DE2930542A1

DE2930542A1 - Neue insulinderivate und verfahren zu ihrer herstellung

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Publication number: DE2930542A1
Application number: DE19792930542
Authority: DE
Inventors: Karl Dr Geisen; Rainer Dipl Chem Dr Obermeier; Guenter Dr Regitz; Hans-Dieter Dipl Chem Dr Summ; Rainer Dipl Chem Dr Uhmann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1979-07-27
Filing date: 1979-07-27
Publication date: 1981-02-12
Also published as: ATE3145T1; DK324380A; JPS5622326A; ES493550A0; EP0027161A1; ES8104202A1; CA1156217A; DE3062890D1; EP0027161B1

Description

HOECHST'AKTIENGESELLSCHAFT HOE 79/F 208 Dr.Li/Pa

Neue Insulinderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Polyethylenglycol (PEG) wird häufig covalent mit Proteinen verbunden, um deren Hydrophilie zu steigern und die Antigenität zu verringern.

So ist in Arch. Biochem. Biophys die Reaktion von 2-chlor-

4-hydroxy-6-PEG mit einem Pollen-Allergen beschrieben. t

In der niederländischen Patentanmeldung 7409770 wird über

Ul

den Umsatz derselben Verbindung mit mehreren Enzymen und mit Insulin berichtfet. Das resultierende Konjugat besitzt noch 50 % Insulinaktiviytät, bezogen auf den Anteil des zu Grunde liegenden Insulins.

Folgt man dem Beispiel 10 der niederländischen Patentanmeldung , so erhält man kein einheitliches Produkt. Ein· Teil des Insulins ist an allen 3 Aminogruppen umgesetzt, ein Teil nur an zwei oder einer Aminogruppe. Ein|ähnliches Ergebnis erhält man, wenn man einen aktivierten Bernsteinsäure-mono-PEG-ester, der ebenfalls in der genannten Anmeldung vorgeschlagen wird, mit Insulin!umsetzt.

. u ^] Über die Struktur der entstandenen Verbindungen erhält man durch einen Edman-Abbau Auskunft. Prüft man die Aminosäurezusammensetzung des Reaktionsprodukts (3 Phenylalaninreste) vor und nach Edman-Abbau, so stellt man fest, daß der Phenylalaningehalt von 3.0 auf etwa 2.5 zurückgegangen ist.

Andererseits beträgt der durch saure Elektrophorese ermittelte Gehalt an dreifach substituiertem Insulin etwa 50 %. Das bedeutet, daß die Aminogruppe des B1-Phenylalanins in mono- und disubstituierten Insulinen frei sein muß. Es sind also neben dem trisubstituierten Insulin Derivate entstanden, bei denen die Aminogruppen in A1 und B29 in diesen beiden Positionen gleichzeitig substituiert sind. Ein nur in B1-substituiertes Insulin liegt nicht vor. Dieser Befund deckt

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sich mit der aus Hoppe-Seyler¹s Z. physiol. Chem. 352 (1971), S. 1487 bekannten Reaktivität des Insulins, wonach in alkalischer Lösung bevorzugt die Aminogruppen in A1 und B29 reagieren, während die Aminogruppe in B1 nur in den trisubstituierten Derivaten in substituierter Form vorliegt.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß man ein 1ΟΘ% wirksames PEG-substituiertes Insulin erhält, wenn man ein PEG-Derivat gezielt mit der Aminogruppe von B1-Phenylalanin umsetzt. Dieses Ergebnis ist deshalb überraschend, weil z.B. B1-Stearoylinsulin in vivo (Blutzuckersenkung am Kaninchen) wirkungslos ist.

Gegenstand der Erfindung sind somit Insulinderivate, welche dadurch geknnzeichnet sind, daß in ihnen die OL -Aminogruppe der B-Kette des Insulins über ein Zwischenglied mit einem Monoalkylpolyethylenglycol verknüpft ist.

Besonders bevorzugt sind Derivate der allgemeinen Formel I 20

A-Kette

R-(O-CH₂CH₂ J_1n-X^O ! ^B-^Kette

in der R Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen und X

-O-

- O - CH₂ -

- O - CO - (CH₂) - oder

- O - CO - NH - (CH₀) - NH -

2 η

bedeutet, wobei η 2 bis 8 und id 10 bis etwa 120 ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Insulinderivaten, das dadurch gekennzeichnet

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ist, daß man ein in den Positionen Ν^^Α1 und N mit Schutzgruppen versehenes Insulin mit einem Alkylpolyethylenglycol-Derivat umsetzt und danach die Schutzgruppen abspaltet.
5

So kann zur Herstellung von Insulinderivaten der allgemeinen Formel I N*^¹, N ^B29- Bis tert.butyloxycarbonyl-Insulin oder N^cvA1, N^rB29-Bis-methylsulfonylethylpxycarbonyl-Insulin mit einem Alkylpolyethylenglycolderivat der allgemeinen Formel II bzw. III umgesetzt

R-(O-CH₀-CH₀) - X-CO-Y II

2. 2 m

R-(O-CH₀-CH₀) -0-CO-NH-(CH₀) -NCO III δ λ m ^n

in der R, X, m und η die obengenannte Bedeutung haben und Υ Chlor, eine Aktivestergruppe oder Azid darstellt, und die tert.-Butyloxycarbonyl-bzw. Methylsulfonylethyloxycarbonyl-gruppen durch Behandeln mit Säure bzw. Lauge abgespalten werden.

An sich kann Monoalkyl-PEG über jeden beliebigen niedermolekularen Rest als Zwischenglied mit der^-Aminogruppe der B-Kette des Insulins verbunden sein, der die freie OH-Gfuppe des Polyethylenglycols mit der Aminogruppe kovalent verknüpft. Der Charakter des Zwischengliedes beeinflußt die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Insulinderivate kaum.

So lassen sich neben den oben bereits genannten Zwischengliedern mit den allgemein bekannten Methoden der organischen Chemie, speziell der Peptidchemie, für -X- auch

Zwischenglieder wie
R

-0-Co-(CH) -NH-

R. R·
-0-CO-(CH)_n-NH-(CH)_n-

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4-

R R

-O-CO-(CH)_n-NH-CO-NH-(CH)_n~ oder

R R"

-0-CO-(CH) -CH₀-S -(CH₀), ₀-CH-n Zz 2 1 —Z

einführen. In diesen Formeln bedeutet ζ 1 oder 2.

Man kann auch anstelle der Esterbindung eine Amidbindung zum R-(O-CH₇-CH₉) - herstellen, indem man gemäß der , £* £ xn

niederländischen Patentanmeldung 7409770 von dem entsprechenden R-(O-CH₀-CH₀) -NH₀ ausgeht. Über eine ent-

Z 2 m Z

sprechende Halogenverbindung können mit Mercapto-Verbindungen auch Zwischenglieder der Struktur

-S-CH₂-(CH) -

R'

erhalten werden. In dieser Formel ist ρ eine ganze Zahl zwischen 1 und 8 und R¹ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis Kohlenstoffatomen. Wenn ρ = 1 ist, kann R¹ auch die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Λ -Aminosäure, in der L-, D- oder DL-Form sein oder Acylamino bedeuten.

Auch heterocyclische Systeme, wie das bekannte 4-Hydroxy-1,3,5-triazin können als Zwischenglied dienen, wobei bei der genannten Verbindung die Vernetzungsstellen in 2- und 6-Position sind.

Ein Alkylpolyethylen-glycol-derivat der Formel III kann man erhalten durch Umsatz von R-(O-CH₀-CH₀) -OH mit Hexa-

Z Z m

methylendiisocyanat. R-(O-CH₉-CH₉) -0-CO-CH₉-CH₉-CO-ONSu (ONSu ist N-Hydroxy-succinimidyl) wird aus R-(0-CH₂-CH₂)_m~0H mit Bernsteinsäureanhydrid und anschließenden Umsatz mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxysuccinimid (HONSu) hergestellt. R-(O-CH₀-CH₉) -0-CH₉-CO-N₀ erhält man aus

£ £* XH £ O

R-(O-CH₉-CH₉) -OH und Chloressigsäure-methylester, Umsetzung des Reaktionsprodukts mit Hydrazin und überführen des Hydrazids in das Azid. R- (0-CH₃-CH₂) ^0-CO-Cl erhält man aus R-(O-CH₉-CH₉) -OH mit überschüssigem Phosgen.

& & XTt

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Mit tert. Butyloxycarbonyl (Boc) oder Methylsulfonylethyloxycarbonyl (Msc) partiell geschützte Insulinderivate sind aus Hoppe-Seyler¹s Z. physiol. Chem. 352 (1971), S. 1487 und Chem. Ber. 108 (1975), S. 2758 bekannt. 5

.Die Umsetzung der Alkylpolyethylen-glycol-derivate der allgemeinen Formeln II und III mit den partiell geschützten Insulinderivaten kann man in Lösungsmitteln wie Dimethylform-. amid oder Dimethylsulfoxid vornehmen. Auch Pyridin ist geeignet. 10

Zusatz einer tert. Base wie Triäthylamin oder N-Methylmorpholin ist empfehlenswert.

Die Reaktion wird bevorzugt bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, jedoch kann leichtes Erwärmen auf eine Temperatur unterhalb der Denaturierungstemperatur des Peptids förderlich sein.

Die Umsetzung wird solange fortgesetzt, bis eine vollständige Acylierung eingetreten ist. Das läßt sich beispielsweise mit Hilfe einer papierelektrophoretischen Prüfung nach Hoppe-Seyler¹s Z. physiol. Chem. 352 (1971), S. 1487 feststellen.

Zur Abspaltung der Schutzgruppen dienen die in der Peptidchemie bekannten Verfahren.

So kann zur Abspaltung von Boc-Gruppen in einem geeigneten Mittel, zum Beispiel in Trifluoressigsäure gelöst und nach etwa 45 Minuten das Insulinderivat, z.B. mit Ether, ausgefällt werden.

Die Msc-Gruppe kann nach Chem. Ber. 108 (1975), S. 2758 durch kurzes Aufbewahren der Verbindung in alkalischem Dimethylformamid-Methanol-Wasser abgespalten werden. Die Verbindung wird danach durch Ansäuern, z.B. mit Essigsäure, und Ausfällen, z.B. mit Ether oder Essigsäure,

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isoliert.

Zur Entsalzung kann sich eine Filtration über eine Säule,

(R)
z.B. aus Sephadex -G15 oder Biogel P2 anschließen.

Sephadex ist ein vernetztes Dextran-Gel, Biogel ein vernetztes Polyacrylamid.

Eine chromatographische Reinigung der Verbindungen kann in der noch geschützten Form durch Verteilungschromatographie analog Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chemie 354 (1973), S.1285 vorgenommen werden.

Die Reinigung der Verbindungen kann auch nach Abspalten der

(R)

Schutzgruppen durch Chormatographie, z.B. an Sephadex G-50 oder Biogel P6 unter gleichzeitiger Entsalzung erfolgen.

Die neuen Insulinderivate dienen als Arzneimittel zur Behandlung des Diabetes Mellitus. Demgemäß ist Gegenstand der Erfindung auch ein Mittel, das eine der genannten Insulinderivate in wäßriger Dispersion enthält und die Ver-Wendung dieses Mittels zur Behandlung des Diabetes Mellitus.

Ein besonderer Vorzug der erfindungsgemäßen Insulinderivate besteht darin, daß ihre Wirkung auf die Fettzelle stark reduziert ist. So zeigt z.B. B1-Methyl-PEG (1500)-succinoylinsulin bei der Blutzuckersenkung am Kaninchen über 100% Insulinwirkung, verglichen auf molarer Basis, während im Fettzelltest nur 65 % gefunden werden. Die verstärkte und verlängerte Insulinwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber natürlichem Insulin wird besonders im Versuch an der adrenalektomierten Streptoratte deutlich.

Mit den neuen Insulinderivaten hat der Arzt erstmals Verbindungen in der Hand, die die bekannte anabole Insulinwirkung bevorzugt am Muskelgewebe und weniger am Fettgewebe entfalten. Damit ist ein schon lange gesuchter Wirkungssplit erreicht.

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Darüber hinaus besitzen die erfindungsgeraäßen Insulinderivate eine stark verminderte Antigenität.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der neuen Verbindungen. Als Ausgangsmaterial können Insuline verschiedener Spezies wie Rind, Schwein oder Mensch dienen.

Beispiel 1

B1-Methyl-PEG(1500)-carbonylamino-hexamethylenaminocarbonylinsulin (Rind)

a) Monoisocyanat aus Methylpolyäthylenglykol (1500) und Hexamethylendiisocyanat
15 g Monomethylpolyäthylenglykol (MG 1500) werden in 200 ml Benzol in der Wärme gelöst. Die Lösung wird mit 1 ml Dibutylzinnlaurat und 8,6 ml Hexamethylendiisocyanat •versetzt und 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Produkt durch Zusatz von Petroläther gefällt, der Überstand dekantiert, der Feststoff in Toluol gelöst und die Lösung erneut mit Petroläther versetzt. Die Fällung wird noch zweimal wiederholt, das Produkt wird abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 14,6g; Charakterisierung durch IR-Spektrum (1705 cm Amid; 2260 cm" Isocyanat).

b) 200 mg N , N -Bis-Boc-insulin vom Rind, hergestellt nach der DPS 2 162 164, werden in 3 ml Dimethylformamid, das 0.2 ml N-Ethylmorpholin enthält, mit 400 mg der oben hergestellten Verbindung 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man fällt mit Ether einen Niederschlag aus und wäscht ihn mit Ether und Essigester. Ausbeute nach dem Trocknen im Vak. 278 mg. Da das Produkt elektrophoretisch hinreichend einheitlich ist, kann auf eine chromatographische Reinigung verzichtet werden.

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Zur Abspaltung der Schutzgruppen löst man das Produkt in ml Trifluoressigsäure und fällt nach 4 5 Minuten Stehen bei Raumtemperatur mit Ether 24 3 mg Reaktionsprodukt aus. Nach Lösen des Präzipitats in 2 ml 0.1 M Ammonacetat/ 0,1 N Essigsäure wird die Lösung über eine Säule Sephadex G-50 superfein 1 χ 50 cm mit 0,1 M Ammonacetat/0,1 N Essigsäure Chromatographiert. Ausbeute: 218 mg.

Die Verbindung ist in der Papierelektrophorese bei pH 2 einheitlich und verhält sich erwartungsgemäß wie ein monoacyliertes Insulin.

Beispiel 2

Bi-Methyl-PEG (500)-succinoy!-insulin (Schwein)

a) Bernsteinsäure-mono-methylpolyäthylenglykolester (500)

15 g Mono-methylpolyäthylenglykol (500) werden in 40 ml Methylenchlorid gelöst, 5 g Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch noch 1 Stunde am Röck-

fluß gekocht. Nach Erkalten wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand in 5 g-Portionen in Methanol gelöst und über Sephadex LH 20 in Methanol chromatographiert. Die Substanz wird im Dünnschicht-Chromatographie - System Methylenchlorid/Diäthylenglykolmonomethyläther/Pyridin (85:15:2 v/v) auf Reinheit überprüft. IR-Spektrum: 1740 cm" .

b) Bernsteinsäure-mono-methylpolyäthylenglykolester (500)-mono-N-hydroxysuccinimidester

1,8 g (3 mmol) Bernsteinsäure-mono-methylpolyäthylenglykolester (500) werden in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und der Lösung 345 mg (3 mmol) N-Hydroxysuccinimid und620 mg DCC zugefügt. Die Mischung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und danach vom ausgefallenen

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Niederschlag befreit. Sodann wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, das zurückbleibende Öl mit Äther überschichtet und zur Kristallisation auf - 2O°C abgekühlt. Der Überstand wird abdekantiert und der kristalline Rückstand auf Raumtemperatur erwärmt, wobei die Kristalle

wieder zerfließen. Diese Kristallisation wird wiederholt. Die Substanz kann unter trockenem Äther aufbewahrt werden. Ausbeute: 1,6 g. - Charakterisierung durch IR-Spektrurn (1820, 1890, 1740 cm"¹).
10
c) B1-Methyl-PEG 1500)-succionyl-insulin (Schwein)

3,0 g N^ ,N -Bis-Msc-insulin vom Schwein, hergestellt nach Chem. Ber. 108 (1975), S. 2758, werden in 40 ml Dimethylformamid und 0,09 ml N-Ethylmorpholin gelöst. Man gibt 1.0 g Methyl-PEG (500)-succionyl-ONSu zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur.

Zur Aufarbeitung versetzt man mit 0,1 ml Essigsäure, fällt das Reaktionsprodukt mit Ether und wäscht mit Methylchlorid und Ether. Ausbeute: 4,0 g.

Die Feinigung erfolgt durch Verteilungschromatographie analog Hoppe Seyler's Z. physiol. Chem. 354 (1973), S. 1285 in einer Säule 200 χ 6 cm. Die Insulinkonzentration im Eluat wird über Messung der UV-Extinktion bei 254 nm verfolgt. Die Fraktionen des Hauptpeaks, die chromatographisch einheitlich sind (Dünnschichtchromatographie aus Kieselgel. Laufmittel Chloroform/Methanol/Wassser/Eisessig (60:45:14:3))werden zusammengefaßt. Ausbeute: 2.1 g.

Zur Abspaltung der Msc-Schutzgruppen löst man die vom Lösungsmittel befreite Substanz in 10 ml Dimethylformamid und versetzt bei 0 C unter Rühren mit 10 ml Methanol und 20 ml 1 N NaOH. Nach 45 sek. gibt man 20 ml 1 N Essigsäure zu und fällt mit Essigester/Ether (1:1) 2.Og Insulinderivat aus, das analog Beispiel 2 durch Gelfiltration entsalzt wird. Ausbeute: 1.8 5 g.

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Beispiel 3 Bi-Methyl-PEG(1500)-succinoyl-insulin (Schwein)

3.5 g N^ , N ^ -Bis-Boc-insulin (Schwein) werden in einer Lösung von 40 ml Dimethylformamid und 0.09 -ml N-Ethylmorpholin mit 8.0 g Methyl-PEG(1500)-succinoyl-ONSu, hergestellt analog Beispiel 2, über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Zur Aufarbeitung versetzt man mit 0.1 ml Essigsäure, fällt das Reaktionsprodukt mit Ether und wäscht es mit Methylenchlorid und Ether. Ausbeute: 4.5 g. Die Reinigung durch Verteilungschromatographie wird analog Beispiel 2 ausgeführt. Ausbeute: 2.8 g.
Man spaltet wie bei Beispiel 1 die Schutzgruppen ab und entsalzt wie bei Beispiel 2 angegeben. Ausbeute: 2.5 g.

Die Reinheit der Verbindung in der Polyacrylamidgel-Elektrophorese entspricht der von chromatographisch gereinigtem Insulin.

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Claims

HOE 79/F 208

1. Insulinderivat, dadurch gekennzeichnet, daß die oC -Aminogruppe der B-Kette des Insulins über ein Zwischenglied mit Monoalkylpolyethylenglykol verknüpft ist.

Patentansprüche:

2. Insulinderivat der Formel I

R- (0-CH₉-CH₀) -X-CO

A-Kette I I S S j I S S I I — B-Kette

in der R Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und X

- 0 - CH₂ -

- 0 - CO -

oder

0 - CO - NH - (CH₂)_n -NH-

bedeutet, wobei η 2 bis 8 und m 10 bis etwa 120 ist.

3. Verfahren zur Herstellung eines Insulinderivats, dadurch gekennzeichnet, daß man ein in den Positionen N und N mit Schutzgruppen versehenes Insulin mit einem Alkylpolyethylenglykol-Derivat umsetzt und danach die Schutzgruppen abspaltet.

4. Verfahren zur Herstellung eines Insulinderivats der-Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man N^ , N Bis-tert.butyloxycarbonyl-Insulin oder Ν°*-^Α1, N * ^B29 Bis-methylsulfonylethyloxycarbonyl-insulinmit einem Alkypolyethylenglykol-Derivat der allgemeinen Formel II bzw. III umsetzt

R-(O-CH₀-CH₀) - X-CO-Y 2 ζ τα

II

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ORIGINAL INSPECTED

->*"- HOE 79/F 208

R- (0-CH₀-CH₀) -0-CO-NH-(CH₀) -NCO III

2 2m 2 η

in der R, X, m und η die obengenannte Bedeutung haben und Y Chlor, eine Aktivestergruppe oder Azid darstellt und die tert.-Butyloxycarbonyl- bzw. Methylsulfonylethyloxycarbonyl-gruppen durch Behandeln mit Säure bzw. Lauge abspaltet.

5. Mittel, enthaltend ein Insulinderivat gemäß Anspruch 1 iⁿ wäßriger Dispersion.

6. Verfahren zur Behandlung des Diabetes mellitus, gekennzeichnet durch die parenterale Verabreichung eines Mittels gemäß Anspruch 5.

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