DE3011334A1

DE3011334A1 - Stroemungsreaktor fuer enzymatische reaktionen, bei welchen das enzym auf einer festen matrix mit einer ebenen oberflaeche immobilisiert wird

Info

Publication number: DE3011334A1
Application number: DE19803011334
Authority: DE
Inventors: Pietro Cremonesi
Original assignee: Italfarmaco SpA
Current assignee: Italfarmaco SpA
Priority date: 1979-05-08
Filing date: 1980-03-25
Publication date: 1980-11-13
Also published as: FR2456138A1; GB2048711A; JPS565091A; FI801413A7; ATA228680A; GB2048711B; FR2456138B1; ES491239A0; CA1141314A; ES8104398A1; NO801248L; LU82422A1; AU5808080A; SE8003488L; AT372974B; NL8002658A; DE3011334C2; IT7922448A0; IT1113361B; CH652743A5

Description

ITALPAHMACO S.P.A.

Viale Fulvio Testi, 330

I - 20126 Mailand/Italien I 11058

Sfcrömungsreaktor für enzymatische Reaktionen, bei welchen das Enzym auf einer festen Matrix mit einer ebenen Oberfläche immobilisiert wird

Die Erfindung betrifft einen Reaktor, der zur Durchführung enzymetischer Reaktionen geeignet ist. Im besonderen ist die Erfindung auf einen Strömungsreaktor gerichtet, bei welchem die verwendeten Enzyme auf einer festen Matrix mit einer ebenen Oberfläche immobilisiert werden.

Bekanntlich weisen Enzyme eine sehr hohe Spezifität hinsichtlich der jeweiligen Substrate auf. Diese Spezifität ist die Basis für die Verwendung der Enzyme zur Herstellung sowie zu analytischen Zwecken auf einer Vielfalt von Gebieten, wie Ver— schmutzungsregelung, Nahrungsmittelerzeugung sowie klinische Chemie«

Die Beschränkungen in der Anwendbarkeit der Enzyme sind im wesentlichen durch zwei Paktoren bedingt:

a) Die relative !Instabilität des Knzyms in einer wässrigen Lösung und

b) die Kosten dieser enzymatischen Reaktionen, die häufig sehr hoch sind und die wesentlich verringert werden

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können, wenn das Enzym in einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Weise wiederverwendet werden könnte.

Das allgemein bekannte Prinzip der Immobilisierung von Enzymen auf einer festen Matrix, die durch chemische Reaktion oder durch Adsorption erreicht wird, überwindet die vorerwähnten Probleme weitgehend, da es die Wiedergewinnung der katalytischen Fähigkeit des Enzyms ermöglicht. Aus diesem Prinzip und in Anbetracht der Notwendigkeit der Wiedergewinnung der katalytischen Aktivität des Enzyms in kontinuierlicher Weise wurden drei Methoden entwickelt, die auf der Verwendung von Reaktoren mit kontinuierlicher Strömung beruhen, wobei die Enzyme immobilisiert sind, zur Herstellung sowie für analytische Zwecke. Die drei Methoden beruhen auf der Verwendung von

1) einer Säule, wobei das Enzym fest auf Perlen aus geeigneten Polymeren gebunden ist;

2) eines Rohres, bei welchem das Enzym fest an der Wand des Rohres angeordnet ist, das aus geeignetem Material hergestellt ist;

3) einer Membran, bei welcher das Enzym fest auf einer geeigneten semipermeablen Membran oder innerhalb von zwei semipermeablen Membranen immobilisiert ist.

Ein gemeinsames Merkmal jeder Art von Strömungsreaktor ist der Kontakt zwischen dem Enzym, das immobilisiert ist, und dem Substrat und in manchen Fällen auch die Kofaktoren, welches Substrat in einer kontinuierlich strömenden Lösung aufgelöst ist.

Bei der Darstellung des Kontakts zwischen dem Substrat und dem Enzym in Form des Zeitaufwandes, wird dieser Zeitaufwand, der Haupt- wenn nicht der einzige Faktor, der die biochemische Umwandlung des Substrats beeinflußt, auch als Ertrag der Sub-

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stratumwandlung bezeichnet. Um hohe Substratumwandlungen zu erzielen, ist es bei einem Verfahren, welches häufig das Signal bestimmt, das bei der analytischen Bestimmung des Substrats selbst verwendet werden soll, vorteilhaft, daß die Kontaktperiode zwischen dem Enzym und dem Substrat so hoch wie möglich ist, solange es vereinbar ist mit 1) den Abmessungen sowie den Herstellungserfordernissen des Strömungsreaktors und 2) der Gesamtzeitperiode, die bei der Analyse aufgewendet wird, so daß die enzymatische Methode im Routinemaßstab nützlich ist« Dies ist beabsichtigt, um einen solchen Umwandlungsvertrag zu erhalten daß es möglich ist, eine Nachweisempfindlichkeit zu erzielen, die für analytische Zwecke nützlich ist.

Die kontinuierlichen Strömungsreaktoren, die ein dünnes Rohr verwenden, haben sich als wertvoll für die Anwendung zu analytischen Zwecken erwiesen trotz des Umstandes, daß sie wesentliche Schwierigkeiten bei der Immobilisierung des Enzyms an der Innenwand des Rohres aufweisen, welche Immobilisierung nur durch chemische Mittel erreicht werden kann und nicht durch Adsorption erzielt werden kann. Ferner erfordert diese Art von Reaktorflüssigkeitvolumen, die nicht vernachlässigbar sind, mit einem beträchtlichen Verbrauch an Reagenzien.

Ferner wurden die Strömungsreaktoren, die Säulen bepackt mit Perlen aufweisen, verwendet, jedoch bestehen ernste Schwierigkeiten hinsichtlich der mechanischen Festigkeit in Abhängigkeit von der Strömung zusätzlich zu den Problemen der Standardisierung der Strömung bei der Verwendung in einer kontinuierlichen Weise.

Ferner sind die Herstellungskosten, obwohl sie von einem Modell zu ;einem anderen verschieden sind und von einem Enzym zu einem anderen veränderlich sind, im allgemeinen ziemlich hoch_s besonders wenn der Umstand berücksichtigt wird, daß die Lebensdauer des Reaktors von der Aktivitätsperiode des immobilisier-

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ten Enzyms abhängt.

Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Entwicklung eines neuartigen Reaktors zur Durchführung enzymatischer Reaktionen, wobei das Enzym auf einer Matrix mit einer ebenen Fläche immobilisiert ist, bei welchem Reaktor die vorerwähnten Nachteile überwunden sind und welcher Reaktor die folgenden Vorteile besitzt:

1) Die Verwendung von Enzymen, die leicht durch chemische Mittel auf festen Matrizen immobilisiert werden sowie die Verwendung von Enzymen, die einfacher auf festen Matrizen adsorbiert werden;

2) die Verwendung von Reaktionsvolumen, die als Ganzes sehr klein sind?

3) die Arbeitsweise mit einer laminaren Strömung, die flach statt zylindrisch ist, wodurch sich eine Zunahme im Kontakt zwischen dem Enzym und der Substratlösung und

in manchen Fällen auch der Kofaktoren ergibt; k·) die Verwendung von tragenden Matrizen, die hydrophob und in ihrer Art eiweißähnlich sein können}

5) die Verwendung von Matrizen aus Filterpapier, wodurch ermöglicht wird, einen Strömungsreaktor mit Eigenschaften zu erhalten, die den Eigenschaften von Reaktoren sehr ähnlich sind, welche aus einer gepackten Säule bestehen, bei einer wesentlichen Verbesserung der Strömungsei genschaft en j

6) die Beseitigung der Diffusionserscheinungen, die in Reaktoren mit einer semipermeablen Membran während der enzymatischen Reaktion auftreten, welche Erscheinungen beispielsweise in Reaktoren üblich sind, die eine Membran in einer spiraligen Anordnung haben, oder in Reaktoren, bei welchen das Enzym zwischen zwei semipermeablen Membranen immobilisiert ist. Diese Diffusionsphänomene verursachsn eine Wiedervermischung mit dem

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Ergebnis, daß die eigentlich Konzentration des Substrats in der Reaktionskammer abnimmt und sich ferner die Rate der enzymatisehen Reaktion verringert. Das endgültige Ergebnis ist eine Verminderung des Ertrages der Umwandlung und daher eine Abnahme der Intensität des Nachweissignals der enzymatischen Reaktion selbst}

7) die Herabsetzung auf ein sehr geringes Maß der Möglichkeit, daß sich die Materialien wiedervermischen, nachdem die enzymatische Reaktion eingetreten istf dieses erneute Vermischen verursacht eine wesentliche Herabsetzung in der Empfindlichkeit, da sie die Konzentration des Produkts der enzymatischen Reaktion verringert, was eine Herabsetzung in der Intensität des Nachweissignales zur Folge hatj

8) leichte Herstellung, was von noch größerer Bedeutung ist, wenn die beträchtlichen Schwierigkeiten berücksichtigt werden, die mit anderen Geräten, insbesondere Membranreaktoren, verbunden sindf

9) eine wesentliche Herabsetzung der Herstellungskosten,

Alle diese Vorteile werden ohne Verlust der Vorteile anderer Arten von Reaktoren, die gewöhnlich verwendet werden, erzielt, da das einfache Auswechseln der Matrix mit dem auf ihr immobilisierten Enzym statt das Auswechseln des ganzen Reaktors die Betriebsfähigkeit des Reaktors wiederherstellt. Der erfindungsgemäße Reaktor ermöglicht das Kombinieren der Einfachheit der Methoden zum Immobilisieren des Enzyms auf einer Fläche, die in stabiler Weise mit Hilfe von kovalenten Bindungen oder einfacher durch Adsorption geschehen kann, wobei eine laminare Strömung auf der Fläche erhalten wird, auf welcher das Enzym immobilisiert ist, welche laminare Strömung flach ist und eine Mindestdicke hat, so daß die Möglichkeit der Wiedervermischung, die bei Membranreaktoren typisch ist_s nicht eintritt» Es wird ein maximaler Kontaktwirkungsgrad zwischen den beiden physikalischen Phasen erzielt und daher eine optimale katalytische

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Wirkung trotz einer kürzeren Kontaktzeit erhalten. Diese Ergebnisse werden erreicht, wenn man die Lösung einer Bewegung folgen läßt, welche mit Bezug auf die Fläche tangential sein muß, die gleichmäßig und längs irgendeiner !laufbahn ist, mit dem Ziel, Kontakt zwischen dem Fluid mit der maximalen Menge der tragenden Fläche von der gleichen enzymatischen Aktivität herbeizuführen.

Bei dem erfindungsgemäßen Reaktor wird diese Bewegung durch einen dünnen Kanal von beliebiger Form auf einer der Flächen eines Halbblockes einer Strömungszelle mit zwei entgegengesetzten Flächen erzielt, der aus einem chemisch inerten Material hergestellt ist, beispielsweise aus Tetrafluoräthylen, Polyvinylchlorid, Polyäthylen, Polyamid, rostbeständiger Stahl imtci:jeheirlan, während der andere Halbblock das immobilisierte Enzym trägt.

Wahlweise kann der erwähnte dünne Kanal in beiden Hohlblöcken vorgesehen werden« Dieser Kanal kann erhalten werden entweder direkt mit Hilfe eines Einschnitts an der Oberfläche eines der Blöcke oder beider Blöcke des Reaktors oder indirekt, beispielsweise unter Verwendung einer Lamelle oder eines Drahtes aus rostbeständigem Stahl oder Tetrafluorpolyäthylen oder aus einem anderen inerten Material, auf welchem oder mittels welchem der Strömungsweg erhalten wird, welcher Kanal zwischen den beiden Halbblöcken der ■ Zelle mit einer ebenen Fläche eingesetzt ist»

Ein wesentliches Erfordernis besteht darin, daß die Wände zwisehen den beiden Kanälen dünn und schmäler als die maximalen Abmessungen des Strömungskanals sein müssen. Abgesehen von diesem Erfordernis befindet sich im wesentlichen die ganze Menge des auf der festen Matrix mit einer ebenen Fläche aufgelagerten Enzyms in Kontakt mit der Lösung des Substrats und

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befindet sich daher in einem Zustand, der zur Ausführung katalytischer Aktivität geeignet ist.

Der Eintritt und der Auslaß der umlaufenden Lösung kann an irgendwelchen zwei Stellen jedes der beiden Halbblöcke vorgesehen werden, unabhängig von der Umlaufrichtung der Lösung« Auf diese Weise wird der Reaktor im wesentlichen durch einen dünnen Kanal von verschiedenen Formen gebildet.

Vorausgesetzt, daß die laminare Strömung so dünn wie möglich ist, ist die enzymatische Aktivität ausreichend, um eine gute Umwandlungsrate des Substrats zu dem Produkt mit einer folglichen Möglichkeit der Verringerung der Kontaktflächen sowie ebenso folglich der Volumen, die verwendet werden müssen_s zu erhalten.

Wenn es vorteilhaft zu sein scheint, das gleiche Substrat einer Reihe von zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Reaktionen zu unterziehen, ist es möglich, den erfindungsgemäßen Reaktor in der Form eines Modulreaktors zu bauen, der zwei oder mehr erfindungsgemäße Reaktionskammern von der vorangehend beschriebenen Art enthält, die voneinander durch Halbblöcke von geeigneter Form getrennt sind und miteinander durch Öffnungen von einer solchen Form verbunden sind, daß die das Substrat enthaltende Lösung aufeinanderfolgend durch die gleichen Kammern hindurchtreten kann.

Zur Erläuterung der Erfindung wird nachfolgend ein Beispiel eines Strömungsmikroreaktors mit dem Enzym immobilisiert auf festen Matrizen, die eine ebene Fläche aufweisen, und werden zwei Beispiele der Anwendung des gleichen Reaktors nachfolgend beschrieben. In den beiliegenden Zeichnungen zeigen:

Fig, 1 eine schematische Darstellung eines Strömungsmikroreaktors im Querschnitt}

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Fig« 2 eine Draufsicht des Halbblockes A von Fig. IJ Fig. 3 eine Draufsicht des Halbblockes Bj

Fig» k in schematischer Darstellung den in Beispiel 1 beschriebenen Stromungsmikroreaktor in freier Anordnung auf dem Gerät.

Beispiel 1 Bauform und Zusammenbau eines Strömungsmikroreaktors

In Fig. 1 bezeichnet der BuchstabeA einen der Halbblöcke, der beispielsweise aus einem Kunststoff, wie aus dem unter dem Namen Sicodur im Handel erhältlichen Material hergestellt ist.

Auf diesem Halbblock wird ein dünner kontinuierlicher Kanal durch einen Einschnitt erhalten, der in diesem besonderen Fall die Form einer Spirale hat. In diesem Falle hat der Kanal einen dreieckigen Querschnitt mit einer maximalen Tiefe von 0,5 mm, einer Basis von 1 mm, einer Länge von 180 mm und einem Volumen von 45 Mikroliter.

Das Enzym wird auf einer festen Matrix M mit einer ebenen Fläche in Form einer Folie oder eines Films, bei dem vorliegenden besonderen Beispiel aus Filterpapier immobilisiert. Hierbei ist jedoch zu erwähnen, daß irgendein anderes Material, sowohl hydrophob als auch hydrophil, in Form einer Folie, eines Films oder einer Membran verwendet werden kann· Die Folie oder der Film wird mit dem Halbblock B haftend angebracht, der so ausgebildet ist, daß die Cellulosematrix gegen die Spiralen des Halbblocks A gepreßt werden. Bei dem in der Figur dargestellten besonderen Beispiel sind die beiden Halbblöcke mit Hilfe von Befestigungsschrauben S hermetisch geschlossen.

Die Mittel für den Einlaß und den Auslaß der Lösung sind in dem gleichen Halbblock A mit Hilfe von Öffnungen von geeigneten Abmessungen vorgesehen, beispielsweise 0,2 mm Durchmesser,

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die in Fig, 1 mit den Buchstaben G und D bezeichnet sind und die Aufgabe haben, das Auftreten einer Wiedervermischung zu vermeiden. Fittings aus geeignetem Material, beispielsweise aus einem Polyamid oder aus Tetrafluorpolyäthylen oder Stahl sind an diesen Öffnungen angeordnet, welche einen analogen Durchmesser von 0,2 mm haben. Die Fittings sind jeweils mit einem System für das Einleiten des Fluids sowie .mit einem System für den Nachweis des Signals der enzymatischen Reaktion verbunden. Bei dem besonderen Beispiel wird ein spektroskopischer Detektor verwendet, es ist jedoch auch möglich, elektrochemische oder spektrofluorimetrische oder andere Detektoren zu verwenden.

Wie in Fig. 2 gezeigt, ist der Halbblock A nach Fig, I mit Offnungen C und D für den Einlaß bzw. Auslaß vorgesehen,.

In dem bei diesem Beispiel dargestellten Reaktor beträgt der Prozentsatz der aktiven Fläche des Enzyms, die mit der Lösung in Kontakt kommt, mit Bezug auf die Gesamtmenge der Lösung 90 %_o

Bei diesem Apparat wird das Enzym immobilisiert, jedoch ist es leicht, ein Enzym durch ein anderes Enzym zu ersetzen, entweder weil das erste Enzym verbraucht ist oder weil mit einem Enzym gearbeitet werden soll, daß '.eine andere Aktivität hat«, Das Ersetzen läßt sich einfach dadurch ausführen, daß die Matrix ersetzt wird, während der ganze Reaktor wiederverwendet wird. Dies stellt einen wesentlichen Unterschied zwischen dem erfindungsgemäßen Reaktor und anderen Strömungsreaktoren mit enzymatischer Aktivität dar, die ein vollständiges Ersetzen erfordern, wenn die enzymatische Aktivität wesentlich verringert ist»

Beispiel 2

"Anwendung des Mikroreaktors mit einer diskontinuierlichen

Einleitung des Substrats"

Der in Beispiel 1 beschriebene Strömungsmikroreaktor ist in Ausfluchtung in dem ganzen in Fig. ^ schematisch gezeigten

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Apparat angeordnete Der Buchstabe A bezeichnet eine Pumpe mit veränderlicher Förderung,, Der Buchstabe B bezeichnet den Behälter der Pufferlösung. Der Buchstabe C ist ein Injektor mit einer Trennwand, während der Buchstabe E den Strömungsreaktor bezeichnet. Der spektrophotometrische Detektor ist mit D bezeichnet, während der Buchstabe E ein System zum Registrieren des vom Detektor D abgegebenen Signals bezeichnet.

Im tatsächlichen Betrieb wird eine geeignete Pufferlösung, beispielsweise mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,25 ml/ min., durch den Reaktor zum Fließen gebracht, in welchem ein Film oder eine Folie oder eine Membran von enzymatischer Aktivität, beispielsweise Peroxydase, angeordnet ist. Das Enzym wird durch kovalente Bindungen immobilisiert oder kann auf der Matrix adsorbiert werden.

Sobald Bedingungen konstanter Strömung erreicht sind, wird eine geeignete Menge der Substratlösung in die Strömung mittels des Injektors eingespritzt, der eine mit C bezeichnete Trennwand C besitzt. Während der Wanderung mit einer laminaren Strömung durch den Innenkanal, der im Reaktor ausgebildet ist, wird das Substrat unter der Wirkung des Enzyms umgewandelt. Diese Umwandlung verursacht im Nachweissystern bzw. Detektor D eine Veränderung des Signals, die in E registriert wird.

Wie in Fig. 5 gezeigt, sind die registrierten Signale proportional der Menge des eingeleiteten Substrats.

Beispiel 3

Anwendung des Mikroreaktors auf eine kontinuierliche Einleitung des Substrats d.h. "stationär" ("steady state") Das vorangehend beschriebene Beispiel 2 betrifft eine Anwendung des Strömungsreaktors auf den Fall, bei welchem es sich um geringe Mengen Substrat handelt. Wenn Lösungen mit einer

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niedrigen Substratkonzentration analysiert werden sollen, ist es möglich, den gleichen Apparat für das Substrat in einer kontinuierlichen Weise mit Hilfe eines geeigneten Sechswegeventils, beispielsweise vom Schleifentyp, zu verwenden, welches Ventil mit der Substratlösung beschickt wird, die der enzymatisehen Reaktion unterzogen werden soll«

Die gleiche in Fig. 4 dargestellte Anordnung wird mit der einzigen Abänderung verwendet, daß das Einspritzsystem mit einem Septum, bezeichnet mit dem Buchstaben C, durch ein Einspritzsystem mit einem Ventil ersetzt ist. Unter den Bedingungen konstanter Strömung wird eine geeignete Menge der Lösung des Substrats mit Hilfe des Ventils eingeleitet, so daß das Substrat die enzymatische Reaktion unter Bedingungen stationären Zustandes erfährt. Die enzymatische Reaktion erzeugt in dem Nachweissystem D eine Veränderung des Signals, das bei E registriert wirdβ Wie in Fig. 6 gezeigt, ist das registrierte Signal proportional der Nähe des in der strömenden Lösung vorhandenen Substrats.

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Claims

Patentansprüche

1» Laminarströmungsreaktor für Reaktionen mit Enzym oder Kofaktoren, "bei welchen das Enzym bzw. der Kofaktor auf einer Matrix mit einer ebenen Oberfläche immobilisiert wird, gekennzeichnet durch eine Zelle aus zwei Halbblöcken A, 3 mit einer ebenen Oberfläche, wobei einer dieser Halbblöcke mit einem Kanal versehen ist, der die Reaktionskammer bildet und eine laminare Strömung hat, wobei die beiden Halbblöcke hermetisch befestigt sind.

2β Reaktor nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktionskarnmer durch Einschneiden eines dünnen Kanals auf der Fläche eines der Halbblöcke geformt worden ist und der zweite Halbblock dazu dient, die Reaktionskammer zu verschließen.

3 ο Reaktor nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet _t daß die Reaktionskarnmer durch einen kontinuierlichen Kanal gebildet wird, der durch Einsetzen einer Lamelle oder eines Drahtes bzw. Fadens aus chemisch inerten Material mit einer Dicke zwischen 0,1 und 2 mm erhalten worden ist, um die Wände des Kanals zu hauen, wobei

der Verschluß der Reaktionskamraer unter Druck ist und durch die beiden Halbblöcke mit einer ebenen Oberfläche gebildet wird, welche gegen die den dünnen Kanal bildende Lamelle drücken.

k. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Weg, der die erwähnte laminare Strömung bildet, eine Vielfalt von Formen hat und die Verwendung einer maximalen Kontaktfläche ermöglicht.

5. Reaktor nach Anspruch 4,

dadurch gekennzeichnet , daß die Substratlösung längs des erwähnten Weges wandert, der eine spiralige Form hat.

6. Reaktor nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet , daß Öffnungen in mindestens einem der Halbblöcke vorgesehen sind, welche den Einlaß bzw. Auslaß der Reaktionslösung bilden.

7. Reaktor nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet , daß das Enzym oder der Kofaktor auf einer festen Matrix immobilisiert wird, die eine ebene Oberfläche hat, und Mittel vorgesehen sind, die dazu 'dienen, diese Matrix durch eine andere Matrix zu ersetzen.

8. Reaktor nach Anspruch 7,

dadurch gekennzeichnet , daß die tragende Matrix des Enzyms oder Kofaktors die Form eines Films oder einer Folie oder einer Membran hat,

9_O Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die das Enzym tragende Matrix oder das Substrat aus Papier hergestellt ist.

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10ο Reaktor nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet , daß der Kanal in beiden Kalbblöcken vorgesehen ist.

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