NL8001045A

NL8001045A - Antitumormiddel.

Info

Publication number: NL8001045A
Application number: NL8001045A
Authority: NL
Original assignee: Yakult Honsha Kk
Priority date: 1979-02-27
Filing date: 1980-02-20
Publication date: 1980-08-29
Also published as: CA1124176A; BR8001129A; IT8067302A0; FR2450108B1; CH653556A5; SG38183G; MY8500010A; NL189999B; IT1129802B; DE3007412A1; HK23784A; JPS6234727B2; NL189999C; US4347240A; JPS55113718A; FR2450108A1

Description

* * * * % VO 168

Titel: antitumonaiddel.

De uitvinding "betreft een antitumormi ddel met daarin een stam van Lactobacillus casei YIT 9018 (depost FEEM-P ^751) als effectief "bestanddeel. Deze stam is gedeponeerd "bij het Fermentation Research Institute, Government Industrial Research, Ministry of International Trade and 5 Industry.

Terwijl de antitumoractiviteit van levende streptococcenprepa-raten (Japan Tokkyo Koho, 6690, 1968) of een extract van lactobacillus-organismen (Japan Tokkyo Koho, 28558, 1970) reeds is vermeld, was het nog niet bekend, dat een door hitte gedood geheel celpreparaat een anti-10 tumoractiviteit kon hebben.

De uitvinding betreft nu de antitumoractiviteit van niet slechts levende maar ook door hitte gedode gehele cellen van Lactobacillus casei YIT 9018, Dit preparaat heeft de volgende voordelen: De bereidingsmethode is eenvoudiger, de neveneffecten door toeslagstoffen cm de 15 bacteriën levend te houden kunnen vervallen. Het is tevens van belang, dat Lactobacillus casei YIT 9018 niet giftig is, en in de practijk wordt gebruikt in gefermenteerde melkprodukten.

Gebleken is, dat Lactobacillus casei YIT 9018 (hieronder aangeduid als LC 9OI8) een hogere antitumoractiviteit heeft vergeleken met 20 andere melkzuurbacteriën. De bacteriestam vertoont deze antitumoractiviteit tegen vaste en ascites-tumoren van Sarccma l80 bij intraveneuze, subcutane, orale of interperitoneale toediening bij muizen. Voorts is gebleken, dat het een antitumoractiviteit heeft tegen muizeleukemie L1210 of P-388, waarop handelsantitumorpreparaten van streptococcen-25 herkanst geen effect hebben. Bovendien is de giftigheid van LC 9018 duidelijk lager dan die van andere melkzuurbacterie- en streptococcen-antitumormiddelen.

LC 9OI8 kan worden gekweekt op een medium met daarin per 1000 3 cm gedestilleerd water: 30 trypticase 10 g gistextract 5 g tryptose 3 g K2HP03 3 g KH2P0^ 3 g 35 ammoniumcitraat 2 g n 1 fw k -— ' -2- natriumacetaat 1 g

Tween 80 80 g glucose 20 g cysteine 0,2 g 5 MgS0u-7H20 0,5 g

PeSO^-TïïgO 0,0U g

MnS 0^-25^0 0,12 g en wel tij 3T°C gedurende 20-U0 uren. ïïa kweken worden de cellen opwassen met gedestilleerd water en gelyofiliseerd.

10 Experiment 1: Antitumoractiviteit van LC 9018.

Voorbeeld I: 6

Sarcoma 180 (l-2 x 10° cellen/muis) werd in ICR mannelijke muizen subcutaan op dag 0 geïmplanteerd. De suspensie van lactobacillen in een fysiologische zoutoplossing (0,25 mg/muis) werd dagelijks op de dagen 15 1 tot 5 intraveneus geïnjecteerd. Drie weken na de tumorimplantatie werden de muizen opengesneden en het gewicht van de tumor gemeten.

De mate van remming werd berekend uit de formule: gem.tumor- gewicht van de onderzochte muizen mate van remming =(l- .,, , , ... , ^ gemiddeld tumorgewicht van de con- 2Q trolemuizen)

Als weergegeven in tabel A vertoonden de lactobacillen een mate van remming van UO-70% evenals de streptococcocuspreparaten. LC 9018 'daarentegen vertoonde een mate van remming van meer dan 80$.

Voorbeeld II: 6 25 Sarcoma l80 (l-2 x 10 cellen per muis) werd subcutaan geïmplan teerd in mannelijke ICR-muizen na mengen met 1 mg LC 9018. De mate van remming met LC 9018 bedroeg 97,3$, welk cijfer werd bepaald als beschreven in voorbeeld I.

Voorbeeld III: 30 Sarcoma 180 (l-x x 10^ cellen/muis) werd subcutaan geoculeerd gevolgd door een subcutane injectie van LC 9018 2b uren na de tumor- implantatie. Als weergegeven in tabel B remde LC 9018 significant de groei van Sarcoma l80 en wel reeds bij een dosis van ^0 mg/kg.

Voorbeeld IV: g 35 Sarcoma 180 (l-2 x 10 cellen/muis) werd subcutaan geïnoculeerd 800 1 0 45 ·' * -3- in mannelijke IGE-mui zen en vel op dag 0. LC 9018 verd dagelijks oraal toegediend op de dagen -10, +1 en +10. Gevonden verd, dat LC 9018 zelfs bij orale toediening een duidelijke tumoractiviteit vertoonde.

(tabel C).

5 Voorbeeld V:

Sarcana 180 (1-2 x 10^ cellen/muis) verd intraperitoneaal op dag 0 geïnoculeerd. LC 9018, gesuspendeerd in een fysiologische zoutoplossing, verd dagelijks intraperitoneaal geïnjecteerd op de dagen -5 tot -1. De mate van overleving (T/C %) verd als volgt berekend: 10 gemiddelde overlevingstijd van de behandelde muizen T/C % s — » — 2c 100 de gemiddelde overlevingstijd van de controlemuizen

Als veergegeven in tabel D verhoogde LC 9018 de overlevingstijd van de met tumorcellen geïmplanteerde muizen.

15 Voorbeeld VI:

Muizeleukemie L1210 of P-388 (l x 10^ cellen/muis) verd intraperitoneaal geïnoculeerd in mannelijke BDF^ muizen en vel op dag 0. LC 9018, gesuspendeerd in een fysiologische zoutoplossing verd intraperitoneaal dagelijks toegediend op de dagen +1 tot +5. Als veergegeven 20 in tabel E remde LC 9018 de groei van deze leukemiecellen. Dit is van speciaal belang omdat een commercieel streptococcenpreparaat geen antitumoractiviteit tegen leukemie bezit.

Experiment 2: Giftigheid van LC9018.

(ï) ld5Q.

25 De LD50 van lactobacillen met een mate van remming (tabel A) van meer dan k0% verd bepaald onder toepassing ι/an ICR-muizen volgens de methode van Lithfield-Wilcoxon. LC 9018 vas het minst giftig vergeleken met streptococcen en andere lactobacilluspreparaten.

(2) Antigene activiteit.

30 LC 9018 verd subcutaan geïnjecteerd bij vitte caviö' s en vel driemaal elke 3 dagen tot een totale dosis van 50 mg/kg. De anafylac-tische reactieproef en een agglutinatieproef verden uitgevoerd 10 dagen en 12 dagen na de laatste injectie van LC 9018. Alle cavia's die LC 9018 hadden toegediend gekregen^vertoonden bij beide proeven ne-35 gatieve reacties.

800 1 0 45

Experiment 3: Antitumoractiviteit en giftigheid van door hitte gedode LC 9018.

De antitumoractiviteit en de giftigheid van door verhitting gedode LC 9018 varen gelijk: aan die van de levende cellen.

5 LC 9018 heeft de volgende kenmerken: celvoim kort staafje, gramkleuring positief optimale pH voor de groei 6,6-7,0 (hij 35-39°C)

temperatuurstraject voor de 10 groet » 15-^2°C

methylroodproef negatief

Voges-Proskauerreactie negatief produktie van indaol negatief produktie van H^S negatief 15 ammonia uit arginine negatief reductie van nitraat. negatief productie van catalase negatief vervloeiing van gelatine en caseïne negatief 20 citraatverhruik negatief coagulatie van melk positief reductie van lakmoesmeIk positief gebruik van ammonia en ureum negatief 25 gasontvikkeling uit glucose negatief fermentatie: arabinose negatief xylose negatief rhamnose negatie 30 glucose positief mannose positief galactose positief sucrose positief maltose positief 35 lactose positief 80 0 1 0 45 -5- cellobiose positief trahalose positief melibiose negatief raffinose negatief 5 melezitose positief mannitol positief sorbitol positief salicine positief amygdalinA positief 10 ' LC 9018 kan volgens gebruikelijke methoderiworden gekweekt. B.v.

kan dit organisme worden gekweekt in een semisynthetische voedingsbodan. met daarin lactose, glucosepepton, gistextract, KHgPO^, K^HPO^, MgSO^ enz. Gekweekt wordt liefst 18-2 k uren bij 3T°C. Ha dit kweken worden de bacteriecellen afgecentrifugeerd en gewassen met gedestilleerd water, 15 waarna wordt gelyofiliseerd. Hoewel de bacteriecellen geen toeslagstoffen nodig hebben cm ze in leven te houden, kunnen desgewenst bepaalde middelen of stoffen worden toegevoegd, cm de kwaliteit op \ 7 peil te houden.

LC 9018 wordt in een fysiologische zoutoplossing gesuspendeerd 20 indien het preparaat voor injectiedoeleinden is bestemd. De dagelijkse effectieve dosis bedraagt 30-100 mg/kg (liefst 50 mg/kg) voor intraveneuze injecties, 5-20 mg/kg (liefst 10 mg/kg) voor intraperitoneale injecties en 1000-2000 mg/kg voor orale toediening.

De frequentie en duur van de toediening varieert overeenkcmstig 25 de toestand van de patiënt►

Als gezegd hebben niet alleen levende maar ook door hitte gedode LC 9018 organismen een significante antitumoractiviteit terwijl ook dit preparaat niet pathogeen is. Dit brengt minder beperkingen in de bereidingsprocedure met zich mee evenals wat betreft de clinische 30 toepassing, terwijl de bereiding economisch kan plaatsvinden.

Bereidingsvoorbeeld: T ·?

(a) LC 9018 (l x 10 cellen) werd geënt in 1000 cnr van een voedingsbodem waarvan de samenstelling bovenvermeld is en 20 uren bij 37°C

gekweekt. Het uiteindelijk aantal levende cellen had toen een maximum 9/3 35 Tan 2,5 x 10 /cm bereikt· Deze cellen werden af gecentrifugeerd en 800 1 0 45 _ ' -6- gewassen met gedestilleerd water. De suspensie van LC 9018 in gedestilleerd water werd in ampullen verdeeld en gelyofiliseerd. ITa 30 dagen "bij 5°C werd dit LC 9018 in de ampullen gebruikt voor de antitumor-experiment en. De mate van remming bedroeg 83,2$.

5 (b) LC 9018 verkregen volgens a) werd 20 min bij 121°C geautoclaveerd en bij 80°C gedroogd. Eet poeder werd in ampullen verdeeld en 2 maanden bij 5°C opgeslagen. De mate van remming tegen Sarcoma l80 van dit preparaat bedroeg 78,5$ en de LD^ 620 mg Ag of 720 mg/kg resp. bij mannelijke en vrouwelijke ICR-muizen.

10 (c) Een voedingsbodem van 300 cnr met daarin 2,5 x 10* cellen/cnr LC 9018 werd geïnoculeerd in 10 1 Rogosa’s medium. Het aantal cellen bedroeg 2,3 x 10^/cm^ na 20 uren kweken bij 37°C. Deze natte cellen (165 g) werden 3 uren bij 80°C gedroogd en aldus kO g poeder verkregen.

0

Dit poeder werd toegevoegd aan 1*0 cm hydroxypropylcelluloseaplossing 15 (10$) in ethanol en gegranuleerd en gedroogd. Deze granules werden oraal toegediend in een dosis van 0,3 g/kg/dag gedurende 10 dagen aan ICR-muizen, die subcutaan waren geïmplanteerd met Sarcoma l80 (1-2 x'10° cellen/muis), 10 dagen voor orale toediening van de granules De mate van reuming 3 weken na de tumor implantatie bedroeg 68,2$.

20 Tabel Ά. Antitumoractiviteit van lactobacillen -----1

Stam of preparaat j remming j L. casei YIT 9018 (LC 9018) 82,7 25 " HVIII-1 65,5 " TK IV - 2 66,6 L.acidophilus B-3208 23,0 " YIT 0163 U3,5 L. salivarius YIT 0089 21,5 30 " YIT 010b 1*0,9 j L. fermentum YIT 0082 lh- ,9 ' " YIT 0159 ! 10,2 L. nlantarum YIT 0102 17,2 " YIT 0158 1*0,1* L.biiLgaricus YIT 00l+6 6U,7 800 1 0 45 -Τι,. jugurti YIT 0085 17 ,Τ L. helveticus YIT 0083 29,0 L·. lactis YIT 0086 12,8 L_. leichmannii YIT 008? | 28,^ 5 L. delbrueckii YIT 0080· j ^7,9 L. brevis YIT 0076 I 5,3 L. jensenii YIT 008U ! 38,

Streptococcenpreparaat 50,8 ---- 10 Sarcoma 180 (1-2 x 10 cellen/muis) werd geïmplanteerd in ICR muizen en wel sub cutaan op dag 0. De suspensie van de lactobacillen of streptococcenpreparaat in zoutoplossing (0,25 mg/muis) werd intraveneus geïnjecteerd en wel dagelijks op de dagen +1 tot +5· gem. tumorgewicht proefimuizen 15 x) remming = (l - gem. tumorgewicht blanco muizen

Tabel B Antitumoractiviteit van subcutaan toegediende LC 9018

Dosis (mg/kg) remming (x) 2q 0 (controle 0 b 39,3 bo 81+

Sarcoma 180 (1-2 x 10 cellen/muis) werd gelnoculeerd in ÏCR muizen.

LC 9018, gesuspendeerd in zoutoplossing werd subcutaan geïnjecteerd 2b uren na de tumorinoculatie. De dieren werden later opengesneden en het gewicht van de tumor gemeten.

(x) De remming werd berekend als bij tabel A.

Tabel C. Antitumoraetiviteit van oraal toegediende LC 9018 2Q Totale dosis (mg/kg) remming (x) 0 (controle) 0 1200 70,5 2000 6b,2 35 Sarcoma l80 (1-2 x 10° cellen:muis werd subcutaan gelnoculeerd in 80 0 1 0 45 -8- ICR muizen op dag 0» LC 9018 werd oraal dagelijks op dagen -10, +1 en +10 gegeven. De dieren werden 3 weken later opengesneden en het gewicht van de tumor gemeten.

(x) berekening als. hij tabel A.

5 Tabel D. Antitumoractiviieit van intrapedtoneaal toegediende LC 9018 tegen intraperitoneaal geënte Sarcaaa l8o.

totale dosis (mg/kg) T/C % (x) 0 (controle 100

10 1 10U

10 367 ko 2b3 £ 15 S arc cm a ISO (1-2 x 10 cellen/muis) werd intraperitoneaal geïn- oculeerd op dag 0. LC 9018, gesuspendeerd in zoutoplossing, werd intraperitoneaal dagelijks op de dagen -5 tot -1 geïnjecteerd.

gem. overlevingstijd v.d. proeflnuizen χ) T/C % * -:-:---:- X 100 gem. overlevingstijd blanco muizen 20

Tabel E. Antitumoractiviteit van LC 9018 tegen muizeléukemie leukemiecellen totale dosis (mg/kg) T/C (x) 25 L1210 0 (controle) 100 6 119 12 128 xx 60 138 xxx 120 127 xx 30____ P-388 0 (controle) 100 5 120 xx 50 II8 xx j 250 108 35 _I__ 800 1 0 45 -9-

Muizeleukemie L1210 of P-388 (l x lO'’ cellen/muis) -werd intraperitcneaal in BDF^ muizen op dag 0 geënt. LC 9018, gesuspendeerd in zoutoplossing, werd intrapeciboneaal op de dagen +1 tot +5 gegeven, x T/C % berekend als bij tabel D.

5 xx P^O,05» xxx p <*0,00011

Tabel F. Acute toxiciteit van lactobacillen en strept ococcoo=preparatie. Route Stam of preparatie LD,— (mg/kg)_ TV ¢7 __^ ΊΓ_

10 i.p. L. casei ÏIT 9018 (LC 9018) 650 T3Q

j " u vin -1 515 581 j " ΤΚ IV - 2 350 k66 L.acidophilus YIT 0163 550 612 L.salivarius YIT 0153 50b 566 15 L. plant arum YIT 0158 3^0 361 L. bulgaricus YIT 00b6 310 358 L. delbruecklii YIT 0080 256 283

Streptococcenpreparaat 125 ltó i.v. L. casei YIT 9018 (LC 9018) 156 2^0 20 Streptococcenpreparaat 2^,5 25»5 s.c. L. casei YIT 9018 (LC 9018) j 2500 2500

Streptococcenpreparaat 238 19T

p.o. L. casei YIT 9018 (LC 9018) 5000 5000

Streptococcenpreparaat 500 500 25__I_j_

De lactobacillen cfstreptococcenpreparaten werden gegeven aan muizen van ca. 25 g en wel intraperitoneaal, (i.p.), intraveneus (i.v.), sub-cutaan (s.c.) of oraal (p.o.).

30 35 800 1 0 45

Claims

-10- totitumormiddel met als actieve stof een stam van Lactobacillus casei YIT 9018· 800 1 0 45