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DE3529094A1 - An polyamide oder cellulosehydrat immobilisierte proteine und deren verwendung zur herstellung von biokatalysatoren, teststreifen oder chromatographiematerialien - Google Patents

An polyamide oder cellulosehydrat immobilisierte proteine und deren verwendung zur herstellung von biokatalysatoren, teststreifen oder chromatographiematerialien

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Publication number
DE3529094A1
DE3529094A1 DE19853529094 DE3529094A DE3529094A1 DE 3529094 A1 DE3529094 A1 DE 3529094A1 DE 19853529094 DE19853529094 DE 19853529094 DE 3529094 A DE3529094 A DE 3529094A DE 3529094 A1 DE3529094 A1 DE 3529094A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
carrier
bound proteins
solution
groups
proteins according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19853529094
Other languages
English (en)
Inventor
Peter 5090 Leverkusen Doppelfeld
Gary Dr. 5090 Leverkusen Oosta
Alexander Dipl.-Chem. Dr. Riebel
Karl Dipl.-Chem. Dr. 5068 Odenthal Schranz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Corp
Original Assignee
Miles Laboratories Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Miles Laboratories Inc filed Critical Miles Laboratories Inc
Priority to DE19853529094 priority Critical patent/DE3529094A1/de
Priority to US06/832,230 priority patent/US4808529A/en
Priority to CA000503291A priority patent/CA1283071C/en
Priority to AU54262/86A priority patent/AU586666B2/en
Priority to AT86102929T priority patent/ATE83248T1/de
Priority to EP86102929A priority patent/EP0194578B1/de
Priority to DE8686102929T priority patent/DE3687236T2/de
Publication of DE3529094A1 publication Critical patent/DE3529094A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Description

BAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, Bayerwerk Konzernverwaltung RP
Patentabteilung Bu/by-c
An Polyamide oder Cellulosehydrat immobilisierte Proteine und deren Verwendung zur Herstellung von Biokatalysa-
torerii Teststreifen oder Chromatoqraphiemater ial ien
Die Erfindung betrifft an Polyamide bzw. Cellulosehydrat gebundene Proteine sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser trägergebundenen Proteine. Die trägergebundenen
Proteine können z.B. zur Herstellung von Biokatalysatoren, Chromatographiematerialien oder Teststreifen verwendet werden. Für die Herstellung von Teststreifen sind die Träger in Form von Folien oder Membranen besonders
gut geeignet,
25
Bekanntlich werden Teststreifen vielfach benutzt, um auf einfache und schnelle Weise halbquantitativ oder quantitativ bestimmte Verbindungen wie z.B. Glucose, Eiweiß, Bilirubin, Urobilinogen, Nitrit, Ketonkorper usw. in
Flüssigkeiten nachzuweisen. Die Flüssigkeiten sind im allgemeinen biologische Flüssigkeiten wie z.B. Urin, Blut, Serum, Plasma oder Liquor, aber auch Getränke oder Abwässer,
Trägermaterialien die für die Herstellung von Teststreifen Verwendung finden sind eine Vielzahl bekannt.
Le A 24 003
-Jt -
^ So werden z.B. Enzyme und andere Reagenzien durch Tranken in saugfähiges Papier eingebracht oder es werden quellfähige, natürliche oder speziell hergestellte Polymere oder Latices verwendet wobei mitunter aufwendige, mehrschichtige Aufbauten zur Anwendung kommen um die empfindlichen Enzyme vor schädlichen Einflüssen anderer in den Schichten enthaltenen Chemikalien zu schützen.
Als Aufnahmematerialien für die Enzyme sind auch feinporige Membranen aus verschiedenen Polymeren wie z.B. Polyethylen, Polyvinylchlorid oder anderen hochmolekularen Verbindungen bzw. Mischungen derselben beschrieben, die entweder selbst porös sind, oder aber durch Zusatz von Füllmaterialien wie Gips, Kieselgur, Silicagel
oder ähnlichem "offenporig" hergestellt werden. 20
In manchen Anwendungsbeispielen wird zusätzlich eine sogenannte Verteilschicht beschrieben, die eine möglichst gleichmäBige Verteilung der Testflüssigkeit auf der Reaktionsfläche bewirken soll. Diese Verteil-
schichten bestehen gewöhnlich aus vorgefertigten Glasoder Polymerteilchen bestimmter Größe, die dann mit Hilfe eines Binders oberflächlich verklebt werden. Dadurch entstehen die erforderlichen Hohlräume zur Aufnahme und Verteilung der Testflüssigkeit. Anstelle
der aus Teilchen bestehenden Vertei1 schichten sind auch solche beschrieben die aus unlöslichen Fasern oder Vliesen bestehen und damit denselben Zweck erfüllen.
Schließlich sind in der Eruopäischen Patentanmeldunq Nr. 35
83 30 05 17.6 spezielle Membranen aus Polyamid
Le A 24 003
(Nylon 66) beschrieben, die hydrophyliert und oberflächlich funktioneile Gruppen, wie zum Beispiel Carboxylgruppen oder Aminogruppen tragen.
Dort wird auch die Verwendung dieser Membranen zur Immobilisierung von Enzymen nach vorheriger chemischer Modifikation beschrieben. Die eine Modifikation ist die Bindung von Cibachrom Blueu an die Membran. Dieser Farbstoff ist, wie aus der Literatur bekannt, in der Lage hochspezifisch NAD-abhängige Enzyme zu binden. Daß die Bindung nur über den Farbstoff erfolgt, wird in Beispiel 5 dieser Anmeldung mit Lactatdehydrogenase demonstriert .
Das zweite in dieser Anmeldung genannte Verfahren ist
die kovalente Bindung von alkalischer Phosphatase mit Glutaraldehyd an die Membran.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Polyamide und auch Cellulosehydrat ohne vorherige chemische Modi-
. .
fikation in der Lage sind, Proteine zu binden. Die Bindung erfolgt direkt an dem Träger. Bevorzugt sind hydrophile Träger, da diese leichter benetzen und damit das Aufbringen der Proteine erleichtert wird. Poröse Träger besitzen eine größere Oberfläche und erleichtern die
Diffusion beispielsweise von Substraten, sie sind daher bevorzugt.
Bei den für die erfindungsgemäßen Träger verwendeten Ausgangspolymeren handelt es sich um alkoholunlösliche
Polyamide, die ein Verhältnis C^sNHCO-Gruppen im
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Bereich von 5:1 bis 7',ί besitzen. Bevorzugt sind Polyhexamethylensebazinsäureamid <Nylon 610), Poly-E-caprolactam (Nylon 6) und Polyhexamethylenadipinsäureamid (Nylon 66) mit einem MW von >30 000.
Die Hydrophylierung sowie die Einführung funktioneller *^ Gruppen erfolgt durch Koagulation einer gemischten Losung des Polyamids und das die funktioneilen Gruppen enthaltenden Polymers (MW >10 000) in Ameisensaure, wobei zunächst durch kontrollierte Zugabe eines Nichtlösungsmittels (z.B. Wasser) Keime gebildet werden. Die endgültige Fallung erfolgt dann nach dem Aufbringen der Losung auf ein Substrat durch Eintauchen desselben in ein Fällbad bestehend aus definierten Mengen Losungsund Nicht lösungsmittel, Die so hergestellte Membran wird
mit Wasser gewaschen und getrocknet, 20
Funktionelle Gruppen wie z.B. Carboxylgruppen, Aminogruppen, SuIfonsäuregruppen, Iminogruppen, Thiogruppen, Hydroxylgruppen, Pyridylgruppen, Phosphorylgruppen oder deren Derivate können die Bindung der Proteine beein-
flüssen. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit der selektiven Bindung von bestimmten Proteinen. Die funktioneilen Gruppen können auch in "aktivierter" Form vorliegen. Unter "aktivierten" Gruppen werden im chemischen Sinne solche verstanden, die durch Einführung eines Substituenten wie z.B. Halogen-, Phenyl-, Carboxyl-, Sulfonyl- "aktiviert" werden, d.h., die Substituenten wirken positivierend auf das Molekül, was sich in einer erhöhten Aciditat des in α-Stellung zum Zentralatom befindlichen Methylen- oder Carboxyl-H-Atoms
auswirkt. Die Einführung von α-ständigen Substituenten
Le A 24 003
-JS-
kann nach in der organischen Chemie bekannten Methoden geschehen.
Es wurde auch gefunden» daß die "Aktivierung" der funktioneilen Gruppen einen Einfluß auf die Bindungseigenschaften der Träger und insbesondere auf die Selektivität der Bindung hat. Für die Herstellung von Testreifen werden die Träger bevorzugt in Form von Folien oder Membranen eingesetzt. Die an dem Träger immobilisierten Proteine sind normalerweise biologisch aktive Proteine wie z.B. Enzyme, Rezeptoren, Antigene oder Antikörper. Die Proteine werden bevorzugt in Form von Lösungen auf den Träger aufgebracht. Besonders bevorzugt sind Tränkverfahren wie z.B. Eintauchen des Trägers in die Proteinlösung oder Beschichten der Träger mit der
Proteinlösung. Die Beschichtung ist für die maschinelle Verarbeitung von Trägern in Form von Folien oder Membranen besonders gut geeignet. Die Proteine binden fest an den Träger und können durch Waschen nicht mehr entfernt werden. Die feste Bindung der Proteine ermöglicht
es Mehrfachbeschichtungen durchzuführen, ohne daß auf dem Träger befindliche Proteine ausgewaschen werden. Außerdem bietet die feste Bindung der Proteine an den Träger die Möglichkeit diese als Biokatalysatoren einzusetzen. Es sind auch mehrschichtige Aufbauten möglich,
insbesondere für Teststreifen. Wie aus den Beispielen hervorgeht ist die Herstellung von Teststreifen möglich bei denen in den verschiedenen Schichten unterschiedliche an die jeweilige Reaktion angepaßte Bedingungen herrschen. Auf diese Weise ist es daher möglich für die
in der US-Patentschrift Nr. 4 231 754 beschriebene Bestimmung von Glukose mit Hilfe von Luminol einen Test-
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streifen herzustellen, ohne daß komplizierte und aufwendige Mehrschichtsysteme mit Trennschichten und/oder Schicht-pH-Wert verändernden Substanzen erforderlich sind.
Ein wesentlicher Vorteil der Träger insbesondere als Folien oder Membranen für die Herstellung von Teststreifen ist Reißfestigkeit« Außerdem quellen die Trager kaum und zeigen eine weitestgehend homogene Oberfläche, wodurch die Auswertung insbesondere mit Reflektionsphotometern erleichtert wird«
Le A 24
Beispiele
Die Beispiele 1 bis 4 zeigen die-Bindung von Enzymen an die Trager. Dabei wurden jeweils 5 χ 5 cm große Membranstücke (siehe Tablle 1) für 30 Minuten in eine Enzymlösung eingetaucht und damit getränkt. Anschließend wurden die Membranen 3 mal in 500 ml Wasser jeweils für 20 Minuten gewaschen um ungebundenes Enzym zu entfernen. Der Nachweis der gebundenen Enzyme erfolgte über deren katalytische Aktivität. Dazu wurden Prüflosungen mit den für den Aktivitätsnachweis notwendigen Reagenzien hergestellt und 1 χ 1 cm große Stücke der enzymbeladenen Membranen darin inkubiert. Nach 30 Minuten wurde die Extinktion der Prüflosungen in einem Spektralphotometer
(Beckmann DU-6®) gemessen.
Zur Kontrolle wurden jeweils unbehandelte Membranen mitgeführt und die Extinktionen der entsprechenden Prüflösungen als Leerwert berücksichtigt.
Die Beispiele 5 bis 9 beschreiben die Herstellung von Teststreifen,
Le A 24 003
Tabelle 1
Nr. Membran
1) Polyurethanmembran hergestellt durch Gießen einer Lösung aus 13,3 g Polyurethan mit 66,37 Dimethylformamid (DMF) unter Zusatz von 7,24 g kationischer Polyurethandispersion in DMF/Wasser und 0,07 g Natriumlaurylsulfat und 11,01 g Titandioxid auf eine Polyesterfolie und anschließender Koagulation
2) poröse Polyestermembren (Nuclepore®)
3) Wie Membran 1 ohne Zusatz der kationischen Polyurethandispersion aber mit Zusatz von 0,05 g ethoxy-
liertem Nonylphenol
4 Wie Membran 1 unter Zusatz von 0,05 g ethoxyliertem Nonylphenol
5) Polyamid 66 mit oberflächenständigen aktivierten Carboxylgruppen
6> Membran aus Cellulosehydrat (CUPROPHAN® der Fa.
ENKA)
30
7) Polyamid 66 ohne funktioneile Gruppen
8) isotrop geschäumtes Polyamid 66 mit oberflächenständigen Carboxyl- und Aminogruppen. Porengröße 0,5 um
9) Wie Membran 8 jedoch Porengröße 0,2 um Le A 24 003
t *. * * f ■
44
Beispiel 1
Enzymlösung: 5 mg Peroxidase (47 U/mg Miles USA) in 20 ml Wasser.
Prüflösung:
2,2 ml H2O2 (13 %ig) 6,2 mg 4-Amino-antipyrin
115,0 mg Dichlorbenzolsulfonsaure-Natriumsalz 90 ml Wasser
10 ml Phosphatpuffer (0,5 Mol/l, pH 7,0)
Eraebni sse Extinktion bei 505 nm
Membran + 0,063
1 + 0,088
2 + 0,117
3 + 0,048
4 + 0,728
25 5 + 0,140
6 + 0,043
7 + 0,025
8 + 0,032
9
Le A 24 003
: 4 9· Γ
Beispiel 2
Enzymlosung: 5 mg Glucoseoxidase (250 U/mg» Boehringer Mannheim) in 20 ml Wasser
Prüflosung:
540 mg Glucose 10 mg Peroxidase (47 Iü/mg) 6,2 mg 4-Amino-antipyrin 115,2 mg Dichlorbenzolsulfonsäure-Natriumsalz 90 ml Wasser
10 ml Phosphatpuffer (C,5 Mol/l, pH 7,0)
Ergebnisse
20
Membran Extinktion bei 505 nm
1 + 0,013
2 - 0,071
3 - 0,016 4 - 0,084
5 + 0,18
6 + 0,221
7 + 0,063
8 + 0,594 9 + 0,574
Le A 24 003
ti
Beispiel
Für die weiteren Versuche wurde eine Auswahl der obengenannten Membranen verwendet.
Enzymlösung: 5 mg Diaphorase (53 U/mg« Boehringer Mannheim) in 20 ml Wasser
Prüf lösung:
0,05 g 2-p-Jodphenyl-S-p-nitrophenyl-ö-phenyl-tetrazoliumchlorid χ H2O (INT) wurden unter Erhitzen in 5 g 20 ttiger wäßriger Polyvinylpyrrolidonlösung (PVP) gelöst. 0,05 g NAD+
0,01 g Glucosedehydrogenase (61,5 IU/mg; Hersteller Biocentrics) 180 mg Glucose 60 ml Wasser
20 ml HEPE's Puffer (0,1 Mol/l, pH 7,2) 25
Erqebni sse Ext inktion bei 500 nm
Membran + O ,195
9 + O ,333
5 + O ,32
6
Le A 24
Beispiel 4
Enzymlösung: Glucosedehydrogenase (61,5 U/mg) in 20 ml Wasser
Prüflösung:
0,05 g INT unter Erhitzen in 5,0 g 20 %iger PVP-Lösung gelöst
180 mg Glucose 0,05 g NAD+
0,01 g Diaphorase (53 U/mg) 60 ml Wasser 20 ml HEPE's Puffer (0,1 Mol/l; pH 7,2)
T^ ^ ·
Ergebnisse Membran Extinktion bei 500 nm
9 + 0,23
5 +0,061
6 + 0,163
Die Beispiele 1 bis 4 zeigen, daß Trager aus Polyamid oder Cellulosehydrat gut geeignet sind Proteine direkt zu binden. Membranen mit unterschiedlichen Oberflacheneigenschaften zeigen dabei eine gewisse Selektivität bei der Bindung der Enzyme.
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Beispiel 5
Die Beispiele 5 und 6 zeigen mit bekannten Methoden hergestellte mehrschichtige Glucosestreifen. Sie dienen als
Beweis dafür, daß man dabei ungenügende Produkte erhalt, 10
Mit Hilfe einer geeigneten Gieß- und Trocknungseinrichtung wie sie zur Herstellung fotografischer Ein- und Mehrschichtmaterialien verwendet wird, wurde auf
einen Träger aus Polyesterfolie folgende Gießlösung
aufgetragen:
0,25 g Luminol (Hersteller Merck) werden mit 0,1 M Xthylendiamintetraessigsäure-Tetranatriumsalz (Trilon B'-")
in 25 ml Wasser gelöst
125 g 20 */.iges Gelatinegel
350 ml Wasser
wurden bei 40"C geschmolzen und die entstandene Lösung
mit der entsprechenden Menge (ca. 20 ml) 50 iiiger
Trilon B®-Lösung auf einen pH-Wert von 9,7 gebracht. Der Naßauftrag betrug 170 pm was einer Gelatinemenge von ca, 7,0 g/m3 und einer Luminolmenge von ca. 0,07 g/m3 entspri cht.
Nach dem Trocknen wurde darüber eine zweite Schicht auf-
gebracht, die aus folgender Gießlösung gegossen wurde:
0,3 g Dodecylbenzolsulfonat (DBS)-Paste (75 %ig) wurden in 3 ml Chloroform und 2 ml 7,5 Jiiger chloroformhaltiger Polycarbonatlösung (Makroion) gelöst
0,123 g Glucoseoxidase (250 IU/mg) und
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* 0,616 g Peroxidase (47 U/mg) werden in 3,6 ml Wasser gelost und unter kraftigem Schütteln in der oben hergestellten Losung dispergiert. 23 ml 13,2 %ige Dispersion einer wäßrigen Polyacrylamidlösung in Chloroform wurden mit 27 ml einer 7,5 %igen Makrolonlosung in Chloroform vereinigt und mit der enzymhaltigen Dispersion vermischt.
Diese Losung wurde mit 70 um auf die luminolhaltige Gelatineschicht aufgebracht und bei Raumtemperatur getrocknet. Bringt man auf den fertigen Schichtaufbau eine Probe von 30 Mikrolitern einer Losung von 250 mg Glucose in 100 ml Wasser, so tritt nach der bekannten Reaktion eine Chemolumineszenz auf.
Nach einer Lagerzeit des Schichtaufbaus von etwa 14 Tagen
bei Raumtemperatur ist die Glucoseoxidase soweit zerstört daß die Chemolumineszenz nur noch dann auftritt, wenn vor der Zugabe der Glucoselosung eine kleine Menge Glucoseoxidaselösung auf den Teststreifen aufgebracht
wird.
25
In diesem Testsystem ist die Glucoseoxidase in der zweiten Schicht nicht fest gebunden«
Außerdem findet die zur Chemolumineszenz führende Reak-
tion aber nur dann statt, wenn die aufgebrachten Proben mit Hilfe von Filterpapier oder einem ähnlichen saugfähigen Material verteilt werden.
Beispiel 6
35
Es wurde wie in Beispiel 5 verfahren jedoch wurde als zweite enzymhaltige Schicht folgende Gießlosung verwendet:
Le A 24 003
** 125 g eines 20 %igen Gelatinegels wurden mit 100 ml Wasser bei 40°C geschmolzen,
12,5 ml einer wäßrigen Glucoseoxidaselösung (1000 IU/ml) und eine Lösung aus 1,2 g Peroxidase in 10 ml Wasser wurden der obigen Gelatinelösung zugefügt und mit 1,5 ml 4 iiiger Netzmittel lösung versetzt.
Die Lösung wurde mit einem Naßauftrag von 70 Mm auf die trockene luminolhaltige Gelatineschicht aufgetragen und bei 20-25eC getrocknet.
Bei diesem Versuch konnte durch Befeuchten mit Glucoselösung keinerlei Chemolumineszenz beobachtet werden.
Hier findet die Inaktivierung der Glucoseoxidase sofort statt. Die in Beispiel 5 und 6 beschriebenen Verfahren
sind also zur Herstellung von solchen Teststreifen ungeeignet .
Die Beispiele 7 bis 9 zeigen die Eignung der erfindungs-
gemaßen Träger für die Herstellung von Teststreifen. 25
Beispiel 7
4,5 Meter einer 16 cm breiten Bahn aus der Membran 9 wurden mit 70 um der folgenden Lösung begossen und bei Raumtemperatur getrocknet:
0,61 g Luminol wurden mit 11,3 ml einer 50 %igen Trilon B^-Lösung gelöst, in 242 ml Wasser gegeben und dann mit einer Lösung von 2,347 g Glucoseoxidase sowie
1,246 g Peroxidase in 23,5 ml Wasser versetzt. Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit Trilon Bw- Lösung (50 ·/,) auf pH 9.7 eingestellt.
Le A 24 003
* Beim Aufbringen von 10-20 Mikrolitern einer Losung aus Glucose in Wasser wurde eine deutliche Chemolumineszenz beobachtet, die mit Hilfe eines entsprechend empfindlichen Lichtmeßgeräts gemessen werden konnte.
Anstelle der Glucoselösung wurden auch glucosehaltige Blutproben auf die präparierte Membran aufgebracht, wobei ebenfalls Chemolumineszenz auftrat, allerdings von geringerer Intensität«
Beispiel 8
Ein Bahnstück wie in Beispiel 7 beschrieben wurde mit zwei Losungen beschichtet und zwar zuerst mit 70 um der
folgenden Lösung:
20
2,347 g Glucoseoxidase und
1,246 g Peroxidase wurden in
296,4 ml Wasser gelost.
Nach dem Trocknen bei Raumtemperatur wurde eine Zweitbeschichtung mit ebenfalls 70 Mm der folgenden Lösung vorgenommen:
0,61 g Luminol wurden mit 11,3 ml 50 Xiger Trilon B®-Lö-
sung und 20,6 ml Wasser gelöst und einer Lösung aus 150 g eines 20 Kigen Gelatinegels in 117,5 ml Wasser
IrI zugegeben. Der pH-Wert dieser Losung wurde mit Trilon Bu-
Lösung auf pH 9,7 eingestellt.
35
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Mach dem Trocknen wurde die so präparierte Membran mit Glucoselösung oder glucosehaltigem Blut wie in Beispiel 7 beschrieben behandelt und die entstandene Chemolumineszenz gemessen. Sowohl mit Glucoselösung als auch mit glucosehaltigem Blut trat eine im Vergleich zu Bei- *^ spiel 7 sehr viel stärkere Chemolumineszenz auf, die ebenso wie im Falle von Beispiel 7 auch nach mehreren Monaten Lagerung der Membran bei Raumtemperatur kaum an Intensität verloren hatte»
Beispiel 9
Es wurden jeweils 3 ml der in Beispiel 7 verwendeten Gießlosung mit Hilfe eines Rakels auf ca« 20 cm lange Stücke von Membran 9 aufgebracht« Hierbei wurde in ge-
trennten Versuchen die Peroxidasemenge sowohl auf das 1 1/2-fache erhöht, als auch auf 3/4, 1/2 und 1/4 der in Beispiel 7 verwendeten Menge erniedrigt.
Bei der Auswertung der mit Glucoselösung entstandenen
Chemolumineszenz zeigte sich, daß sowohl bei höherer als auch bei niedrigerer Menge Peroxidase als der in Beispiel 7 verwendeten die Intensität der Chemolumineszenz stark abfiel.
In gleicher Weise wurde auch die Glucoseoxidasemenge variiert. Im Gegensatz zur Peroxidase wurde bei Glucoseoxidase im Rahmen des angewendeten Mengenbereichs eine direkte Relation der Enzymmenge mit der Intensität der
Chemolumineszenz beobachtet,
35
Le A 24 003
Beispiel 10
Um einen Hinweis auf die Art und Festigkeit der Bindung an den Träger zu bekommen wurde das nun folgende
Experiment durchgeführt,
10
5 χ 5 cm große Membranstücke (Membran Nr. 9) werden in eine Losung aus 5 mg Glukoseoxydase und 20 ml Wasser für 30 Minuten eingetaucht und damit getränkt. Anschließend werden die Membranstücke 3 mal in je 500 ml Wasser für 20 Minuten gewaschen um überschüssiges Enzym zu entfernen,
Anschließend werden jeweils 1 χ 1 cm große Stücke dieser beladenen Menbran für 15 Minuten in 10 ml Kochsalzlosung
mit jeweils unterschiedlicher Konzentration <0,lM, 0,25M, 0,5M, l,0M und 3,0M) gewaschen.
Zum Machweis der Aktivitäten wurde die in Beispiel 2 beschriebene Prüf lösung verwendet, wobei nach Entfernen
der Membranstücke sowohl die Kochsalz-Lösung als auch die Membranstücke selbst geprüft wurden.
Die Auswertung ergab, daß in den verschiedenen Kochsalzlösungen keinerlei Enzymaktivitäten nachgewiesen werden
konnten, während die in den zugehörigen Membranstücken beobachtbaren Farbintensitäten keine signifikante Abnahme der Enzymaktivität in den Membranen zeigten. Dieser Versuch zeigt deutlich, daß die Immobilisierung der Enzyme nicht auf ionischen Wechselwirkungen
beruht,
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Claims (11)

Patentansprüche
1. Trägergebundene Proteine an Trägern aus Polyamid oder Cellulosehydrat» dadurch gekennzeichnet, daß
die Proteine direkt an den Träger gebunden sind, 10
2. Trägergebundene Proteine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger funktioneile Gruppen trägt.
3« Trägergebundene Proteine gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet« daß die funktionellen Gruppen Carboxylgruppen, Aminogruppen, Sulfonsäuregruppen, Iminogruppen, Thiogruppen, Hydroxylgruppen, Pyridylgruppen, Phosphorylgruppen oder deren Derivate sind.
4. Trägergebundene Proteine nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger Membranen
sind.
25
5. Trägergebundene Proteine nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger hydrophil sind.
6. Trägergebundene Proteine nach Anspruch 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Träger porös sind.
7. Trägergebundene Proteine nach Anspruch 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die trägergebundenen
Proteine Enzyme sind.
Le A 24 003
^
8. Trägergebundene Proteine nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die trägergebundenen Proteine, Peroxidase, Glucoseoxidase, Diaphorase oder Glucosedehydrogenase sind.
*^
9. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Beladung der Träger durch Tränken mit einer Proteinlosung erfolgt.
1^
10, Verwendung von trägergebundenen Proteinen nach Anspruch 1 bis 8 als Biokatalysatoren.
11. Verwendung von trägergebundenen Proteinen nach
Anspruch 1 bis 8 zur Herstellung von Teststreifen.
25
30
35
Le A 24
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