DE2634562A1

DE2634562A1 - Enzym-membran

Info

Publication number: DE2634562A1
Application number: DE19762634562
Authority: DE
Inventors: Yukio Hashimoto; Kazuo Kimura
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1975-08-01
Filing date: 1976-07-31
Publication date: 1977-02-17
Also published as: FR2319897B1; FR2319897A1; CA1072468A; GB1560691A; JPS5217889A

Description

Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch Patentanwälte Diplom-Physiker Dr. Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur Dr.-lng. Manfred Honke Diplom-Ingenieur Hans Dieter Gesthuysen Diplom-Physiker Dr. Karl Gerhard Masch Anwaltsakte:

459/_Ja+

43 Essen 1, Theaterplatz 3, Postf. 789

29. Juli 1976

Patentanmeldung KYOWA HAKKO KOGYO KABUSHIKI KAISHA No. 6-1, 1-chome, Chiyoda-ku, Tokyo-to, Japan

Enzym-Membran

Diese Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym und im besonderen betrifft sie ein Enzym - immobilisiert auf einer Membran, die z. B. für eine Enzym-Elektrode verwendet wird, welche durch Kombination einer enzymatischen Aktivität mit einem elektrochemischen Analyse-Verfahren als ein elektrochemischer Klein-Umwandler arbeitet.

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Enzyme sind Kraft ihrer Substrat-Spezifizität und katalytischen Aktivität zur Analyse, Reinigung und Reaktion von verschiedenen Substanzen, wie Zucker, Cholesterin und dergl., die in lebenden Körpern oder gelöst in Flüssigkeit enthalten sind, in der Tat nützlich.

Jedoch ist der Gebrauch eines Enzyms für solche Zwecke wegen der Unbeständigkeit der Enzyme, des großen Verbrauchs an teuren Enzymen für jeden Ablauf der Analyse und die Erfordernis eines langen Zeitraumes für die Analyse nützlich.

Im Hinblick auf die Überwindung dieser Nachteile sind Versuche gemacht worden, um eine Enzym-Membran zu schaffen, z.B. ein Enzym, das darin immobilisiert ist oder von einer plastischen Membran getragen ist, welche z.B. für Sauerstoff, Ionen, Substrate und dergl., die zu behandeln sind, durchlässig ist. Eine so erhaltene Membran hat die Vorteile der Festigkeit, Stabilität und Gleichmäßigkeit.

Es ist auch vorgeschlagen worden, solche Enzym-Membran mit einem elektrotechnischen Verfahren zu kombinieren durch Anbringen der Membran am Kopf einer Elektrode einer Zelle, die für analytische Zwecke dient, um dabei folgende Vorteile zu erhalten:

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a) Die Bestimmung wird in einer kurzen Zeitperiode mit einer guten Reproduzierbarkeit und Stabilität ausgeführt.

b) Die Elektrode ist nach Vollendung der vorausgehenden Operationen leicht abwaschbar (z.B. gute Aufbereitbarkeit).

c) Die Elektrode kann mehrere Male zur Analyse verwendet werden, weil der Verbrauch an Enzym pro Analysenablauf ganz gering ist.

Die Enzym-Membrane oder Enzym-Elektroden der bekannten Typen werden wie folgt veranschaulicht.

Typ 1: Eine Enzym-Lösung wird in einer semipermeablen Membran eingeschlossen, welche direkt mit der Spitze einer Elektrode in Kontakt ist unter Verwendung von 0-Ringen, berichtet in der Analytischen Chemie, £2 (1), 118-121 (1970). Dieser Typ erfordert eine lange Zeitperiode, um die Abfälle von der vorhergehenden Operation zu entfernen, und das Enzym ist unbeständig und nicht gleichförmig.

Typ 2: Eine Lösung, enthaltend ein Enzym, Acrylamid; Ν,Ν-Methylenbisacrylamid und ein Polymerisierungsmittel wird einer Photo-Polymerisation auf einer plastischen Membran unterworfen, welche direkt mit einer Elektrode in Kontakt

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steht, um das Enzym in das Gefüge des Acrylamid-Gels einzuschließen - berichtet in Nature, 214, 986-988 (1967). Dieser Typ kann eine große Menge eines Enzyms oder eines Enzymkomplex-Systems von zwei oder mehreren Enzymen festlegen, er erfordert aber eine sehr komplizierte Gelbildungs-Reaktion an der Elektrode für die Gewinnung der gewünschten Enzym-Elektrode. Ferner kann dieser Typ mühsam anwendbar sein auf hochmolekulare Substrate wegen einer übermäßig hohen Dichte der Gefüge-Struktur des Acrylamid-Gels, und er ist auch in der Reproduzierbarkeit mangelhaft.

Typ 3: Es wird ein Enzym mit einem inaktiven Protein vermischt und der Vernetzungs-Reaktion unterworfen, um Ausscheidungen von vernetzten Proteinen zu ergeben, welche dann auf eine plastische Membran aufgebracht werden, die in direktem Kontakt mit einer Elektrode plaziert ist und durch ein Netz, das aus einem plastischen Harz gemacht ist, gestützt wird - berichtet in Pathology Biology, ^2 (6), 497-502 (1974). Dieser Typ hat einen ähnlichen Vorteil wie der vom Typ 2, jedoch ist das Enzym unbeständig und infolge der Pastenform der vernetzten Proteine ungleichmäßig.

Typ 4: Es werden Aminogruppen eines organischen Polymerisats in Pulverform und ein Enzym miteinander gekoppelt, um eine Paste aus einem immobilisierten Enzym zu ergeben - berichtet in Analytical Letter, j[ (4), 301-312 (1973). Dieser Typ

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hat wegen der Pastenform ähnliche Mangel wie die des Typs 3.

Typ 5; Es wird eine Lösung, die Collagen-Fasern und ein Enzym enthält, mit einem konstanten elektrischen Strom unter saurer Bedingung in eine Zelle eingebracht, um eine Enzym-Collagen-Membran um die Kathode herum zu ergeben. Die Membran wird gewaschen, getrocknet und als ein Teil einer Doppel-Membran verwendet, die noch eine andere Membran hat, die aus einer Sauerstoff-permeablen Membran besteht, die aus einem plastischen Harz, z. B. Teflon, gemacht ist, Diese Doppelmembran wird direkt mit einer Elektrode in Kontakt gebracht und mit Kautschuk-Ringen dicht an der Elektrode befestigt - berichtet in Analytica Chimica Acta, 69, 431 (1974). Dieser Typ hat die Mängel einer geringen Dispersion des Substrats und eines Zeitverbrauchs. Selbst dann wenn diese Mängel durch Verwendung einer dünnen Membran vermieden werden können, bestehen noch die Nachteile einer schlechten mechanischen Eigenschaft und der Schwierigkeit in der Handhabung. Dieser Typ kann ebenfalls kaum anwendbar sein auf einige Enzyme, welche unter sauren Bedingungen inaktiviert werden können.

Wie oben beschrieben sind die Schwierigkeiten zum Immobilisiren des Enzyms untrennbar verbunden mit den Enzym-Membranen oder Enzym-Elektroden der bekannten Typen. Man hat jedoch jetzt entdeckt, daß eine Enzym-Membran ohne die zuvor

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erwähnten Nachteile durch Verwendung einer porösen Membran, die aus einem organischen Hochpolymeren hergestellt ist, bereitet werden kann.

Ein Gegenstand der Erfindung ist, eine Enzym-Membran vorzusehen, welche mit Vorteil entweder allein für chemische Verfahren oder in Kombination mit einer Elektrode einer Zelle für elektrochemische Verfahren verwendet zu werden.

Diese Erfindung betrifft eine Enzym-Membran für chemische oder elektrotechnische Verfahren, wie Analyse, Reinigung, Reaktion und dergl., wobei die Enzym-Membran im allgemeinen als eine Ober-Membran einer Doppelmembran verwendet wird, von der die Unter-Membran ein Sauerstoff oder Ionen-permeabler Plasticfilm ist. Wenn eine Doppelmembran der bekannten Typen, z.B. Teflon-Membran oder Nylon-Membran verwendet wird für ein elektrochemisches Verfahren, so wird die Doppel-Membran direkt und dicht in Kontakt mit einer Elektrode einer Zelle z.B. durch Verwendung von O-Ringen angebracht.

Diese Erfindung unterrichtet über eine Enzym-Membran, die ein Enzym umfaßt, das in einer porösen Membran festgelegt ist, welche permeabel ist, und welche aus einem organischen hochmolekularen Polymeren besteht.

Die für den erfindungsgemäßen Zweck verwendete plastische Membran hat eine mikroporöse Struktur, wobei die Poren, die

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im Durchschnitt einen Durchmesser von 10 bis 10 000 8 (vorzugsweise von 50 bis 5000 R) haben, dicht und ungleichmäßig auf der ganzen Oberfläche verteilt sind. Die Stärke des plastischen Harzfilmes liegt zwischen 1 und 500 ,u. Solche Filme sind in der Technik bekannt und z.B. als Membran-Filter verwendet. All und jede plastischen Harzfilme, die für die Herstellung der bekannten Enzym-Membrane verwendet werden, können für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden, obgleich es auch möglich ist, Filme zu verwenden, die aus Polyacrylnitril, Polyurethan, Polystyrol, Polyamid, Polyharnstoff-Harz, Polyester, Polyäthylen, Polypropylen und dergl. hergestellt sind. Es können gute Ergebnisse erhalten werden durch Verwendung eines Harzfilmes, der aus einem Mischpolymerisat von Acrylnitril mit entweder Vinylacetat, Acrylamid, Methylacrylat oder dergl. hergestellt ist. Auch Polypropylen-Filme, die einen Porendurchmesser von durchschnittlich 50 bis 5000 8. haben, sind vorzuziehen.

Poröse Harzfilme der bekannten Typen werden in zwei Typen klassifiziert. Die eine ist mit Poren ausgerüstet, welche nicht untereinander verbunden sind, z. B. ein geschlossener Zeil-Typ, und eine andere ist mit Poren ausgerüstet, welche durch verschlungene Bahnen untereinander verbunden sind, welche von einer äußeren Oberfläche zu einer anderen, z.B. als ein Offen-Zell-Typ, sich ausdehnen können. Beide Film-Typen

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können für den Zweck der Erfindung verwendet werden, wenn die Filme von einer mikroporösen Struktur sind, welche eine hohe Affinität und eine gute Adhesion des Enzyms auf. dem Film gewähren. Die für die im Rahmen der Erfindung benutzbaren Kunststoff-Membranen erforderliche Permeabilität ist im Stande der Technik bekannt und kann entsprechend der Benutzungsart der fertigen Enzym-Membran variieren. So ist z.B. eine Permeabilität für Glukose, wenn die Kunststoff-Membran für eine Glukose-Oxydase-Sauerstoff-Elektrode benutzt wird und eine Permeabilität für das Reaktionsprodukt, wenn die Kunststoff-Membran für die enzymatische Reaktion eingesetzt wird. Es können gute Ergebnisse durch Verwendung eines Offen-Zell-Typs erhalten werden. Mikroporöse Filme, wie sie in den nachfolgenden Beispielen verwendet werden, können z. B. nach Verfahren hergestellt werden, wie sie in der USA-Patentschrift 3 679 538, den japanischen Offenlegungsschriften 78576/75, 90579/75 und 43878/74 offenbart sind.

Es ist möglich, das Enzym in der Membran durch eine einfache oder kombinierte Anwendung der nachfolgenden Methoden festzulegen.

- chemische Methoden für covalente Bindung des Enzyms mit den aktiven Gruppen der hochmolekularen plastischen Membran (z.B. Methylestergruppe und Nitrilgruppe) -

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- Vernetzen in einer Matritze durch Verwendung eines VernetζungsmitteIs -

- physikalische Adsorption.

Da die poröse Harzmembran im allgemeinen hydrophob ist, ist es vorteilhaft, das Enzym durch Bestreichen der porösen Membran nach der Behandlung festzulegen. Z. B. wird die Membran in ein organisches Lösungsmittel, wie z.B. Alkohol oder Aceton, getaucht mit nachfolgendem Einlegen in Wasser.

Die Reaktion (Kontakt) des Enzyms mit der Membran wird bei einer geeigneten Temperatur durchgeführt, welche unter der Temperatur liegt, bei der das Enzym inaktiviert wird (vorzugsweise bei 0 bis 40°e). Die Kontaktzeit ist nicht begrenzt, sie liegt aber vorzugsweise zwischen 1 und 24 Stunden. Die chemische Behandlung der Membran wird mit oder ohne das adsorbierte Enzym eine geeignete Zeit lang bei einer geeigneten Temperatur durchgeführt. Es ist auch möglich, die Membran vor der Kombinierung mit dem Enzym bei erhöhter Temperatur und über eine kürzere Zeitperiode zu behandeln.

Die Enzyme, welche für die Erfindung verwendet werden können, werden veranschaulicht durch Oxydasen, wie z.B. Glukose-Oxydase, Aminosäure-Oxydase, Alkohol-Oxydase, Ureat-Oxydase, Cholesterin-Oxydase und dergl.; verschiedene Aminosäuren-

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Decarboxylasen, Urease, Glutaminase, p-Glukosidase, Penicillinase, Cholinesterase, Cholesterinesterase, Katalase, .Invertase, Asparaginase, Mutarotase und dergl. Es ist möglich, die Enzyme allein oder in Kombination von wenigstens zwei derselben zu verwenden. Die Komplex-Enzym-Systeme werden veranschaulicht durch die Kombination von Oxydase und Katalase, Cholesterinesterase und Cholesterinoxydase, Invertase und Glukoseoxydase, und Invertase und Mutarotase.

Die Erfindung kann auf verschiedene selektive Elektroden für elektrochemische und quantitative Bestimmung z.B. unter Verwendung der folgenden Elektroden angewendet werden.

Clarke- oder Galvani-Typ-Sauerstoff-Elektrode; pH-Elektrode, Cyanat-Elektrode; Ammonium-Elektrode; Carbonat-Elektrode; Iodinen-Elektrode und dergl.

Die Enzym-Elektrode, ausgerüstet mit der erfindungsgemäßen Enzym-Membran wird in allen Flüssigkeiten verwendet, solange die enzymatische Reaktion ohne Inaktivierung des verwendeten Enzyms ausgeführt werden kann. Es wird jedoch vorgezogen, sie in einer Flüssigkeit beim pH von 3 bis 9 und bei einer Temperatur von 0 bis 50°C zu verwenden. Die Bedingungen können in Abhängigkeit von den Elektrodentypen und dem zur enzymatischen Reaktion verwendeten Medium variieren. Wenn

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z.B. die Enzym-Membran für eine Sauerstoff-Elektrode verwendet wird, liegt die Temperatur vorzugsweise unter 50⁰C, und im Falle einer Ammonium-Ionen-Elektrode können bei einem relativ höheren pH gute Ergebnisse erhalten werden. Die Konzentration des für eine enzymatische Reaktion verwendeten Substrats kann in Abhängigkeit von den Eigenschaften der verwendeten Enzym-Membran, den Substrat-Typen, der Elektrode und dergl. variieren, jedoch sind 10~ Mol/l bis 10 Mol/l vorzuziehen. Beim Gebrauch wird die Enzym-Elektrode in eine Lösung gesteckt, welche das Substrat nicht enthält und welche mit einem konstanten elektrischen Strom und Vollspannung belastet ist. Danach wird eine kleine Menge der zu bestimmenden Lösung allmählich zugefügt, um die Änderung des Stromes oder der Vollspannung auf übliche Weise zu kontrollieren. Selbst dann, wenn die Lösung zuerst eine kleine Menge an Substrat enthält, ist es möglich, durch Stehenlassen der Lösung für eine geeignete Zeitspanne ein Gleichgewicht zu erhalten.

Erfindungsgemäß ist es möglich, die Enzym-Membran ohne die zuvor erwähnten Nachteile jedoch mit folgenden vorteilhaften Ergebnissen zu erhalten.

a) Viele Enzym-Typen können immobilisiert werden, und es ist auch möglich, verschiedene Enzyme zu verwenden, welche inaktiviert werden können bei einem pH, welches nicht anwendbar auf die Collagen-Membran des bekannten Typs ist.

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b) Das auf der Enzym-Membran festgelegte Enzym ist beständig, und die so erhaltene Membran ist gleichförmig. Wenn z.B. eine gleiche Enzym-Membran - wie die im Beispiel 1 verwendete - 100 mal in dem stationären, elektrischen Umlauf-Verfahren zur Bestimmung der Glukose-Konzentration (16 mg/dl) verwendet wird, so ist das erhaltene Ergebnis durch die Endbestimmung im Bereich von 98 % des anfänglich erhaltenen Ergebnisses.

Verschiedene Nachteile der bekannten Enzym-Elektroden im Hinblick auf Stabilität, konstante Wiederholbarkeit, Aufbereitbarkeit und Wirkungszeit werden durch diese Erfindung überwunden, und durch diese Erfindung ist eine weite Anwendbarkeit auf die verschiedensten Enzyme geliefert.

Die begleitenden Zeichnungen werden in den Fig. 1-3 auf S. 987 von Nature, Band 214 (1967) wiedergegeben, um die Konstruktion und Funktion einer Enzym-Elektrode, wie sie im Beispiel 1 nachfolgend verwendet wird, zu erläutern.

Die Erfindung wird durch die folgenden, jedoch nicht beschränkenden Beispiele erläutert, in denen alle Verfahrensschritte bei Zimmertemperatur - sonst einzeln angegeben ausgeführt werden, und in denen die plastischen Membranen, in denen die Enzyme festgelegt sind, wie folgt hergestellt werden können.

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Herstellung der Membrane, die in den Beispielen 1-4 und 6-12 verwendet werden.

Acrylonitril (95 Gew.-Teile) und Methylacrylat ( 5 Gew.-Teile) werden auf konventionelle Art mischpolymerisxert offenbart in der französischen Patentschrift 2 254 355, um ein Mischpolymerisat herzustellen, welches in Dimethylformaldehyd gelöst wurde, um eine Lösung mit einer Mischpolymerisat-Konzentration von 20 Gew.-% zu ergeben. Die Lösung wurde auf eine Glasplatte gegossen mit nachfolgenden 10 Min. langer Tauchung in Wasser bei 20°C, um eine semipermeable Membran zu ergeben. Diese Membran wurde mit Wasser gewaschen und dann 10 Min. lang einer thermischen Behandlung in heißem Wasser von 80 C unter halbwegs keinem Druck unterworfen. Die erhaltene Membran war mikroporös und fürdie zu behandelnden Substrate, Sauerstoff und Ionen permeabel. Die auf der gesamten äußeren Oberfläche dicht verteilten Poren waren mikroskopisch klein und hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von 50 bis 1000 A.

Herstellung der im Beispiel 13 verwendeten Membran.

Die plastische Membran wurde auf eine ähnliche Art wie in der USA-Patentschrift 3 679 538 beschrieben - wie folgt hergestellt:

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Polypropylen mit einem Schmelzindex von 0,7 bis 5,0 und einer Dichte von 0,90 bis 0,925 wurde bei 200 bis 25O°C geschmolzen stranggepreßt durch einen T-Stempel und mit einer rotierenden Gußwalze, gehalten bei 50⁰C, in Kontakt gebracht. Die so erhaltene Membran wurde 30 bis 60 Min. lang im Luftstrom mit einer geringen Spannung bei 125 bis 140 C offen getempert. Die Membran wurde dann bei Zimmertemperatur einer z.B. 100%igen Längsdehnung unterworfen und anschließend 5 Min. lang bie 100 bis 150°C unter Druck thermofixiert. Man erhielt eine mikroporöse Membran von z.B. ca. l,78g/cm Schüttdichte und ca. 0,17 cm /g Hubdichte (cubic density).

Beispiel 1

Eine poröse Membran (Stärke - 75 ,u); Raum-Verhältnis 53 %; durchschnittlicher Porendurchmesser - 90 S, hergestellt aus einem Mischpolymerisat von Acrylnitril (95 Gew.-Teile) und Methylacrylat (5 Gew.-Teile) wurde in eine 25%ige Methanollösung von Hydrazinhydrat gelegt. Die Menge

ο der verwendeten Hydrazinlösung betrug 1 ml/1 cm der Ausgangsmembran. Man ließ die Membran 3 Std. lang bei Zimmertemperatur in der Methanollösung liegen, und dann wurde sie 10 Min. lang in eine 10%ige Glutaraldehyd-Lösnng in einer 0,1 Mol Phosphat-Pufferlösung (pH 8) gelegt.

2 Die Menge an Glutaraldehyd-Lösung betrug 1 ml/1 cm der

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Ausgangsraembran. Eine Enzym-Lösung, die 50 mg/ml Glukose-Oxydase (spezifische Aktivität: 14 IU/mg, ein Handelsprodukt der Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan) enthielt, wurde durch Lösen des Enzyms in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 6) bereitet und auf die Membran in einer Menge von 0,2 ml/1 cm Ausgangsmembran aufgetragen, um das Enzym festzulegen. Die so behandelte Membran mit einer enzymatisehen Aktivität von ca. 0,2 Iü/cm wurde eng mit einem Teflon-Film (Stärke - 20,u) verknüpft, und zwar an der Spitze einer Sauerstoff-Elektrode vom Clarke-Typ unter Verwendung eines 0-Ringes aus Gummi. Die Elektrode wurde auf eine ähnliche Art - wie in Nature, 214, 986 - 988 (1967) berichtet - hergestellt. Wenn diese Elektrode in einer Phosphat-Pufferlösung (pH 6) als Sauerstoff-Elektrode ohne Verwendung der Enzym-Membran und dem stationären, elektrischen Umlauf (currency) getestet wurde, die auf 0,65/uA eingestellt war, so wurde die Menge an Sauerstoff beobachtet, die in der Pufferlösung vorhanden war, daß sie 2,2 χ 10 Mol/l betrug. Die Elektrode wurde zusammen mit der Enzym-Membran verwendet, und der stationäre elektrische Strom wurde auf 0,70 ,uA eingestellt.

Die erhaltene Elektrode wurde in eine Zelle eingesetzt. Es wurden der Zelle eine gegebene Menge einer Glukose-haltigen Testlösung zugefügt. Der elektrische Strom wurde nach ca. 1 Min. stationär. Die Glukose-Konzentration in der Testlösung wurde bestimmt durch die Differenz zwischen den

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anfänglichen und den stationären elektrischen Strömen und ergab die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse. Der Abfallgrad der Sauerstoff-Konzentration an der Spitze der.Elektrode ist proportional der Glukose-Konzentration. Er brauchte ca. 1 bis 2 Min., um die stationäre - wie oben beschrieben Konditionsmethode auszuführen, während nur 15 Sek. genügten, um die Abfallgrad-Methode durchzuführen.

Tabelle 1

Glukose- Konzentration (mg/dl)	Stationäre Methode (Strom-Differenz) ^uA)	Abfallgrad (rate)- Methode (,uA/Min.)
4 8 12 16	0.037 0.072 0.106 0.144	0.070 0.142 0.208 0.275

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Beispiel 2

Eine ähnliche Membran vom Acrylnitril-Typ - wie im Beispiel 1 verwendet - wurde in 0,2 ml einer Enzymlösung für 16 Std. bei 5°C pro 1 cm Ausgangsmembran gelegt. Die Enzymlösung, die 50 mg/ml Glukose-Oxydase (spezifische Aktivität - 14 IU/mg, Handelsprodukt der Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan) enthielt, wurde durch Lösen des Enzyms in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 6) bereitet. Danach wurde die Membran mit einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 6) leicht gewaschen und 20 Min. lang bei Zimmertemperatur in eine 10%ige Glutaraldehydlösung gelegt, welche durch Lösen von Glutaraldehyd in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 8) bereitet wurde. Auf diese Weise wurde das auf der porösen Membran adsorbierte Enzym durch die Vernetzungs-Reaktion festgelegt. Die so erhaltene mit dem Enzym kombinierte Membran hatte eine enzymatische Akti-

vität von 0,2 IU/cm der Ausgangs-Membran und wurde verwendet, um eine ähnliche der im Beispiel 1 beschriebenen Enzym-Elektrode herzustellen. Auf die gleiche Weise - wie im Beispiel 1 beschrieben - wurde die Glukose-Konzentration quantitativ bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

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Tabelle 2

Glukose- Konzentration (mg/dl)	Strom-Differenz (/UA)-	Abfallgrad (rate) ( ,uA/Min.)
4 8 12 16	0.036 0.072 0.107 0.144	0.076 0.141 0.209 0.275

Beispiel 3

Eine ähnliche Membran vom Polyacrylnitril-Typ - wie die im Beispiel 1 verwendete - wurde 16 Std. bei 5°C in 0,2 ml einer Misch-Enzymlösung-enthaltend 300 mg/ml Invertase (spezifische Aktivität - 23 IU/mg; Handelsprodukt der Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan), 50 mg/ml Glukose-Oxydase (spezifische Aktivität - 14 IU/mg; Handelsprodukt der Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan) und 2,5 mg/ml Mutarotase (spezifische Aktivität - 6.000 IU/mg; Handelsprodukt von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) auf 1 cm der Membran gelegt. Die Enzymlösung wurd^ durch Lösen der

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Enzyme in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 6,5) bereitet. Die Membran wurde leicht mit einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 6,5) gewaschen und für 20 Min. bei Zimmertemperatur in eine 10%ige Glutaraldehydlösung gelegt, die durch Lösen von Glutaraldehyd in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 8) hergestellt wurde, um sogleich Invertase, Glukose-Oxydase und Mutarotase mit der Membran zu kombinieren, welche verwendet wurde, um eine ähnliche Enzym-Elektrode - wie die im Beispiel 1 verwendete - herzustellen. Die Elektrode wurde verwendet, um die Saccharose- und Glukose-Konzentrationen zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt, wonach es so aussieht, als ob die Empfindlichkeiten der Elektrode zu beiden Zuckern fast einander gleich sind.

Tabelle 3

Konzentration der Glukose und Saccharose (/U Mol/ml)	Strom-Differenz ( /UAJ	Glukose
0.3 0.6 1.2 1.8 2.4	Saccharose	0.024 0.047 0.095 0.140 0.185
0.022 0.045 0.089 0.125 0.172

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Beispiel 4

Eine ähnliche Membran vom Polyacrylnitril-Typ - wie ■ die im Beispiel 1 verwendete - wurde auf ähnliche Weise behandelt - wie die im Beispiel 1 beschriebene - , um die Aldehydgruppe einzuführen, und sie wurde dann in 0,2 ml

2 einer Enzymlösung gelegt, die pro 1 cm Membran Katalase

enthielt. Dauer der Einlage 16 Std. bei 5°C. Die Enzymlösung wurde bereitet durch Lösen von Katalase (Kuhleber-Enzym, erhältlich durch Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan) in 0,1 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH 7), und sie hatte eine Aktivität von 110 000 IU/ml. Die mit dem Enzym koitibi-

2 nierte Membran hatte eine Katalase-Aktivität von 1,1 IU/cm der Ausgangsmembran und wurde verwendet, um eine ähnliche - wie die im Beispiel 1 verwendete - Enzym-Elektrode zu schaffen. Das Substrat (Wasserstoffperoxyd) wurde durch Katalase im Wasser und Sauerstoff zersetzt. Die Steigerungsrate an Sauerstoff-Konzentration an der Spitze der Elektrode war proportional der Wasserstoffperoxyd-Konzentration. Infolgedessen erhöhte sich der Stand an Sauerstoff an der Elektrode in Gegenwart des Substrats, und der Wasserstoffperoxydgehalt wurde im Verhältnis zur Höhe des Sauerstoffs und dessen Steigungsgeschwindigkeit bestimmt. Die quantitative Bestimmung der Wasserstoffperoxyd-Konzentration wurde bei 2 C und einem pH von 7.4 durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

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Tabelle 4

Konzentration an Wasserstoffperoxyd ( /ug/ml)	Stationäre Conditions- methode (Strom differenz - /UA)	Abfallgrad(rate)- Methode (Rate -,uA/Min.)
15	0.088	0.109
37.5	0.226	0.268
75	0.443	0.503
112.5	0.679	0.770
150	0.890	0.994
187.5	1.144	1.240
225	1.276	1.420

Beispiel 5

Juragard 2400 (Handelsname für eine aus Polypropylen hergestellte Membran, erhältlich durch Polyplastics Corporation, Japan; Stärke - 25 ,u; durchschnittlicher Porendurchmesser 100 8. (größere Achse) und 200 8 (kleinere Achse)) wurde in Aceton gelegt, um eine Affinität zu Wasser zu liefern durch Einhängen in Wasser, und es wurde dann in 0,2 ml einer Enzymlösung gelegt, die 50 mg/ml Glukose-Oxydase (spezifische Aktivität - 14 IU/mg; Handelsprodukt von

2 Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan) pro 1 cm der Ausgangsmembran

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enthielt. Die Enzyitilösung wurde hergestellt, indem man das Enzym in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 5,6) löste. Die so erhaltene poröse Membran wurde mit 0,1 Mol einer Phosphat-Pufferlösung (pH 5,6) leicht gewaschen und 20 Min. bei Zimmertemperatur in eine 10%ige Glutaraldehydlösung gelegt, die bereitet wurde, indem man Glutaraldehyd in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 8) löste, um Glukose-Oxydase mit der Polypropylen-Matritze zu kombinieren. Die Membran, die mit dem Enzym kombiniert war und

2
eine Aktivität von 0,1 IU/cm der Ausgangsmembran hatte, wurde verwendet, um eine ähnliche der im Beispiel 1 verwendeten Enzym-Elektrode herzustellen. Entsprechend einem Verfahren, das im Beispiel 1 beschrieben ist, wurde die Glukose-Konzentration in der Testlösung unter Verwendung der Elektrode bei 37°C und einem pH von 7,4 bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

	(/UA)	10	Glukose-Konzentration (mg/dl)	20	30	40	50 60	70	80
		0.063	0.125	0.180	0.242	0.302 0.362	0.415	0.463
CD

Bemerkung: CD - Strom-Differenz.

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Beispiel 6

Eine ähnliche poröse Membran vom Polyacrylnitril-Typ

- wie die im Beispiel 1 verwendete - mit Ausnahme einer Stärke von 100 ,u, einem Raum-Verhältnis von 58 % und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 120 8 - wurde einer ähnlichen Behandlung mit Hydrazin und Glutaraldehyd wie im Beispiel 1 angewendet - unterworfen zwecks Einführung der Aldehydgruppe in die Membran. Die Membran wurde 16 Std.

lang bei 5°C in 0,2 ml einer gemischten Enzymlösung pro

1 cm der Ausgangsmembran eingelegt, um die Enzyme festzulegen. Diese Enzymlösung enthielt 50 mg/ml Cholesterin-Esterase (spezifische Aktivität - 2 IU/mg) und 10 mg/ml Cholesterin-Oxydase (spezifische Aktivität - 10 Iü/mg)

- beide Enzyme sind kommerziell erhältlich bei Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan - und sie wurde hergestellt, indem man diese Enzyme in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) löste. Die Membran wurde verwendet, indem man eine ähnliche Enzym-Elektrode - wie die im Beispiel 1 beschriebene - herstellte. Entsprechend einem ähnlichen Verfahren

- wie im Beispiel 1 beschrieben - wurden bei 37°C und einem pH von 7,4 unter Verwendung der Elektrode Cholesterin-Konzentrationen (freie und in Esterformen) in der Testlösung bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 6-1 und 6-2 gezeigt. Cholesterin-Linolat wurde als eine der Esterformen verwendet, und als Substratlösung wurde eine

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Lösung, die 5 % Äthanol und 1 % Triton-X-100 (ein Netzmittel, kommerziell erhältlich bei Nakarai Kagaku Yakuhin K.K., Japan) verwendet.

Tabelle 6-1

(Esterform)

Cholesterin-Konzentration (mg/dl)	Strom-Differenz (/UA)
20 40 60 80	0.004 0.008 0.013 0.017

Tabelle 6-2 (freie Form)

Cholesterin-Konzentration (mg/dl)	Strom-Di fferenz (/UA)
20 40 60 80	0.010 0.020 0.031 0.034

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Beispiel 7

Eine ähnliche Enzym-Elektrode -wie die im,Beispiel 6 verwendete - wurde verwendet, um Blutzucker zu bestimmen und wurde mit einer anderen analytischen Methode (Somogi-Nelson's Methode) zur Bestimmung der Glukose-Konzentration verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Probe	Somogi-Nelson's Methode	vorliegendes Verfahren
1 2	81 mg/dl 155 mg/dl	82.7 mg/dl 152 mg/dl

Beispiel 8

Eine Membran vom Polyacrylnitril-Typ, welche der im Beispiel 1 verwendeten ähnlich war, wurde 16 Std. bei 5°C

in 0,2 ml einer Enzymlösung, die 25 mg d-Aminosäure-Oxydase

2
pro 1 cm der Ausgangsmembran enthielt, getaucht. Die Enzymlösung wurde bereitet, indem man das Enzym (spezifische Aktivität - 15 IU/mg; Handelsprodukt der Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) in einer 0_rl molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 8) löste. Die Membran wurde dann leicht

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gewaschen mit einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 8) und in eine 0,1 molare Phosphat-Pufferlösung, die 10 % Glutaraldehyd enthielt 20 Min. lang gelegt, und man erhielt eine Enzym-Membran. Die d-Alanin-Konzentration in der Testlösung wurde quantitativ bestimmt, indem man auf ähnliche Weise die im Beispiel 1 verwendete Enzym-Membran anwendetet Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.

Tabelle 8

Konzentration an d-Alanin (mg/dl) 1.25 2.50 3.75 5.00

Strom-Differenz

(,uA) 0.041 0.084 0.123 0.159

Beispiel 9

Eine Membran vom Polyacrylnitril-Typ - eine ähnliche wie im Beispiel 1 verwendete - wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben - behandelt, um die Aldehydgruppe einzuführen, und dann wurde sie 16 Std. lang bei 5 C in 0,2 ml einer Enzymlösung pro 1 cm der Ausgangsmembran gelegt, um eine Enzym-Membran zu ergeben. Die Enzymlösung wurde hergestellt, indem man Uricase (spezifische Aktivität (Candida utilis) - 2,5 IU/mg; kommerzielles

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Produkt der Sigma Corp., USA) in einer 0,1 molaren Borat-Pufferlösung (pH 9,0) löste, sie enthielt 10 mg/ml des Enzyms. Die erhaltene Enzym-Membran wurde verwendet, um die Harnsäure in der Testlösung auf die gleiche im Beispiel 1 beschriebene Weise zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.

Tabelle 9

Konzentration von Harnsäure (mg/dl) 2.5 5.0 10.0 15.0

Strom-Differenz (,uA) 0.102 0.200 0.385 0.540

Beispiel 10

Eine Membran vom Polyacrylnitril-Typ - eine ähnliche wie im Beispiel 1 verwendete - wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben - behandelt, um die Aldehydgruppe einzuführen, und dann wurde sie 16 Std. lang bei 5 C in 0,2 ml einer Enzymlösung (pro 1 cm der Ausgangsmembran) , die 2 mg/ml Asparaginase enthielt, gelegt, um eine Enzym-Membran zu ergeben. Die Enzymlösung wurde hergestellt, indem man das Enzym (spezifische Aktivität - 110 IU/mg; Handelsprodukt der Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan)

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in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 7) löste. Die Enzym-Membran wurde auf die Spitze einer Ammonium-Elektrode (Typ 7161, Handelsprodukt von Denki Kagaku. Keiki K.K., Japan) gesetzt. Die Konzentration von 1-Asparagin wurde durch Verwendung der Elektrode bestimmt. Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse. Bei der Bestimmung wurde eine 0,1 molare Phosphat-Pufferlösung verwendet (pH 8,5). Der Logarithmus der Ammonium-Konzentration ist proportional der Spannung.

Tabelle 10

Konzentration ml-Asparagin (Mol/l)

5 χ 10~⁴ 10"³ 5 χ 10~³ 10"²

Spannungs-Differenz (mV) 17 25 43 51

Beispiel 11

Eine Membran vom Polyacrylnitril-Typ - eine ähnliche wie im Beispiel 1 verwendete - wurde auf die gleiche Weise - wie im Beispiel 1 beschrieben - behandelt, um die Aldehydgruppe einzuführen, und dann wurde sie 16 Std. lang bei 5°C in 0,2 ml einer Enzymlösung, die Urease enthielt (Io mg/ml) getaucht, um eine Enzym-Membran zu ergeben. Die

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Enzymlösung wurde hergestellt, indem man das Enzym (spezifische Aktivität - 700 IU/mg; Handelsprodukt der Sigma Corp., USA) in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 7) löste. Die Enzym-Membran wurde auf die gleiche im Beispiel 10 beschriebene Weise verwendet, um quantitativ die Harnstoff-Konzentration in der Testlösung zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.

Tabelle 11

Konzentration an Harnstoff (Mol/l) 5 x 10"⁴ 10~³ 5 χ 10"³ 10"² 5xlO~²

Spannungs-Differenz (mV) 10 22 48 59

Beispiel 12

Eine ähnliche - wie im Beispiel 1 verwendete - Membran vom Polyacrylnitril-Typ wurde einer gleichen Behandlung mit Hydrazin und Glutaraldehyd - wie im Beispiel 1 angewendet - unterworfen, um die Aldehydgruppe in die Membran

einzuführen. Die Membran wurde 16 Std. lang bei 5°C in

0,2 ml einer Enzymlösung pro 1 cm der Ausgangsmembran getaucht, um das Enzym festzulegen. Die Enzymlösung enthielt 50 mg/ml Laktase-Y (ein Handelprodukt der Kyowa Hakko Kogyo K.K., Japan ; spezifische Aktivität - 26 IU/ml).

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Sie wurde hergestellt, indem man das Enzym in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 7) löste. Die mit dem Enzym kombinierte Membran hatte eine enzymatische Aktivität von 2,8 IU/cm der Ausgangsmembran. Es wurde eine Diaflo-Zelle (Typ 402) (eine Apparatur für Ultra-Filtration, kommerziell erhältlich von der Amicon Corp., USA), die mit dieser Membran ausgerüstet war, verwendet, um ca. 200 ml einer 8%igen Käsemolke zu behandeln, und zwar unter Druck

2
mit einem Stickstoffgas (3 kg/cm der Membran), wobei sich ein Filtrat (20 ml/Std.) ergab. Durch Konzentrieren des Filtrats unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit wurde das gewünschte Produkt erhalten, dessen Gehalt in Tabelle 12 gezeigt wird.

Tabelle 12

Käsemolke Produkt

Laktose 64.2 % 12 %

Glukose 0 31 %

Galaktose 0 30 %

Protein 6.7% 0

Beispiel 13

Eine poröse Polypropylen-Membran (Stärke - 30 ,u; Raum-

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Verhältnis - 38 %; durchschnittlicher Poren-Durchmesser 1500 8 in der größeren Achse und 400 8 in der kleineren Achse), die auf dieselbe Weise - wie in der USA-Patentschrift 3 679 538 beschrieben- hergestellt war, wurde verwendet. Ein gleiches Verfahren - wie im Beispiel 5 beschrieben - wurde ausgeführt, jedoch unter Verwendung einer Enzym-Membran (enzymatische Aktivität - 0,15 IU/cm der Ausgangsmembran), die durch Verwendung von 60 mg/ml Glukose-Oxydase-Lösung hergestellt war. Die Glukose-Konzentration in der Testlösung wurde bei 37°C und einem pH von 7,4 bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.

Tabelle 13

Glukose-Konzentration ( ,ug/ml) 10 20 30 40 50 60 70 80

A-O.061 0.120 0.178 0.238 0.290 0.350 0.400 0.445

Beispiel 14

Die pH-Beständigkeit, Wärmebeständigkeit und Haltbarkeit einer Membran, die entsprechend dem Beispiel 1 hergestellt ist, wurde mit einer Membran verglichen, die in ein Acrylamid-Gel eingeschlossen war und freies Enzym enthielt, und ergab die in den Tabellen 14, 15 und 16 gezeigten Ergebnisse.

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Eine Membran, die in ein Acrylamid-Gel eingeschlossen ist, wurde wie folgt hergestellt.

95 mg Acrylamid, 5 mg N-N-Methylenbisacrylamid und 50 mg Glukose-Oxydase (ein ähnliches Produkt, wie das im Beispiel 1 verwendete) wurden in 0,8 ml 0,1 η Phosphat-Pufferlösung gelöst. 5 mg Ν,Ν,Ν¹,N¹-Tetramethyläthylendiamxn und 1 mg Ammoniumpersulfat wurden in 0,2 ml 0,1 η Phosphat-Pufferlösung gelöst. Sofort danach wurden die zwei Lösungen

vermischt, und ein Nylonnetz (50 cm ) wurde mit der kombinierten Lösung überzogen. Man ließ das beschichtete Nylonnetz bei Zimmertemperatur in STickstoff-Atmosphäre stehen, bis die in Acrylamid-Gel eingeschlossene Membran erhalten wurde.

Tabelle 14

pH-Stabilität

Probe pH

5.6

6.5

7.5

A	90	92	91	88	80	78	85
B	90	90	90	80	64	52	40
C	91	91	90	75	54	45	5

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Bemerkung: A - Membran gemäß Beispiel 1 B - Membran, eingeschlossen in Acrylamid-Gel C - freies Enzym

Die in Tabelle 14 gezeigten Ergebnisse kennzeichnen die enzymatischen Aktivitäten der Proben, bestimmt an den angezeigten pH-Werten (Anfangs-Aktivität - 100). Die Haltbarmachung wurde 1 Std. lang bei 60⁰C durchgeführt.

Tabelle 15

100	100	98	92	72
100	100	95	90	48
100	100	92	91	13

Probe Temperatur 30⁰C 40°C 50°C 60°C 70⁰C

Die in Tabelle 15 gezeigten Ergebnisse kennzeichnen die enzymatischen Aktivitäten der Proben, welche in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung gelöst waren und welche bei den angezeigten Temperaturen für eine Stunde (Anfangs-Aktivität - 100) haltbar gemacht wurden.

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Tabelle 16

Haltb armachung

Probe 1 Woche

Haltbarkeits-Periode 2 Wochen " 3 Wochen

4 Wochen 5 Wochen

A	92	91	90	90	90
B	85	75	70	65	63
C	69	50	42	25	12

Bemerkung: A - Membran Gemäß Beispiel 1

B - Membran, eingeschlossen in Acrylamid-Gel C - freies Enzym

Die in Tabelle 16 gezeigten Ergebnisse kennzeichnen die enzymatisehen Aktivitäten der Probe, welche in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 5,6) gelöst waren, während sie bei 30°C aufbewahrt wurden.

Wie aus den Tabellen 14 - 16 zu ersehen - sind die pH-Stabilität, die Hitze-Beständigkeit und die Haltbarkeit der Membrane, die mit dem festgelegten Enzym gemäß dem Verfahren der Erfindung eine Bindung eingegangen sind, sowohl denen der festgelegten Enzyme der bekannten Typen als auch

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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte j&Jfs&k _o

der freien Enzyme überlegen. Die festgelegten Enzyme der Erfindung stellen ohne Zweifel einen Vorteil in der Technik dar und sehen eine ausgezeichnete Enzym-Elektrode vor.

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Claims

Andreiewslei, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen

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Patentans prüche:

1y Enzym-Membran, verwendet als chemischer oder elektrochemischer Umwandler (transducer), wobei die Enzym-Membran permeabel ist und aus einem organischen hochmolekularen Polymerisat besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mikroporös ist.
2. Enzym-Membran gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren auf der ganzen Oberfläche ihres Äußeren verteilt sind.
3. Enzym-Membran gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der durchschnittliche Durchmesser der Poren zwischen 10 und 10 000 S liegt.
4. Enzym-Membran gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die plastische Membran vom Offen-Zell-Typ ist.
5. Doppel-Membran, einschließend eine Enzym-Membran gemäß Anspruch 1 als eine obere Membran.
6. Enzym-Elektrode, einschließend eine Enzym-Membran gemäß Anspruch 1.

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