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DE2939443A1 - Membranen mit immobilisierten enzymen, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Membranen mit immobilisierten enzymen, ihre herstellung und verwendung

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Publication number
DE2939443A1
DE2939443A1 DE19792939443 DE2939443A DE2939443A1 DE 2939443 A1 DE2939443 A1 DE 2939443A1 DE 19792939443 DE19792939443 DE 19792939443 DE 2939443 A DE2939443 A DE 2939443A DE 2939443 A1 DE2939443 A1 DE 2939443A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
membrane
solution
sponge layer
asymmetrical
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19792939443
Other languages
English (en)
Inventor
Yoshiharu Karasawa
Hisashi Kohkame
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Ltd filed Critical Hitachi Ltd
Publication of DE2939443A1 publication Critical patent/DE2939443A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/14—Dynamic membranes
    • B01D69/141—Heterogeneous membranes, e.g. containing dispersed material; Mixed matrix membranes
    • B01D69/142—Heterogeneous membranes, e.g. containing dispersed material; Mixed matrix membranes with "carriers"
    • B01D69/144—Heterogeneous membranes, e.g. containing dispersed material; Mixed matrix membranes with "carriers" containing embedded or bound biomolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood

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Description

Membranen mit immobilisierten Enzymen, ihre Herstellung und Verwendung
Die Erfindung betrifft Membranen mit immobilisierten Enzymen, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Membranen sowie ihre Verwendung, insbesondere in Enzymelektrodenvorrichtungen für elektrochemische Meßgeräte.
Es wurden bereits zahlreiche analytische Verfahren angegeben, bei denen Membranen mit immobilisierten Enzymen zur quantitativen Analyse medizinisch, biochemisch oder pharmakologisch wichtiger Substanzen in lebenden Organismen, beispielsweise von Sacchariden, Harnstoff, Cholesterin und anderen in Körperflüssigkeiten in nur sehr kleinen Mengen enthaltenen Substanzen mit guter Selektivität eingesetzt werden. Derartige Verfahren lassen sich zwar in wirksamer Weise zum Nachweis und zur Bestimmung von
81-(A 4178-O2)-SP/Nu
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Komponenten heranziehen, die in einem flüssigen Mehrkompo· nentensystem in sehr kleinen Mengen enthalten sind, wobei die Substratspezifität sowie die hohe katalytische Aktivität von Enzymen ausgenutzt werden. Derartige Verfahren werfen jedoch hinsichtlich der Immobilisierung des Enzyms Probleme auf und wurden bisher noch nicht in breitem Umfang in der Praxis angewandt.
Das Enzym wurde bisher nach einer der folgenden Verfahrensweisen in einem membranartigen Zustand bzw in einer Membran immobilisiert:
(1) durch Einschließen des Enzyms in einem Polyacrylamidgel (Nature 214; (196?) 986);
(2) durch Vermischen des Enzyms mit einem inerten Protein wie etwa Albumin udgl als Verstärkungsmittel und Vernetzung des inerten Proteins mit einem Vernetzungsmittel (Biotechnology and Bioengineering Λ%. (1973) 359);
(3) durch Absorbieren des Enzyms In einem Filterpapier oder in Cellophan und Vernetzen mit Glutaraldehyd (Biotechnology and Bioengineering 1£ (1973) 359);
(4) durch ionische Bindung des Enzyms an lonenaustauechercellulose (Biotechnology and Bioengineering (1971) )i
(5) durch Zugabe des Enzyms zu einer Zollagenfaeerlosung, Einbringen der Lösung in eine Elektrolysezelle, Durchleiten eines elektrischen Stroms durch die Zelle und elektrische Abscheidung eines
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. 7 _ 2939U3
Kollagenfilms, der das Enzym auf einer Elektrode einschließt (Biochemistry, Biophysics Research Communication 4£ (1972) 51);
(6) durch physikochemische Immobilisierung des Enzyme auf einem porösen Film aus einem organischen Polymer (JA-OS 17 889/77);
(7) durch Sandwichen eines Enzymgels zwischen zwei Filmen (JA-OS 55 691/77) etc.
Nach der Verfahrensweise (1) kann zwar eine große Enzymmenge immobilisiert werden, jedoch ist die Membranfestigkeit nicht hoch genug und die Diffusion von Substraten und Reaktionsprodukten nur gering.
Nach der Verfahrensweise (2) kann zwar die Enzymbeladung erhöht werden, jedoch wird keine ausreichende Festigkeit erzielt; da ferner als Verstärkungsmittel ein Protein verwendet wird, liegt keine genügende Beständigkeit gegenüber Mikroorganismen vor.
Das Verfahren (3) kann zwar leicht durchgeführt werden, jedoch ist die erzielbare Enzymbeladung nicht ausreichend; wenn ferner die Filmdicke zur Erhöhung der Festigkeit erhöht wird, wird die Diffusion des Substrats etc. unzureichend; wenn andererseits die Dicke des Films verringert wird, resultiert eine schlechte Festigkeit. Die Verfahren (4-) und (5) können zwar ebenfalls leicht durchgeführt werden, jedoch ist die resultierende Bindung des Enzyms am Träger nur schwach, weshalb das Enzym leicht vom Träger wieder freigesetzt wird. Verfahren (6) dient zur Vermeidung der obengenannten Nachteile, führt jedoch zu Membranen, die von der
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— ο —
Vorderseite zur Rückseite hin perforiert sind, weshalb keine ausreichende Enzymmenge in den Perforationen der porösen Membran zurückgehalten werden kann. Die Membran weist ferner keine genügende Porosität auf, auch ist die Enzymbeladung nicht ausreichend.
Die Verfahrensweise (7) ist schließlich in der Durchführung kompliziert, da das Enzymgel zwischen zwei dünnen Schichten gesandwicht wird, was die Herstellungskosten erhöht, obgleich die Enzymbeladung hierbei hoch ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Membranen mit immobilisierten Enzymen mit hoher Enzymbeladung, guter Diffusionspermeabilität für bestimmte Materialien und stabilisierter Aktivität über längere Zeitdauer sowie eine Enzymelektrodenvorrichtung für elektrochemische Meßgeräte mit den obigen ausgezeichneten Eigenschaften, einem guten Ansprechverhalten und guter analytischer Genauigkeit anzugeben«
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelost.
Die Erfindung gibt Membranen mit einem immobilisierten Enzym an, die gekennzeichnet sind durch eine asymmetrische Membran aus einer dichten, hautartigen, im wesentlichen enzymundurchlässigen, jedoch gas- und flüssigkeitsdurchlässigen Schicht (im folgenden kurz als Filmschicht bezeichnet) und einer damit integrierten schwammartigen Schicht mit einer zur Aufnahme der erforderlichen Enzymmenge ausreichenden Porosität und durch die Schicht hindurch miteinander in Verbindung stehenden Poren, in denen das Enzym durch Vernetzung immobilisiert ist (im folgenden kurz als Schwammschicht bezeichnet).
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Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Zeichnung näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1: eine Querschnittsansicht einer erfindungsgemäßen Membran mit immobilisiertem Enzym;
Fig. 2: einen senkrechten Querschnitt durch eine Enzymelektrodenvorrichtung für elektrochemische Meßgeräte gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
und
Fig. 3'· eine graphische Darstellung zur Beziehung zwischen Sauerstoffverbrauch und Glucosekonzentration bei der Enzymelektrodenvorrichtung von Fig. 2.
In Fig. 1 ist eine erfindungsgemäße Membran mit immobilisiertem Enzym schematisch dargestellt, wobei mit Λ_ die dichte Filmschicht bezeichnet ist, die im wesentlichen enzymundurchlässig, jedoch gas- und flüssigkeitsdurchlässig ist, und 2_ die Schwammschicht bezeichnet, die eine zur Aufnahme der erforderlichen Enzymmenge ausreichende Porosität sowie über die Schwammschicht miteinander in Verbindung stehende Poren aufweist, wobei die Filmschicht 1_ und die Schwammschicht £ miteinander zu einer asymmetrischen Membran J5 mit immobilisiertem Enzym integriert sind und die Filmschicht 1_ und die Schwammschicht 2 vorzugsweise aus dem gleichen Material bestehen.
Die Filmschicht 1_ und die Schwammschicht 2 sind demgemäß nicht durch Verbindung der beiden Schichten miteinander
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erzeugt, obgleich die beiden Schichten aus dem gleichen Material bestehen.
Asymmetrische Membranen sind bereits wohlbekannt, beispielsweise als Membranen zur umgekehrten Osmose; ihre Herstellung und Struktur sind ebenfalls geläufig, beispielsweise aus folgenden Publikationen:
(a) S. Marjikian, S. Loeb und J. W. McCutchan, Proc. 1 Int. Symp. on Water Desalination, Washington, D. C. (1965)
und
(b) G. T. Gittene, F. A. Hitchcock, D. C. Sammon and 6. E. Wakley, Desalination S (1970) 369.
Die Filmschicht der erfindungsgemäßen Membranen besitzt die Eigenschaft, für Substanzen mit niederem Molekulargewicht einschließlich ionischer Substanzen durchlässig zu sein, deren Menge durch die Enzymreaktion erhöht oder erniedrigt wurde und die nachgewiesen bzw bestimmt werden sollen.
Ale Material für die erfindungsgemäSe asymmetrische Membran können sämtliche Materialien verwendet werden, soweit aus ihnen sogenannte Reversosmosemembranen, also Membranen zur umgekehrten Osmose, hergestellt werden können« Beispiele für derartige Materialien sind etwa Cellulosederivate wie Acetylcellulose, Äthylcellulose, Propionylcellulose, Butyrylcellulose udgl, aliphatische und aromatische Polyamide, Polyamid-imide, Polybenzimidazole, Acrylnitril-Copolymere, Polycarbonate, Polyester, Polyaminosäuren udgl. Besonders günstig sind Cellulose-
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derivate und Polyaminosäuren, die eine Affinität gegenüber Enzymen besitzen.
Die Dicke der asymmetrischen Membran liegt günstigerweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 1OOO um und vorzugsweise von 30 bis 300 am. Die Dicke der Filmschicht der asymmetrischen Membran beträgt günstigerweise etwa 0,01 bis etwa 10yum und vorzugsweise 0,1 bis 3 jum· Die Filmschicht weist keine Poren auf, die groß genug sind, um einen Durchtritt zumindest der Enzymmoleküle zu ermöglichen. Die in der Schwammschicht erzeugten Poren weisen unterschiedliche Porengröße auf; die Porengröße von Poren in größerem Abstand von der Filmschicht ist größer, und die Poren an der Oberfläche der Schwammschicht besitzen Porengrößen von etwa 100 bis etwa 500 nm, so daß eine Enzymlösung über die großen Porenöffnungen frei in die Poren der Schwammschicht eindringen kann. Die Porosität der Schwammschicht der erfindungsgemäßen asymmetrischen Membran kann in gewissen Grenzen je nach den Herstellungsbedingungen der Membran geändert werden; üblicherweise ist jedoch eine Porosität von etwa 50 bis etwa 90 % günstig.
Das Enzym kann nach dem üblichen Immersionsverfahren in die Poren der Schwammschicht eingebracht und darin festgehalten werden. Das Einbringen und die Bindung des Enzyms können noch bevorzugter auch leicht und in wirksamer Weise durch ein Druckfiltrationsverfahren erfolgen. Hierbei kann erfindungsgemäß eine Enzymlösung unter Druck in die Schwammschichtseite der asymmetrischen Membran unter Ausnutzung der Reversosmoseeigenschaften der Membran eingepreßt werden, wodurch die Enzymlösung in den Poren
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(poröser Teil) der Schwammschicht zurückgehalten wird. Hierbei permeiert das Enzym im wesentlichen nicht durch die Filmschicht hindurch und wird in stabiler Weise in den Poren der Schwammschicht zurückgehalten. Die Druckfiltration wird so durchgeführt, daß eine wäßrige Enzymlösung, ggfs unter Zusatz eines Stabilisators,
von der Schwammschichtseite der asymmetrischen Membran her unter Druck eingepreßt wird, wobei sich hierfür lediglich die erfindungsgemäße asymmetrische Membran eignet. Bei Verwendung von gewöhnlichen, rein porösen Membranen wie beispielsweise Fasermaterialien wie etwa Papier tritt Penetration durch die Poren von einem Ende der Membran zum anderen hin auf, wobei üblicherweise kein Unterschied zwischen der Vorderseite und der Rückseite der Membran besteht, dh daß in diesen Fällen Vorderseite und Rückseite in völlig identischem Zustand sind, weshalb die Enzymlösung nicht durch Druckfiltration eingebracht und in der Membran zurückgehalten werden kann*
Die einzubringende wäßrige Enzymlösung kann jede erwünschte Enzymkonzentration aufweisen, jedoch ±st allgemein eine Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 50 mg/ml günstig.
Der zum Einpressen angewandte Druck liegt über Atmosphärendruck und kann frei gewählt werden, solange die asymmetrische Membran hierdurch nicht zusammengepreßt oder beschädigt wird; der Druck liegt günstigerweise im Bereich von 0,2 bis 1 MPa.
Die Filtrationsdauer hängt von der Enzymkonzentration der Enzymlösung ab, liegt jedoch üblicherweise im Bereich von
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50 min bis 10 h.
Die Temperatur, bei der die Druckfiltration durchgeführt wird, muß in einem Bereich liegen, innerhalb dessen keine Denaturierung des Enzyms erfolgt, und liegt günstigerweise bei etwa 0 bis etwa 40 0C.
Erfindungsgemäß wird das in der Schwammschicht der asymmetrischen Membran zurückgehaltene Enzym durch Kontakt mit einer lösung eines Vernetzungsmittels vernetzt und in den Porenbereichen der Schwammschicht immobilisiert. Dabei kann das Enzym mit der Lösung des Vernetzungsmittels nach einer oder mehreren der nachstehenden Verfahrensweisen in Kontakt gebracht werden:
durch Eintauchen einer asymmetrischen Membran mit dem darin zurückgehaltenen Enzym in eine Lösung eines Vernetzungsmittels ;
durch Aufsprühen oder Aufbeschichten der Lösung des Vernetzungsmittels auf die asymmetrische Membran und/oder
durch Einpressen der Lösung des Vernetzungsmittels unter Druck in die asymmetrische Membran von der Seite der Schwammschicht her.
Zu den erfindungsgemäß verwendbaren Vernetzungsmitteln gehören beispielsweise Dialdehyde wie Glutaraldehyd, Dialdehydstärke udgl, Iβocyanatverbindungen wie Hexamethylendiisocyanat, Tolylendiisocyanat udgl, Bisdiazobenzidin, NjN'-Polymethylenbisdodacetamid, N,N-Äthylenbismaleinimid udgl· Besonders günstig sind Dialdehyde wie Glutaraldehyd.
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Das Vernetzungsmittel wird in einer Menge von 10 bis 1000 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil des zu immobilisierenden Enzyms eingesetzt; die Konzentration des Vernetzungsmittels in der Lösung beträgt günstigerweise 1 bis 20 Gew.-%.
Die Reaktionsdauer für die Vernetzungsreaktion hängt von der Konzentration des Vernetzungsmittels in der Lösung ab, und liegt üblicherweise zwischen 15 min und 24 h. Die Temperatur bei der Vernetzungsreaktion muß in einem Bereich liegen, innerhalb dessen das Enzym nicht denaturiert wird, dh von -10 0C bis Raumtemperatur, vorzugsweise bei 0 bis 5 °C·
Zu den erfindungsgemäS verwendbaren Enzymen gehören Gxidasen wie etwa Glucoseoxidase, Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase, üricase udgl ^ Urease, Creatinina.se, Glutaminase, Penicillinase, Catalase, Peroxidase, Invertase, Mutarotase, Amylase, Proteasen wie Papain, Trypsin udgl sowie etwa Glucoseisomerase udgl. Diese Enzyme können sowohl allein als auch in Kombination von zwei oder mehreren immobilisiert werden. So können beispielsweise Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase, Glucoseoxidase und Catalaee sowie etwa Invertase und Glucoseoxidase oder Mutarotase odgl zusammen immobilisiert werden.
Die erfindungsgemäße Membran mit immobilisiertem Enzym ist leicht herstellbar und weist folgende ausgezeichnete Eigenschaften auf χ
(1) eine hohe Enzymbeladung;
(2) eine hohe Stabilität gegenüber physikalischen,
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chemischen und biologiechen Außeneinflüssen, da das Enzym in der Schwammschicht der asymmetrischen Membran immobilisiert ist;
(3) eine hohe Festigkeit trotz kleiner Dicke der Membran
sowie
(4-) eine lange Lebensdauer und eine hohe Aktivität.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Zur Herstellung einer Gießlösung wurden 25 g Acetylcellulose mit 39»8 Gew.-% Acetylgruppen (Hersteller Eastman Kodak, USA), 45 g Aceton und 30 g Formamid zusammengemischt. Etwa 10 g der Gießlösung wurden mit einem Baker-Applikator auf eine saubere, glatte Glasplatte zu einer Membran von etwa 75/um Dicke gegossen; nach 30 s Verdampfen des Lösungsmittels wurde die Membran zusammen mit der Glasplatte zur Gelbildung in 4- 0C kaltes Wasser eingetaucht, wodurch eine asymmetrische Membran erhalten wurde. Die Membran war eine Reversosmosemembran mit einer Filmschicht von 1 yum Dicke und einer Schwammschicht mit einer Porosität von 80 %. Aus der asymmetrischen Membran wurde eine Scheibe von 4-7 mm Durchmesser ausgeschnitten und den folgenden Tests für eine asymmetrische Membran unterzogen.
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Daneben wurde zur Herstellung einer Enzymlösung von pH 6,8 mit einer Enzymkonzentration von 10 mg/ml Glucoseoxidase (spezifische Aktivität 70 IU/mg (Hersteller Boehringer Mannheim)) in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung von pH 6,8 gelöst. Die resultierende Lösung wurde unter Druck durch Druckfiltration (0,5 MPa) von der Schwammschichtseite her in die asymmetrische Membran eingepreßt, um hierdurch die Glucoseoxidase in die porösen Teile der Membran einzubringen und darin festzuhalten.
Durch die asymmetrische Membran mit der darin zurüokgehaltenen Glucoseoxidase wurden 5 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung bei pH 6,8, die 2 Gew.-% Glutaraldehyd enthielt, unter einem Druck von 0,5 MPa hindurchgedrückt; anschließend wurde die asymmetrische Membran in 10 ml der Lösung des Vernetzungsmittels eingetaucht und darin zur Durchführung der Vernetzungsreaktion und Immobilisierung der Glucoseoxidase 3 h bei 4 0C belassen.
Die so erhaltene Membran mit immobilisiertem Enzym besaß
eine Aktivität von 0,5 IU/cm ; nach Aufbewahrung in Phosphatpufferlösung (0,1 M, pH 6,8) bei Raumtemperatur während 30 Tagen betrug die Hestaktivität 80 %»
Vergleichsbeispiel 1
Glucoseoxidase wurde wie in Beispiel 1 immobilisiert mit dem Unterschied, daß eine poröse Polyamidmembran (Nylon, Schichtdicke 130/um, Porengröße 1 Aim, Porosität 80 %) verwendet wurde* Die resultierende Membran besaß eine
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Aktivität von 0,1 IU/cm2.
Beispiel 2
Es wurde eine Membran mit immobilisiertem Enzym wie in Beispiel 1 hergestellt mit dem Unterschied, daß die asymmetrische Membran zum Einbringen des Enzyms 24- h in die Enzymlösung eingetaucht wurde. Die resultierende Membran besaß eine Aktivität von 0,2 IU/cm .
Beispiel 3
Es wurde eine Membran mit immobilisiertem Enzym wie in Beispiel 1 erhalten mit dem Unterschied, daß 5 ml Glutaraldehyd unter Druck durch die Membran permeieren gelassen wurden. Die resultierende Membran besaß eine Aktivität von 0,2 IU/cm2.
Aus den obigen Beispielen 1 bis 3 sowie Vergleichsbeispiel 1 geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Membranen mit immobilisiertem Enzym eine höhere Aktivität und demgemäß eine höhere Enzymbeladung aufweisen. Es ist ferner leicht ersichtlich, daß diese Eigenschaften besonders bemerkenswert sind, wenn das Enzym durch Druckfiltration in die Membran hineingedrückt wird und die Lösung des Vernetzungsmittels unter Druck durch die Membran hindurchgedrückt wird.
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Beispiele 4 bis 11
Es wurden wie in Beispiel 1 Membranen mit immobilisiertem Enzym hergestellt, wobei die Membran, das Enzym, das Vernetzungsmittel sowie die Immobilisierungsbedingungen geändert wurden.
Die Eigenschaften der jeweils resultierenden Membranen wurden untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt (sämtliche Enzyme waren von Boehringer Mannheim bezogen).
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Bei Asymmetrische Dicke Verwen Enzymlösung Spezi
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Akti
vität
(IU/ng 		Con-
z ent rc
tion
ml) 		yernetzungsmittel- Kon-
zen-
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Gesamtaktivitat beider Enzyme
CD CO
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In Fig. 2 ist eine senkrechte Querschnittsansicht einer Enzymelektrodenvorrichtung für elektrochemische Meßgeräte gemäß einer erfindungsgemäßen Ausfuhrungsform dargestellt; in der Mitte eines isolierenden Gefäßes *3, das mit einer Elektrolytlösung 2. gefüllt ist, ist eine Säule aus einem Isoliermaterial vorgesehen, an deren unterem Ende eine Anode 4 herausragt; um die Säule ist eine Kathode £ herumgewickelt. Die Anode 4 und die Kathode £ sind über Leitungen mit einer Gleichstromquelle verbunden. Das obere Ende des isolierenden Gefäßes ist mit einer korrosionsbeständigen Platte verschlossen; das untere Ende ist mit einer erfindungsgemäßen Membran 6 mit immobilisiertem Enzym abgeschlossen, die mit einem O-Ring 2. dicht am isolierenden Gefäß Q befestigt ist.
Wenn die Membran mit dem immobilisierten Enzym mit einer Probenlösung in Kontakt gebracht wird, reagiert das in der Probenlösung enthaltene Substrat selektiv mit dem in der Membran enthaltenen immobilisierten Enzym, wobei beispielsweise Sauerstoff in der Probenlösung verbraucht wird. Auf diese Weise wird der Gleichgewichtszustand zwischen der Elektrolytlösung % und der Probenlösung geändert, wodurch sich wiederum der elektrische Strom ändert, der zwischen der Anode 4 und der Kathode £ fließt. Dies bedeutet, daß die Menge des Substrats in der Probenlösung durch Messung der Änderung des elektrischen Stroms analysiert werden kann.
Die obige Ausführungsform entspricht dem Fall einer Enzymelektrodenvorrichtung, die auf einer Kombination von Sauerstoffelektrode und Membran £ mit immobilisiertem Enzym beruht; auch bei Kombinationen mit anderen Arten von
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Elektroden funktioniert die erfindungsgemäße Membran (3 mit immobilisiertem Enzym in gleicher Weise wie oben, wobei lediglich die Systeme zum Nachweis von Änderungen im Elektrolyten °/ von dem obigen System verschieden sind.
Im einzelnen können erfindungsgemäß zahlreiche verschiedene Elektroden innerhalb eines weiten Bereichs herangezogen werden, beispielsweise Sauerstoffelektroden, Wasserstoffperoxidelektroden, Ammoniakelektroden, Ammoniumelektroden, Carbonationenelektroden, Gyanidionenelektroden, Kohlendioxidgas-Elektroden, Jodidionenelektroden, Elektroden mit einwertigem Kation, Glaselektroden udgl.
Mit der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenvorrichtung lassen eich zahlreiche Substanzen bestimmen; hierzu gehören beispielsweise Glucose, Harnstoff, Cholesterin, Aminosäuren, Penicillin, Amygdalin, Creatinin, Harnsäure, Rohrzucker, Lactose udgl. Durch Kombination der obigen verschiedenen Elektroden mit den erfindungsgemäßen Membranen mit immobilisiertem Enzym lassen sich ferner auch zahlreiche andere Substanzen analysieren.
Beispiel 12
Durch Befestigung einer nach Beispiel 1 hergestellten Membran mit immobilisiertem Enzym an der Arbeltsfläche einer Sauerstoffelektrode gemäß Fig. 2 (Clark-Typ) mit einem O-Sing aus Gummi wurde eine Enzymelektrodenvorrichtung hergestellt. Die Vorrichtung wurde in eise Glucose— lösting von 100 mg/dl (Phoaphatpufferlösung pH 6,8)
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eingebracht, worauf der Sauerstoffverbrauch in der Glucoselösung gemessen wurde. Etwa 15 s danach wurde ein stationärer Zustand erreicht. Anschließend wurde die Enzymelektrodenvorrichtung in andere Glucoselösungen mit verschiedener Glucosekonzentration eingebracht und der jeweilige Sauerstoffverbrauch 5 s danach gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt, in der die Beziehung zwischen der Glucosekonzentration und dem Sauerstoffverbrauch bei der Enzymelektrodenvorrichtung von Fig. 2 dargestellt ist.
Für drei Glucosekonzentrationen von Probenlösungen, nämlich 100 mg/dl, 200 mg/dl und 300 mg/dl, war der Sauerstoffverbrauch proportional zur Konzentration. Wenn die erfindungsgemäße Enzymelektrodeneinrichtung demgemäß mit einer Glucose-Probenlösung unbekannter Konzentration in Kontakt gebracht wird, kann ihre Glucosekonzentration rasch mit hoher Genauigkeit ermittelt werden.
Vergleichsbeispiel 2
Zum Vergleich der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenvorrichtung von Beispiel 12 mit herkömmlichen Enzymelektrodenvorrichtungen hinsichtlich ihrer Eigenschaften wurde folgender Test herangezogen:
In herkömmlicher Weise wurde mit einem Polyacrylamidgel eine Membran mit immobilisiertem Enzym erzeugt, die die gleiche Glucoseoxidase wie in Beispiel 1 enthielt; die resultierende Membran mit immobilisiertem Enzym besaß eine Dicke von 75/um und die gleiche Aktivität wie die Membran von Beispiel 1 und wurde auf der Arbeitsfläche
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der Enzymelektrodenvorrichtung über eine Polyfluorkohlenstoffmembran mit einer Dicke von 10yum als Sperrmembran befestigt; die Membran mit dem immobilisierten Enzym befand sich demgemäß auf der Sperrmembran. Bei der Analyse der gleichen Probenlösungen wie in Beispiel 12 mit der so hergestellten herkömmlichen Enzymelektrodenvorrichtung waren 60 s erforderlich, um einen stationären Zustand zu erzielen. Das Ansprechen war demgemäß erheblich verzögert. Daraus geht hervor, daß das verzögerte Ansprechen durch die nur geringe Diffundierbarkeit der herkömmlichen Membran mit dem immobilisierten Enzym sowie die Verwendung der Sperrmembran bedingt ist, die als Barriere zur Verhinderung eines Austritts von Elektrolyt sowie des Eintritts störender Substanzen verwendet wurde.
Die Erfindung gibt zusammengefaßt Membranen mit immobilisiertem Enzym an, die eine asymmetrische Membran darstellen, bei der eine Filmschicht, die im wesentlichen für Enzyme undurchlässig ist, jedoch den Durchtritt von Gasen und Flüssigkeiten erlaubt, mit einer Schwammschicht integriert ist, die ausreichende Porosität besitzt, um darin eine erforderliche Menge des Enzyms zurückzuhalten, und miteinander Innerhalb/Scnwammschicht in Verbindung stehende Poren aufweist, wobei das Enzym in den Poren durch Vernetzung immobilisiert ist. Die erfindungsgemäßen Membranen mit immobilisiertem Enzym weisen eine hohe Enzymbeladung, ein gutes Diffusionsvermögen, eine hohe Permeabilität, eine über lange Zeit stabile Aktivität sowie
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ein schnelles Ansprechen auf, wenn sie in Enzymelektroden vorrichtungen für elektrochemische Meßgeräte eingesetzt werden.
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L e e r s e 11 e

Claims (11)

  1. Ansprüche
    M. !Membran mit einem oder mehreren immobilisierten Enzymen,
    gekennzeichnet durch eine asymmetrische Membran aus einer hautartigen, im wesentlichen enzymundurchlässigen, jedoch gas- und flüssigkeitsdurchlässigen Filmschicht (1)
    und einer damit integrierten Schwammschicht (2) mit zur Aufnahme der erforderlichen Enzymmenge ausreichender
    schient
    Porosität und durch die Schwamm/ Hindurch miteinander in Verbindung stehenden Poren, in denen das Enzym
    durch Vernetzung immobilisiert ist.
  2. 2. Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die asymmetrische Membran eine Reversosmosemembran
    ist.
  3. 3· Membran nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die asymmetrische Membran aus einem Cellulosederivat, Polyamid oder einer Polyaminosäure besteht, wobei die Filmschicht und die Schwammschicht aus dem gleichen Material bestehen.
  4. 4. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch
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    gekennzeichnet, daß die Filmschicht der asymmetrischen Membran eine Dicke von 0,1 bis 3/im und die Schwammschicht eine Dicke von 30 bis 300 nm sowie eine Porosität von 50 bis 90 % aufweist.
  5. 5. Verfahren zur Herstellung der Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 4-,
    gekennzeichnet durch
    Zusammenbringen einer Enzymlösung mit einer asymmetrischen Reversosmosemembran, bei der eine Filmschicht, die im wesentlichen enzymundurchlässig, jedoch gasuiid flüssigkeitsdurchlässig ist, und eine Schwammschicht mit zur Zurückhaltung der erforderlichen Enzymmenge ausreichender Porosität und miteinander durch die Schwammschicht hindurch in Verbindung stehenden Poren miteinander integriert sind, wobei die Enzymlösung in den Poren der Schwemmschicht der Reversosmosemembran zurückgehalten wird, und
    Zusammenbringen des Enzyms mit einer Lösung eines Vernetzungsmittel und Vernetzung des Enzyas und Iamobilisierung in der Schwammschicht.
  6. 6, Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung zuvor in den Poren der Schwammschicht zurückgehalten und die lösung des Vernetzungsmittels mit dem Enzym zur Vernetzung in Kontakt gebracht wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung durch Druckfiltration von der
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    Schwammschichtseite der asymmetrischen Membran her in die Poren der Schwammschicht eingebracht und darin
    festgehalten
    iind die Lösung des Vernetzungsmittels unter Druck von der Schwammschichtseite der asymmetrischen Membran her zur Vernetzung des Enzyms durch die asymmetrische
    Membran hindurchgedrückt wird.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte asymmetrische Membran nach dem Durchdrücken der Lösung des Vernetzungsmittel unter Druck zur Vernetzung des Enzyms in die Lösung des Vernetzungsmittels eingetaucht wird·
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die asymmetrische Membran eine Filmschicht von 0,1 bis 3 Jim Dicke sowie eine Schwammschicht von 30 bis 300yum Dicke und einer Porosität von 50 bis 90 % aufweist.
  10. 10. Enzymelektrodenvorrichtung für elektrochemische Meßgeräte, bei der eine Substanz in einer Probenlösung elektrochemisch analysiert wird, mit
    einem Gefäß (8) zur Aufnahme einer Elektrolytlösung (9),
    einer Anode (4-),
    einer Kathode (5) und
    einer an der Arbeitsfläche der Anode und/oder der Kathode vorgesehenen Sperrmembran,
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    gekennzeichnet durch
    eine asymmetrische MembranpiSch einem der Ansprüche 1 bis 4 als Sperrmembran.
  11. 11. Verwendung der Kembran nach einem der Ansprüche 1 bis 4- für analytische oder präparative biochemische
    Zwecke.
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