DE3007412A1

DE3007412A1 - Antitumormittel

Info

Publication number: DE3007412A1
Application number: DE19803007412
Authority: DE
Inventors: Tokio Hachioji; Ikuo Kato; Seizaburo Kobayashi; Masahiko Mutai; Teruo Yokokura
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1979-02-27
Filing date: 1980-02-27
Publication date: 1980-11-06
Also published as: JPS6234727B2; FR2450108B1; JPS55113718A; IT1129802B; FR2450108A1; US4347240A; NL189999B; NL8001045A; NL189999C; CA1124176A; IT8067302A0; SG38183G; HK23784A; BR8001129A; MY8500010A; CH653556A5

Description

PAT E N TAN WALTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-! NG. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · Dl PL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MO N CH EN 81 - TELEFO N (089) 911087 · TELEX 05-29019 (PATH E)

33 122 o/fi

KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA Tokyo / Japan

Antitumormittel

Die Erfindung betrifft ein Antitumormittel, enthaltend den Stamm von Lactobacillus easel YIT 9018 (deponiert unter FERM-P 4751) als wirksamen Bestandteil. Der Stamm ist beim Fermentation Research Institute, Government Industrial Research, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt worden.

Die Antitumoraktivität von lebenden Streptokokken-Zubereitungen (Japan Tokkyo Koho, 6690, 1968) oder des Extraktes von Lactobacilli (Japan Tokkyo Koho, 28558, 1970) ist bekannt, jedoch ist nicht bekannt, daß die wärmeabgetötete gesamte Zellzubereitung Antitumoraktivität aufweist.

Die Erfindung betriff die Antitumoraktivität von nicht nur lebenden, sondern auch wärmeabgetöteten Gesamtzellen von Lactobacillus casei YIT 9018. Dadurch werden folgende

3 0045/0599 ~³"

Vorteile erzielt: Das Herstellungsverfahren ist einfacher und die Nebenwirkungen durch Additive zum Überleben der Bakterien können vermieden werden. Besonders betont werden muß auch, daß Lactobacillus casei YIT 9018 nicht toxisch ist und in der Praxis in einem fermentierten Milchprodukt angewendet wird.

Es wurde festgestellt, daß Lactobacillus casei YIT 9018 (deponiert unter FERM-P4751) (nachfolgend als "LC 9018" bezeichnet) eine höhere Antitumoraktivität aufweist im Vergleich zu anderen Lactobacilli. Der Bakterienstamm weist Antitumoraktivität gegenüber festen und Ascites-Tumor von Sarcoma 180 bei intravenöser, subkutaner, oraler oder intraperitonealer Verabreichung an Mäusen auf. Weiterhin zeigt er Antitumoraktivität gegenüber Mäuse-Leukämie L1210 oder P-388 bei denen im Handel übliche Antitumor-Streptokokken-Zubereitungen keine Wirkung aufweisen. Darüber hinaus ist die Toxizität von LC 9018 wesentlich niedriger im Vergleich zu anderen Lactobacilli und Streptokokken-Antitumormitteln.

LC 9018 wurde in einer Brühe, enthaltend pro 3000 ml destilliertem Wasser

Trypticase 10 g

Hefeextrakt 5 g

Tryptose 3 g

K₂HPO₄ 3 g

KH₂PO₄ 3 g

Ammoniumzitrat 2 g

Natriumazetat 1 g

Tween 80 80 g

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Glukose 20 g

'Cystein 0,2 g

MgSO₄-7H₂O 0,5 g

FeSO₄-7H₂O 0,04 g

MnSO₄-2H₂O 0,12 g

bei 37°C während 20 bis 40 Stunden kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen mit destilliertem Wasser gewaschen und lyophilisiert.

VERSUCH 1: Antitumoraktivität von LC9O18

Beispiel (1)

Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde männlichen ICR-Mäusen subkutan am Tage 0 implantiert. Eine Suspension von Lactobacilli in Kochsalz CO,25 mg/Maus) wurde täglich intravenös an Tagen +1 bis +5 injiziert. Die Mäuse wurden 3 Wochen nach der Tumorimplantation seziert und das Gewicht des Tumors wurde gemessen. Der Inhibierungsgrad wurde nach folgender Formel berechnet:

Durchschnittliches Tumorgewicht . der untersuchten Mäuse

Inhibierungsgrad = ( 1 χ

Durchschnittliches Tumorgewicht der Kontrollmäuse

Aus Tabelle 1 geht hervor, daß Lactobaciili einen xnhibierungsgrad von 40 bis 70 % aufwies, während LC 9018 einen Inhibierungsgrad von über 80 % zeigte.

004 5/0599

Beispiel (2)

Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde männlichen ICR-Mäusen nach Abmischen mit 1 mg LC 9018 subkutan implantiert. Der Inhibierungsgrad bei LC 9018 betrug 97,3 % und wurde wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt.

Beispiel (3)

Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde subkutan inokuliert und anschließend erfolgte 24 Stunden nach der Tumorimplantation eine subkutane Injektion von LC 9018. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, inhibiert LC 9018 das Wachstum von Sarkom 180 bei einer Dosis von 40 mg/kg.

Beispiel (4)

Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde männlichen ICR-Mäusen am Tage 0 subkutan inokuliert. LC 9018 wurde an den Tagen -10, +1 und +10 täglich oral verabreicht. Es wurde festgestellt, daß LC 9018 eine Antitumoraktivität auch bei oraler Verabreichung aufweist (Tabelle 3)

Beispiel (5)

Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde am Tage 0 intraperitoneal inokuliert. LC 9018, suspendiert in Kochsalzlösung wurde täglich an den Tagen -5 bis -1 intraperitoneal injiziert. Der relative Überlebensgrad (T/C %) wurde wie folgt berechnet:

Durchschnittliche Überlebensdauer

a - der geprüften Mäuse _1m_

* Durchschnittliche Überlebensdauer ^{x JUU}

der Kontrollmäuse

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"" D —

Aus Tabelle 4 wird ersichtlich, daß LC 9018 die Überlebenszeit von mit Tumorzellen implantierten Mäusen erhöhte.

Beispiel (6)

Mäuseleukämie L121O oder P-388 (1 χ ΙΟ⁵ Zellen/Maus) wurde intraperitoneal männlichen BDF.-Mäusen am Tage O inokuliert. LC 9018, suspendiert in Kochsalzlösung, wurde tägljch an den Tagen +1 bis +5 intraperitoneal verabreicht. Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, inhibiert LC 9018 auch das Wachstum von Leukämiezellen. Dies ist besonders bemerkenswert, weil bekannte Streptokokken-Zubereitungen keine Antitumoraktivität gegen Leukämie haben.

VERSUCH 2: Toxizität von LC9O18 (D LD₅₀

Die LD₁. von Lactobacilli, die einen Inhibierungsgrad (Tabelle 1) von mehr als 40 % zeigte, wurde unter Verwendung von ICR-Mäusen nach der Methode von Lithfield-Wilcoxon bestimmt. LC 9018 war im Vergleich zu Streptokokken-Zubereitungen und auch gegenüber anderen Lactobacilli weniger toxisch.

(2) Antigenität

LC 9018 wurde einem weißen Meerschv/einchen subkutan dreimal jeden dritten Tag in einer Gesamtmenge von 50 mg/kg injiziert. Der anaphylaktische Reaktionstest und der Agglutinationstest wurde 10 Tage, bzw. 12 Tage nach der letzten Injektion von LC 9018 durchgeführt. Alle Meerschweinchen, die LC 9018 erhalten hatten, zeigten bei beiden Tests negative Reaktionen.

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VERSUCH 3: Antitumoraktivitat und Toxizität von wärmeabgetöteten LD 9018

Die Antitumoraktivitat und Toxizität von wärmeabgetöteten LC 9018 war die gleiche wie bei lebenden Zellen.

LC 9018 hat folgende Eigenschaften:

Zellform
Gram-Färbung

Optimaler pH für
das Wachstum

Temperaturbereich
für das Wachstum

Methylrottest

Voges-Proskauer-Reaktion

Bildung von Indol
Bildung von H₂S

Ammoniak oder
Arginin

Reduktion von
Nitrat

Produktion von
Katalase

Verflüssigung von
Gelatine u. Kasein

Zitratverwendung

Koagulation von
Milch

Reduktion von
Lakmusmilch

Verwendung von
Ammonium und
Harnstoff

Gas aus Glukose

Fermentation
Arabinose
Xylose
Rhamnose

kurze Stäbchen positiv

6,6 bis 7,0 (bei 35 bis 39°C)

15 bis 42°C negativ

negativ negativ negativ

negativ negativ

positiv positiv

negativ negativ

negativ negativ negativ

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Glukose positiv

Mannose positiv Galactose · positiv

Sucrose positiv

Maltose positiv

Lactose positiv

Cellobiose positiv

Trehalose positiv

Melibiose negativ

Raffinose negativ

Melezitose positiv

Mannit positiv

Sorbit positiv

Salicin positiv

• Amygdalin positiv

LC 9018 kann nach üblichen Methoden kultiviert werden. Zum Beispiel kann man es auf einer halbsynthetischen Brühe, enthaltend Lactose, Glukose, Pepton, Hefeextrakt, KH₃PO₄, K_?HP0₄, MgSO₄ und dergleichen kultivieren. Die Kultivierung wird während 18 bis 24 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach der Kultivierung werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gesammelt und mit destilliertem Wasser gewaschen und dann lyophilisiert. Obwohl die Bakterienzellen keine Additive benötigen, um sie lebendig zu halten, kann man gewisse Mittel oder Substanzen zusetzen, um gegebenenfalls die Qualität beizubehalten.

LC 9018 wurde für Injektionszwecke in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Die tägliche wirksame Dosis betrug 30 bis 100 mg/kg (vorzugsweise 50 mg/kg) bei intravenöser Injektion, 5 bis 20 mg/kg (vorzugsweise JO mg/kg)

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bei intraperitonealer Injektion und 1000 bis 2000 mg/kg bei oraler Verabreichung. Die Häufigkeit und die Dauer der Verabreichung hängt von dem Zustand des Patienten ab.

Wie schon erwähnt, hat nicht nur lebendes sondern auch wärmeabgetötetes LC 9018 eine merkliche Antitumoraktivität und ist nicht pathogen. Die Herstellung erfolgt sehr einfach und auch die klinische Anwendung von LC 9018 ist vereinfacht und insgesamt ist eine wirtschaftliche Herstellungsweise möglich.

HERSTELLUNGSBEISPIEL

(1) LC 9018 ( 1 χ 1O⁷ Zellen) wurden zu 1000 ml einer Brühe der oben angegebenen Zusammensetzung gegeben und die Kultivierung erfolgte 20 Stunden bei 37^OC. Die Anzahl der lebenden Zellen erreichte schließlich ein Maximum

von 2,5 χ 10 /ml. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Suspension von LC 9018 in destilliertem Wasser wurde in Ampullen aufgeteilt und lyophyilisiert. Nach 30-tägigem Stehen bei 5°C wurde das in Ampullen abgefüllte LC 9018 für einen Antitumorversuch verwendet. Der Inhibierungsgrad betrug 83,2 %.

(2) LC 9018 wurde,wie in (1) beschrieben, erhalten. Es wurde 20 Minuten bei 121°C autoklavisiert und dann bei 80°C getrocknet. Das Pulver wurde in Ampullen aufgeteilt und 2 Monate bei 5°C gelagert. Der Inhibierungsgrad gegen Sarkom 180 betrug bei dieser Zubereitung 78,5 und die LD₅ betrug bei männlichen ICR-Mäusen 620 mg/kg und bei weiblichen ICR-Mäusen 720 mg/kg.

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- 1ü -

(3) 300 ml einer KuItürbrühe mit einem Gehalt von 2,5 χ 1O⁹ Zellen/ml an LC 9018 wurden in 10 1 Rogosa-Medium inokuliert. Nach 20-stündiger Kultivierung bei 37°C betrug die Anzahl der Zellen 2,3 χ iO⁹/ml. Die feuchten Zellen (165 g) wurden 3 Stunden bei 80 C getrocknet, wobei man 40 g eines Pulvers erhielt. Das Pulver wurde zu 40 ml Hydroxypropylzelluloselösung (10 %-ig) in Äthanol gegeben, granuliert und dann getrocknet. Das Granulat wurde in einer Dosis von 0,3 g/ kg/Tag während 10 Tagen ICR-Mäusen oral verabreicht. 10 Tage vor der oralen Verabreichung des Granulats waren ICR-Mäuse subkutan mit Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) implantiert worden. Der Inhibxerungsgrad betrug 3 Wochen nach der Tumorimplantation 68,2 %.

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TABELLE 1
Antitumoraktivität von Lactobacilli

Stamm oder Zubereitung	casei YIT 9018 (LC9018)	Inhibierungsgrad
L.	¹¹ N VIII - 1	82,7
	¹¹ TK IV - Z	65,5
	acidophilus B-3208	66,6
L.	" YIT 0163	23,0
	salivarius YIT 0089	43,5
L.	" YIT 0104 *	21,5
	fermentum YIT 0082	40,9
L.	¹¹ YIT 0159	14,9
	plantarum YIT 0102	10,2
L.	¹¹ YIT 0158	17,2
	bulgaricus YIT 0046	40,4
L.	jugurti YIT 0085	64,7
L.	helveticus YIT 0083	17,7
L.	lactis YIT 0086	29,0
L.	leichmannii YIT 0087	12,8
L.	delbrueckii YIT 0080	28,4
L.	brevis YIT 0076	47,9
L.	jensenü YIT 0084	5,3
L.	Streptococcal preparation	38,4
. 50,8

Sarkom 180 (1-2 χ IO Zellen/Maus) wurde ICR- Mäusen am Tage O implantiert. Die Suspension von Lactobacilli oder Streptokokken-Zubereitungen in Kochsalzlösung (0,25 mg/Maus) wurden intravenös täglich an den Tagen +1 bis +5 injiziert.

Durchschnittstumorgewicht

^Inhibierungsgrad = (1-

^ ^ Durchschnxttstumorgewxcht

der Kontrollmäuse

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TABELLE

Antitumoraktivität bei subkutaner Verabreichung von LC 9018

Dosis (mg/kg)	Inhibierungsgrad
O (Kontrolle) 4 40	O 39,3 84,4

Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde subkutan ICR-Mäusen inokuliert. LC 9018, suspendiert in Kochsalzlösung, wurde 24 Stunden nach der Tumorinokulation subkutan injiziert. Die Tiere wurden 3 Wochen nach der Inokulation seziert und das Gewicht des Tumors gemessen.

Der Inhibierungsgrad wurde wie bei Tabelle 1 berechnet.

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ταβκγ.τ.κ 3

Antitumoraktivität bei oraler Verabreichung • von LC 9018

Gesamtdosis (mg/kg)	Inhibierungsgrad
O (Kontrolle) 1200 2000	0 70,5 64,2

Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde am Tage 0 subkutan ICR-Mäusen inokuliert. LC 9Ο18 wurde an den Tagen -10, +1 und +10 oral verabreicht. Die Tiere wurden 3 Wochen nach der Inokulation mit den Tumorzellen seziert und das Tumorgewicht wurde gemessen.

%
Der Inhierungsgrad wurde wie in Tabelle 1 berechnet.

TABELLE

Antitumoraktivität von intraperitoneal verabreichtem LC 9018 bei intraperitoneal inokuliertem Sarkom 180

Gesamtdosis (mg/kg)	T/C % *
0 (Kontrolle) 1 1O 4O	100 104 367 243

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Sarkom 180 (1-2 χ 10 Zellen/Maus) wurde am Tage 0
intraperitoneal inokuliert. In Kochsalzlösung suspendiertes LC 9018 wurde'an den Tagen -5 bis -1 täglich intraperitoneal injiziert.

T/C % =

DurchschnittsüberleLenszeit _ der geprüften Mäuse

Durchschnittsüberlebenszeit der Köntrollinäuse

χ 100.

TABELLE

Antitumoraktivitat von LC 9018
gegen Mäuseleukämie

Leukämiezellen	Gesamtdosis (mg/kg	T/C %*
L1210	0 (.Kon trol le)	100
	6	119
	12	128 **
	60	138 ***
	120	127
P-388	0 (Kontrolle)	100
	5 50	120 118
	250	108

Mäuseleukämie L1210 oder P-388 (1 χ 10 Zellen/Maus) wurde intraperitoneal BDF₁-Mäusen am Tage 0 inokuliert.

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LC 9018, suspendiert in Kochsalzlösung, wurde täglich an den Tagen +1 bis +5 intraperitoneal verabreicht.

* T/C % wurde wie in Tabelle 4 berechtnet. ** P 0,005, *** 0,0001.

TABELLE

Akute Toxizität von Lactobacilli und Streptokokken-Zubereitungen

Route	Stamm oder Zubereitung	^LD5o	(mg/kg)
i.p.	L. casei YIT 9018 (LC 9018)	männlich	weiblich
	¹¹ N VIII - 1	650	730
	TK IV - 2	515	581
	L. acidophilus YIT 0163	350	466
	L. salivarius YIT 0153	550	612
	L. plantarum YIT 0158	504	566
	L. bulgaricus YIT 0046	340	361
	L. delbrueckii YIT 0080	310	358
	Streptococcal preparation	256	283
i.V.	L. casei YIT 9018 (LC 9018)	125	140
	Streptococcal preparation	156	240
S . C.	L. casei YIT 9018 (LC 9018)	24,5	25,5
	Streptococcal preparation	2500	2500
p.o.	L. casei YIT 9018 (LC 9018)	238	197
	Streptococcal preparation	5000	5000
500	500

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Lactobacilli- oder Streptokokken-Zubereitungen wurden ICR-Mäusen (Körpergewicht etwa 25 g) intraperitoneal (i.p.), intravenös (i.V.), subkutan (s.c.) oder oral (ρ.ο.) verabreicht.

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Claims

HOFFMANN · EITLE Ä-. PARTNER 3007412

PAT Ii N TAN WÄLT JS

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-19/6) · DI PL.-I N G. W. E ITLE · D R. k E R. N AT. K. H O FFMAN N · Dl PL. -I NG. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) . D-8000 MO N C H EN 81 · TE LE FO N (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E)

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KABÜSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA Tokyo / Japan

Antitumorraittel

Patentanspruch :

Antitumormittel, enthaltend den Stamm Lactobacillus casei YIT 9018^aIs wirksamen Bestandteil.

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