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WO2012013316A1 - Verfahren und vorrichtung zur passiven trennung und sortierung von tropfen, insbesondere in einem mikrofluidischen system, durch verwendung von nicht-optischen markern für reaktionen innerhalb der tropfen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur passiven trennung und sortierung von tropfen, insbesondere in einem mikrofluidischen system, durch verwendung von nicht-optischen markern für reaktionen innerhalb der tropfen Download PDF

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WO2012013316A1
WO2012013316A1 PCT/EP2011/003640 EP2011003640W WO2012013316A1 WO 2012013316 A1 WO2012013316 A1 WO 2012013316A1 EP 2011003640 W EP2011003640 W EP 2011003640W WO 2012013316 A1 WO2012013316 A1 WO 2012013316A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
drops
droplets
cells
primary
biological
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2011/003640
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christian Böhm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of WO2012013316A1 publication Critical patent/WO2012013316A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
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    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
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    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions

Definitions

  • the present invention relates to methods for passively separating and sorting drops by using non-optical markers for reactions within the drops.
  • the methods are particularly suitable for microfluidic systems with high throughput.
  • the methods of the invention are particularly suitable for use in screening methods for the analysis, selection and identification of a broad spectrum of analytes, including cells, catalysts, enzymes and other substances that can influence or control physical, chemical or biological reactions.
  • Microfluidic systems have been used increasingly successfully for such examination and screening methods recently.
  • Microfluidic systems offer the unique ability to handle the smallest fluid volumes in micron-sized channel structures. Due to the small dimensions, a large number of channels, reaction spaces and control elements can be integrated in the smallest space, which enables the possibility of an efficient parallelization of reactions. An important prerequisite for high-throughput processes is thus fulfilled.
  • micro fluidic systems are characterized by further physical properties, which give access to new applications: The flow in such systems is usually laminar. As a result, parameters such as substance concentration and temperature can be manipulated selectively and locally.
  • the large surface-to-volume ratio another characteristic of microfluidics, enables efficient temperature exchange and thus controlled reaction conditions. Icon drops are easily generated and can be used as microreactors, in which, for example, individual cells or all reactants of interest can be included.
  • Such drops can be used as isolated Picoliter reaction vessels: Different drops of different contents can be fused together or split into daughter drops of different sizes.
  • the ability to create and analyze smallest volumes offers significant benefits in a variety of screening applications, especially in biological assays: •
  • the required sample volume is drastically reduced (a microdip with a diameter of 25 pm has a volume of ⁇ 8 pl, so that more than 120,000 drops can be generated from 1 ⁇ sample solution).
  • the small sample volume offers the possibility to include single cells in the drops. This allows whole cell populations to be analyzed at the individual cell level.
  • the lab-on-chip of the reaction step thus becomes again a macroscopic system in which the necessary control and analysis unit exceeds the size and cost of the reaction module many times over.
  • the object of the present invention is to provide new improved methods for analysis, separation and sorting of drops in which chemical, biological or physical reactions take place or have taken place, and analytes contained therein, in particular in a microfluidic system, which are suitable for performing high-throughput screening and analysis methods and no longer have the disadvantages of the prior art and in particular the advantages of a much simpler handling and high cost efficiency Offer .
  • the inventive method according to claim 1 comprises the following steps:
  • a significant advantage of the method according to the invention over most of the separation methods of the prior art is that it is possible to dispense with the customary optical markers for detecting a reaction which has taken place in the drops and the associated external detection systems.
  • a modified non-optical physical parameter of the drops preferably a geometric or mechanical parameter, is used as the marker.
  • this physical parameter is selected from the group consisting of volume, specific gravity, adhesion to or affinity for particular surfaces, surface tension, viscoelasticity, or shape of the drops.
  • the physical parameter is a volume change, i. a reduction or increase in volume of the drops.
  • the separation of droplets of different size is preferably carried out by a separator comprising a surface with one or more openings (s) of predetermined diameter.
  • This surface may for example be part of a screening or filtering device and / or consist of the surface of a perforated plate or perforated membrane.
  • the separating device is formed by at least one part of at least one boundary surface, in particular cover and / or base, of the incubation space. If the droplets have a lower specific gravity than the FLÜS ⁇ SiGe carrier phase, they accumulate on the apertured ceiling of the incubation room, and there will be automatically separated according to size. Conversely, drops of greater specific gravity than the liquid carrier phase collect on the bottom where they can be separated by size.
  • the separator may e.g. comprise a surface with openings of predetermined size and shape which allows only drops of a particular shape to pass through.
  • the separator may comprise a surface which exclusively or preferably only the adhesion of particular droplets, for example only primary droplets or only secondary droplets or only a kind of secondary drops, allowed.
  • Drops of predominantly viscous character are easily deformed and can also be filled through openings smaller than the drop diameter, with corresponding pressure differences. squeeze through. This does not succeed or only at a significantly higher pressure difference with elastic drops.
  • Elastic drops can be formed, for example, by polymerization / gellation of the droplet medium, triggered by a chemical or biological reaction within the droplets. The different deformation behavior of the drops finally allows easy separation.
  • a change in the surface tension of microdroplets can be caused by a reaction-induced change of the surfactants used in the droplets for stabilization or by the formation of further surface-active substances.
  • droplets can be stabilized or destabilized: destabilized droplets can fuse together and form larger droplets. The stabilized drops retain their original size and do not fuse with other drops. These drops, in turn, can be separated from the fused large drops by a filtering process.
  • the incubation space and / or the separation device is part of a microfluidic system.
  • the separating device can also be advantageously formed by at least one inner surface of a microfluidic channel.
  • a microfluidic system can use a plurality of channels and thus also of incubation chambers and / or separation devices in parallel.
  • this will have at least one inner surface of the microfluidic channel at least one opening with a predetermined diameter. Due to the possible parallel use of many channels Also, parallel separators, each with only one orifice (or a few orifices), can result in very efficient and rapid separation and sorting of droplets.
  • the altered physical parameter of the drops is the result of a mass transfer between the drops and their surroundings.
  • this mass transfer is caused by an osmotic pressure differential between the droplets and their environment built up by the flow of chemical, biological or physical reactions in the droplets.
  • the osmotic pressure difference between the drops and their surroundings leads to an outflow or inflow of water or another solvent of the reaction medium from the drops and thus to a reduction in volume or increase in volume of the drops.
  • the type of volume change is determined by the reactions taking place in the drops: increasing the total number of dissolved substances in the drops, for example by enzymatic polymer degradation, leads to a solvent influence and thus to an increase in volume. Conversely, a reduction in the total number of solutes in the drops, for example, by glucose consumption by cells, leads to a reduction in volume.
  • the mass transfer between the drops and their environment may take place with a reaction medium-containing carrier phase and / or with at least one reaction medium-containing surface of the incubation space.
  • a reaction medium-containing carrier phase and / or with at least one reaction medium-containing surface of the incubation space.
  • the latter alternative is usually preferred, as it is also the use allows such carrier phases, which can absorb little or no reaction medium.
  • the reaction medium-containing surface preferably has the same reaction medium as that of the droplet phase adsorbed thereto and / or absorbed therein.
  • the material of this surface is not particularly limited and may be selected depending on the kind and composition of the reaction medium.
  • a specific, non-limiting example of such a material having hydrophilic properties is polydimethylsiloxane which works well with aqueous media, e.g. Cell media, can be saturated.
  • the reaction medium-containing surface may also comprise or consist of a membrane permeable to the solvent of the reaction medium which separates the droplets from a reaction medium reservoir, so that the mass transfer can occur through this membrane.
  • another droplet phase may also serve as the reaction medium-containing environment.
  • These drops hereinafter referred to as inactive drops, contain only the reaction medium or reaction medium together with an inactive or weakly active catalyst or an inactive or weakly active cell. There is therefore no reaction or only a weak reaction in the inactive drops.
  • an osmotic pressure difference is built up between the inactive drops and the active drops, in which desired chemical, biological or physical reactions take place, which finally causes a mass transfer between these drops.
  • the change in volume of the inactive droplets behaves in the same way as that of the active droplets: A solvent flow takes place from the active droplets into the inactive droplets or vice versa Direction instead.
  • the relative size difference between active and inactive drops is thereby enhanced, thus facilitating the selection of active drops.
  • these droplets contain all the necessary reactants and auxiliaries for the respective reaction.
  • they preferably contain at least one further component which may have an influence on the respective chemical, biological or physical reactions. This component often simultaneously constitutes an analyte which is to be investigated or identified by means of the method according to the invention.
  • this component is selected from the group of catalysts including enzymes, cocatalysts and inhibitors.
  • the method according to the invention can be carried out such that the chemical, biological or physical reactions in step b) occur for a predetermined time. This period of time will be at least as long that the sequence of the respective reaction leads to a sufficient change in the intended physical parameter of the droplets. This period of time may vary widely depending on the particular reaction and reaction conditions, but can be easily determined by one skilled in the art in routine experiments.
  • the drops contain entities in or on which chemical, biological or physical reactions occur.
  • These structures can, for example, be natural or artificial cells, particles, beads, vesicles or capsules, or other molecular aggregates.
  • these are biological cells whose cell activity, in particular metabolic activity and / or division activity, is to be investigated.
  • the cells to be examined are enclosed in drops by hydrodynamic flux-focusing of a cell suspension (LI) (FIG. 1).
  • LI cell suspension
  • L2 perfluorinated hydrocarbons having a higher density than water (e.g., FC-40 of 3, about 1.9 g / ml) are used.
  • FC-40 perfluorinated hydrocarbons having a higher density than water
  • solvents can be used which do not mix with the drop phase and thus allow a two-phase system (microemulsion): hydrocarbons, mineral oils etc.
  • the composition of the drop fluid changes: For example, the concentration of small nutrient molecules drops drastically outside the cells. These are taken up by the active cells, metabolized and finally used to build up intracellular structures. This depletion of the droplet medium leads to the formation of an osmotic pressure difference between the droplet medium and the medium-saturated microfluidic environment.
  • the environment consists for example of polydimethylsiloxane (PDMS), an elastic polymer which can be easily saturated with aqueous solutions, a solvent-permeable membrane which separates the droplets from a medium reservoir, or other droplets containing only droplet medium, without an active component that causes a reaction within the drops.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the osmotic pressure difference leads to a water outflow from the drops into the environment (PDMS walls).
  • the loss of water compensates for the concentration difference again and leads to a reduction of the drops.
  • the size change serves as a new microfluidic marker for the biological activity of the cells enclosed in the drops.
  • step a) several types of primary droplets of different composition are provided in step a) and in step b) different secondary droplets are generated, which differ from one another by at least one physical parameter of the droplets, and then in step c) a passive separation and sorting of various secondary drops.
  • the different primary drops contain different types of cells which differ in at least one cell activity, and L0 the separation of the different secondary drops formed due to the different cell activity enables discrimination and sorting of active and non-active cells.
  • the size of the drops used in the process according to the invention is not particularly critical and can be adapted to the systems to be investigated and reaction conditions.
  • this is carried out in a microfluidic system and the droplet diameters are in the size range produced by conventional microfluidic techniques. This range is from about 1 micron to 500 microns. Typically, the droplet size ranges from 5 microns to 100 microns, more preferably from 10 microns to 50 microns. For droplets containing entities such as biological cells, the minimum size becomes that size And droplet size typically ranges from 10 microns to 50 microns.
  • a major advantage of all micro-fluidic methods, and in particular of the method according to the invention is the possibility of carrying out a large number of reactions and subsequent analysis and separation steps in a small space in parallel.
  • An essential aspect of the present invention is the use of the described separation method for the selection and identification of cells which have or lack a particular cell activity, or for the selection and identification of substances which have a certain qualitative or quantitative influence on certain have chemical, biological or physical reactions or not.
  • These selection and analysis methods are preferably high throughput methods.
  • the substances studied are substances from the group of catalysts, including enzymes, cocatalysts and inhibitors.
  • step a) comprises the steps a) -c) of the method according to any one of claims 1-18, wherein in step a) primary drops are provided, of which at least a part contains the cells or substances to be examined, and further
  • the method is carried out several times in succession, the cells or substances selected after the first passage of the method being subjected to further selection passes. In these further runs, they may, for example, be subjected to other, in particular more stringent, reaction conditions, to thereby obtain a higher degree of selection.
  • the serial procedure is also suitable for optimizing substances by "directed evolution": After each reaction step, the selected cells and substances are subjected to a change, in particular by mutagenesis. Subsequently, a further selection and modification takes place it is possible to achieve a gradual optimization of the desired properties.
  • Another aspect of the invention relates to a device, in particular for carrying out the method according to one of claims 1-24, comprising
  • Phase in the form of droplets comprising a reaction medium and a second liquid carrier phase which is immiscible with the first phase;
  • a separating device which has a predetermined geometric shape and / or surface design, such that different droplets have a different interaction with the geometric shape and / or surface learn chenwill the separator and thereby can be separated.
  • the device in particular for the separation of drops with different diameters, is characterized in that the separating device comprises a surface with one or more openings (s) with a predetermined diameter.
  • This surface may for example be part of a sieve or filter device or the surface of a perforated plate or membrane.
  • the separating device is formed by at least one part of at least one boundary surface, in particular cover and / or base, of the incubation space. If the drops have a lower specific gravity than the liquid carrier phase, they accumulate at the ceiling of the incubation room provided with openings or other selecting surface and are automatically stored there, e.g. separated according to the size. Conversely, drops of greater specific gravity than the liquid carrier phase collect on the bottom and can be separated there.
  • At least one separating device can be provided on the bottom and / or the ceiling of the incubation chamber for the separation of different droplets.
  • the separator may comprise a surface having openings of predetermined size and shape which will allow only droplets of a particular shape to pass through.
  • the separating means may comprise a surface which exclusively or preferably only the adhesion of be ⁇ voted drops, for example, only primary drops or only secondary drops or only one kind of secondary drops allowed.
  • the incubation space and / or the separation device is part of a microfluidic system.
  • the separating device can also be advantageously formed by at least one inner surface of a microfluidic channel.
  • Such a microfluidic system can use a plurality of channels and thus also of incubation chambers and / or separation devices in parallel.
  • this will have at least one inner surface of the microfluidic channel at least one opening with a predetermined diameter. Due to the possible parallel use of many channels, parallel separators, each having only one exit opening (or a few openings), can lead to a very efficient and rapid separation and sorting of drops.
  • the device according to the invention is characterized in that the incubation space comprises at least one surface which has the same reaction medium as that of the droplet phase adsorbed thereto and / or absorbed therein.
  • the incubation space may also have a surface containing a permeable to the solvent of the reaction medium membrane, which the drops in the Separation incubation room from a reaction medium reservoir separates, includes or consists of.
  • a surface can also be considered in a broader sense as a reaction medium-containing surface.
  • FIG. 3 shows a compact novel micro fluidic system according to the invention, which allows the generation of droplets, incubation with concomitant change in size of the droplets and selection through a perforated membrane.
  • the realization of the present invention in a microfluidic system is based on four core steps in order to miniaturize the reactions to be investigated and the subsequent detection and selection:
  • the target parameter (I) to be detected is transformed into a microfluidic variable, a change of specific drop characteristics ( II). This is done by the interaction of microdrops with their environment, which is characterized by a suitable geometry and material properties.
  • the microfluidic marker (III) finally allows a purely passive selection (IV), which requires no active and external control. The system works autonomously.
  • Fig. 4 shows in panel A the representation of a cell screen with reference to the four core steps discussed above. After incubation, the volume of the drops with division-active yeast cells (Nos. 1, 2, 3 and 6) has significantly decreased (Panel B). Small droplets are selected by passive buoyancy through a microfilter (box C). Panel D shows a prototype for drop production, incubation and subsequent filtering (corresponding to Fig. 3).
  • the inventive methods presented here are based on a fundamentally new approach:
  • the present invention provides access to a new universal base and platform technology that can be used for a variety of microfluidic applications (and other applications) and is not limited to a product niche.
  • the inventive concept can reduce the necessary analysis elements on microstructured geometries and material properties, production costs for an OF INVENTION ⁇ to the invention chip are essentially used by the Materi- determined al: in the case of PDMS currently used about 1 € per unit.
  • Novel microfluidic markers allow the selection of global system properties without the need to develop specific, often costly assays: the overall efficiency of enzymatic polymer degradation can be measured as a target, regardless of the molecular details (cut position, fragment length, substrate modifications or substrate heterogeneity). The system works "assay-free”.
  • the simple design also allows the realization of compact and mobile products for flexible use in research laboratories in the form of simple consumables ("Ki t concept"): Already a 20 x 20 cm 2 system allows the incubation and the parallel selection of approx 2.5 x 10 7 drop containers Furthermore, the simple design makes it easy to parallelize and cascade
  • Fig. 2 Schematic representation of a passive sorting according to the invention based on the drop size by simply tilting the device with the drops
  • FIG. 3 shows a plan view of an apparatus for carrying out the method according to the invention
  • Fig. 4 schematic representation of an embodiment of the method according to the invention
  • Fig. 5 Generation of microdroplets by flow focusing of water and oil
  • FIG. 6 Volume change of model drops due to osmotic pressure differences between drops and PDMS environment
  • 6a salt gradient
  • 6b sugar gradient
  • Figures 7 and 8 volume reduction of drops with enclosed yeast cells; Fig. 7: micrograph of the drops in micro-fluidic channels, Fig. 8: graphical representation of the volume reduction
  • Fig. 9 Volume reduction of drops with entrapped E. coli bacteria
  • Fig. 10 Growth curve of E. coli bacteria in the drops compared to conventional aerated cultures
  • Fig. 11 Volume enlargement of drops with enclosed algae
  • Fig. 12 Drop formation for cell-free enzyme systems
  • Fig. 14 DNAsel control
  • Fig. 15 view of a separating device according to the invention
  • FIG. 16 Detailed view of the separator of FIG. 15 with two drops passing through it.
  • the mechanism of size change was tested on various cell systems and enzyme systems. It has been shown that the inventive method is not only on cell systems, but also on non-cell systems for the detection of chemical reactions within the drops, eg enzymatic synthesis and degradation of polymers, can be successfully applied.
  • a microfluidic channel system whose walls and ceiling consist of PDMS and are saturated with the appropriate aqueous solution (eg cell medium).
  • the PDMS system was incubated for at least one day in the appropriate solution.
  • the PDMS absorbs the solution during this time, thus providing a reservoir of defined osmolarity that allows the exchange of water with drops and the PDMS system through the oil phase and into direct contact with the drops.
  • Fig. 6 shows the change in size of drops containing a 1% solution of zonyl in a microenvironment of PDMS treated with the same solution or a 100 mM NaCl; 1% zonyl solution was saturated.
  • the cross-sectional area has reduced to about 80% of the initial size of the drops, which corresponds to a volume change of about 30% (FIG. 6a).
  • E. coli bacteria show the effect of volume reduction by incubating the bacteria in the drops ( Figures 9 and 10B).
  • the bacteria in the drops show a higher growth rate and reach a higher cell density compared to classical cell culture conditions (cell incubation in the incubator with shaking in milliliter volumes) (FIG. 10).
  • a DNA / DNase system for the drops was prepared. wraps.
  • DNase was attached to polystyrene beads and enclosed in drops together with a DNA solution using a double-flow microfluidic system.
  • the double-feed system ensures that the enzyme and substrate are in contact only immediately prior to drop formation (FIG.
  • the activity of the DNase bead systems was checked by gel electrophoresis (FIG. 14): After incubation with the DNAase beads, the previously added lambda DNA was broken up into small fragments.
  • Control 1 DNasel in solution
  • Reaction 1-3 DNasel beads in various concentrations (0.67 mg, 3.33 mg, 0.33 mg)
  • control 2 supernatant of beads with DNA
  • control 3 heat inactivation
  • control 4 only DNA
  • ladder (rightmost track) DNA ladder (bands from bottom to top: 1-10 kb in increments of 1 kb and 15 kb).
  • the size separation of the droplets is effected by the permeation of sufficiently small droplets through a lattice structure, the separation diameter being determined by the lattice geometry and the flow velocities in the channels leading back and forth.
  • the grid and an overlying collecting geometry replace the duct ceiling in a certain area of the flow cell. If the diameter is sufficiently small, droplets flowing down the channel rise driven by the buoyancy force through the grid and can be sucked out of the collecting channel.
  • FIG. 15 shows a possible structure of the separation geometry in a flow cell:
  • a lower PDMS layer contains a channel structure in which drops flow along.
  • An upper PDMS Layer with a collecting channel closes the flow cell tight.
  • Fig. 16 the rise of two small drops is shown coming from below flow under the grid and then ascend through the grid, recognizable by the running out of focus.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur passiven Trennung und Sortierung von Tropfen durch Verwendung von nicht-optischen Markern für Reaktionen innerhalb der Tropfen. Ein solches Verfahren umfasst vorzugsweise a) Bereitstellen einer ersten Phase von primären Tropfen, die ein Reaktionsmedium umfassen und in denen bestimmte Reaktionen ablaufen, in einem Inkubationsraum, der eine zweite flüssige Trägerphase enthält, die mit der ersten Phase nicht mischbar ist; b) Ablaufen lassen der Reaktionen in den primären Tropfen, wodurch mindestens ein Teil der primären Tropfen in sekundäre Tropfen überführt wird, die sich von den primären Tropfen durch eine Veränderung mindestens eines nicht-optischen physikalischen Parameters der Tropfen unterscheiden, c) passives Trennen der primären und sekundären Tropfen in Abhängigkeit von Unterschieden des mindestens einen nicht-optischen physikalischen Parameters der Tropfen durch Kontaktieren der Tropfen mit einer Trenneinrichtung, welche eine vorgegebene geometrische Form und/oder Oberflächengestaltung aufweist, dergestalt, dass hinsichtlich des mindestens einen nicht-optischen physikalischen Parameters unterschiedliche Tropfen eine unterschiedliche Wechselwirkung mit der geometrischen Form und/oder Oberfläche der Trenneinrichtung erfahren und dadurch getrennt werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur passiven Trennung und Sortierung von Tropfen, insbesondere in einem mikrofluidischen System, durch Verwendung von nicht-optischen Markern für Reaktionen innerhalb der Tropfen
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur passiven Trennung und Sortierung von Tropfen durch Verwendung von nicht-optischen Markern für Reaktionen innerhalb der Tropfen.
Die Verfahren sind vor allem für mikrofluidische Systeme mit hohem Durchsatz geeignet. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere für die Anwendung in Screening- Verfahren zur Analyse, Selektion und Identifizierung eines breiten Spektrums von Analyten, einschließlich Zellen, Katalysatoren, Enzyme und andere Substanzen, die physikalische, chemische oder biologische Reaktionen beeinflussen oder steuern können.
Für solche Untersuchungs- und Screeningverfahren wurden in letzter Zeit zunehmend mikrofluidische Systeme mit Erfolg eingesetzt .
Mikrofluidiksysteme bieten die einzigartige 'Möglichkeit, kleinste Flüssigkeitsmengen in mikrometergroßen Kanalstrukturen zu handhaben. Aufgrund der geringen Dimensionen lässt sich eine Vielzahl von Kanälen, Reaktionsräumen und Steuerelementen auf kleinstem Raum integrieren, wodurch die Möglichkeit einer effizienten Parallelisierung von Reaktionen gegeben ist. Eine wichtige Voraussetzung für Hochdurchsatz-Verfahren wird damit erfüllt. Neben der Größenreduktion zeichnen sich Mikro- fluidiksysteme durch weitere physikalische Eigenschaften aus, die den Zugang zu neuen Anwendungen eröffnen: Der Fluss in solchen Systemen ist gewöhnlich laminar. Dadurch lassen sich Parameter wie Stoffkonzentration und Temperatur gezielt und örtlich begrenzt manipulieren. Das grosse Oberflächen-Volumen- Verhältnis, ein weiteres Charakteristikum der Mikrofluidik, ermöglicht einen effizienten Temperaturaustausch und damit kontrollierte Reaktionsbedingungen. ikrotropfen lassen sich einfach erzeugen und können als Mik- roreaktoren verwendet werden, in denen sich beispielsweise einzelne Zellen oder alle Reaktanten interessierender Reaktionen einschließen lassen.
Durch die Verwendung mehrerer Flüssigkeitsphasen in Mikroflui- diksystemen kann das Anwendungsspektrum weiter ausgebaut werden: Die Herstellung monodisperser Tropfen mit Produktionsraten von bis zu 10,000 Tropfen pro Sekunde wird durch hydrodynamische Fo- kussierung zweier nicht-mischbarer Flüssigkeiten ermöglicht.
Solche Tropfen können als isolierte Picoliter-Reaktionsgefäße genutzt werden: Verschiedene Tropfen unterschiedlichen Inhalts lassen sich miteinander fusionieren oder in Tochtertropfen unterschiedlicher Größe aufspalten. Die flexiblen Gestaltungsoptionen und die speziellen physikalischen Eigenschaften zusammen mit der Möglichkeit, Systemparameter auf zellularer Ebene zu kontrollieren, machen die Mikrofluidiktechnologie damit gerade für zellbiologische Anwendungen zu einem vielversprechenden Werkzeug, da die Möglichkeit besteht, einzelne Zellen in separierten Reaktionsvolumina zu untersuchen.
Die Möglichkeit, kleinste Volumina zu erzeugen und zu analysieren, bietet entscheidende Vorteile in verschiedensten Screening- Anwendungen gerade bei biologischen Assays: • Das benötigte Probenvolumen wird drastisch reduziert (ein Mikrotropfen mit einem Durchmesser von 25 pm besitzt ein Volumen von ~8 pl, damit lassen sich aus 1 μΐ Probenlösung mehr als 120,000 Tropfen erzeugen).
5 · Eine Vielzahl von Reaktionen lässt sich damit parallelisieren und auf kleinstem Raum durchführen.
• Das geringe Probenvolumen bietet die Möglichkeit, einzelne Zellen in den Tropfen einzuschließen. Damit lassen sich ganze Zellpopulationen auf Einzel-Zell-Ebene analysieren.
L0
Der Einsatz der Tropfenmikrofluidik zur Hochdurchsatzanalyse wurde beispielsweise von Agresti et al. (PNAS 107, 4004-9 (2010)) beschrieben.
L5 Während die Reaktionsschritte in derzeitigen Mikrofluidik- ansätzen vollständig miniaturisiert sind, erfolgt die Analyse und Kontrolle allerdings weiterhin über klassische Verfahren, die eine aktive und externe Steuerung erfordern. So werden bei¬ spielsweise klassische Fluoreszenzmarker zur Assay-Analyse ver-
.0 wendet (wie z.B. in US 2009/0068170 AI beschrieben). Das Fluoreszenzsignal eines jeden einzelnen Tropfens wird detektiert und ausgewertet {extern) . Die Tropfen mit entsprechendem Signal werden schließlich mit Hilfe elektrischer Felder (aktiv) aussortiert .
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Aus dem Lab-on-Chip des Reaktionsschrittes wird damit wieder ein makroskopisches System, bei dem die notwendige Steuer- und Analyseeinheit die Größe und Kosten des Reaktionsmoduls um ein Vielfaches übersteigt.
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Vor diesem Hintergrund liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung neuer verbesserter Verfahren zur Analyse, Trennung und Sortierung von Tropfen, in denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen stattfinden oder stattgefunden haben, und darin enthaltenden Analyten, insbesondere in einem mikrofluidischen System, welche zur Durchführung von Hochdurchsat z-Screening- und Analyseverfahren geeignet sind und die genannten Nachteile des Standes der Technik nicht mehr aufweisen und insbesondere die Vorteile einer deutlich einfacheren Handhabung und hohen Kosteneffizienz bieten .
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit den Verfahren nach Anspruch 1 und 21 sowie der Vorrichtung nach Anspruch 25. Speziellere Ausführungsformen und weitere Aspekte der Erfindung sind Gegenstand der weiteren Ansprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren nach Anspruch 1 umfasst die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer ersten Phase von primären Tropfen, die ein Reaktionsmedium umfassen und in denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen, in einem Inkubationsraum, der eine zweite flüssige Trägerphase enthält, die mit der ersten Phase nicht mischbar ist;
b) Ablaufen lassen der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in den primären Tropfen, wodurch mindestens ein Teil der primären Tropfen in sekundäre Tropfen überführt wird, die sich von den primären Tropfen durch eine Veränderung mindestens eines nicht-optischen physikalischen Parameters der Tropfen unterscheiden,
c) passives Trennen der primären und sekundären Tropfen in Abhängigkeit von Unterschieden des mindestens einen nichtoptischen physikalischen Parameters der Tropfen durch Kontaktieren der Tropfen mit einer Trenneinrichtung, welche eine vorgegebene geometrische Form und/oder Oberflächengestaltung aufweist, dergestalt, dass hinsichtlich des mindestens einen nicht-optischen physikalischen Parameters unterschiedliche Tropfen eine unterschiedliche Wechselwirkung mit der geometri- sehen Form und/oder Oberfläche der Trenneinrichtung erfahren und dadurch getrennt werden.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den meisten Trennverfahren des Standes der Technik besteht darin, dass auf die üblichen optischen Marker zum Nachweis einer stattgefundenen Reaktion in den Tropfen und die damit verbundenen externen Detektionssysteme verzichtet werden kann. Erfindungsgemäß wird als Marker ein veränderter nichtoptischer physikalischer Parameter der Tropfen, vorzugsweise ein geometrischer oder mechanischer Parameter, verwendet.
Spezieller ist dieser physikalische Parameter aus der Gruppe ausgewählt, welche das Volumen, die spezifische Dichte, Adhäsion an oder Affinität zu bestimmten Oberflächen, Oberflächenspannung, Viskoelastizität oder Form der Tropfen um- fasst .
Besonders bevorzugt ist der physikalische Parameter eine Volumenänderung, d.h. eine Volumenverringerung oder -erhöhung der Tropfen. In diesem Fall erfolgt die Trennung von Tropfen unterschiedlicher Größe vorzugsweise durch eine Trenneinrichtung, die eine Oberfläche mit einer oder mehreren Öffnung (en) mit vorgegebenem Durchmesser umfasst. Diese Oberfläche kann beispielweise Bestandteil einer Sieb- oder Filtervorrichtung sein und/oder aus der Oberfläche einer Lochplatte oder Lochmembran bestehen .
In einer speziellen und besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trenneinrichtung von mindestens einem Teil von mindestens einer Begrenzungsfläche, insbesondere Decke und/oder Boden, des Inkubationsraums gebildet. Falls die Tropfen eine geringere spezifische Dichte als die flüs¬ sige Trägerphase haben, sammeln sie sich an der mit Öffnungen versehenen Decke des Inkubationsraums und werden dort automatisch nach der Größe getrennt. Umgekehrt sammeln sich Tropfen mit einer größeren spezifischen Dichte als die flüssige Trägerphase am Boden und können dort nach der Größe getrennt werden.
Auch bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen eine Veränderung der spezifi- sehen Dichte ist, kann eine Trennung von unterschiedlichen Tropfen durch Trenneinrichtungen am Boden und/oder der Decke des Inkubationsraums auf einfache und effiziente Weise erfolgen. Bei¬ spielsweise können die Tropfen mit der höheren Dichte am Boden und die Tropfen mit der geringeren Dichte an der Decke gesammelt und abgeführt werden.
Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Tropfenform ist, kann die Trenneinrichtung z.B. eine Oberfläche mit Öffnungen vorgegebener Größe und Form umfassen, welche nur Tropfen einer bestimmten Form passieren lässt.
Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Adhäsion an oder Affinität zu bestimmten Oberflächen ist, kann die Trenneinrichtung eine Oberfläche umfassen, welche ausschließlich oder bevorzugt nur die Adhäsion von bestimmten Tropfen, beispielsweise nur primären Tropfen oder nur sekundären Tropfen oder nur einer Art von sekundären Tropfen, gestattet.
Bei einer Änderung der visko-elastischen Tropfeneigenschaften:
Tropfen mit überwiegend viskosem Charakter lassen sich leicht deformieren und auch durch Öffnungen, die kleiner sind als der Tropfendurchmesser, bei entsprechenden Druckdifferenzen hin- durchzwängen. Dies gelingt nicht oder nur bei einer wesentlicher höheren Druckdifferenz mit elastischen Tropfen. Elastische Tropfen können beispielsweise durch eine Polymerisation/Gelierung des Tropfenmediums entstehen, ausgelöst durch eine chemische oder biologische Reaktion innerhalb der Tropfen. Das unterschiedliche Deformationsverhalten der Tropfen erlaubt schließlich eine einfache Trennung.
Bei einer Änderung der Oberflächenspannung der Tropfen:
Eine Veränderung der Oberflächenspannung von Mikrotropfen kann durch eine reaktionsbedingte Veränderung der in den Tropfen zur Stabilisierung verwendeten Tenside oder durch die Bildung weiterer oberflächenaktiver Substanzen hervorgerufen werden. Dadurch können Tropfen stabilisiert bzw. destabilisiert werden: Destabilisierte Tropfen können miteinander fusionieren und größere Tropfen bilden. Die stabilisierten Tropfen behalten ihre ursprüngliche Größe und verschmelzen nicht mit anderen Tropfen. Diese Tropfen können wiederum durch ein Filterverfahren von den fusionierten großen Tropfen getrennt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Inkubationsraum und/oder die Trenneinrichtung Bestandteil eines mikrofluidischen Systems. In diesem Fall kann die Trenneinrichtung auch vorteilhaft von mindestens einer inneren Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals gebildet werden. Ein solches mikrofluidisches System kann eine Vielzahl von Kanälen und damit auch von Inkubationsräumen und/oder Trenneinrichtungen parallel nutzen.
Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen das Volumen ist, wird diese mindestens eine innere Oberfläche des mikrofluidischen Kanals mindestens eine Öffnung mit vorgegebenem Durchmesser aufweisen. Durch die mögliche parallele Verwendung vieler Kanäle können auch parallele Trenneinrichtungen mit jeweils nur einer Austrittsöffnung (oder einigen wenigen Öffnungen) zu einer sehr effizienten und schnellen Trennung und Sortierung von Tropfen führen.
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist der veränderte physikalische Parameter der Tropfen das Resultat eines Stoffaustausches zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung.
Typischerweise wird dieser Stoffaustausch durch eine osmotische Druckdifferenz zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung, welche durch den Ablauf der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in den Tropfen aufgebaut wurde, hervorgerufen .
Die osmotische Druckdifferenz zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung führt zu einem Ausstrom oder Einstrom von Wasser oder einem anderen Lösungsmittel des Reaktionsmediums aus den Tropfen und damit zu einer Volumenverringerung oder Volumenerhöhung der Tropfen. Die Art der Volumenänderung wird durch die in den Tropfen ablaufenden Reaktionen bestimmt: Die Erhöhung der Gesamtzahl an gelösten Stoffen in den Tropfen, beispielsweise durch enzymatischen Polymerabbau, führt zu einem Lö- sungsmitteleinfluss und damit zu einer Volumenvergrößerung. Umgekehrt führt eine Verringerung der Gesamtzahl gelöster Stoffe in den Tropfen, beispielsweise durch Glukoseverbrauch durch Zellen, zu einer Volumenverringerung.
Der Stoffaustausch zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung kann mit einer reaktionsmedium-enthaltenden Trägerphase und/oder mit mindestens einer reaktionsmedium-enthaltenden Oberfläche des Inkubationsraums stattfinden. Die letztere Alternative ist in der Regel bevorzugt, da sie auch den Einsatz solcher Trägerphasen erlaubt, die kein oder kaum Reaktionsmedium aufnehmen können.
Die reaktionsmedium-enthaltende Oberfläche weist vorzugsweise das gleiche Reaktionsmedium wie das der Tropfenphase daran adsorbiert und/oder darin absorbiert auf. Das Material dieser Oberfläche ist nicht besonders beschränkt und kann in Abhängigkeit von der Art und Zusammensetzung des Reaktionsmedium ausgewählt werden. Ein spezielles, nicht beschränkendes Beispiel für ein solches Material mit hydrophilen Eigenschaften ist Polydimethylsiloxan, das gut mit wässrigen Medien, z.B. Zellmedien, gesättigt werden kann.
Die reaktionsmedium-enthaltende Oberfläche kann auch eine für das Lösungsmittel des Reaktionsmediums permeable Membran, welche die Tropfen von einem Reaktionsmedium-Reservoir trennt, umfassen oder daraus bestehen, so dass der Stoffaustausch durch diese Membran erfolgen kann.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann auch eine weitere Tropfenphase als reaktionsmedium-enthaltende Umgebung dienen. Diese Tropfen, im folgenden inaktive Tropfen genannt, enthalten lediglich das Reaktionsmedium oder Reaktionsmedium zusammen mit einem inaktiven oder schwach aktiven Katalysator oder einer inaktiven oder schwach aktiven Zelle. Es findet daher keine Reaktion bzw. nur eine schwache Reaktion in den inaktiven Tropfen statt. Damit wird zwischen den inaktiven Tropfen und den aktiven Tropfen, in denen gewünschte chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen, eine osmotische Druckdifferenz aufgebaut, die schließlich einen Stoffaustausch zwischen diesen Tropfen hervorruft. Die Volumenänderung der inaktiven Tropfen verhält sich damit umgekehrt wie diejenige der aktiven Tropfen: Ein Lösungsmittelfluss findet von den aktiven Tropfen in die inaktiven Tropfen bzw. in umgekehrter Richtung statt. Der relative Größenunterschied zwischen aktiven und inaktiven Tropfen wird dadurch verstärkt und erleichtert damit die Selektion aktiver Tropfen.
Nachdem in den aktiven Tropfen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen stattfinden, enthalten diese Tropfen alle erforderlichen Reaktionspartner und Hilfsstoffe für die jeweilige Reaktion. Vorzugsweise enthalten sie neben den Eduk- ten der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen mindestens eine weitere Komponente, die einen Einfluss auf die jeweiligen chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen haben kann. Diese Komponente stellt häufig gleichzeitig einen Analyten dar, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht oder identifiziert werden soll.
Spezieller ist diese Komponente aus der Gruppe aus Katalysatoren, einschließlich Enzymen, Kokatalysatoren und Inhibitoren ausgewählt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann so durchgeführt werden, dass die chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in Schritt b) für eine vorbestimmte Zeit ablaufen. Diese Zeitspanne wird mindestens so lange sein, dass der Ablauf der jeweiligen Reaktion zu einer ausreichenden Veränderung des vorgesehenen physikalischen Parameters der Tropfen führt. Diese Zeitspanne kann in Abhängigkeit von der jeweiligen Reaktion und den Reaktionsbedingungen stark variieren, kann jedoch von einem Fachmann auf diesem Gebiet unschwer in Routineversuchen ermittelt werden.
In einer speziellen Ausführungsform enthalten die Tropfen Gebilde, in oder auf denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen. Diese Gebilde können beispielswei- se natürliche oder künstliche Zellen, Partikel, Beads, Vesikel oder Kapseln, oder andere Molekülaggregate sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um biolo- gische Zellen, deren Zellaktivität, insbesondere meta-bolische Aktivität und/oder Teilungsaktivität, untersucht werden soll.
Die zu untersuchenden Zellen werden durch hydrodynamische Flussfokussierung einer Zellsuspension (LI) in Tropfen einge- schlössen (Fig. 1) . Als inertes Öl (L2) werden beispielsweise perfluorierte Kohlenwasserstoffe mit einer höheren Dichte als Wasser (z.B. FC-40 von 3 ; ca. 1,9 g/ml) verwendet. Es können jedoch prinzipiell alle Arten von Lösungsmittel verwendet werden, die sich nicht mit der Tropfenphase mischen und damit ein Zwei-Phasen-System (Mikroemulsion) erlauben: Kohlenwasserstoffe, Mineralöle etc.
Aufgrund metabolischer Aktivitäten verändert sich die Zusammensetzung der Tropfenflüssigkeit: So sinkt beispielsweise die Konzentration kleiner Nährstoffmoleküle drastisch außerhalb der Zellen. Diese werden von den aktiven Zellen aufgenommen, metabolisiert und schließlich zum Aufbau intrazellulärer Strukturen verwendet. Diese Verarmung des Tropfenmediums führt zum Aufbau einer osmotischen Druckdifferenz zwischen Tropfenmedium und der mit Medium gesättigten mikrofluidischen Umgebung. Die Umgebung besteht z.B. aus Polydimethylsiloxan (PDMS), einem elastischen Polymer, das sich mit wässrigen Lösungen einfach sättigen lässt, einer für das Lösungsmittel permeablen Membran, welche die Tropfen von einem Medium-Reservoir trennt, oder anderen Tropfen, die lediglich Tropfenmedium enthalten, ohne eine aktive Komponente, die eine Reaktion innerhalb der Tropfen bewirkt. Die osmotische Druckdifferenz führt zu einem Wasserausstrom aus den Tropfen in die Umgebung (PDMS-Wände) . Der Verlust von Wasser gleicht den Konzentrationsunterschied wieder aus und führt zu einer Verkleinerung der Tropfen. Die Größenänderung dient schließlich als neuer mikrofluidischer Marker für die biologische Aktivität der in den Tropfen eingeschlossenen Zellen .
Eine Selektion und Sortierung in aktive und nicht-aktive Zellen kann nun auf rein passive Weise durch eine geeignete Mik- rostrukturierung erfolgen: Die Tropfen besitzen ein geringere Dichte als das sie umgebende Trägeröl. Die Tropfen steigen auf. Kleinere Tropfen können durch eine Filterdecke von den übrigen separiert und entnommen werden (Fig. 2).
Zur Selektion sind damit keine externen und aktiven Analyse¬ verfahren notwendig, die beispielsweise ein Fluoreszenzsignal jedes einzelnen Tropfen messen, auswerten und darauf basierend Tropfen aussortieren. Es genügt ein einfaches integriertes Mikrofluidiksystem.
In einer typischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt a) mehrere Arten von primären Tropfen mit unterschiedlicher Zusammensetzung bereitgestellt und in Schritt b) verschiedene sekundäre Tropfen erzeugt, die sich durch mindestens einen physikalischen Parameter der Tropfen voneinander unterscheiden, und in Schritt c) erfolgt dann eine passive Trennung und Sortierung der verschiedenen sekundären Tropfen .
In den verschiedenen primären Tropfen können beispielsweise unterschiedliche chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen oder die gleichen chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in unterschiedlicher Weise, z.B. unterschiedlich schnell, ablaufen. Diese Unterschiede können beispielsweise auf die Anwesenheit einer bestimmten Komponente, eines bestimmten Analyten, zurückzuführen sein und können zur die Identifizierung einer Komponente mit bestimmten 5 gewünschten Eigenschaften genutzt werden.
In einer speziellen Ausführungsform enthalten die verschiedenen primären Tropfen verschiedene Arten von Zellen, die sich hinsichtlich mindestens einer Zellaktivität unterscheiden, und L0 die Trennung der aufgrund der unterschiedlichen Zellaktivität gebildeten unterschiedlichen sekundären Tropfen ermöglicht eine Unterscheidung und Sortierung von aktiven und nicht-aktiven Zellen .
L5 Die Größe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Tropfen ist nicht besonders kritisch und kann an die zu untersuchenden Systeme und Reaktionsbedingungen angepasst werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird dieses 20 in einem mikrofluidischen System durchgeführt, und die Tropfendurchmesser liegen in dem mit herkömmlichen mikrofluidischen Techniken erzeugten Größenbereich. Dieser Bereich beträgt etwa 1 Mikrometer bis 500 Mikrometer Typischerweise liegt die Tropfengröße in einem Bereich von 5 Mikrometer bis 100 Mikrometer, vor- 25 zugsweise von 10 Mikrometer bis 50 Mikrometer Bei Tropfen, die Gebilde wie biologische Zellen enthalten, wird die Mindestgröße von der Größe dieser Gebilde bestimmt und die Tropfengröße liegt typischerweise in einem Bereich von 10 Mikrometer bis 50 Mikrometer.
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Bei Tropfen ohne Gebilde hängt die Untergrenze im Wesentlichen nur vom verwendeten Tropfenerzeugungssystem ab. Grundsätzlich ist die Verwendung möglichst kleiner Tropfen, soweit noch handhabbar, bevorzugt, da materialsparend und somit kostengünstiger. Wie be- reits oben ausgeführt, liegt ein Hauptvorteil aller mikro- fluidischen Verfahren und insbesondere auch des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Möglichkeit zur parallelen Durchführung einer großen Anzahl von Reaktionen und nachfolgenden Analyse- und Trennschritten auf kleinstem Raum.
Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Anwendung des beschriebenen Trennungsverfahrens zur Selektion und Identifizierung von Zellen, die eine bestimmte Zell- aktivität aufweisen oder nicht aufweisen, oder zur Selektion und Identifizierung von Substanzen, die einen bestimmten qua- litativen oder quantitativen Einfluss auf bestimmte chemische, biologische oder physikalischen Reaktionen haben oder nicht haben. Diese Selektions- und Analyseverfahren sind vorzugswei- se Verfahren mit hohem Durchsatz.
Spezieller handelt es sich bei den untersuchten Substanzen um Substanzen aus der Gruppe aus Katalysatoren, einschließlich Enzymen, Cokatalysatoren und Inhibitoren.
Ein spezielleres Verfahren zur Selektion und Identifizierung von Zellen, die eine bestimmte Zellaktivität aufweisen oder nicht aufweisen, oder zur Selektion und Identifizierung von Substanzen, die einen bestimmten qualitativen oder quanti- tativen Einfluss auf bestimmte chemische, biologische oder physikalischen Reaktionen haben oder nicht haben,
umfasst die Schritte a)-c) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-18, wobei in Schritt a) primäre Tropfen bereitgestellt werden, von den mindestens ein Teil die zu untersuchen- den Zellen oder Substanzen enthält, und ferner
d) Isolieren von Tropfen mit einem vorgegebenen physikalischen Zielparameter und Identifizieren der Zellen oder Substanzen, welche in diesen Tropfen vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Selektions- bzw. Screeningverfahren wird das Verfahren mehrmals hintereinander durchgeführt, wobei die nach dem ersten Durchgang des Verfahrens selektierten Zellen oder Substanzen weiteren Selektions- durchgängen unterworfen werden. In diesen weiteren Durchgängen können sie z.B. anderen, insbesondere stringenteren, Reaktionsbedingungen unterworfen werden, um dadurch einen höheren Grad an Selektion zu erhalten. Daneben ist die serielle Durchführung auch geeignet, um Substanzen durch „gerichtete Evolution" zu optimieren: Nach jedem Reaktionschritten werden die selektierten Zellen und Substanzen einer Veränderung unterworfen, inbesondere durch Mutagene- se. Anschließend erfolgt eine weitere Selektion und Verände- rung. Auf diese Weise lässt sich eine schrittweise Optimierung der gewünschten Eigenschaften erreichen.
Vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten sind beispielsweise das Enzym-Screening und die Enzymoptimierung durch „gerichtete Evolution" für verschiedenste Zwecke, z.B. Celluloseabbau, Ethanolproduktion, Waschmittelenzyme etc.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-24, umfassend
a) einen Inkubationsraum, der zur Aufnahme einer ersten
Phase in Form von Tropfen, die ein Reaktionsmedium umfassen, und einer zweiten flüssigen Trägerphase, die mit der ersten Phase nicht mischbar ist, ausgelegt ist;
b) eine Trenneinrichtung, welche eine vorgegebene geometrische Form und/oder Oberflächengestaltung aufweist, dergestalt, dass unterschiedliche Tropfen eine unterschiedliche Wechselwirkung mit der geometrischen Form und/oder Oberflä- chengestaltung der Trenneinrichtung erfahren und dadurch getrennt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere zur Trennung von Tropfen mit unterschiedlichem Durchmessser, ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung eine Oberfläche mit einer oder mehreren Öffnung (en) mit vorgegebenem Durchmesser umfasst. Diese Oberfläche kann beispielweise Bestandteil einer Sieb- oder Filtervorrichtung sein oder die Oberfläche einer Lochplatte oder Lochmembran.
In einer speziellen und besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Trenneinrichtung von mindestens einem Teil von mindestens einer Begrenzungsfläche, insbesondere Decke und/oder Boden, des Inkubationsraums gebildet. Falls die Tropfen eine geringere spezifische Dichte als die flüssige Trägerphase haben, sammeln sie sich an der mit Öffnungen oder einer anderen selektierenden Oberfläche versehenen Decke des Inkubationsraums und werden dort automatisch z.B. nach der Größe getrennt. Umgekehrt sammeln sich Tropfen mit einer größeren spezifischen Dichte als die flüssige Trägerphase am Boden und können dort getrennt werden.
Auch in dem Fall, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen eine Veränderung der spezifischen Dichte ist, kann zur Trennung von unterschiedlichen Tropfen mindestens eine Trenneinrichtung am Boden und/oder der Decke des Inkubationsraums vorgesehen sein.
In dem Fall, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Tropfenform ist, kann die Trenneinrichtung z.B. eine Oberfläche mit Öffnungen vorgegebener Größe und Form umfassen, welche nur Tropfen einer bestimmten Form passieren lässt. In dem Fall, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Adhäsion an oder Affinität zu bestimmten Oberflächen ist, kann die Trenneinrichtung eine Oberfläche umfassen, welche ausschließlich oder bevorzugt nur die Adhäsion von be¬ stimmten Tropfen, beispielsweise nur primären Tropfen oder nur sekundären Tropfen oder nur einer Art von sekundären Tropfen, gestattet .
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Inkubationsraum und/oder die Trenneinrichtung Bestandteil eines mikrofluidischen Systems. In diesem Fall kann die Trenneinrichtung auch vorteilhaft von mindestens einer inneren Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals gebildet werden. Ein solches mikrofluidisches System kann eine Vielzahl von Kanälen und damit auch von Inkubationsräumen und/oder Trenneinrichtungen parallel nutzen.
Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen das Volumen ist, wird diese mindestens eine innere Oberfläche des mikrofluidischen Kanals mindestens eine Öffnung mit vorgegebenem Durchmesser aufweisen. Durch die mögliche parallele Verwendung vieler Kanäle können auch parallele Trenneinrichtungen mit jeweils nur einer Austrittsöffnung (oder einigen wenigen Öffnungen) zu einer sehr effizienten und schnellen Trennung und Sortierung von Tropfen führen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsraum mindestens eine Oberfläche umfasst, die das gleiche Reaktionsmedium wie das der Tropfenphase daran adsorbiert und/oder darin absorbiert aufweist. Der Inkubationsraum kann auch eine Oberfläche aufweisen, die eine für das Lösungsmittel des Reaktionsmediums permeable Membran, welche die Tropfen im Inkubationsraum von einem Reaktionsmedium-Reservoir trennt, umfasst oder daraus besteht. Auch eine solche Oberfläche kann im weiteren Sinne als reaktionsmedium-enthaltende Oberfläche betrachtet werden.
Fig. 3 zeigt ein erfindungsgemäßes kompaktes neues Mikro- fluidiksystem, welches die Tropfenerzeugung, Inkubation mit einhergehender Größenänderung der Tropfen und Selektion durch eine Lochmembran erlaubt.
Die Realisierung der vorliegenden Erfindung in einem mikroflu- idischen System basiert auf vier Kernschritten, um die zu untersuchenden Reaktionen und die anschließende Detektion und Selektion zu miniaturisieren: Der zu detektierende Zielparameter (I) wird in eine mikrofluidische Größe, eine Änderung bestimmter Tropfeneigenschaften, transformiert (II). Dies geschieht durch die Wechselwirkung von Mikrotropfen mit ihrer Umgebung, die sich durch eine geeignete Geometrie und Materialeigenschaften auszeichnet. Der mikrofluidische Marker (III) ermöglich schließlich eine rein passive Selektion (IV), die keiner aktiven und externen Kontrolle bedarf. Das System arbeitet autonom.
Fig. 4 zeigt in Feld A die Darstellung eines Zell-Screenings unter Bezugnahme auf die vier oben erläuterten Kernschritte. Nach Inkubation hat sich das Volumen der Tropfen mit teilungsaktiven Hefezellen (Nr. 1, 2, 3 und 6) deutlich verkleinert (Feld B) . Die Selektion kleiner Tropfen erfolgt durch passiven Auftrieb durch einen Mikrofilter (Feld C) . Feld D zeigt einen Prototyp für die Tropfenproduktion, Inkubation und anschließende Filterung (entspricht Fig. 3) .
Die hier vorgestellten erfindungsgemäßen Verfahren beruhen auf einem grundsätzlich neuen Ansatz: Durch den Einsatz einer passiven Sortierung unter Nutzung spezieller Marker, bei denen es sich um einen nicht-optischen physikalischen Parameter der Tropfen handelt, der durch den Reaktionsablauf so weit verändert wird, dass er zur Unterscheidung und Trennung von verschiedenen Tropfen verwendet werden kann, entfällt die Notwendigkeit zur aktiven und externen Beobachtung und Steuerung der Tropfen.
Bei der bevorzugten Anwendung in einem mikrofluidischen System ergeben sich noch weitere Vorteile:
a) nicht nur die zu untersuchenden Reaktionen werden miniaturisiert, sondern ebenso die anschließenden Schritte der Analyse und Kontrolle/Sortierung;
b) die Miniaturisierung von Analyse und Sortierung erfolgt durch die Nutzung spezieller mikrofluidischer Marker in Kombination mit einer geeigneten mikrofluidischen Umgebung;
c) diese Kombination führt zu einer passiven Sortierung, die keiner aktiven und externen Steuerung bedarf und die Zahl der notwendigen Mikro-Makro-Schnittstellen wird damit auf ein Mi- nimum reduziert.
Die vorliegende Erfindung eröffnet den Zugang zu einer neuen universellen Basis- und Plattform-Technologie, die für unterschiedlichste Mikrofluidikanwendungen (und andere Anwen- düngen) eingesetzt werden kann und nicht auf eine Produktnische beschränkt ist.
Die Reduktion der Mikro-Makro-Schnittstellen und der größtmögliche Verzicht auf externe Kontrollelemente steigern die Ro- bustheit erheblich. Eine Eigenschaft, die gerade in der Mikrofluidik entscheidend für eine erfolgreiche Anwendung ist.
Zudem reduziert der Verzicht auf aktive Steuerelemente und das einfache Grundkonzept die Kosten des Systems drastisch: Da das erfindungsgemäße Konzept die notwendigen Analyseelemente auf mikrostrukturierte Geometrien und Materialeigenschaften reduzieren kann, werden die Produktionskosten für einen erfin¬ dungsgemäßen Chip im wesentlichen durch das verwendete Materi- al bestimmt: im Falle des derzeit eingesetzten PDMS ca. 1 € pro Einheit.
Neuartige mikrofluidische Marker erlauben die Selektion globaler Systemeigenschaften ohne die Notwendigkeit spezifische, oft kostspielige Assays zu entwickeln: So lässt sich die Gesamteffizienz eines enzymatischen Polymerabbaus als Zielgröße messen, unabhängig von den molekularen Details (Schnittposition, Fragmentlänge, Substratmodifikationen oder Substrathetero- genität). Das System arbeitet „assay-frei" .
Das einfache Design erlaubt darüber hinaus die Realisierung kompakter und mobiler Produkte für den flexiblen Einsatz in Forschungslaboratorien in Form von einfachen Verbrauchsmaterialien („Ki t-Konzept" ) : Bereits ein 20 x 20 cm2 großes System erlaubt die Inkubation und die parallele Selektion von ca. 2,5 x 107 Tropfencontainern. Weiterhin ist durch das einfache Design eine Parallelisierung und Kaskadierung problemlos möglich. Kurzbeschreibung der Figuren
Fig. 1: Schema der Erzeugung von Mikrotropfen durch Flussfo- kussierung zweier nicht-mischbarer Flüssigkeiten
Fig. 2: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen passiven Sortierung auf Basis der Tropfengröße durch einfaches Neigen der Vorrichtung mit den Tropfen
Fig. 3: Aufsicht auf eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Fig. 4: schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
Fig. 5: Erzeugung von Mikrotropfen durch Flussfokussierung von Wasser und Öl
Fig. 6: Volumenänderung von Modelltropfen durch osmotische Druckdifferenzen zwischen Tropfen und PDMS-Umgebung;
6a: Salzgradient; 6b: Zuckergradient
Fig. 7 und 8: Volumenverkleinerung von Tropfen mit eingeschlossenen Hefezellen; Fig. 7: mikroskopische Aufnahme der Tropfen in mikro-fluidischen Kanälen, Fig. 8: graphische Darstellung der Volumenverkleinerung
Fig. 9: Volumenverkleinerung von Tropfen mit eingeschlossenen E. coli-Bakterien
Fig. 10: Wachstumskurve der E. coli-Bakterien in den Tropfen im Vergleich zu herkömmlichen belüfteten Kulturen
Fig. 11: Volumenvergrößerung von Tropfen mit eingeschlossenen Algen
Fig. 12: Tropfenbildung für zellfreie Enzymsysteme
Fig. 13: Volumenvergrößerung von Tropfen mit einem zellfreien Enzymsystem (DNAsel)
Fig. 14: DNAsel-Kontrolle
Fig. 15: Ansicht einer erfindungsgemäßen Trenneinrichtung
Fig. 16: Detailansicht der Trenneinrichtung von Fig. 15 mit zwei Tropfen, welche diese passieren
Die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
In diesen Beispielen wurde der Mechanismus der Größenänderung an verschiedenen Zellsystemen und Enzymsystemen getestet. Es wurde gezeigt, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur auf Zellsysteme, sondern auch auf Nicht-Zell-Systeme zur Detektion chemischer Reaktionen innerhalb der Tropfen, z.B. enzymatischer Auf- und Abbau von Polymeren, erfolgreich anwenden lässt.
In den folgenden Experimenten wurden Tropfen mit einem Durchmesser von 20 bis 50 μπι verwendet. Hergestellt wurden diese durch das mikrofluidische Verfahren der Flussfokussierung (Fig. 5). Dazu wurde ein inertes perfluoriertes Trägeröl verwendet (FC-40, 3M) . Die wässrige Phase enthielt zur Stabilisierung das Tensid Zonyl FSO-100. Als weiteres wurde das Ammoniumsalz des fluorierten Tensids Krytox 157 FSL zur Ölphase gegeben (2 Gewichts-%) um die Tropfenstabilität zu erhöhen. FC-40 besitzt eine Dichte von 1,855 g/ml. Wässrige Tropfen erfahren damit einen Auftrieb, der eine Filterung durch eine löchrige Decke ermöglicht.
Um eine definierte System für den Austausch von Wasser zwischen Tropfen und der Umgebung zu erzeugen, wurde ein Mikrofluidik-Kanalsystem verwendet, dessen Wände und Decke aus PDMS bestehen und mit der entsprechenden wässrigen Lösung (z.B. Zellmedium) gesättigt sind. Zur Sättigung wurde das PDMS-System für mindestens einen Tag in der entsprechenden Lösung inkubiert. Das PDMS nimmt in dieser Zeit die Lösung auf und stellt damit ein Reservoir mit definierter Osmolarität dar, das den Austausch von Wasser mit Tropfen und dem PDMS- System durch die Ölphase hindurch und in direkten Kontakt mit den Tropfen erlaubt. BEISPIEL 1
Volumenänderung durch unterschiedliche Stoffkonzentrationen innerhalb und außerhalb der Tropfen
Die Möglichkeit, die Tropfengröße durch osmotische Druckdifferenzen in einem geeigneten mikrofluidischen System zu verändern, wurde anhand von definierten Modellsystemen charakterisiert :
Um den Wasseraustausch zwischen den Tropfen und der mit einer Lösung gesättigten PDMS-Umgebung näher zu untersuchen wurden verschiedene statische Systeme mit jeweils einer unveränderlichen Lösungs-Zusammensetzung hinsichtlich der Zahl gelöster Stoffe innerhalb und außerhalb der Tropfen verwendet. Fig. 6 zeigt die Größenänderung von Tropfen, die eine 1 % Zo- nyl-Lösung enthalten, in einer Mikroumgebung aus PDMS, das mit der gleichen Lösung bzw. einer 100 mM NaCl; 1 % Zonyl-Lösung gesättigt wurde.
Nach ca. 10h Inkubation hat sich die Querschnittsfläche auf etwa 80 % der Ausgangsgröße der Tropfen reduziert, was einer Volumenänderung von etwa 30 % entspricht (Fig. 6a).
Eine Verwendung einer 1 M Zuckerlösung in den Tropfen führte in der gleichen gesättigten PDMS-Umgebung zu einer Vergröße- rung der Tropfenquerschnittsfläche um mehr als 20 % nach 48 Stunden (Fig. 6b) .
BEISPIEL 2
Volumenverkleinerung durch Hefezellen
Der Einschluss und die anschließende Inkubation von Hefezellen führt innerhalb weniger Stunden zu einer merklichen Änderung der Tropfengröße (Fig. 7) . Das Ausmaß der Volumenabnahme pro tropfen wird bestimmt durch die metabolische Aktivität, die Teilungsfähigkeit der Zellen sowie durch die Zahl der zu Beginn der Tropfenbildung in den Tropfen eingeschlossenen Zellen (Fig. 8).
BEISPIEL 3
Volumenverkleinerung durch Bakterien
Auch E . coli-Bakterien zeigen den Effekt der Volumenreduktion durch Inkubation der Bakterien in den Tropfen (Fig. 9 und Fig. 10B) .
Interessanterweise zeigen die Bakterien in den Tropfen eine höhere Wachstumsrate und erreichen eine höhere Zelldichte im Vergleich zu klassischen Zell-Kulturbedingungen (Zellinkubation im Brutschrank unter Schütteln in Millilitervolumina) (Fig. 10) .
BEISPIEL 4
Volumenvergrößerung durch Algen
Der Mechanismus der Volumenänderung der Tropfen durch Veränderung der osmotischen Druckdifferenz lässt für zuckeraufbauende Organismen eine Vergrößerung des Volumens erwarten. In Experimenten mit Algen, die zur Photosynthese und damit zur Produktion von Glukose in der Lage sind, konnte dies auch tatsächlich beobachtet werden: Tropfen mit Algen (Fig. 11 rechts unten) nahmen an Größe zu, während Hefe enthaltende Tropfen kleiner wurden.
BEISPIEL 5
Volumenvergrößerung durch Enzymsysteme
Zur Demonstration des Volumeneffektes bei nicht-lebenden Reaktionssystemen wurde ein DNA/DNase-System für die Tropfen ent- wickelt. Dazu wurde DNase an Polystyrolbeads angebunden und mit Hilfe eines Doppelzufluss-Mikrofluidiksystem gemeinsam mit einer DNA-Lösung in Tropfen eingeschlossen. Das Doppelzufluss-System gewährleistet, dass Enzym und Substrat erst unmittelbar vor der Tropfenbildung in Kontakt (Fig.
12) kommen. Damit ist sichergestellt, dass der Polymerabbau der DNA erst mit der Tropfenbildung beginnt.
Die Anbindung der DNase an Beads erlaubt die einfache Herstellung eines „binären" Tropfen-Systems, mit Tropfen, die entweder Beads und damit DNase enthalten oder kein Enzym enthalten. Die Beads erlauben zudem die einfache Visualisierung (Fig.
13) .
Die Aktivität der DNase-Bead-Systeme wurde mittels Gelelektrophorese geprüft (Fig. 14): Nach Inkubation mit den DNa- se-Beads ist die zuvor zugegebene Lambda-DNA in kleine Bruchstücke zerlegt worden.
Beschreibung von Fig. 14:
Control 1: DNasel in Lösung; reaction 1-3: DNasel-Beads in verschiedenen Konzentrationen (0.67 mg, 3.33 mg, 0.33 mg); control 2: Überstand von Beads with DNA; control 3: Hitze- Inaktivierung; control 4: nur DNA; ladder (Spur ganz rechts): DNA-Leiter (Banden von unten nach oben: 1-10 kb in Schritten von 1 kb und 15 kb) .
Die erwartete Volumenvergrößerung der Tropfen durch den Poly- merabbau und die damit einhergehende Erhöhung der Osmolarität fiel aufgrund der eingesetzten sehr geringen DNA-Menge (90 μΜ) nur gering aus (Fig. 13) . Dennoch konnte damit eindeutig die Anwendbarkeit des Verfahrens auf Enzymsysteme demonstriert werden. Anwendungsmöglichkeiten bestehen damit für das Enzym- Screening und die Enzymoptimierung durch „gerichtete Evolution" für verschiedenste Zwecke.
BEISPIEL 6
Passive Filterung basierend auf Tropfenauftrieb
durch ein Gitter
Die passive Filterung von Tropfen unterschiedlicher Größe, die durch eines der oben beschriebenen Verfahren erzeugt wurden konnte mit Hilfe eines einfachen Metallgitters (TEM-Grid) demonstriert werden, dass als Trennfilter zwischen zwei Mikrofluidikkanälen platziert wurde (Fig. 15).
Dieses System ermöglichte die einfache Trennung durch den Tropfenauftrieb: Eine Deformierung der Tropfen findet unter statischen Bedingungen oder bei geringen Fließgeschwindigkeiten nicht statt. Nur Tropfen mit einem Durchmesser, der kleiner als die Lochgröße des Gitters ist, gelangen von der unteren Kammer in den darüber liegenden Kanal.
Die Größentrennung der Tropfen erfolgt durch die Permeation genügend kleiner Tropfen durch eine Gitterstruktur, wobei der Trenndurchmesser durch die Gittergeometrie und die Flussgeschwindigkeiten in den hin- und wegführenden Kanälen festgelegt wird. Das Gitter und eine darüber liegenden Auffanggeometrie ersetzen in einem bestimmten Bereich der Flusszelle die Kanaldecke. Bei genügend kleinem Durchmesser steigen im Kanal entlangfließende Tropfen getrieben von der Auftriebskraft durch das Gitter auf und können aus dem Auffangkanal abgesogen werden .
Fig. 15 zeigt einen möglichen Aufbau der Trenngeometrie in einer Flusszelle: Eine untere PDMS-Schicht beinhaltet eine Kanalstruktur, in der Tropfen entlangfließen. Eine obere PDMS- Schicht mit einem Auffangkanal schließt die Flusszelle dicht ab. In dem Bereich, in dem sich die Kanäle unterer und oberer PDMS-Schicht überschneiden, befindet sich ein dünnes hexagonales TE -Gitter. In Fig. 16 ist der Aufstieg zweier kleiner Tropfen dargestellt, die von unten kommend unter das Gitter fließen und dann durch das Gitter aufsteigen, erkennbar am Herauslaufen aus dem Fokus.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Trennung und passiven Sortierung von Tropfen in einem mehrphasigen System, umfassend
a) Bereitstellen einer ersten Phase von primären Tropfen, die ein Reaktionsmedium umfassen und in denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen, in einem Inkubationsraum, der eine zweite flüssige Trägerphase enthält, die mit der ersten Phase nicht mischbar ist;
b) Ablaufen lassen der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in den primären Tropfen, wodurch mindestens ein Teil der primären Tropfen in sekundäre Tropfen überführt wird, die sich von den primären Tropfen durch eine Veränderung mindestens eines nicht-optischen physikalischen Parameters der Tropfen unterscheiden,
c) passives Trennen der primären und sekundären Tropfen in Abhängigkeit von Unterschieden des mindestens einen nichtoptischen physikalischen Parameters der Tropfen durch Kontaktieren der Tropfen mit einer Trenneinrichtung, welche eine vorgegebene geometrische Form und/oder Oberflächengestaltung aufweist, dergestalt, dass hinsichtlich des mindestens einen nicht-optischen physikalischen Parameters unterschiedliche Tropfen eine unterschiedliche Wechselwirkung mit der geometrischen Form und/oder Oberfläche der Trenneinrichtung erfahren und dadurch getrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht-optische physikalische Parameter ein geometrischer oder mechanischer Parameter der Tropfen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der physikalische Parameter aus der Gruppe ausgewählt ist, welche das Volumen, die spezifische Dichte, Adhäsion an oder Affinität zu bestimmten Oberflächen, Oberflächenspannung, Viskoelastizität oder Form der Tropfen um¬ fasst .
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen eine Volumenänderung der Tropfen ist und die passive Trennung von Tropfen unterschiedlicher Größe durch eine Trenneinrichtung, die eine Oberfläche mit einer oder mehreren Öffnung (en) mit vorgegebenem Durchmesser umfasst, erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung von mindestens einem Teil von mindestens einer Begrenzungsfläche, insbesondere Decke oder Boden, des Inkubationsraums gebildet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tropfen Gebilde enthalten, in denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen .
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gebilde natürliche oder künstliche Zellen, Partikel, Ve- sikel oder Kapseln, oder andere Molekülaggregate sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass die primären Tropfen neben den Edukten der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen mindestens eine weitere Komponente enthalten, die einen Einfluss auf die jeweiligen chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen haben kann.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Komponente aus der Gruppe aus Katalysatoren, einschließlich Enzymen, Cokatalysatoren und Inhibitoren ausgewählt ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen das Resultat eines Stoffaustausches zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Stoffaustausch durch eine osmotische Druckdifferenz zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung, welche durch den Ablauf der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in den Tropfen aufgebaut wurde, hervorgerufen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die osmotische Druckdifferenz zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung zu einem Ausstrom oder Einstrom von Wasser oder einem anderen Lösungsmittel des Reaktionsmediums aus den Tropfen und damit zu einer Volumenverringerung oder Volumenerhö¬ hung der Tropfen führt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Stoffaustausch zwischen den Tropfen und einer reaktionsmedium-enthaltenden Trägerphase und/oder einer reaktionsmedium-enthaltenden weiteren Tropfenphase und/oder zwischen den Tropfen und mindestens einer reaktionsmedium-enthaltenden Oberfläche des Inkubationsraums stattfindet .
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass die chemischen, biologischen oder physikali- sehen Reaktionen in Schritt b) für eine vorbestimmte Zeit ablaufen .
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) mehrere Arten von primären Tropfen mit unterschiedlicher Zusammensetzung bereitgestellt werden und in Schritt b) verschiedene sekundäre Tropfen erzeugt werden, die sich durch mindestens einen physikalischen Parameter der Tropfen voneinander unterscheiden, und in Schritt c) eine passive Trennung und Sortierung der verschiedenen sekundären Tropfen erfolgt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass die primären Tropfen verschiedene Arten von Zellen enthalten, die sich hinsichtlich mindestens einer Zellaktivität unterscheiden, und dadurch, dass die Trennung der aufgrund der unterschiedlichen Zellaktivität gebildeten unterschiedlichen sekundären Tropfen eine Unterscheidung und Sortierung von aktiven und nicht-aktiven Zellen ermöglicht.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsraum und/oder die Trenneinrichtung Bestandteil eines mikrofluidischen Systems ist bzw. sind .
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung von mindestens einer inneren Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals gebildet wird, welche mindestens eine Öffnung mit vorgegebenem Durchmesser aufweist.
19. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-18 zur Selektion und Identifizierung von Zellen, die eine bestimmte Zellaktivität aufweisen oder nicht aufweisen, oder zur Selektion und Identifizierung von Substanzen, die einen bestimmten qualitativen oder quantitativen Einfluss auf bestimmte chemische, biologische oder physikalischen Reaktionen haben oder nicht haben.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen aus der Gruppe aus Katalysatoren, einschließlich Enzymen, Kokatalysatoren und Inhibitoren ausgewählt sind.
21. Verfahren zur Selektion und Identifizierung von Zellen, die eine bestimmte Zellaktivität aufweisen oder nicht aufweisen, oder zur Selektion und Identifizierung von Substanzen, die einen bestimmten qualitativen oder quantitativen Einfluss auf bestimmte chemische, biologische oder physikalischen Reaktionen haben oder nicht haben,
welches Selektionsverfahren die Schritte a)-c) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-18 umfasst, wobei in Schritt a) primäre Tropfen bereitgestellt werden, von den mindestens ein Teil die zu untersuchenden Zellen oder Substanzen enthält, und welches Selektionsverfahren ferner umfasst,
d) Isolieren von Tropfen mit einem vorgegebenen physikalischen Zielparameter und Identifizieren der Zellen oder Substanzen, welche in diesen Tropfen vorliegen.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Substanzen aus der Gruppe aus Katalysatoren, einschließlich Enzymen, Kokatalysatoren und Inhibitoren ausgewählt sind.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mehrmals hintereinander durchgeführt wird, wobei die nach dem ersten Durchgang des Verfahrens selektierten Zellen oder Substanzen weiteren Selektionsdurchgängen unterworfen werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die weiteren Selektionsdurchgänge unter anderen, insbesondere stringenteren, Re¬ aktionsbedingungen durchgeführt werden, um dadurch einen höheren Grad an Selektion zu erhalten, und/oder wobei die nach einem Durchgang oder mehreren Durchgängen des Verfahrens selektierten Zellen, oder Substanzen zwischen den Selektionsdurchgängen zufallsbedingten Änderungen, z.B. durch Mutagene- se, unterworfen werden, um dadurch eine gerichtete Evolution und/oder Optimierung der Substanzen oder Zellen zu erreichen.
25. Vorrichtung, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-24, umfassend
a) einen Inkubationsraum, der zur Aufnahme einer ersten Phase in Form von Tropfen, die ein Reaktionsmedium umfassen, und einer zweiten flüssigen Trägerphase, die mit der ersten Phase nicht mischbar ist, ausgelegt ist;
b) eine Trenneinrichtung, welche eine vorgegebene geometrische Form und/oder Oberflächengestaltung aufweist, dergestalt, dass unterschiedliche Tropfen eine unterschiedliche Wechselwirkung mit der geometrischen Form und/oder Oberflächengestaltung der Trenneinrichtung erfahren und dadurch getrennt werden können.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung eine Oberfläche mit einer oder mehreren Öffnung (en) mit vorgegebenem Durchmesser umfasst.
27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche von mindestens einem Teil von mindestens einer Begrenzungsfläche, insbesondere Decke oder Boden, des Inkubationsraums gebildet wird.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsraum und/oder die Trenn- einrichtung Bestandteil eines mikrofluidischen Systems ist bzw. sind.
29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung von mindestens einer inneren Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals gebildet wird, welche mindestens eine Öffnung mit vorgegebenem Durchmesser aufweist .
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsraum mindestens eine Oberfläche umfasst, die das gleiche Reaktionsmedium wie das der Tropfenphase daran adsorbiert und/oder darin absorbiert aufweist .
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108152232A (zh) * 2017-12-28 2018-06-12 西北工业大学 基于微液滴增强吸光度效应的六价铬检测装置及方法
US10357771B2 (en) 2017-08-22 2019-07-23 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
CN111437897A (zh) * 2020-05-21 2020-07-24 浙江大学 一种双流式单分散液滴流发生方法与装置
CN113490548A (zh) * 2019-02-08 2021-10-08 光投发现有限公司 微滴操作方法
US11660601B2 (en) 2017-05-18 2023-05-30 10X Genomics, Inc. Methods for sorting particles
US11833515B2 (en) 2017-10-26 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microfluidic channel networks for partitioning

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10639631B2 (en) * 2015-02-13 2020-05-05 International Business Machines Corporation Microfluidic probe head for processing a sequence of liquid volumes separated by spacers
CN113441099B (zh) * 2021-06-28 2022-05-06 北京理工大学 无损转移液滴表面及制备方法与无损转移液滴方法
TWM669381U (zh) * 2024-06-28 2025-04-21 醫華生技股份有限公司 非接觸式生物微粒處理設備及生物微粒處理裝置

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030040119A1 (en) * 2001-04-11 2003-02-27 The Regents Of The University Of Michigan Separation devices and methods for separating particles
EP1457251A1 (de) * 2001-10-26 2004-09-15 NEC Corporation Trennvorrichtung, analysesystem, trennverfahren und verfahren zur herstellung der trennvorrichtung
FR2901717A1 (fr) * 2006-05-30 2007-12-07 Centre Nat Rech Scient Procede de traitement de gouttes dans un circuit microfluidique.
US20080014589A1 (en) * 2006-05-11 2008-01-17 Link Darren R Microfluidic devices and methods of use thereof
US20080074449A1 (en) * 2006-08-02 2008-03-27 Lee Abraham P Microfluidic production of monodispersed submicron emulsion through filtration and sorting of satellite drops
US20090068170A1 (en) 2007-07-13 2009-03-12 President And Fellows Of Harvard College Droplet-based selection
WO2009134395A2 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic device for storage and well-defined arrangement of droplets
US20100124759A1 (en) * 2008-06-27 2010-05-20 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic droplets for metabolic engineering and other applications

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100744336B1 (ko) * 2004-06-18 2007-07-30 삼성전자주식회사 Ｏｆｄｍ기반의 무선 통신 시스템에서의 핸드오버 방법
US7556776B2 (en) * 2005-09-08 2009-07-07 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic manipulation of fluids and reactions
EP2004328B1 (de) * 2006-03-09 2014-06-04 Agency for Science, Technology and Research Verfahren zur durchführung einer reaktion in einem tröpfchen

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030040119A1 (en) * 2001-04-11 2003-02-27 The Regents Of The University Of Michigan Separation devices and methods for separating particles
EP1457251A1 (de) * 2001-10-26 2004-09-15 NEC Corporation Trennvorrichtung, analysesystem, trennverfahren und verfahren zur herstellung der trennvorrichtung
US20080014589A1 (en) * 2006-05-11 2008-01-17 Link Darren R Microfluidic devices and methods of use thereof
FR2901717A1 (fr) * 2006-05-30 2007-12-07 Centre Nat Rech Scient Procede de traitement de gouttes dans un circuit microfluidique.
US20080074449A1 (en) * 2006-08-02 2008-03-27 Lee Abraham P Microfluidic production of monodispersed submicron emulsion through filtration and sorting of satellite drops
US20090068170A1 (en) 2007-07-13 2009-03-12 President And Fellows Of Harvard College Droplet-based selection
WO2009134395A2 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic device for storage and well-defined arrangement of droplets
US20100124759A1 (en) * 2008-06-27 2010-05-20 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic droplets for metabolic engineering and other applications

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGRESTI ET AL., PNAS, vol. 107, 2010, pages 4004 - 9

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11660601B2 (en) 2017-05-18 2023-05-30 10X Genomics, Inc. Methods for sorting particles
US12325023B2 (en) 2017-05-18 2025-06-10 10X Genomics, Inc. Methods for sorting particles
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
US10821442B2 (en) 2017-08-22 2020-11-03 10X Genomics, Inc. Devices, systems, and kits for forming droplets
US10549279B2 (en) 2017-08-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Devices having a plurality of droplet formation regions
US10610865B2 (en) 2017-08-22 2020-04-07 10X Genomics, Inc. Droplet forming devices and system with differential surface properties
US10357771B2 (en) 2017-08-22 2019-07-23 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
US10766032B2 (en) 2017-08-22 2020-09-08 10X Genomics, Inc. Devices having a plurality of droplet formation regions
US12201983B2 (en) 2017-08-22 2025-01-21 10X Genomics, Inc. Droplet forming devices and system with differential surface properties
US10898900B2 (en) 2017-08-22 2021-01-26 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
US10583440B2 (en) 2017-08-22 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
US11565263B2 (en) 2017-08-22 2023-01-31 10X Genomics, Inc. Droplet forming devices and system with differential surface properties
US11833515B2 (en) 2017-10-26 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microfluidic channel networks for partitioning
CN108152232A (zh) * 2017-12-28 2018-06-12 西北工业大学 基于微液滴增强吸光度效应的六价铬检测装置及方法
CN113490548B (zh) * 2019-02-08 2022-12-23 光投发现有限公司 微滴操作方法
CN113490548A (zh) * 2019-02-08 2021-10-08 光投发现有限公司 微滴操作方法
CN111437897B (zh) * 2020-05-21 2023-10-20 浙江大学 一种双流式单分散液滴流发生方法与装置
CN111437897A (zh) * 2020-05-21 2020-07-24 浙江大学 一种双流式单分散液滴流发生方法与装置

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Publication number Publication date
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