DE2931082A1 - Streptomyces-metabolit - Google Patents

Description

• Streptomyces-Metabolit
• Priorität: 3. August 1978 - Großbritannien BESCHREIBUNG: Die Erfindung bezieht sich auf einen Metaboliten, M.139603, der durch aerobe Kultivierung von Streptomyces longisporoflavus erhalten werden kann. Dabei handelt es sich offensichtlich um eine neue Verbindung der Formel C35H530aNa.
• M.139603 ist ein Natriumsalz. Die Erfindung bezieht sich auch auf die entsprechende "freie Säure" und auf die anderen Alkalimetallsalze, die davon erhalten werden können.
• Die Verbindungen sind dazu in der Lage, den Anteil an Methan, der bei der Fermentation im Rumen erzeugt wird, zu verringern und den Anteil an Propionsäure in der Rinderrumenflüssigkeit zu steigern, weshalb sie wachstumsfördernde Eigenschaften bei Wiederkäuern besitzen dürften, da es allgemein bekannt ist, daß andere chemische Verbindungen, welche den Anteil an Propionsäure in der Rumenflüssigkeit erhöhen, eine erhöhte Wachstumsgeschwindigkeit ergeben, wenn sie an Rinder oder Schafe verabreicht werden. Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen außerdem eine antibakterielle Aktivität gegenüber grampositiven Organismen. Schließlich besitzen sie auch bei einem in vitro-Test eine Anticoccidienakti'tät gegen Eimeria tenella.
• Gegenstand der Erfindung sind also die Verbindung M 139603, welche die folgenden Charakteristiken aufweist: a) Molekularformel C35H5308Na, gemessen durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M+, mit der Masse 624,361 zeigt (berechnet für C35H5308Na = 624,364), und durch Elementaranalyse: C = 67,5, H = 8,8 % (berechnet für C35H5308Na - C = 67,3, H = 8,5 %); b) Infrarotspektrum in Nujol-Mull, wie in Figur 1 gezeigt, mit charakteristischen Absorptionen bei 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm ' c) magnetisches Protonenresonanzspektrum in Deuteriochloroform wie in Figur 2 gezeigt; d) Ultraviolettspektrum in Methanol lösung zeigt eine charakteristische Absorption bei 234 nm (# = 12900) und 272 nm (E= 10800); e) Schmelzpunkt 176-1780C; f) [α]D23 = -82° (c = 0,2 in Methanol); und die entsprechende "freie Säureform" dieser Verbindung mit der Molekularformel C35H5408, die gekennzeichnet ist durch RF = 0,55 (annähernd) bei Dünnschichtchromatografie auf Silicagel (Merck Kieselgel 60F-254" - Warenzeichen), Dicke 0,25 mm, entwickelt mit einem Gemisch aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhältnis 95:4:1; UV in Ethanol 274 nm ( £= 13900), breit; sowie die anderen davon ableitbaren Alkalimetallsalze.
• Gemäß der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der obigen erfindungsgemäßen Verbindung vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man einen M.139603-bildenden Stamm von Streptomyces longisporoflavus oder einen M.139603-bildenden Varianten oder Mutanten davon in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22 und 320C kultiviert, das so erhaltene Fermentationsgemisch mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel durch herkömmliche Maßnahmen extrahiert und das Lösungsmittel eindampft, wordurch herkömmliche Maßnahmen auf man/ggf. das Natriumsalz, M.139603, in in die "freie Säure" überführt und die "freie Säure" ggf.
• in ein anderes Alkalimetallsalz überführt.
• Ein geeigneterM.139603-bildender Stamm von S. longisporoflavus ist derjenige, der als NCIB 11426 identifiziert wird und der ohne Beschränkung von der National Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland, erhältlich ist und die folgende Beschreibung aufweist: zDie verwendeten Medien wurden gemäß den Rezepten für das 'International Streptomyces Project' (ISP) hergestellt und sind von Shirling E.G. & Gottlieb D. (International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340, 1966) beschriebenz.
• Bedingungen für die Inkubation - ca. 250C - Tageslicht.
• ISP1 Trypton-Hefe (aber mit zugesetztem Agar).
• 5 Tage - Dünn, etwas feucht, samtig, bräunlich.
• - Unterseite ungefärbt.
• 13 Tage - Dünn, samtig, etwas körnig, bräunlich.
• - Unterseite ungefärbt.
• ISP2 Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar.
• 5 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.
• - Unterseite sehr blaß, gelbbraun.
• 13 Tage - Sauber, erhaben und gerunzelt, samtig, hellgelb/ braun/grau.
• - Unterseite rehbraun.
• ISP3 Hafermehl-Agar.
• 5 Tage - Spärlich bis dünn, samtig, hellgelb/grau.
• - Unterseite nicht sichtbar.
• 13 Tage - Dünn, etwas erhaben, samtig, hellgrau.
• - Unterseite nicht sichtbar.
• ISP4 Anorganische Salze / Stärke-Agar.
• 5 Tage - Dünn, bräunlich, etwas körnig.
• - Unterseite ungefärbt.
• 13 Tage - Dünn, etwas feucht, rehbraun.
• - Unterseite mehr oder weniger ungefärbt.
• ISP5 Glycerin/Asparagin-Agar.
• 5 Tage - Dünn, etwas körnig, bräunlich.
• - Unterseite ungefärbt.
• 13 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.
• - Unterseite ungefärbt.
• ISP7 Tyrosin-Agar.
• 5 Tage - Spärlich bis dünn, etwas körnig, samtig, bräunlich/grau.
• - Unterseite ungefärbt.
• 13 Tage - Dünn, samtig, etwas erhaben, rehbraun.
• - Unterseite rehbraun/grau.
• Bei ISP7 wird beim Altern die Kultur im allgemeinen rötlichbraun, zeigt aber einige Bereiche dunklerer Färbung zusammen mit stärkerer Sporulation.
• ISP9 Kohlenstoffausbeutungs-Agar. Einstufung 15 Tage - Kein Kohlenstoff - sehr spärlich, summers - Glucose - Dünn, sauber, samtig, rehbraun. + - Arabinose - Spärlich t - Fructose - Dünn, samtig, rehbraun + - Inosit - Sehr spärlich - Mannit - Dünn, samtig + - Raffinose - Sehr spärlich - Rhamnose - Spärlich t - Xylose - Spärlich Allgemein Es werden keine Melanine gebildet.
• An der Unterseite werden keine Pigmente gebildet.
• Es werden keine löslichen Pigmente gebildet.
• Die Sporen werden in offenen und dichten Spiralen erzeugt, die oftmals von der Hauptachse durch ein gerades Stück getrennt sind, das "Hyphen" oder u.U. Sporenketten trägt. Die Sporen selbst sind durch das normale Mikroskop schwierig zu sehen, da sie sehr dicht miteinander verbunden sind. Die Sporenwandungen (E.M. auf 4 8 Uranylacetatpräparat) sind glatt.
• Dieser Stamm von S. longisporoflavus ist auch ohne Beschränkung vom Centraalbureau voor Schimmelcultures, PO Box 273, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Netherlands, unter der Bezeichnung CBS 312.79 erhältlich.
• Gemäß der Erfindung werden weiterhin Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 und M.139603-bildende Varianten und Mutanten davon vorgeschlagen.
• Schließlich wird gemäß der Erfindung das Fermentationsgemisch vorgeschlagen, das erhalten wird durch Kultivierung eines M.139603-bildenden Stamms von Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 oder eines M.139603-bildenden Varianten oder Mutanten davon.
• Gemäß der Erfindung wird auch ein Extrakt vorgeschlagen, der dadurch erhalten wird, daß man einen M.139603-bildenden Stamm von Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 oder einen M.139603-bildenden Varianten oder Mutanten, wie sie oben beschrieben sind, kultiviert und das Fermentationsgemisch mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Ethylacetat, extrahiert.
• Gemäß der Erfindung wird weiterhin die Verbindung M.139603 vorgeschlagen, sofern sie durch Kultivierung von Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 oder eines Varianten oder Mutanten davon, wie sie oben beschrieben wurden, oder durch ein naheliegendes Äquivalent davon erhalten worden sind.
• Die dem Natriumsalz, M.139603, entsprechende "freie Säure" kann dadurch erhalten werden, daß man eine Lösung von M.139603 ansäuert und die saure Lösung mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Andere Alkalimetallsalze können dadurch erhalten werden, daß man eine Lösung der "freien Säure" mit einem entsprechenden Alkalimetallhydroxid, wie z.B. Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Caesiumhydroxid oder Rubidiumhydroxid, behandelt.
• Wenn Natriumhydroxid verwendet wird, dann wird M.139603 regeneriert, was demonstriert, daß durch diese Reaktionen keine strukturellen Änderungen entstehen.
• Wie oben bereits festgestellt, besitzen die Verbindungen die Wirkung, daß sie den Anteil an Propionsäure in der Rumenflüssigkeit und insbesondere den Anteil an Propionsäure auf Kosten von Methan und/oder Essigsäure steigern. Dies ist bekanntermaßen ein nützlicher Effekt bei der Wiederkäuerernährung, da Propionsäure ein wesentlich wirksamerer Vorläufer für Glucose ist, aus welcher das Tier seine Energie und sein Wachstum bezieht, als dies bei Essigsäure der Fall ist. Der Teil der Tiernahrung, der in Methan überführt wird, geht ganz einfach durch die Bildung von Blähungen verloren. Somit ist also die Änderung des Rumenstoffwechsels, der durch die erfindungsgemäßen Verbindungen erreicht wird, ein äußerst nützlicher Effekt. Es ist anzunehmen, daß hierdurch die Wachstumsgeschwindigkeit und die Nahrun-gsausnutzung bei Wiederkäuern erhöht werden.
• So wird also gemäß der Erfindung weiterhin ein Verfahren für die Verwendung in-der Tierzucht von domestizierten Wiederkäuern vorgeschlagen, um deren Wachstumsgeschwindigkeit und/oder Ausnutzung der Nahrung zu steigern, welches dadurch ausgeführt wird, daß man oral an die Tiere eine erfindungsgemäße Verbindung, ein erfindungsgemäßes Fermentationsprodukt oder einen erfindungsgemäßen Extrakt, wie sie oben beschrieben wurden, verabreicht.
• Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise oral an die Tiere als Ergänzung zu deren normaler Nahrung verabreicht, d.h. also in Mischung mit einer gewöhnlichen festen Nahrung, in Nahrungswürfeln oder in Salzlecksteinen, als Lösung im Trinkwasser oder, bei jungen Tieren, wie z.B. Lämmern oder Kälbern, als Lösung in Vollmilch oder Magermilch. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden in die Nahrung, die Nahrungswürfel, die Salzlecksteine, das Trinkwasser, die Vollmilch oder die Magermilch in einem solchen Ausmaß einverleibt, daß jedes behandelte Tier 0,01 mg/kg Körpergewicht bis 30 mg/kg Körpergewicht je Tag, vorzugsweise 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg je Tag, einer erfindungsgemäßen Verbindung erhält.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können alternativ oral an Tiere in Form von intraruminalen Pellets oder Pillen mit langsamer Wirkstoffabgabe verabreicht werden, so daß das Tier eine ähnliche Menge je Tag der erfindungsgemäßen Verbindung aufnimmt.
• Die Tiere können die erfindungsgemäßen Verbindungen während praktisch ihrer ganzen Wachstumsperiode oder nur während eines Teils ihrer Wachstumsperiode erhalten, beispielsweise während einer frühen Periode und/oder während einer Periode vor dem Schlachten. Die Zunahme der Wachstumsgeschwindigkeit, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht wird, ermöglicht es, Tiere auf Fleisch zu züchten, so daß sie in einer kürzeren Wachstums zeit auf Marktgewicht oder Schlachtgewicht als normal gebracht werden können. Das Verfahren ermöglicht es jedoch auch, schwerere Tiere am Ende einer normalen Wachstumsperiode zu erzielen. Die verbesserte Nahrungsausnützung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht wird, ermöglicht es, daß die behandelten Tiere ein bestimmtes Gewicht erreichen, während sie weniger Nahrung als unbehandelte Tiere, die auf das gleiche Gewicht gezüchtet werden, verbrauchen. Bei optimalen Wachstumsförderungskonzentrationen wurden keinerlei Anzeichen irgendwelcher giftigen Wirkungen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen beobachtet.
• Es wird deshalb gemäß der Erfindung weiterhin eine Zusammensetzung vorgeschlagen, die eineerfindungsgemäße Verbindeng, ein erfindungsgemäßes Fermentationsprodukt oder einen erfindungsgemäßen Extrakt zusammen mit einem festen oder flüssigen, verzehrbaren,nicht-giftisenVerdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
• Ein geeignetes flüssiges Verdünnungmittel oder Trägermittel ist beispielsweise Trinkwasser, Vollmilch oder Magermilch.
• Ein geeignetes festes, verzehrbares, nicht-giftiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel ist beispielsweise eine herkömmliche nährwertmäßig ausgewogene Wiederkäuernahrung, wie z.B. eine typische Rinder- oder Schafsnahrung, die aus Getreideprodukten, wie z.B. Gerstenmehl, Maismehl oder Weizenschrot, Nüssen und Samenprodukten, wie z.B. Kuchen aus dekortierten gemahlenen Nüssen oder Baumwollsamen oder extrahierten Baumwollsamen, gemeinsam mit kleineren Mengen von beispielsweise Federmehl, Seetangmehl, Knochenmehl, Kreide, Salz, Harnstoff, Molassen, Vitaminen und Spurenmineralien bestehen. Es kann sich aber auch um ein inertes festes Verdünnungsmittel oder Trägermittel ohne Nährwert handeln, wie z.B. Kaolin, Talkum, Calciumcarbonat, Fuller'sche Erde, Attapulgitton, gemahlene Austernschalen oder gemahlener Kalkstein. Es kann sich auch um Stärke oder Lactose handeln.
• Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann die Form einer Ergänzungsnahrung zum direkten Verfüttern an Tiere aufweisen, in welchem Fall sie 5 ppm bis 3000 ppm der erfindungsgemäßen Verbindung in Mischung mit einer herkömmlichen Wiederkäuernahrung enthält. Sie kann auch die Form eines konzentrierten Vorgemischs für die Verdünnung mit einer herkömmlichen Wiederkäuernahrung aufweisen, um eine ergänzte Nahrung herzustellen, die sich für das direkte Verfüttern eignet. Ein solches Vorgemisch wird 0,3 bis 50 % (G/G) der erfindungsgemäßen Verbindung in Mischung mit entweder einer herkömmlichen, nährwertmäßig ausgewogenen Wiederkäuernahrung oder einem festen inerten Verdünnungsmittel ohne Nährwert, wie z.B. gemahlener Kalkstein, oder Stärke oder Lactose enthalten.
• In allen oben beschriebenen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann die erfindungsgemäße Verbindung natürlich durch das erfindungsgemäße Fermentationsgemisch oder durch einen erfindungsgemäßen Extrakt, der eine äquivalente Menge M.139603 enthält, ersetzt werden.
• Gemäß der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer festen erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man gleichmäßig eine Verbindung, ein Fermentationsgemisch oder einen Extrakt gemäß der Erfindung mit einem festen, verzehrbaren, nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel mischt.
• Die erfin2ungsaviBenVerbinQungenWwerden vorzugsweise serienmäßig.
• mit dem Verdünnungsmittel oder Trägermittel in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Stufen verdünnt, um ein gleichmäßiges Mischen sicherzustellen.
• Wie oben bereits festgestellt, besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Aktivität gegen Coccidien. Diese wird durch einen Gewebskulturtest bei Hühnernierenzellen, die mit Sporozoiten von Eimeria tenella beimpft werden, durch das Standardtestverfahren, das in Journal of Parasitology, Bd. 58, S. 664-668 (1972) beschrieben ist, demonstriert. Bei diesem Test verhindert M.139603 das Wachstum der Sporozoiten bei einer Konzentration von < 0,001 ppm.
• Außerdem zeigt M.139603 toxische Wirkungen bei den Gastzellen nur bei einer Konzentration von > 0,33 ppm.
• Die Verbindung M.139603 besitzt außerdem grampositive antibakterielle Eigenschaften. Beispielsweise konnte gezeigt werden, daß sie das Wachstum von Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Clostridium welchii und Corynebacterium acne bei einer Konzentration von < 10 rg/ml verhindert, weshalb sie als Wachstumsförderer bei Nichtwiederkäuern, wie z.B. Geflügel und Schweinen, verwendet werden kann.
• Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert: Beispiel 1 Die Streptomycesart NCIB 11426 wurde in einen 500 ml-Erlenmayerkolben auf Typton/Hefe-Agar gezüchtet, der folgendes enthielt: Trypton - "Oxoid" L42 (Warenzeichen) 0,5 % G/V Hefeextrakt - "Oxoid" L21 (Warenzeichen) 0,3 % G/V und der vorher in einem Autoklaven während 20 min bei Normaltemperatur vorsterilisiert worden war. Der pH des Mediums betrug annähernd 7,0. Der Kolben wurde 120 st lang auf einem Rotationsschüttler bei 250C geschüttelt.
• Der Inhalt des Kolbens wurde dann dazu verwendet, weitere 10 ähnliche Kolben zu beimpfen, von denen jeder 200 ml des folgenden Mediums enthielt: Glucosesirup 3,0 % G/V Calciumcarbonat 0,25 % G/V Natriumchlorid 0,5 % G/V Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,05 % G/V Spurenelementekonzentrat 0,1 % V/V Bakteriologisches Pepton ("Oxoid" L37 - Warenzeichen) 0,1 % G/V Rinderextraktpul ver ("Oxoid" L29, "Lab Lemco" -Warenzeichen) 0,5 % G/V Entsalztes Wasser auf 100 Der pH wurde auf 7,2 eingestellt, und das Medium wurde in einem Autoklaven während 20 min bei 1200C vorsterilisiert.
• Die beimpften Kolben wurden bei 250C 120 st auf einem Rotationsschüttler geschüttelt, und der Inhalt der Kolben wurde dann zusammengeschüttet und durch sorgfältige Zugabe von 0,1 n Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Das Medium wurde 2mal mit 600 ml Ethylacetat extrahiert, die Extrakte wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei ein öliger Rückstand (290 mg) erhalten wurde.
• Der Ethylacetatextrakt wurde durch präparative Dünnschichtchromatografie auf zwei Silicapiatten (Merck Kieselgel" 60F-254 - Warenzeichen, 20 x 20 cm, 2 mm dick) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluiermittel gereinigt. Die Bande bei RF = 0,39 (annähernd) wurde von den Platten abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, worauf das Lösungsmittel abgedampft wurde, so daß 21 mg eines viskosen Gummis erhalten wurden. Dieser zeigte in vitro eine antibakterielle Aktivität gegen S. aureus. Diese aktive Fraktion wurde weiter durch präparative Dünnschichtchromatografie auf Silicagelplatten (Merck "Kieselgel" 60F-254, 20 x 20 cm, 0,25 mm dick) unter Verwendung eines Gemischs aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Yerhältnis von 95:4:1 gereinigt. Die Bande bei RF = 0,55 (annähernd) wurde von der Platte abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, wobei nach Abdampfen des Lösungsmittels 9 mg eines viskosen Gummis zurückblieben. Der Gummi wurde in das Natriumsalz, M.139603, überführt, indem eine Chloroformlösung mit einer Lösung von 0,1 m Natriumhydroxid geschüttelt wurde. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei 8 mg M.139603 als weißer Feststoff erhalten wurden, Fp 129-132°C.
• Das Infrarotspektrum (Figur 1) zeigte die folgenden Maxima: 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm 1. Elementaranalyse: Gefunden C = 67,5, H = 8,8 %; berechnet für C35H5308Na C = 67,3, H = 8,5. Massenspektrum: M+ = 624,361, berechnet für C35H5308.Na = 624,364. RF = 0,39 (Dünnschichtchromatografie auf Merck 60F-254-Platten mit einer Dicke von 0,25 nml, entwickelt mit Ethylacetat, sichtbar gemacht als brauner Fleck nach Bespritzen mit 3 n Schwefelsäure und Erhitzen auf 1000C. Das magnetische Protonenresonanzspektrum in Deuteriochloroform ist in Figur 2 angegeben.
• Beispiel 2 Das Vermögen von M.139603, die Bildung von Methan im Rumen von Wiederkäuern zu inhibieren und den Anteil des Propionats auf Kosten des Acetats (Ac/Pr) in den gebildeten flüchtigen Fettsäuren (VFA) zu erhöhen, wird wie folgt demonstriert: Rumenflüssigkeit wird in der üblichen Weise von zwei Stieren gesammelt, die mit der gleichen Heu-und-Konzentrat-Nahrung gefüttert werden. Die Probenzeit wird so weit wie möglich standardisiert, und die Flüssigkeit von den beiden Tieren wird auf einer 50/50-Basis vereinigt. Große teilchenförmige Stoffe werden durch Filtrieren der gesammelten Flüssigkeit durch vier Schichten eines Muslin-Tuchs entfernt. Das Filtrat wird dann im Verhältnis von 1 Volumen Filtrat zu 3 Volumina künstlicher Rumenflüssigkeit verdünnt (hergestellt nach der Vorschrift von G.L. Bales et.al., Journal of Diary Science, 1976, Bd. 59, S. 1850, wobeì~edoch die Essigsäure weggelassen wird), und der pH des Gemischs wird mit gesättigter wäßriger Natriumcarbonatlösung auf 6,9-7,0 eingestellt. Proben von 50 ml dieses Gemischs werden in konische 100 ml-Kolben, die 0,5 g getrocknetes gemahlenes Heu enthalten, abgegeben, und jeder Kolben wird dazu verwendet, eine Testverbindung bei einer bestimmten Konzentration zu testen.
• Die Testverbindung wird dem konischen Kolben als Lösung in Ethanol zugegeben, der Kolben wird mit Kohlendioxidgas gespült, mit einer Suba-Dichtung zugestöpselt und 15-16 st bei 39°C inkubiert. Nach 1 st wird eine Nadel mit einer engen Bohrung durch die Suba-Dichtung eingeführt, um den Gasdruck wegzunehmen, worauf die Nadel 30 min vor Beendigung der Inkubation herausgezogen wird. Die Fermentation wird dann abgebrochen, indem der Kolben in Eis gestellt wird, und nach einer Kühlzeit von 15 min wird das Gas über der Flüssigkeit durch Gaschromatografie auf Methan analysiert.
• Die Kolbeninhalte werden dann durch einen vorher getrockneten gesinterten Glastrichter filtriert. Drei Proben des Filtrats werden durch Gaschromatografie auf VFA analysiert, und durch Vergleich Xit den vor der Inkubation bestimmten VFA-Werten netto die VFA (Acetat und Propionat), die während der Inkubation gebildet werden, bestimmt.
• Es wurden die folgenden Resultate erhalten, ausgedrückt als % von Vergleichswerten, die erhalten werden, wenn keine Testverbindung verwendet wird. Monensin, ein bekannter Wachstumsförderer, der aufgrund eines ESekts auf den Rumen wirkt, ist. als positiver Vergleich beigeschlossen.

  Verbindung Konzentration Methan - $ Acetat/Propio-

  gug/ml im Verhält- nat-Verhältnis -

  nis zum Ver- % im Verhältnis

  gleich zum Vergleich

  M.139603 1,0 58 62

  0,3 72 64

  Monensin 1,0 67 79

  0,3 90 87

  0,1 100 95

  Beispiel 3 Steptomyces longisporoflavus NCIB 11426 wurde auf Schrägkulturen auf ISP-7-Agar (45 ml) 7 Tage lang bei 300C gezüchtet. Drei Schrägkulturen wurden einzeln in drei Kolben mit 100 ml sterilem Wasser gekratzt, und die so erhaltenen Suspensionen wurden dazu verwendet, drei 2 l-Kolben zu beimpfen, von denen jeder 1 1 des folgenden Mediums enthielt: Glycerin 3,0 % G/V Bakteriologisches Pepton ("Ooid" L37 - Warenzeichen) 2,0 % G/V KH2P04 0,024 % G/V MgS04.7H20 0,02 % G/V Spurenelementekonzentrat 0,1 % V/V Kreide 0,1 % G/V Entsalztes Wasser auf 1 1 welches in einem Autoklaven bei Normaldruck während 1/2 st vorsterilisiert worden war, wobei der pH annähernd 6,7 betrug.
• Die drei 2 l-Kolben wurden 3 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 300C geschüttelt. Die Inhalte der drei Kolben wurden dann vereinigt und dazu verwendet, einen Fermentator aus rostfreiem Stahl, der 30 1 eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, zu beimpfen: Glycerin 3,0 G/V Sojamehl BSP 70 1,0 % G/V Kreide 0,25 g G/V Cerelose 3,0 % G/V NaCl 0,5 % G/V MgS04. 7H20 0,05 % G/V Spurenelementekonzentrat 0,1 % V/V Destilliertes Wasser auf 30 1 Der Inhalt des Fermentators wurde 70 st bei 300C gerührt, wobei eine Turbine mit 4 flachen Schaufeln verwendet wurde, die mit 350 U/m lief. Dabei wurde mit einer Geschwindigkeit von 15 1/min belüftet. Dem Gemisch waren vor der Behandlung im Autoklaven 30 ml "Silcolapse" (Warenzeichen), ein Silicon-Antischäummittel, zugegeben worden. Der pH der Ernte war 7,9, und das erhaltene Fermentationsgemisch (22 1) wurde mit einem gleichen Volumen Ethylacetat gemischt und geschüttelt. Nach 30 min wurde das Gemisch in einer Zentrifuge getrennt, worauf der Ethylacetatextrakt (annähernd 18 1) über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 10,7 g eines öligen Rückstands erhalten wurden.
• M.139603 wurde aus dem obigen Konzentrat durch das folgende Verfahren erhalten: Der ölige Rückstand (10,7 g) wurde in dem geringsten Volumen Ethylacetat aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf die Oberseite einer Kolonne von neutralem Aluminiumoxid (Woelm N, 200 g, 18 cm x 4 cm), die mit Ethylacetat vorbereitet worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde zunächst mit Ethylacetat, dann mit einem 50:50-Volumengemisch aus Ethylacetat und Methanol und schließlich mit Methanol eluiert. Es wurden die folgenden Fraktionen gesammelt, nachdem die Lösungsmittelfront aus der Kolonne ausgetreten war: Fraktion Nr. Volumen Eluiermittel 1 150 ml Ethylacetat 2 150 ml 3 150 ml 4 150 ml 5 150 ml " -Methanol 50 g V/V 6 150 ml " " " 1f 7 150 ml " " " 8 150 ml " ?1 9 200 ml Methanol 10 200 ml 11 200 ml Von den Fraktionen 7-11 konnte durch Dünnschichtchromatografie auf Silicagel und bei Entwicklung mit 20 % V/V Aceton in Petrolether (Kp 60-800C) gezeigt werden, daß sie M.139603 (RF N 0,22) enthielten, weshalb sie vereinigt und eingedampft wurden, wobei 840 mg eines viskosen Gummis entstanden, der weiter durch präparative Dünnschichtchromatografie auf Silica (Merck "Kieselgel 60F250" - Warenzeichen, 40 cm x 20 cm, 2 mm dick) unter Verwendung eines Gemischs aus 20 % V/V Aceton und Petrolether (Kp 60-800C) als Eluiermittel gereinigt wurde. Die in UV sichtbare Bande bei RF N 0,22 (annähernd) wurde von den beiden Platten abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wurde zur Trockene eingedampft, wobei 240 mg eines viskosen Gummis erhalten wurden, der bei Zusatz von Petrolether (Kp 60-80°C) kristallisierte. Das Material wurde aus Petrolether (Kp 60-800C) umkristallisiert, wobei M.139603 in Form farbloser Kristalle erhalten wurde, die nach dem Abfiltrieren und Trocknen 210 mg wogen und einen Fp von 176-1780C aufwiesen. Das UV-Spektrum in Ethanol zeigte Absorptionen bei 234 nm (g =12900) und 272 nm (g = 10800). Das IR-Spe»-trum und das magnetische Kernresonanzspektrum waren mit denjenigen des Produkts von Beispiel 1 identisch.
• Beispiel 4 40 mg M.139603 wurden in einem Gemisch aus 10 ml Aceton und 2 ml Wasser aufgelöst, 1 ml 2 n Salzsäure wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 5 min heftig gerührt. 20 ml destilliertes Wasser wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 2mal in 10 ml Dichloromethan extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 2 n Salzsäure und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Dichloromethanschicht wurde dann konzentriert, wobei 33 mg eines viskosen Gummis, der M.139603 entsprechenden "freien Säure", erhalten wurden.
• Elementaranalyse: Gefunden C = 69,5, H = 9,1; berechnet für C35H5408 C = 69,8, H = 9,0; IR-Spektrum in Nujol-Mull, wie in Figur 3 gezeigt, enthielt charakteristische Absorptionen -1 bei 3500, 1765, 1685, 1650, 1575 cm . Das magnetische Protonenresonanzspektrum in Deuteriochloroform ist in Figur.4 gezeigt.
• Beispiel 5 30 mg der M.139603 entsprechenden "freien Säure" wurden in einem Gemisch aus 7 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Wasser auf-2ngelöst. 2 ml eines/Alkalimetallhydroxids, XOH, wurden dem wäßrigen Tetrahydrofurangemisch zugegeben, das dann 10 min heftig gerührt wurde. 10 ml Wasser wurden zugesetzt, und die Lösung wurde 2mal in 15 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt und eingedampft, wobei das dem Natriumsalz M. 139603 entsprechende Alkalimetallsalz erhalten wurde.
• Wenn X für Kalium stand, dann wurde das Kaliumsalz erzeugt, Fp 146-1500C, Molekularformel C35H5308.K, ermittelt durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M+, mit einer Masse von 640,335 zeigt (berechnet für C35H53O8.K = 640,338), und durch Elementaranalyse: Gefunden C = 65,7 %, H = 8,5; berechnet für C35H5308.K C = 65,6%, H = 8,3 t).
• Wenn X für Rubidium steht, dann wird das Rubidiumsalz gebildet, Fp 95-12O0C, Molekularformel C35H5308.Rb, ermittelt durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, N+, mit einer Masse von 686,279 (berechnet für C35H5308.Rb = 686,286) zeigt.
• Beispiel 6 Das Vermögen von M.139603, den Anteil an Propionat auf Kosten von Acetat in der Rumenflüssigkeit eines Schafs zu erhöhen, wurde wie folgt demonstriert: 23 Schafe wurden einzeln gehalten und mit der gleichen Nahrung von 1 kg getrockneten Graswürfeln je Tier und je Tag, aufgeteilt in zwei Portionen je Tag, gefüttert. Die Tiere wurden willkürlich wie folgt zusammengefaßt: 13 als negativer Vergleich, 5 als positiver Vergleich unter Verwendung von Nonensin, einem bekannten Rumenmanipulator, und 5 für die Dosierung mit M.139603. Die behandelten Tiere erhielten Monensin oder M.139603 oral in einer Rate von 0,5 mg/kg an einem jeden von vier aufeinanderfolgenden Tagen. Proben der Rumenflüssigkeit wurden durch Magenkanülen 6 st nach der Behandlung am 4. Tag gesammelt. Die Rumenflüssigkeitsproben wurden dann gemäß der Vorschrift von Beispiel 2 auf Acetat und Propionat analysiert. Die erhaltenen Resultate sind wie folgt:

  Mol-% der gesamten VFA

  Behandelte Gruppen

  Acetat Propionat

  Negativer Vergleich 69,9 19,8

  Positiver Vergleich -

  Monensin 0,5 mg/kg 57,1 32,3

  M.139603 - 0,5 mg/kg 54,2 39,9

  Das Ansprechen im Hinblick auf Acetat durch M.139603 ist bei p< 0,02 gegenüber dem positiven Vergleich, Monensin, bemerkenswert, und das Ansprechen im Hinblick auf Propionat durch M.139603 ist bei p zu 0,001 gegenüber dem positiven Vergleich, - Monensin, bemerkenswert.
• ZUSAMMENFASSUNG: Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen Metaboliten, M.139603, der empirischen Formel C35H53O8Na, der durch aerobe Fermentation einer neuen Streptomyces-Art, NCIB 11426, erhalten wird, und auf die entsprechende freie Säureform davon, C35H5408. M.139603 reduziert den Anteil an Methan, der bei der "Verdauung" von Nahrung im Rumen von Wiederkäuern gebildet wird, und erhöht den Anteil von Propionat gegenüber Acetat im Rumeninhalt. Die Verbindung eignet sich deshalb zur Beschleunigung des Wachstums von Wiederkäuern und/oder zur Steigerung ihrer Nahrungsausnutzung. Die Verbindung besitzt auch eine Aktivität gegenüber grampositivenMikroorganismen und gegenüber Coccidien,wie z.B. Eimeria tenella.
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Claims (10)

1. PATENTANSPRUCHE: 1. Die Verbindung M.139603, welche die folgenden Charakteristiken aufweist: a) Molekularformel C35H5308Na, gemessen durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M+, mit der Masse 624,361 zeigt (berechnet für C35H 5308Na = 624,364), und durch Elementaranalyse: C = 67,5, H = 8,8 % (berechnet für C35H5308.Na - C = 67,3, H = 8,5 %); b) Infrarotspektrum in Nujol-Mull, wie in Figur 1 gezeigt, mit charakteristischen Absorptionen bei 3300, 1725 , 1645, 1565 und 915 cm ; c) magnetisches Protonenresonanzspektrum in Deuteriochloroform wie in Figur 2 gezeigt; d) Ultraviolettspektrum in Methanollösung zeigt eine charakteristische Absorption bei 234 nm (E= 12900) und 272 nm (6= 10800); e) Schmelzpunkt 176-178°C; f) [α]D23= -82°(c = 0,2 in Methanol), und die entsprechende "freie Säureform" dieser Verbindung mit der Molekularformel C35H5408, die gekennzeichnet ist durch RF = 0,55 (annähernd) bei Dünnschichtchromatografie auf Silicagel (Merck "Kieselgel 60F-254" -Warenzeichen), Dicke 0,25 mm, entwickelt mit einem Gemisch aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhältnis 95:4:1; UV in Ethanol 274 nm (E= = 13900), breit; sowie die anderen davon ableitbaren Alkalimetallsalze.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen M.139603-bildenden Stamm von Streptomyces longisporoflavus in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22 und 320C kultiviert, das so erhaltene Fermentationsgemisch mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel durch herkömmliche Maßnahmen extrahiert und das Lösungsdurch herkömmliche Maßnahmen mittel eindampft, worauf man/ggf. das Natriumsalz, M.139603, in die "freie Säure" überführt und die "freie Säure" ggf. in ein anderes Alkalimetallsalz überführt.
3. 3. Verfahren-nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als M.139603-bildenderStamrn vDnS.longisporoflavus derjenige verwendet wird, der mit NCIB 11426 identifiziert ist und der die folgende Schreibung besitzt: £Die verwendeten Medien wurden gemäß den Rezepten für das International Streptomyces Project (ISP) hergestellt und sind von ShirlingE.G & Gottlieb D. (International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340, 1966) beschriebeni.

   Bedingungen für die Inkubation - ca. 250C - Tageslicht..

   ISP1 Trypton-Hefe (aber mit zugesetztem Agar).

   5 Tage - Dünn, etwas feucht, samtig, bräunlich.

   - Unterseite ungefärbt.

   13 Tage - Dünn, samtig, etwas körnig, bräunlich.

   - Unterseite ungefärbt.

   ISP2 Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar.

   5 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.

   - Unterseite sehr blaß, gelbbraunb 13 Tage - Sauber, erhaben und gerunzelt, samtig, hellgelb/braun/grau.

   - Unterseite rehbraun.

   ISP3 Isafermehl-Agar.

   5 Tage - Spärlich bis dünn, samtig, hellgelb/grau.

   - Unterseite nicht sichtbar.

   13 Tage - Dünn, etwas erhaben, samtig, hellgrau.

   - Unterseite nicht sichtbar.

   ISP4 Anorganische Salze / Stärke-Agar.

   5 Tage - Dünn, bräunlich, etwas körnig.

   - Unterseite ungefärbt.

   13 Tage - Dünn, etwas feucht, rehbraun.

   - Unterseite mehr oder weniger ungefärbt.

   ISP5 Glycerin/Asparagin-Agar.

   5 Tage - Dünn, etwas körnig, bräunlich.

   - Unterseite ungefärbt.

   13 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.

   - Unterseite ungefärbt.

   ISP7 Tyrosin-Agar.

   5 Tage - Spärlich bis dünn, etwas körnig, samtig, bräunlich/grau.

   - Unterseite ungefärbt.

   13 Tage - Dünn, samtig, etwas erhaben, rehbraun.

   - Unterseite rehbraun/grau.

   Bei ISP7 wird beim Altern die Kultur im allgemeinen rötlichbraun, zeigt aber einige Bereiche dunklerer Färbung zusammen mit stärkerer Sporulation.

   ISP9 Kohlenstoffausbeutungs-Agar. Einstufung 15 Tage - Kein Kohlenstoff - Sehr spärlich, submers - Glucose - Dünn, sauber, samtig, rehbraun + - Arabinose - Spärlich + - Fructose - Dünn, samtig, rehbraun + - Inosit - Sehr spärlich - Mannit - Dünn, samtig + - Raffinose - Sehr spärlich - Rhamnose - Spärlich + -;Xylose - Spärlich + Allgemein Es werden keine Melanine gebildet.

   An der Unterseite werden keine Pigmente gebildet.

   Es werden keine löslichen Pigmente gebildet.

   Die Sporen werden in offenen und dichten Spiralen erzeugt, die oftmals von der Hauptachse durch ein gerades Stück getrennt sind, das "Hyphen" oder u.U. Sporenketten trägt. Die Sporen selbst sind durch das normale Mikroskop schwierig zu sehen, da sie sehr dicht miteinander verbunden sind. Die Sporenwandungen (E.M. auf 4 % Uranylacetatpräparat) sind glatt.
4. 4. Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 und M.139603-bildende Varianten und Mutanten davon.
5. 5. Das Fermentationsgemisch, das durch Kultivierung eines M.139603-bildenden Stamms von Streptomyces longisporoflavus oder eines M.139603-bildenden Varianten oder Mutanten davon in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, unter Schütteln und aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22 und 320C erhalten wird.
6. 6. Der Extrakt, der durch Extrahieren des in Anspruch 5 genannten Fermentationsgemischs mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel erhalten wird.
7. 7. Die Verbindung M.139603, die in Anspruch 1 beansprucht ist, sofern sie durch das Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 oder durch ein naheliegendes Äquivalent davon hergestellt worden ist.
8. 8. Verfahren zur Zucht von domestizierten Wiederkäuern, dadurch gekennzeichnet, daß man oral an die'Tiere eine Verbindung nach Anspruch 1, ein Fermentationsprodukt nach Anspruch 5 oder einen Extrakt nach Anspruch 6 verabreicht.
9. 9. Zusammensetzung, welche eine Verbindung nach Anspruch 1, ein Fermentationsgemisch nach Anspruch 5 oder einen Extrakt nach Anspruch 6 gemeinsam mit einem festen oder flüssigen verzehrbaren,nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
10. 10. Verfahren zur Herstellung einer festen Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichförmig eine Verbindung nach Anspruch 1, ein Fermentationsprodukt nach Anspruch 5 oder einen Extrakt nach Anspruch 6 mit einem festen verzehrbaren,nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel mischt.