig zur Hauptachse ist. Das Mycel unterteilt sich rasch in große, uneinheitliche Abschnitte durch die Bildung von transversal verlaufenden Scheidewänden und durch die Kondensation des Cytoplasmas innerhalb der Fäden. Diese großen Einheiten zerspalten sich in kurze, grampositive, nicht säurefeste, nicht frei bewegliche, pleomorphe Stäbchen von 0,7 bis 6,0 -0,5 bis 0,7 Mikron innerhalb von 2 bis 3 Tagen. Häufig entwickeln die kleineren Stäbchen ausgerichtete Schwellungen, die den Eindruck von Doppelkokken erwecken. Gramgefärbte Kulturzubereitungen zeigen, daß das Cyctoplasma innerhalb der Stäbchen häufig zu verschiedenen stark gefärbten Kokkeneinheiten kondensieren kann. Diese Einheiten bleiben gewöhnlich innerhalb der Zellwand auch in alten Kulturen und liegen nicht in größerer Anzahl als freie Kokkenkörper vor. Keime werden an den Seitenflächen einiger Zellen gebildet. Vergrößerte Zellen und Zellketten bis zu 1,5 Mikron Breite werden in beschränktem Maße gebildet.
• Eine Sporophorenbildung wird kaum beobachtet. Die Sporophorenbildung in Kulturen des Nocardia humifera ist schwierig zu beobachten. Einige isolierte Büschel offener bis geschlossener Spiralen von drei bis fünf Windungen wurden auf zwei Medien festgestellt, von denen beide einen Nährstoffmangel für die Kultur darstellen, d. h. Pridhams und Gottliebs Grundmedium mit Sucrose oder Natriumacetat als einzige Quelle für Kohlenstoff. Die Conidien sind ellipsenförmig bis rechteckig mit abgerundeten Enden und einer Größe von 0,7 bis 1,2 - 1,2 bis 1,8 Mikron.
• Die Gattung Nocardia wird in zwei Hauptgruppen gemäß dem Klassifikationssystem von Nocardia von Waksman und Henrici in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. Ausgabe), 1957, und Actinomycetes, Bd. II, von W a k s m a n, S. A., 1961, eingeteilt. Gruppe I enthält nach der Beschreibung diejenigen Mikroorganismen, die »teilweise säurebeständige Organismen mit stark brechenden Zellen darstellen, nicht proteolytisch und im allgemeinen nicht diastatisch und fähig zur Verwertung von Paraffin« sind. Nocardia humifera ist in Gelatine und Milch proteolytisch, diastatisch und nicht säurebeständig und gehört deshalb nicht in diese Gruppe. Gruppe 1I wird beschrieben als »nicht säurebeständige Organismen mit schwachbrechenden Zellen; keine deutliche Bildung von Kokken; diastatisch«. Diese Gruppe wird weiter in zwei Abschnitte eingeteilt: einen »nicht proteolytischen Teil«, der Nocardia humifera ausschließen würde, und einen »proteolytischen Teil«, der dreizehn Arten enthält. Ein sorgfältiger Vergleich mit den Beschreibungen dieser dreizehn Arten zeigte, daß Nocardia humifera ATCC 13 748 recht stark dem Nocardia fiavescens (Jensen, 1931), Waksman und Henrici, 1948, ähnelt. Die Bildung von spiralförmigen Sporophoren durch Nocardia humifera macht es möglich, diesen von Nocardia flavescens zu unterscheiden und wird deshalb als neue Art betrachtet. Wachstum und biochemische Reaktion Den folgenden Wachstumsangaben liegt eine 14-tägige Beobachtungszeit zugrunde bei Vorliegen verschiedener Medien und einer Temperatur von 28° C. Sofern nicht anders angegeben, beruhen alle Kulturbeschreibungen auf Beobachtungen eines Wachstums, das dadurch erzielt wurde, daß eine Nähr-Agar-Oberfläche nach dem »Cross-hatsch«-Verfahren beimpft wurde, die lebhaft wachsende vegetative Zellen aufwies. Der Impfstoff wurde dadurch hergestellt, daß man die Kultur in einer Trypton-Hefeextraktbrühe im »Rotary«-Schüttler 48 Stunden lang bei einer Temperatur von 26 ± 1° C wachsen ließ.

  Tomatenpaste-Haferme-Agar

  Substratwachstum üppig, graubräunlich bis grau,

  zopfförmig, teigig bis lederartig

  Luft-Mycel ..... Keines, gelegentlich Entwick-

  lung kleiner Flecken und/oder

  Abschnitte eines dünnen,

  weißen Belages

  Rückseite

  (reverse) ...... braun

  Lösliches Pigment hellbraun

  Großkolonie .... graubraun, flach bis erhaben,

  zopfförmig mit radialen Fur-

  chen, Mitte häufig zu einem

  Punkt erhöht, wellenförmiger

  Rand, teigig bis lederartig, Ko-

  lonie stark am Substrat hängend

  Benett-Agar

  Substratwachstum mäßig bis üppig, farblos bis

  blaßgelborangebraun, teigig,

  knotig bis wabenförmig (viele

  anastomose Grate und Falten)

  Luftmycel ...... keines

  Rückseite ....... farblos bis blaßgelborange

  Lösliches Pigment blaßgelborange

  Großkolonie .... farblos bis blaßgelbbraun, er-

  höht, Oberfläche wabenförmig,

  Rand gewellt, teigig, Wachstum

  gewöhnlich nicht stark am Sub-

  strat hängend

  Higkey und Tresner-Agar

  Substratwachstum üppig, farblos bis blaß leder-

  farben, lederartig, Zopfform

  Luftmycel ...... keines

  Rückseite ....... verschiedene Schattierungen in

  lederfarbig

  Lösliches Pigment sehr schwach braun

  Czapek-Agar-Lösung

  Substratwachstum spärlich, farblos bis weiß, flach,

  glatt bis leicht knotig, faserig

  Luftmycel ...... keines

  Rückseite ....... farblos

  Lösliches Pigment keines

  Anorganisches Salz-Stärke-Agar

  Substratwachstum mäßig, weißlich bis blaß

  schmutziggelb, teigig bis leder-

  artig, knotig zu zopfförmig

  Luftmycel ...... keines

  Rückseite ....... weißlich bis blaßgrünlichgelb

  Lösliches Pigment keines

  Bemerkung: Medium klar (2- bis 3-mm-Zone). Hefeextraktagar Wachstum ähnlich wie auf Bennett-Agar. Textrose-Trypton-Agar Wachstum ähnlich wie auf Bennett Agar.

  Glycerin-Asparagin-Agar

  Substratwachstum mäßig, schwach, orange, glatt

  bis leicht geraubt, lederartig

  Luftmycel ...... keines

  Rückseite ....... blaßlederfarben

  Lösliches Pigment keines

  Dextrose-Asparagin-Agar

  Substratwachstum mäßig, schwach weiß bis blaß-

  orangebraun, raub bis stark ge-

  faltet (wabenförmig), teigig bis

  lederartig

  Luftmycel ...... keines

  Rückseite ....... schwach weiß bis blaßorange-

  braun

  Lösliches Pigment nur ganz schwach braun

  Casein-Agar (Magermilch)

  Substratwachstum mäßig, bis üppig, weiß bis blaß-

  gelblederfarbig, weich, leicht

  gerauht bis knotenförmig, Kante

  ist nicht faserig

  Luftmycel ...... keines

  Rückseite ....... gelborange

  Lösliches Pigment blaßgelb

  Bemerkung: Positive Caseinhydrolyse 3 bis 5 mm nach 3 Tagen Kla zone mit Klärung des Substrates nach 7 bis 10 Tagen.

  Tyrosin-Agar

  Substratwachstum mäßig, graubräunlich, knotig

  bis zopfförmig, teigig

  Luftmycel ...... keines, gelegentlich entwickeln

  sich kleine Flecken und/oder

  Abschnitte eines dünnen, weißen

  bis leicht grauen Belages auf

  der Oberfläche

  Rückseite ....... dunkelrötlich, braun

  Lösliches Pigment Substrat verfärbt sich zu einem

  dunklen Rnthrann

  Bemerkung: Tyrosinkristalle gelöst. Kohlehydratsäure Xylose . . . . . . . . . kein Wachstum Lactose . . . . . . . . . kein Wachstum Maltose ........ positiv Mannose ....... positiv Adonit ......... positiv Arabinose ...... kein Wachstum Galactose ....... positiv Glucose ........ positiv Glycerin ........ positiv Inosit .......... positiv Mannit ......... positiv Raffinose ....... kein Wachstum Rhamnose ...... kein Wachstum Sorbit .......... positiv Schafsblut-Agar Citrat Üppiges Wachstum, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment, Blut-Haemolyse - nach 72 Stunden (1- bis 2-mm-Zone) - schwach positiv. Kohlenstoffverwertung Auf Pridhams anorganischen Agar als Grundmedium konnte Wachstum festgestellt werden bei 28' C in einem Zeitraum von 10 Tagen bei Vorliegen von nur folgenden Kohlenstoffquellen: Glukose, Calctose, Fruktose, Maltose, d-Mannit, Sorbit, Dextrin, Stärke, Glyzerin, Inosit, Natriumcitrat, Natriumsccinat (gering).
• Kein Wachstum wurde festgestellt auf Rhamnose, Sucrose, Lactose, Xylose, Raffinose, Cellubiose, Inulin, Dulcit, Natriumacetat, Natriumoxyalat, Natriumsalicylat und Natriumtartrat.

  Sauerstoffbedarf aerob; wächst nicht anaerob

  Stickstoff-

  verwertung ... Nitrat und Ammoniumsalze,

  Asparagin und Pepton werden

  verwertet

  Cellulose, Paraffin

  (Schmelzpunkt

  56 bis 58°C) .. Phenol, m-Cresol und o-Cresol

  werden in einem Grundsalz-

  medium nicht verwertet, das

  entweder Nitrat oder Am-

  moniumsalze als Stickstoffquelle

  enthält

  Schwefelwasser-

  stoff . . . . . . . . . nicht erzeugt

  Acetylmethyl-

  carbinol ...... nicht erzeugt

  Catalase ........ positiv

  Gelatine . . . .. .. . 70- bis 100°/oige Verflüssigung

  in 14 bis 21 Tagen, es wird kein

  lösliches Pigment gebildet

  Stickstoff-

  verwertung ... Nitrite werden aus Nitraten ge-

  bildet

  Stärkehydrolyse positiv

  Kartoffelpfropfen 1- bis 2wöchiges Wachstum

  feucht, glatt bis leicht gerunzelt,

  cremefarben, kein Luftmycel

  gebildet, Farbe des Nährbodens

  unverändert

  3wöchentliches Wachstum auf-

  recht, faltig, cremefarben bis

  gelblichbraun, einige verbreitete

  Hügel eines weißen Luftmycels,

  Farbe des Nährbodens unver-

  ändert

  Lackmusmilch ... 2 Tage bei 28°C-keine Farb-

  veränderung, keine Peptonisie-

  rung oder Koagulation

  8 Tage - Wachstum als weißer

  vegetativer Ring, positive Pep-

  tonisierung und Koagulation,

  PI-1 6,8

  21 Tage - dasselbe wie bei

  8 Tagen

  Der Herstellung des Actinogans durch Fermentation, ihrer Gewinnung und Reinigung folgte ein Invivo-Antitumorversuch unter Benutzung von Sarcoma-180 (S-180) an Mäusen. Dieses Untersuchungsverfahren hält sich streng an die bei D. A.Clarke, (»Mouse Sarcoma 180«, Cancer Research, Supple, Nr. 3, S.14 bis 17, 1955) beschriebenen. Die In-vivo-S-180-Untersuchungen wurden mit einer Experimentiergruppe von fünfzig Mäusen, denen Stückchen gleicher Größe (etwa 2 bis 3 mm3) eines Tumors von einem Spender stammend eingepflanzt wurden, gemacht. Diese fünfzig Mäuse sind stets- gleicher Abstammung (Swiss-Webster), von gleichem Geschlecht, Herkunft und Gewicht (20±2 g). Sie werden aufgeteilt in acht Behandlungsgruppen von je fünf Mäusen und eine Kontrollgruppe mit zehn Tieren. 24 Stunden nach erfolgter Implantation des Tumors beginnt man die Versuchsmäuse mit dem Versuchsmittel gegen Tumor intraperitonal zu injizieren und setzt das zweimal täglich fort, bis insgesamt dreizehn Injektionen erreicht sind. Verdünnte Brühe oder Festsuspensionen werden in einer einheitlichen Volummenge von 0,5 ml »Locke-Ringer-Salz« verabreicht. Die zehn Kontrollmäuse erhalten nur dreizehn Injektionen mit »Locke-Ringer-Salz«. Am achten Tag nach der Implantation wird die Tumorgröße ausgewertet, indem man die Maße durch die Haut des Tieres in ihrer längsten Ausdehnung und senkrecht dazu mit Meßzirkel mißt. Der durchschnittliche Durchmesser des Tumors der behandelten Tiere wird bestimmt und mit den Maßen der Kontrolltiere verglichen. Das Verhältnis behandelte (treated) Tiere zu Kontrolltieren (control) (TIC) der durchschnittlichen Abmessung wird in der Weise.echnet, daß der Grad der durch die Behandlung erzielten Hemmwirkung in Augenschein tritt. Eine gründliche statistische Untersuchung hat ein Verhältnis TIC = 0,75 als brauchbaren maximalen Meßpunkt für die Wirksamkeit erkennen lassen.' Um alle möglicherweise verspätet auftretende Erscheinungen zu : beobachten, wurden nach Einstellung der Behandlung die Tiere in einigen Fällen mehrere Wochen zurückbehalten, um die weitere Entwicklung des Tumors festzustellen. In beinahe allen Fällen begannen die durch die Behandlung aufgehaltenen Tumore wieder zu wachsen, und zwar in einem Maße, daß sie sehr rasch die Geschwulstgröße der Kontrolltiere erreichten. In seltenen Fällen tritt ein Rückgang des Tumors und völlige Heilung des Versuchstieres als Folge der Behandlung ein. Die Fälle einer spontanen Regression machen bei S-180 5 bis 10 % aus; die zurückbleibenden Tumorgeschwülste wachsen sehr rasch und töten das betreffende Tier in einem Zeitraum von etwa 3 Wochen. Die besten verfügbaren Antitumormittel können zu einer über 50 % völligen Regression bei mit diesem Tumor behafteten und behandelten Mäusen führen. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: Beisniel 1 Die Medien (1; 2) wurden in 100-ml-Mengen in 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bereitet und im Autoklav bei etwa 6,8 kg (15 pounds) behandelt. Für eine 2%ige Impfung wurde ein vegetatives Wachstum von 30 Stunden der amerikanischen Kultur 13 748 verwendet. Die Fermentationen wurden in einem Rotaryschüttler bei 27° C durchgeführt. Die Aktivität gegen Tumor der in Schüttelflaschen fermentierten Brühe nach 72 Stunden betrug: S-180 bei 32x: TIC = 0,55. (1) Impfmedium Glukose .................... 2,00/0 (NH4)2S04 . . . . . . . . : . . . . . . . . . 0,3% ZnS04 # 7 H$0 . . . . . . . . . . . . . . . 0,003% Maismehlweichwasser . . . . . . . . 1,0 0% (V(V) Pharmamedium . . . . . . . . . . 1,00/0 CaCOe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/0 (2) Produktionsmedium Cerelose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/0 NaCI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5% Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . 3,0% CaCOs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3% Beispiel 2 In einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von etwa 45001 (1000 Gallonen) wurden dieselben Bedingungen eingehalten, was die Medien, die Temperatur und die Impfung betrifft, wie bei der Schüttelflaschenfermentation.
• Die Aktivität gegen Tumore betrug bei der im Tank fermentierten Brühe nach 70 Stunden: vs. S-180 bei 64x: TIC = 0,37.
• »64x« bedeutet dabei, daß die Brühe untersucht wurde, nachdem sie mit 63 Volumeinheiten eines Pufferungsmittels verdünnt worden war.
• Es wurde festgestellt, daß der aktive Bestandteil »Actinogan« durch Aceton oder Ammoniumsulfat ausgefällt wurde. Weder Aktivkohle (1% charcoal) noch das carboxylische Kationenaustauschharz IRC-50 (Na) beseitigte die Aktivität. AMBERLITE IRC-50® ist ein im Handel befindliches Kationenausstauschharz vom carboxylischen Typ und stellt ein Copolymer aus Methacrylsäure und Divinylbenzol dar, wobei Divinylbenzol einen 21/z- bis 5o/oigen Bestandteil des Harzes ausmacht. Zinkchlorid fällte unwirksame Verunreinigungen aus, Protamin ergab ein wirksames Festes. Durch Celluloseacetatmembranen dialysierte die Aktivität nicht.
• Das Ausfällen bei verschiedenen pH-Werten ergab aktive Präcipitate und Supernatante bei einer Indikation der maximalen Unlöslichkeit bei 9,5 pH.
• Aktive Präcipitate wurden entweder aus 4 Volumeinheiten Aceton oder gesättigtem Ammoniumsulfat mit Methanol bereitet, der unlösliche Anteil wurde in Wasser gelöst und dialysiert und die sich ergebende Lösung durch Zusetzen von Alkohol fraktionell ausgefällt. Das Feste war aktiv vs. S-180 bei 8 mkd (TIC = 0,54), zeigte aber keine Aktivität in vitro gegen B. subtilis bei 6 oder 8 pH, Stath. aureus oder E. coli noch auf Spektralplättchen bei 10 oder 50 mg/ml. Das Ultraviolettabsorptionsbild zeigte eine breite Schulter zwischen 260 und 280 m[,.
• Acetonpulver wurden durch wiederholtes Durchpassieren durch SEPHADEXƒ G 25,G 50 und G 75 gereinigt. Letztere sind im Handel befindliche verzweigte Dextranpolymere, die mit Wasser ein Gel bilden, als Molekularsiebe dienen und Polyglykosemoleküle absorbieren unterhalb einem Molekulargewicht von 3000, 7000 bzw. 10 000. Dabei waren die Fraktionen mit den größten Molekülen die am meisten aktiv wirkenden. Diese wurden darauf mittels Chromatographie und Kolonnen mit modifizierter Cellulose, die als Anionaustauscher dienen, gereinigt.
• Die aus den modifizierten Cellulosekolonnen mit Pufferlösungen eluierten Fraktionen wurden im Gefrierverfahren getrocknet und ergaben farblose Pulver, die eine Wirksamkeit zeigten gegen Tumore S-180, Ca 755 und Ehrlichsche Asciten bei einer Dosis von 1 bis 2 mg/kg/täglich verabreicht an Tumor tragende Mäuse. Das Material zeigte sich positiv in Molisch-, Anthron-, Tauberschen Resorcinol - und Anilin-Acetat-Testen. Negativ waren die Barfoed-, Benedict- und Seliwanoff-Versuche. Das Material entfärbte weiterhin Brom und alkalinische Permanganatlösung. Ninhydrin- und Sakaguchi-Versuche verliefen positiv, die Elson-Morgan- und Morgan-Elson-Versuche verliefen schwach positiv, und der Xanthoproteintest war negativ.
• Der wirksame Bestandteil Actinogan scheint eher ein Kohlehydratgroßmolekül als ein Peptid zu sein und läßt sich durch einige, aber nicht alle Protein-Fällungsmittel ausfällen. Der Stoff ist unter Laboratoriumsbedingungen gegen pH-Schwankungen zwischen 4 und 9 und Erhitzen auf 50° C ziemlich stabil, wird aber bei 100° C inaktiv und weist ein Molekulargewicht von über 7000 bis 10 000 auf, was dadurch erkennbar wurde, daß er auf Sephadex G 75 (ein verzweigtes Dextrangel, das Stoffe mit einem Molekulargewicht, das höher als 7000 bis 10 000 ausschließt) nicht zurückgehalten werden konnte.
• Das nun folgende Beispiel dient nur der Erläuterung, stellt keine Einschränkung der Erfindung dar und illustriert die Gewinnung des erfindungsgemäßen Polysaccharids aus einer Fermentationsbrühe.
• Beispiel 3 Isolierung und Reinigung des Actinogans Eine nach vorstehendem Verfahren gewonnene Brühe wurde zentrifugiert, die so erhaltene klare Brühe mit Ammoniumsulfat abgesättigt und das ausgefällte rohe Actinogan durch Zentrifugieren abgetrennt. Hierauf wurde das rohe Actinogan in einer sehr kleinen Menge destillierten Wassers aufgelöst und dann 6 Stunden lang im Celluloseacetatrohr gegen Leitungswassers dialysiert. Teile der Lösung wurden im Gefrierverfahren getrocknet (festes G 21) oder unter Zusatz von 4 Volumteilen Aceton verdünnt (festes G 23).
• Das Feste, das durch Ausfällen mit Aceton erhalten wurde, wurde in einer minimal Menge Wasser aufgelöst und durch eine Kolonne mit SEPHADEX@ G 25 geleitet. Eine Kolonne mit einem Durchmesser von etwa 7,62 cm und einer Länge von etwa 18,0 cm, die ein aus 100 g SEPHADEXƒ G 25 bereitetes Gel enthielt, wurde mit 180 ml einer gesättigten Lösung aus zweimal gefälltem Festmaterial (G 23) beschickt. Die ersten 200 ml des Ausflusses wurden verworfen, und die nächsten 200 ml wurden im Gefrierverfahren getrocknet (Ergebnis: festes Actinogan, Muster G 27).
• Bei einem Versuch, die Molekularsiebkolonnen für eine weitere Reinigung auszunutzen, wurde ein Gel mit größerer Porengröße (G 50) eingesetzt. SEPHADEXƒ G 50 absorbiert Polyglucose Moleküle unter einem Molekulargewicht von 7000. Die Fraktionen mit den größten Molekülen zeigten die größte Wirksamkeit, doch wiesen selbst die Fraktionen mit den kleinsten Molekülen noch eine gewisse Aktivität auf (G 36-41). Die Wirksamkeit nach dem S-180-Versuch bei Mäusen ergab folgende Resultate:

  Wirksamkeit (T/C-Verhältnis)

  Dosis

  32 16 8 I 4 2 1 I 0,5

  Untersuchtes Material (fest)

  Am. Sulfat ppte. G 21 . . . . . . . . . . . . . . . . . - toxisch 0,52 0,83 - - -

  Am. sulfat ppte. G 23 . . . . . . . . . . . . . . . . . toxisch -28 0,20 0,68 0,85 - -

  SEPHADEX® 3000 G 27 . . . . . . . . . . . . . . toxisch toxisch toxisch 0,09 0,45 0,73 0,86

  Molekulargewicht

  von SEPHADEX-Fraktionen

  Größer als 7000 G 36 . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - 0,19 0,37 - -

  Größer als 3000 G 37 . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - 0,07 0,45 - -

  Annähernd gleich 3000 G 38 . . . . . . . . . . . - - toxisch - 0,57 - -

  Niedriger als 3000 G 38 . . . . . . . . . . . . . . . - - toxisch - 0,65 - -

  Letztes Eluat G 41 . . . . . . . . . . ... . . . . . . . - - 0,81 - - - -

  * Milligramm Actinogan je Kilogramm Maus je Tag. Ein Strich in der Tabelle bedeutet, daß mit dieser Dosis kein Test ge-

  macht wurde.

  Die Ausgangsbrühe ergab folgendes T/C-Verhältnis (Verdünnung in Klammern): toxisch (1/32); 0,75 (1/64) und 0,91 (1/25).
• Die Substanz Actinogan stimuliert die Abwehrkräfte und stimuliert die Bildung von Abwehrkörpern! Wenn also ein »schwaches« Antigen zur Bildung von Antikörpern gegeben ist, führt die Verabreichung von Actinogan zu einer gesteigerten Bildung der Antikörper. Dieser Umstand ist wertvoll bei der Suche nach einem schwachen, aber nichttoxischen Antibioticum. Actinogan ist eine wertvolle Hilfe beim Studium der Faktoren, die mit der Abwehrkraft des Gastkörpers, der Bildung von Antikörpern, der Entfernung von Teilchen aus dem Blutstrom durch das Reticuloendothelialsystem und dem Verhältnis zwischen diesem System und aufkommenden Infektionen. Auf diese Weise dient Actinogan der Erforschung des Körpermechanismus in ähnlicher Weise wie die Anwendung von bakteriellen Endotoxinen. Actinogan ist außerdem geeignet, verhältnismäßig unwirksame antibakterielle Mittel zu potenzieren, insbesondere Antibiotika, in der Weise, daß eine größere Wirksamkeit vermittelt wird oder die Möglichkeit einer schwächeren Dosierung gegeben wird.
• Die Substanz Actinogan ist ein wertvolles Mittel, gewisse Tumore rückläufig zu machen. Tritt eine solche Regression bei Tieren auf, so kann derselbe Tumor-»strain« nicht mehr implantiert werden. Man hat so auf eine praktische, einfache Art ein einzigartiges Testtier erhalten, z. B. eines, das gegenüber diesem besonderen Tumor »resistent« ist. Für die wissenschaftliche Erforschung einiger biochemischer und physiologischer Vorgänge wird ein Paar sonst offensichtlich gleicher Tiere zur Verfügung gestellt, eines, das,tumorresistent, und eines (das unbehandelte Kontrolltier), das nicht resistent ist.
• Die Substanz Actinogan ist wertvoll für Mensch und Tier und bewirkt eine teilweise oder völlige Regression gewisser Tumore.
• Die Substanz Actinogan ist wertvoll für Mensch und Tier bei gleichzeitiger Verabreichung mit autologen Tumorvaccinen. Das erfindungsgemäße Produkt besitzt außerdem die Fähigkeit, die Eigenresistenz des Wirtskörpers gegen Infektionen zu erhöhen, wie im folgendem Versuch gezeigt wird.
• Das erfindungsgemäße Produkt wurde 3 Tagelang einmal täglich in die peritoneal Höhlung der männlichen weißen Maus (18 bis 20 g) injiziert. Am dritten Tage unmittelbar nach der dritten Einspritzung wurde die Maus mit Staphylococcus aureus (zwei gegen Benzylpenicillin und Tetracycline hochresistente Isolate) infiziert. Es wurde eine Suspension der Kokken in Schweinemagensaft (5 %) intraperitonal injiziert. Die Wirkung wird beurteilt nach dem Weiterleben und dem Tod der Mäuse.

  Die Ergebneisse zeigt die untenstehende Tabelle:

  Produkt Organismus Ergebnis

  Dosis

  (Infektion Verhältnis

  drei tägliche zum Zeitpunkt Tod zu

  Injektionen der Einspritzung) Gesamtzahl

  Mäuse

  5,0 0.-5

  1,0 Staph. aureus 0 : 5

  0,1 (1633-2) 1: 5

  0 10: 10

  5,0 0 : 5

  1,0 Staph. aureus 0 : 5

  0,1 (52-75) 2 : 5

  0 9:10

  Wie Versuche ergaben, zeigte das Produkt keine Schutzwirkung, wenn nur eine Dosis zum Zeitpunkt der Infektion gegeben wurde. Versuche mit überlebenden Mäusen (s. oben), die erneut infiziert wurden, zeigten, daß die Schutzwirkung bei Behandlung mehrfacher Dosen mindestens 6 Tage lang noch vorhielt. Der vorstehende Versuch kann auch als Untersuchungsmethode für das erfindungsgemäße Produkt angewendet werden.

Claims (1)

1. Patentanspruch: Die Verwendung des Nocardia humifera nov. spec. ATCC 13 748 unter submersen aeroben Bedingungen in einer wäßrigen Kohlenhydratlösung bei einer Temperatur von etwa 22 bis etwa 37° C bis zur Erzeugung einer wesentlichen Aktivität gegenüber Sarcoma 180 in diesem Medium zur Herstellung des tumorhemmenden Wirkstoffs Actinogan unter üblichen submersen aeroben Bedingungen und Gewinnung des Actinogans aus der Gärflüssigkeit und gegebenenfalls dessen Reinigung auf übliche Weise.