DE2836599A1 - Verfahren zum herstellen von zitrovorumfaktor - Google Patents

Description

UNITED STATES OF AMERICA, represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C. (U.S.A.)

Verfahren zum Herstellen von Zitrovorumfaktor

Die Anwendung einer Hochdosis-Methotrexattherapie mit Zitrovorumfaktor, 5-Formyl-5,6,7,8-Tetrahydrofölsäure, (5-CHO-THF) -unterstützung zur Behandlung einer Anzahl von festen Tumoren und malignen Blutkrankheiten wird intensiv untersucht. Die Entwicklung erfolgreicher BehandlungsVorschriften wird dazu führen, das größere Mengen an Zitrovorumfaktor (5-CHO-THF) benötigt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren zum Herstellen und Reinigen von Zitrovorumfaktor anzugeben.

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BOEHMERT & POEHMERT

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß 10-FormyIfölsäure in Trifluoressigsäure zu 5,10-Methenyl-5,6,7,8-Tetrahydrofölsäure hydriert wird. Alternativ hierzu kann auch vorgesehen sein, daß Folsäure mit Natriumhydrid reduziert und die resultierende Tetrahydro folsäure in Anwesenheit von Ascorbinsäure als Antioxydanz isoliert wird. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß Folsäure mit Natriumborhydrid reduziert und eine wässrige Lösung der resultierenden Tetrahydrofölsäure zur Gewinnung von 5,10-Methenyl-5,6,7,8-Tetrahydrofölsäure mit Ameisensäure behandelt wird. Außerdem kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, daß der Imidazolinring von 5,1O-Methenyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure unter neutralen oder leicht sauren Bedingungen, bei einem pH-Wert von etwa 6,2 bis 7,0, geöffnet wird. Schließlich wird erfindungsgemäß zur Lösung der oben angegebenen Aufgabe vorgeschlagen, daß Rohausbeuten von Zitrovorumfaktor durch Einstellen des pH-Wertes einer wässrigen Lösung von Zitrovorumfaktor und Magnesiumchlorid auf einen pH-Wert von 12 zum Erzeugen eines Verunreinigungen enthaltenden Niederschlages eingestellt und Zitrovorumfaktor aus dem Filtrat rückgewonnen wird.

Unter einem ersten Aspekt der Erfindung führt die Formylierung von Folsäure (FA) zu 10-CHO-FA, welche in Trifluoressigsäure zur Gewinnung hoher Ausbeuten von (5,10-CH-THF) hydriert wird, dem dehydratisierten Produkt der anfangs gebildeten 10-CHO-THF. Unter einem anderen Aspekt ergibt die Reduzierung von Folsäure mit Borhydrid, mit nachfolgender Behandlung der resultierenden THF mit Ameisensäure, erfindungsgemäß gute Ausbeuten von (5, 10-CH-THF)⁺, als Chlorid isoliert. Der Einfluß

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der Basiskonzentration/ der Temperatur und der Reaktionszeigt auf die Umwandlung von (5,10-CH-THF) Cl" zu 5-CHO-THF wurde ermittelt. Diese Verfahren führten mit hohen Ausbeuten zum Calziumsalzdihydrat von 5-CHO-THF₇ welche einen Reinheitsgrad von etwa 78% hatte. Die Identifizierung der Verunreinigungen in diesen 5-CHO-THF-Proben erfolgte durch Hochdruck-Flüssigchromatographie wobei die Verunreinigungen durch Florisil-Chromatographie entfernt wurden. Die Erfindung betrifft auch, wie oben ausgeführt wurde, ein nicht-chromatographisches Verfahren zum Entfernen des größten Teils der Verunreinigungen von Rohproben von 5-CHO-THF.

Die Abnahme der Toxizität und die Zunahme der therapeutischen Wirksamkeit, die aus der unterstützenden Behandlung von osteogenen Sarkomen mit einer hohen Dosis von Methotrexat und nachfolgender Erhaltung mit Zitrovorumfaktor, 5-Formyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure, (5-CHO-THF), erzielt wird, ist durch Jaffe et al., New Engl.J.Med., 291, 994 (1974), beschrieben worden. Bei dieser Anwendung schützt offensichtlich 5-CHO-THF normal empfindliches Gewebe ohne die inhibitorische Aktivität von Methotrexat gegen neoplastisches Gewebe zu beseitigen. Außerdem ist berichtet worden, daß diese Art der Therapie potentiell auch gegen andere bösartige Erkrankungen wirksam ist, einschließlich ansonsten unbehandelbarer akuter Leukämie, Bronchialkarzonomen sowie Kopf- und Halskrebs. Obwohl die volle Wirksamkeit, in Anzahl von Heilungsfällen ausgedrückt, dieser Art der Therapie noch nicht voll belegt wurde, liegt es doch auf der Hand, daß die Entwicklung der Hochdosis-Methotrexatdiät oder -behandlung große Mengen an sowohl Methotrexat als auch an 5-CHO-THF erforderlich macht. Kürzlich

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ist durch J.R. Piper und J.A. Montgomery, J. Heterocycl. Chem./ Vl_. 279 (1974) ein verbessertes Verfahren für die Synthese von Methotrexat hohen Reinheitsgrades in großem Maßstab angegeben worden, zusammen mit verbesserten Verfahren zur großtechnischen Herstellung und Reinigung von 5-CHO-THF.

Die Synthese und Identifizierung von 5-CHO-THF erfolgte vor etwa 25 Jahren, wie dies beispielsweise durch Pohland et at., J.Am. Chem. Soc., 73/ ³²⁴⁷ (1951) beschrieben wurde. Allgemein umfassen die bekannten Verfahren die Formylierung von Folsäure mit Ameisensäure, die katalytische Hydrierung des Pyrazinringes der resultierenden Ameisensäurelösung von 10-CHO-FA und die Behandlung des Reduktionsproduktes mit Basen bei erhöhten Temperaturen, um so Roh-5-CHO-THF zu erhalten. Bei einem Verfahren zeigte die biologische Wertbestimmung des Rohproduktes, daß eine etwa 22%ige Ausbeute von 5-CHO-THF erhalten wurde. Die Reinigung erfolgte durch Säulenchromatographie, wobei sich eine geringe Ausbeute an 5-CHO-THF ergab, welche als das Bariumsalzpentahydrat isoliert wurde. Obwohl über Ausbeute gerade nicht berichtet wurde, ist festzuhalten, daß ein ähnliches Verfahren zur Präparation des Calziumsalzes von 5-CHO-THF verwendet wurde.

Bei dem Syntheseverfahren nach dem Stand der Technik, welches vorstehend beschrieben ist, zeigt es sich, daß 5-CHO-THF unter sauren Bedingungen zu (5,10-CH-THF)⁺ dehydriert wird. Dasselbe Produkt erhält man aus 10-CHO-THF) , die aus der Hydrierung von 10-CHO-FA in Ameisensäure resultiert. Die Behandlung von (5,10-CH-THF) mit Basen bei Raumtemperatur öffnet den Imidazolinring, wodurch sich hauptsächlich 10-CHO-THF (kinetische Kon-

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trolle) ergibt, die in Anwesenheit von Sauerstoff und Licht leicht oxydiert wird, wodurch sich Zerfallsprodukte ergeben, wie dies von May et at., J.Am.Chem.Soc., 73, 3067 (1951) beschrieben wurde. Im Gegensatz hierzu führt die Behandlung von (5,1O-CH-THF) mit Basen bei höheren Temperaturen zur Bildung von 5-CHO-THF (thermodynamische Kontrolle) und Zerfallsprodukten.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren besteht eine erste Näherungslösung darin, daß Folsäure mit 98%igem H„O₂H ■ unter N bei 60° zur Bildung von 10-CHO-FA behandelt wird, welche durch Rekristallisierung aus H„0 gereinigt wird. Alle angegebenen Temperaturen sind, wie auch im folgenden in ⁰C. Wie in der oben angegebenen Literaturstelle von Pohland et al angegeben ist, bestand bisher eine beträchtliche Schivierigkeit darin, 10-CHO-FA in HCO₂H zu hydrieren, wobei diese Reduktion bislang mehr als 40 Stunden zur Aufnahme von 2 Moläquivalenten von H„ in Anwesenheit von Platin bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck erforderte. Wegen dieser Ergebnisse wurde versucht, 10-CHO-FA zu 10-CHO-THF zu reduzieren, wobei dies erfindungsgemäß in situ zu einer Umlagerung zwecks Gewinnung von 5-CHO-THF führen soll.

Bei der Hydrierung von 10-CHO-FA in Pyridin in Anwesenheit von Pd schienen zunächst 2 Moläquivalente H₂ innerhalb von fünf Stunden absorbiert zu werden. Die Rückgewinnung von 10-CHO-FA aus dieser Reaktion zeigte aber, daß eher eine Hydrierung des Lösungsmittels als des Pyrazinringes von 10-CHO-FA stattgefunden hatte. Basierend auf der erfolgreichen chemischen

Reduktion von Folsäure zu THF mit Na-S„0. wurde dann

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bei der Entwicklung der erfindungsgemäßen Lehre die Reduzierung von 10-CHO-FA mit diesem Reagens versucht. Die Behandlungen von Lösungen von 10-CHO-FA in wässrigem Pyridin und in Wasser bei pH-Werten von 6, 7 und 8,5 mit Na_S_O. bei 75 ergab jedoch die Bildung von Komplexmischungen (TLC), die nicht weiter untersucht wurden. Zusätzlich hierzu ergab die Behandlung von 10-CHO-FA entweder bei Raumtemperatur mit Überschuß von wässrigem NaBH. (alkalisches Medium) oder mit wässrigem NaBH^CN im Rückfluß bei einem pH-Wert von 6,7 eine extensive Zersetzung der Probe mit überhaupt keiner oder nur geringer Umwandlung zu 5-CHO-THF.Obwohl die Behandlung von 10-CHO-FA mit einer gleichen Gewichtsmenge NaBH., unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes des Mediums nahe 8 mittels HOAc, mit nachfolgender Rückflußbehandlung der Reaktionsmischung nach Einstellen des pH-Wertes auf 6,7, wie weiter unten beschrieben, zu einer Mischung führte, die 5-CHO-THF enthielt, wies die Mischung dort eine große Menge an unreduzierter 10-CHO-FA auf. Diese Schwierigkeiten wurden durch katalytische Hydrierung von 10-CHO-FA in CF₂CO₃H, welches vorreduziertes enthielt, umgangen, wobei dieses Reaktion mehr als zwanzigmal soschnell ablief wie die Blydrierung von 10-CHO-FA in

Als nächstes erfolgten die Formylierung und Hydrierung von Folsäure ohne Isolierung von 10-CHO-FA. Die Lösung von 10-CHO-FA in HCO₃H, die aus der Formylierung von Folsäure resultierte, wurde mit einem gleichen Volumen CF-CO₃H verdünnt und in Anwesenheit von vorreduziertem PtO₃ (20 Gew.-% der Folsäure) hydriert. Die Absorption von H₃ war langsamer als erwartet, und die Reaktion wurde durch Entfernen der Ameisensäure nach

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der Formylierung und unter Verwendung einer geringeren Katalysatormenge, 5 Gew--% der Folsäure, wiederholt. Unter diesen Bedingungen schien der Katalysator nach Aufnahme eines Moläquivalentes H„ vergiftet zu sein, jedoch kehrte die Reduktion nach Zugabe von entweder frisch reduziertem PtO₂ (insgesamt 7,5 Gew.-% der Folsäure) oder von zusätzlichem Lösungsmittel zur ursprünglichen Rate zurück. Basierend auf diesen Resultaten, erfolgten großtechnische Preparationen durch Formylierung von Folsäure mit HCO₉H, Rückgewinnen des HCO₃H durch Vakuumdestillation und Hydrierung des resultierenden trockenen Restes in vorreduziertes PtO- (5 Gew.-% der · Folsäure) enthaltendem CF^CO₉II bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck. Obwohl sich herausstellte, daß CF-CO₉H durch Pt reduziert wurde, erfolgte die Reaktion langsamer als die Reduktion von 10-CHO-FA. Weiterhin schien keines der Reduktionsprodukte von CF₉CHpH die Hydrierung von 10-CHO-FA oder die Isolierung ihrer Reduktionsprodukte zu stören.Sowohl das Lösungsmittel als auch der Katalysator konnten rückgewonnen und wenigstens fünfmal weiter verwendet werden.

Obwohl die Hydrierung von 10-CHO-FA in CF.,CO₉H anfangs wahrscheinlich 10-CHO-THF ergab, wurde diese Verbindung durch das Lösungsmittel leicht dehydratisiert. Das resultierende Produkt war ein azyliertes Derivat (entweder Formyl oder Trifluoracetyl oder beides) von (5,10-CH-THF) , isoliert als Schaum, welches durch Auflösung in 0,5-N-HCL und Konzentrierung der resultierenden Lösung zu einem Niederschlag von praktisch reinem (5,10-CH-THF) Cl" umgewandelt wurde. Die Tatsache, daß dieses Produkt in einer Menge gleich dem Gewicht des Folsäure-Ausgangsmaterials erhalten wurde,

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zeigte, daß in jedem Schritt der Reaktionsabfolge eine praktisch quantitative Umwandlung erfolgte.

Als Abwandlung des vorstehenden Lösungsweges wurde die großtechnische Reduktion von Folsäure zu THF untersucht. Zunächst führte die Reduktion von Folsäure mit Borhydrid zu einer Mischung von nicht umgesetzter Folsäure DHF, und THF₇ wobei die Ausbeute an letzterem bis zu 50% betrug. Einleitende Experimente zeigten, daß eine Menge Natriumborhydrid, die gleich dem Gewicht der Folsäure war, notwendig war, um eine vollständige Reduktion sicherzustellen. Um die Verwendung eines gepufferten Mediums umgehen zu können, erfolgte die Reduktion durch portionsweises Zugeben einer wässrigen Lösung von NaBH. unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes des Reaktionsmediums nahe bei 8 durch Zufügen von verdünnter HCl. Es trat jedoch eine gewisse Oxydation des Produktes beim Ansäuern der Reaktionsmischung, um so THF auszufällen, auf. Zusätzliche Experimente zeigten, daß das Zugeben von HCl während der Reduktion unnötig ist, weil das System durch Borat bei einem pH-Wert von weniger als 10 gepuffert wird. Die Reoxydation der THF während der Isolation wurde durch die Zugabe von Ascorbinsäure während der Ansäuerung verhindert, wodurch sich THF als Borkomplex mit 96%iger Ausbeute ergab.

Die direkte Umwandlung der freien Säure von THF zu 5-CHO-THF erfolgte mit einer 95:5-Rückflußmischung von Pyridin-HCO_H mit Ascorbinsäuregehalt. Nach einer grundlegenden Untersuchung zeigte sich aber, daß die isolierte CF eine beträchtliche Menge an 10-CHO-DHF (TLC, HPLC) enthielt, woraufhin für dieses Verfahren

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keine weitere Arbeit mehr aufgewendet wurde.

Die Behandlung des THF-Produktes mit entweder HCO₂H oder 2 : 1 HCO₂H-CPjCO H bei Raumtemperatur ergab hauptsächlich (5,10-CH-THF)⁺. In ähnlicher Weise ergab sich dasselbe Produkt bei der Kondensation von THF mit (EtO)₃CH entweder in Anwesenheit von HCl bei Raumtemperatur oder in Anwesenheit wässriger Ascorbinsäure im Rückfluß. Die Ausbeuten und die Reinheit des Produktes schienen besser zu sein als bei den Verfahren, bei denen HCO₉H eingesetzt wird. Das angewendete Verfahren umfaßte die Auflösung der ausgefällten THF direkt in 98:2 HCO₂H-CF₃-CO₂H, woraus sich (5,10-CH-THF) , welche frei war von Borverunreinigungen, ergab. Dieses Verfahren wurde noch dadurch verbessert, daß der Schritt bei dem THF isoliert wird, eliminiert wurde. Die Behandlung der wässrigen Lösung (pH-Wert 7) von THF, die aus der NaBH₄-Reduktion von FA mit einem gleichen Volumen HCO₉H resultierte, ergab die Isolierung einer guten Ausbeute von (5,10-CH-THF) Cl .

Bei TLC zeigten viele dieser Proben von (5,10-CH-THF) Cl Spurengehalte an farbigen fluoroeszierenden Verunreinigungen, welche durch Säulenchromatographie entfernt wurden. Dies Imidazolinchlorid schien in festem Zustand und in saurer wässriger Lösung stabil zu sein, jedoch war es, wie oben bemerkt wurde, in Anwesenheit wässriger Base unstabil. Eine zusätzliche Information über die Umwandlung von (5,10-CH-THF)⁺Cl in Lösungen wurde aus dem UV-Spektrum der Eluatpeaks erhalten, die sich in Chromatogrammen ergaben, welche durch Hochdruck-Rückphasen-Flüssigchromatographie erhalten wurden.

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Wenn (5,10-CH-THF) Cl in einem Puffer mit einem pH-Wert von 5 aufgelöst wurde, ergab sich eine Mischung von 10-CHO-DHF, (5,10-CH-THF)⁺ und 5-CHO-THF. Vermutlich wurde (5,10-CH-THF)⁺ zu 5,10-(HOCH)-THF umgewandelt, bei der verschiedene Arten von Ringöffnungen auftraten, wodurch sich eine geringe Menge von 5-CHO-THF und eine große Menge von 10-CHO-THF ergab, mit nachfolgender Luftoxydation der 10-CHO-DHF zu 10-CHO-DHF. Keine 10-CHO-DHF wurde gebildet, wenn (5,10-CH-THF) in einem Puffer mit einem pH-Wert von 5, welcher Ascorbinsäure enthielt, aufgelöst wurde, wobei die resultierende Lösung Peaks nur für (5,10-CH-THF) und 5-CHO-THF zeigte. Im Gegensatz hierzu zeigte das Chromatogramm einer Lösung von (5,10-CH-THF) bei einem pH-Wert von 7 in Anwesenheit von Ascorbinsäure eine geringe Menge an 10-CHO-DHF und zwei neue Peaks, die versuchsweise 10-CHO-THF und 5,10-(HOCH)-THF zugeordnet wurden. Ein späteres Chromatogramm dieser Lösung zeigte, daß beide, 10-CHO-THF und 5,10-(HOCH)-THF zugeordneten Peaks mit der Zeit abnahmen, während der 10-CHO-DHF-Peak auch in Anwesenheit von Ascorbinsäure wuchs. Aus der Überlegung wurde nicht die Möglichkeit ausgeschlossen, daß der 5,10-(HOCH)-THF zugeordnete Peak eine tautomere Form von 10-CHO-DHF war, welche anfangs durch die Oxydation von 10-CHO-THF gebildet wurde.

Eine Lösung von (5,10-CH-THF)⁺Cl" bei einem pH-Wert von 13, welche Ascorbinsäure enthielt, zeigte nur den 10-CHO-THF zugeordneten Peak. Obwohl das UV-Spektrum dieses Peaks ähnlich demjenigen von 10-CHO-DHF war, resultierte dieser von 10-CHO-THF, welche in der UV_ Zelle durch UV-Strahlung rasch zu 10-CHO-DHF umgewandelt wurde. Diese Umwandlung wurde verfolgt, indem

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das Anwachsen des Absorptionsvermögens bei einer Wellenlänge von 330 mn gemessen wurde, wo 1Ö-CH0-DHF ein Maximum ergab, nachdem der Peak aus der Säule ausgewaschen war. Überraschenderweise ergab die Behandlung von (5,10-CH-THF) Cl" mit Base bei einem pH-Wert von 11 ohne Schutz gegen 0„ eine hohe Ausbeute an 10-CHO-THF, die als ihr Calziumsalz isoliert wurde- Die Struktur des Calziumsalzes wurde durch dessen Rückwandlung zu (5,10-CH-THF) Cl" in einem saurem Medium (UV) bestätigt. Die weitere Behandlung von 10-CHO-THF in einem basischen Medium ergab jedoch die Bildung einer Mischung von 10-CHO-DHF, 10-CHO-FA und Zersetzungsprodukten. Ein Versuch, eine gereinigte Probe von 10-CHO-DHF durch Auswaschen dieser Mischung aus einer Florisil-Säule mit 0,1-M-Merkaptoethanol zu erhalten, war ohne Erfolg, da der größte Teil der Probe sich in der Säule zersetzte. Nicht nur das Gewicht des rückgewonnenen Materials war gering (15%), sondern HPlC ergab, daß die 10-CHO-DHF, die man erhielt, mit p-Aminobenzoylglutaminsäure, Pterinen und unidentifizierten Substanzen kontaminiert war.

Versuchsweise wurde die in situ hergestellte (5,10-CH-THF) in einem heißen, neutralen oder alkalischen Medium mit einer Reaktionszeit von etwa einer Stunde zu 5-CHO-THF umgewandelt. Das feste (5,10-CH-THF)⁺Cl", welches in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde, wurde in Laborexperimenten dazu verwendet, den Einfluß der Basenkonzentration, der Temperatur und der Reaktionszeit auf die Reinheit der erhaltenen 5-CHO-THF zu bestimmen. Der Reaktionsfortgang wurde durch Ermittlung des UV-Spektrums von aliquoten Teilen von 0,1-N-NaOH und Vergleichen des Verhältnisses

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■χ 2 82 , Χ242 mit demjenigen verfolgt, welches in der

max min
isolierten Probe von 5-CHO-THF beobachtet wurde. Die UV-Daten zeigten, daß das Verhältnis bei den höheren pH-Werten schneller anstieg, ergaben aber auch, daß das Verhältnis ein Maximum erreichte und dann abfiel. Zusätzlich hierzu wurde die Bildungsrate von Zitrovorumfaktor beim Ausführen der Reaktion in einem Druckapparat bei höheren Temperaturen gesteigert, wobei sich aber hinsichtlich der Reinheit des Produktes kein Vorteil ergab.

Bei einer Reaktion, bei der Anfangs-pH-Wert 8,3 und der End-pH-Wert 5,9 betrug, wurde dasselbe Verhältnis für die letzte aliquote Menge und das isolierte Produkt erhalten, wodurch nahegelegt wird, daß die Reaktionsmischung sich im Gleichgewicht befand. Bei dieser Reaktion trat ein 75%iger Anstieg des Absorptionsvermögens bei 282 nm innerhalb von 2,5 Stunden auf, mit einem nachfolgenden kleineren Abfall über die restliche Versuchsdauer. Eine logarithmische Auftragung des Absorptionsvermögens (log A) gegen die Zeit legte den Schluß nahe, daß die Umwandlung zwei aufeinanderfolgende Reaktionen erster Ordnung umfaßte: Möglicherweise die Umwandlung von (5,10-CH-THF)⁺ über 5,10-(HOCH)-THF zu 5-CHO-THF und 10-CKO-TFH mit nachfolgender reversibler Umwandlung von 10-CHO-THF über 5,10-(HOCH)-THF zu 5-CHO-THF, eine Reaktion, die im letzten Teil der Umwandlung vorherrschen sollte.

Ein außerordentlich Signifikates Resultat dieser Untersuchung war die Erkenntnis, daß die Öffnungsrate des Imidazolinringes von (5,10-CH-THF)⁺ angemessen war und die 5-CHO-THF di_e gebildet wurde, am Reinsten war,

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Wenn die Reaktion unter neutralen oder leicht sauren Bedingungen, bei einem pH-Wert von etwa 6,2 bis 7,0, ausgeführt wurde. Das letztgenannte Ergebnis wurde in Reaktionen mit (5,10-CH-THF) bei pH-Werten von 11,4, 9 und 6,2 bestätigt, bei denensich 5-CHO-THF mit wachsender Reinheit ergab. In verdünnten Lösungen von 5-CHO-THF bei 100° für sieben Stunden über den pH-Bereich von 6,5 bis 5,5 durchgeführte Experimente hingegen zeigten, daß bei abnehmenden pH-Wert wachsende Mengen von 10-CHO-DHF, 10-CHO-FA und p-Aminobenzoylglutaminsäure (PABGA) entstanden. Für die großtechnische Synthese von 5-CHO-THF aus (5,10-CH-THF)⁺Cl" in konzentrierten Lösungen wurde der pH-Wert des Reaktionsmediums für etwa 11 Stunden nahe 6,7 gehalten, wodurch sich ein Produkt mit einem UV-Verhältnis von 3,4 bis 3,9 ergab. Diese Proben von 5-CHO-THF enthielten 10-CHO-DHF und PABGA als Hauptverunreinigungen sowie 10-CHO-FA und Pterine als geringere Verunreinigungen. Bei TLC waren (5,10-CH-THF)⁺, 10-CHO-DHF und 10-CHO-FA zu weniger als 5% der Konzentration von 5-CHO-THF nachweisbar. Der hauptsächliche Teil der 10-CHO-DHF-Verunreinigungen in 5-CHO-THF-Proben wurde aus nicht umgewandelter (5,10-CH-THF)⁺ und 10-CHO-THF während der basischen Aufarbeitung der Reaktion gebildet.

Das Calziumsalz von 5-CHO-THF schien in wasserfreien organischen Lösungsmitteln nicht oder nur wenig löslich zu sein. In der Tat wurde das Salz aus einer wässrigen Lösung bei Zugabe von DMAC erneut ausgefällt. Auch eignete sich die Rekristallisierung des Salzes aus einer gesättigten Lösung von CaCl„ und fraktionierende Ausfällung des Salzes aus Wasser-Athanolmischungen nicht befriedigend für die Herstellung gereinigter Proben.

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Zusätzlich hierzu ergab sich, daß mittels Säulenchromatographie mit den nachfolgenden Packungen eine gereinigte Probe von 5-CHO-THF nicht erfolgreich erhalten werden konnteiKationen-Harzkügelchen, entwickelt mit 0,1-M-Ca Cl₂-Ca(OH)₂ (pH-Wert 10); Kationen-Austauschzellulose, entwickelt mit 0,1-M-CaCl₂-HCl (pH-Wert 5,5); Avicel-Zellulose, entwickelt mit 0,1-M-CaCl₂ (pH-Wert 8); Silikagel H entwickelt mit 7:3-H₂O-Aceton unter Wasserdruck; Polyäthylenpulver, entwickelt oder aufgeschlossen mit 3:1-H„0-Aceton; und Sephadex G-75, entwickelt mit HO (pH 8). Aus Eohproben ergab sich durch Säulenchromatographie auf Sephadex G-10, welches mit wässrigem Ca(OH)₂ (pH-Wert 8) entwickelt oder aufgeschlossen wurde, praktisch reines 5-CHO-THF, wie weiter unten noch beschrieben wird. Ein besseres Verfahren besteht aber in der Säulenchromatographie von Rohproben auf Florisil, welches mit wässrigem Merkaptoäthanol entwickelt ist, wobei sich 5-CHO-THF mit 28 bis 35%iger Ausbeute (von FA) ergibt. HPLC ergab, daß dieses Proben nur Spurenmengen an UV-absorbierenden Verunreinigungen enthalten.

Unter einem weitere Aspekt betrifft die Erfindung ein nicht-chromatographisches Verfahren zum Entfernen der meisten Verunreinigungen aus Rohproben von 5-CHO-THF. Eine Lösung der Probe in Wasser, welches Magnesiumchlorid enthält, wurde mittels Calziumhydroxid auf einen pH-Wert von 12 eingestellt, um so einen Niederschlag der anorganischen Oxide, des größten Teiles der Verunreinigungen, und von etwas 5-CHO-THF zu erhalten. Aus dem Filtrat wurde 5-CHO-THF mit guter Qualität rückgewonnen.

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Dieses Verfahren ist möglicherweise das am besten und vorteilhaftesten für die Reinigung von 5-CHO-THF geeignete.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele, teilweise unter Bezugnahme auf die Zeichnung, im einzelnen erläutert sind.

Die aus einer einzigen Figur (Fig. 1) bestehende Zeichnung zeigt verschiedene Reaktionen, die erfindungsgemäß stattfinden.

Beispiel 1

10-Formylfölsäure (10-CHO-FA). Eine Mischung von FA - 2HO (30,0 g, 62,8 mmol) und 9 8%-HCO„H (400 ml) wurde unter N~ in einem ölbad von 60 zwei Stunden lang gerührt, die resultierende Lösung wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit verdampft. Der Rückstand wurde im Vakuum über Ρ_0_ς- und NaOH-Pellets 18 Stunden lang getrocknet, wobei sich ein trockenes, glasiges Material ergab: Ausbeute 37,2 g; /t , nm: 0,1-N-HCl-252, 322;

ItI 3.x

pH 7-260, 349; 0,1-N-NaOH-257, 365. Pmr (DMSO-d_c/"

5,5% g/ml)- 68,14 (CCHO-Komponente, Position unidenti-

fiziert), 8,63 (7-CH), 8,79 (10-CHO). TLC [Avicel,

0,1-M-Phosphatpuffer (pH 7)] -R_f ^0,85 (fluoreszierend).

In einem 1,O-g-Lauf wurde der isolierte Rückstand aus heißem H^O (110 ml) zum Gewinnen des Monohydrates rekristallisiert: Ausbeute, 0,57 g (56%). Diese Probe unterlag von etwa 200° der Zersetzung. A , nm (6 χ 10 ):

max

" ¹⁵ " 909827/0596

BOEHMERT *k BOEHMERT

0,1 N HCl-252 (26,5), 322 (8,69): pH 7-249 sh (24,3), 263 br (25,6), 348 (6,15)m 357 sh (5,81): 0,1 N NaOH-257 (39,0), 367 (7,62). S , cm"¹: 1680 br. Pmr (DMSO-d^,

ΓΓ13.Χ O

4,3% g/ml) - £ 8,63 (7-CH), 8,79 (10-CHO).

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FIGUR 1

IJ

Il

H₂N-^N ""^W

FA

HH/

η "T^h'^khr

CHO

CHO

10-CHO-FA

Pt \0-CHO-DHF

HN H₂N^t

CHO g

HN^

THF

10-CHO-THF PI er ins R = H. CH₁OH

HCOjH

CHO

/"^/N^/rj; NUR

"M J tr

5-CHO-THF

HO.

5.10-(HOCIt)-THF - "1 IT""

(5. 10-CH-THF)⁴-

R = 4-C^₄CONHCH(CO₂H)CHjCH₂CO₁H

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ORIGINAL INSPECTED

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Analyse. Berechnet für C₂₀H₁₉N₇O₇-H 0: C₇ 49,29; H₇ 4,34; N, 20,12. Gemessen: C, 49,12; H, 4,27; N, 19,97.

Beispiel 2

Calzium-IQ-Formyl-7,8-dihydrofolat. Eine Suspension von (5,10-CH-THF)⁺Cl" (10,0 g) in H₃O (315 ml) wurde gerührt und mit 1 N-NaOH ( 85 ml) behandelt, woraus sich eine klare, gelbe Lösung (pH 11, Meßgerät) ergab. Nach Rühren bei Raumtemperatur mit freiem Luftzutritt für zwei Stunden wurde die Lösung mit verdünnter HCl auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, woraufhin eine geklärte Lösung von CaCl₃ (2,5 g/5 ml) und EtOH (150 ml) zugesetzt wurde. Der gelbe Niederschlag (0,6 g), der sich absetzte, wurde durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde mit einer zusätzlichen Menge EtOH (800 ml) verdünnt. Der resultierende schwachgelbe Niederschlag wurde durch Filtrieren aufgenommen und in Vakuum über P„0,- getrocknet: Ausbeute 9,74. Das UV-Spektrum zeigte, daß dieser Feststoff hauptsächlich aus Calzium-10-

Formyl-5 , 6, 7, 8-Tetrahydrofolat bestand, ^t , ran -3 max

(£ χ 10 ): pH 7 (1% Merkaptoäthanol)-257 (18,8), 305 sh (6,12), 340 sh (2,85). Nach 24 Stunden ergab diese Lösung das nachfolgende Spektrum: 262 &17,5), sh (7₇56),34O sh (3,60).

Analyse. Berechnet für C~_H,.,N_0 · Ca· 0,75 C_H^0.2H_0: ■* ZU ZiJi- ZO Z

C, 44,36; H, 5,11; N, 16,84; Ca, 6,89; Asche (CaO), 9,65. Gemessen: C₇ 44,69; H, 4,91; N, 17,06; Ca₇ 6,82; Asche (CaO), 10,17.

Ein Teil des vorstehend beschriebenen Feststoffes (5,0 g) wurde in H„0 (500 ml) aufgelöst. Die Lösung (pH-Wert

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7,4) wurde in Anwesenheit von Luft bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeitperiode setzte sich ein gelber Feststoff ab, sobald der pH-Wert der Lösung auf 6,7 abfiel. Der Feststoff wurde durch Filtrieren aufgenommen und im Vakuum über P₉O_n.

1 getrocknet. Ausbeute, 0,76 g. Das H NMR-Spektrum,

Elementaranalysen und HPLC-Untersuchung dieser Probe zeigten, daß sie aus einer 2:1-Mischung der Calziumsalze von 10-Formyl-7,8-Dihydrofolat und 10-Formylfölsäure bestand. Λ , nm ( &x 10~³) : pH 7 - 233 (30,8), 260 sh

ΙΪ13.Χ

(22,8), 266 sh (22,3), 335 (6,68). TLC j_Avicel, 0,1-M-Phosphatpuffer (pH 7)J - R_f0,70 (1O-CHO-DHF), 0,86 (10-CHO-FA) (beide fluoreszierend).

Analyse: Berechnet für (C- H₁₉N₇O₇J₂ (C„ H.. .JSi₇O₇) -Ca-2H₂O: C, 44,09; H, 4,13; N, 18,00, Ca, 736, Asche (CaO) 10,30- Gemessen: C, 44,18; H, 4,10; N, 17,99; Ca, 7,33; Asche (CaO) 9,93.

Die Verdünnung des Filtrates des obengenannten Feststoffes mit EtOH ergab eine Mischung der Salze von 10-Formyl-7,8-Dihydro- und 10-Formylfolsäuren (3,21 g) welche mit anderen Verunreinigungen (p-Aminobenzoylglutaminsäure, Pterinen) kontaminiert war.

Beispiel 3

5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure. Zu einer Suspension von Folsäuredihydrat (47,8 g, 100 mmol) in entgastem H 0 (1.000 ml), welches in einem Eisbad gekühlt worden war, wurde langsam unter Umrühren 50%ige NaOH (10,5 ml) zugesetzt. Die resultierende dunkelgelbe Lösung (pH 8,0, Meßgerät) wurde über eine Zeitdauer von 10 Minuten mit

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einer Lösung von NaBH (58 g) in H O (150 ml) behandelt.

2 Die Lösung wurde weitere 30 Minuten gerührt, wobei

während dessen der pH-Wert von 8,4 auf 8,8 anstieg. Überschüssige NaBH- wurde durch zusetzen von 6-N-HCl Vorsicht, heftig aufbrausend!), bis der pH-Wert der Lösung 6,8 betrug. Feste Ascorbinsäure (5 g) wurde zugesetzt, woraufhin weitergerührt wurde, bis eine' vollständige Auflösung eingetreten war. Die resultierende Lösung wurde mit 6-N-HCl (Gesamtvolumen 165 ml) auf einen pH-Wert von 3,7 eingestellt. Der cremefarbene Niederschlag wurde durch Filtration unter N„ aufgenommen, mit eiskalter HCl (pH-Wert 3,5, 200 ml), welche Ascorbinsäure enthielt (2 g), gewaschen und auf konstantes Gewicht im Vakuum über P-,0,- bei Raumtemperatur getrocknet, mit einer Ausbeute von 60,0 σ (96%). Lösungen für die Bestimmung der UV-Spektren wurden durch Auflösen von Tetrahydrofölsäure (5,5 mg) durch aufeinanderfolgendes Zugeben von Merkaptoäthanol (2,5 ml) und Wasser (22,5 ml) und Verdünnen der resultierenden Ausgangslösung mit dem geeigneten Lösungsmittel (5 —> 50 ml) erhalten. Λ / nm (ix 10~³): 0,1 N-HCl -- 270 (23,5), 292

(20,8); pH 7 — 297 (25,7); 0,1 N-NaOH-297 (25,9). TLC £dEAE Zellulose; 0,005 M KH₃PO₄ + 0,5 M NaCl + 0,2 M Merkaptoäthanol (pH 7) ] —R^O,44 (verlängert).

Die Probe wurde analysiert und zeigte die nachfolgende Zusammensetzung: Analyse: Berechnet für C₁ „ H-.,N-O ■ 1 ,66 HCl-1 ,68H₃BO₃-0,74H₂O; C, 36,66; II, 5,04; B, 2,92; Cl, 9,45; N, 15,75. Gemessen: C, 36,69; H, 5,20; B, 2,89; Cl, 9,45; N, 15,66.

Beispiel 4

Calziumsalz von Zitrovorumfaktor. Die kombinierten Pro-

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28365^9

dukte von (5,10-CH-THF)⁺Cl" (1212 g) , in der weiter unten beschriebenen Weise hergestellt, wurden unter Umrühren unter einer N„-Atmosphäre siedendem Wasser (30 1) über eine Zeitdauer von 20 Minuten zugesetzt. Während des Zusetzens und während der nachfolgenden Stunde wurde heiße, sauerstoff freie 3,7-NaOH (^21) mit einer Rate zugesetzt, die ausreichte, um ein saures Reaktionsmedium aufrechtzuerhalten. Dann wurde eine vollständige Auflösung des Feststoffes mittels sauerstofffreier 1-N-NaOH bewerkstelligt. Die resultierende Lösung wurde 11 Stunden lang einer Rückflußbehandlung unterworfen, wobei der pH-Wert mittels 1-N-NaOH (insgesamt ungefähr 450 ml) zwischen 6,5 und 6,9 (Meßwert) gehalten wurde. Der Fortgang der Reaktion wurde dadurch verfolgt, daß die HPLC-Chromatogramme aliquoter Proben bestimmt wurden. Nach stehenlassen für weitere 8 Stunden ohne Wärmezufuhr wurde die Lösung (56°, pH 7,7) mit einer geklärten Lösung (1200 ml) von CaCl„ (600 g) behandelt, wobei der pH-Wert auf 7,2 abgesenkt wurde. Die Lösung wurde mit ETOH (3,2 1) verdünnt und durch ein Tygonrohr mit peristaltischer Pumpe einem in einer Eis-Salz-Mischung gekühlten Kolben zugeführt. Sobald die Temperatur der Mischung weniger als 10° betrug wurde der abgelagerte hellgelbe Festkörper durch Hydrieren entfernt. An Luft dunkelte dieser Festkörper nach und wurde braun, wobei der Festkörper gummiartig wurde. TLC des halbtrockenen Restes (ungefähr 400 g) zeigte, daß er mit zahlreichen Verunreinigungen kontaminierte 5-CHO-THF enthielt. Weitere der Charakterisierung dieses Rückstandes dienende Arbeiten sind in dem die nicht chromatographische Reinigung von 5-CHO-THF betreffenden Abschnitt beschrieben.

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BOEHMHRT (

Das klare gelbe Filtrat des vorstehenden Ansatzes wurde in einen großen Behälter gepumpt und mit EtOH (insgesamt 102 1) verdünnt. Die resultierende Aufschlemmung von cremefarbenem Niederschlag von 5-CHO-THF-Ca wurde in einem Eisbad 18 Stunden lang gekühlt (< 10°) woraufhin der Festkörper durch Filtration gewonnen, mit EtOH (73.) gewaschen und in Vakuum über P₂^s getrocknet

wurden: Ausbeute 897 g (^ 45% von FA). λ- , nm ■3 -— max

(grx 10~^J): 0,1-N-NaOH-2 82 (28,8) λ 282, λ,242 , N-NaOH)

t- max min ' '

3,6 [J . TCL [ Avicel, 0,1 -M-Phosphatpuffer (pH 7)} — R_f 0,76 (10-CHO-DHF), 0,85 (CF, absorbierend), 0,93 (10-CHO-FA).

Analyse: Berechnet für C₂₀H₂₁N₇O₇-Ca-O₇SC₂HgO-I₇SH₂O: C₇ 44,49; H, 4,91; N₇ 17,29; Ca, 7,07; Asche (CaO), 9,89. Gemessen: C₇ 44,49; H₇ 4,97; N, 17,29; Ca₇ 7,18; Asche (CaO) 9,65.

Die HPLC-üntersuchung dieser Probe zeigte, daß 5-CHO-THF-Ca (78%) vorhanden war, weiterhin, unter Ausschluß von Äthanol und Wasser, die nachfolgenden Verunreinigungen: PABGA-Ca (3,1%), 10-CHO-DHF (4,6%), 10-CHO-FA «0,5%), Pterine (1,0%) und unidentifiziertes und nicht nachgewiesenes Material (3,0%).

Beispiel 5

5 , 1 Q-Metheny 1-5, 6,7, 8-Tetrahydrof ölsäure (5 ,10-CH-THF)"¹" (A). Eine Suspension von PtO₂ (1,50 g) in CF₃CO₂H (600 ml) wurde bei 24° unter Atmosphärendruck hydriert, bis das theoretische Volumen (322 ml) an H₇ absorbiert war ( < 5 Minuten). Dieser Mischung wurde eine Lösung

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BOEHMERT & BOEHMERT

von roher 10-CHO-FA (37,1 g von 30 g FA) in CF₃CO₂H (900 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde dann unter schnellem magnetischem Rühren bei 24,5° und unter Atmosphärendruck hydriert. Innerhalb von 2,5 Stunden war die theoretische Menge H_ absorbiert (3,095 ml). Die resultierende Mischung wurde unter N -Druck filtriert (Celite). Das Filtrat wurde bei weniger als 40° unter reduziertem Druck verdampft, wobei sich ein trockener, poröser Schaum ergab. Nach Trocknen dieser Probe für 18 Stunden über Ρ₂°ς ^wur(^^e der Schaum in 0,5-M-HCl (200 ml) aufgelöst, die 0,1-M in 2-Merkaptoäthanol war. Die dunkle Lösung wurde auf 40 erwärmt (H₉0-Bad), mit Holzkohle (0,5 g) behandelt und filtriert. (Celite). Die Filtermasseplatte wurde mit dem 0,5-M-HCl-O,1-M-Merkaptoäthanollösungsmittel (100 ml) gewaschen. Das klargelbe Filtrat wurde bei 40° unter Vakuumabsaugung auf 2/3 seines Volumens konzentriert. Die resultierende Mischung wurde gekühlt. Der gelbe Festkörper des Chloridsalzes wurde durch Filtrierung aufgenommen, mit dem 0,5-M-HCl-0,0i-M-Merkaptoäthanollösungsmittel (25 ml) gewaschen und in Vakuum über P₃O₅- und NaOH-Pellets 18 Stunden lang getrocknet. Ausbeute, 29,9 g. X , nm: 1-N-HCl— 286, 347

ItI 3.x

(A ³⁴⁷· A³⁰² = 2 60- lit A³⁴⁸ / A ^3O5 =2 46) ^tA max' ^Amin ^ZfbO' ^±:Lt· \ax ' ^A min ^b j.

Ymax' ^cin~^1: Ί73Ο, 1655 Sh₇ 1630, 1620 sh. Pmr (CF₃CO₂D₇ 5,3% g/ml) , d~9/57 (Methenyl-CH) . TLC^Avicel, 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7) J zeigte einen langgestreckten bläulich weißen Fluoreszenzpunkt bei R_f 0,47 und einen gelben Fluoreszenz-Verunreinigungsfleck nahe dem Ursprung. Die Konzentration des Filtrates auf etwa 20 ml von dem ersten Produkt ergab einen dunkel gefärbten Festkörper: Ausbeute 0,9 g. TLC zeigte, daß diese Probe mehr gelbe fluoreszierende Verunreinigungen enthielt.

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Bei dieser Hydrierung konnten sowohl der Katalysator als auch das Lösungsmittel .rückgewonnen und wenigstens 5 χ wiederverwendet werden.

Die gelbe fluoreszierende Verunreinigung in der Probe 5,10-CH-THF) Cl eines anderen Laufes wurde durch Säulenchromatographie entfernt. Diese Probe (0,50) wurde mit einer Rate von 6 ml/10 min. aus einer Avicel-Säule (75 g) mit HCl (pH 2,3), die in 2-Merkaptoäthanol 0,01-M war, ausgewaschen. Die Fraktionen 20-25, welche kristallines (5,10-CH-THF)⁺Cl enthielten,wurden kombiniert und in Vakuum unterhalb Raumtemperatur zu einer dicken Aufschwemmung konzentriert. Der gelbe Festkörper wurde durch Filtration unter N aufgenommen, mit EtOH und Et20 gewaschen und in Vakuum 18 Stunden lang über P₉O getrocknet: Ausbeute 0,24g (48% Rückgewinn) . A. . nm (£ χ 10 ) : 1 N HCl — 286 (12,4),

Iu 3.X

347 (25,8) r_A347 303 ₌ J ^ -1

L max ' min ' ■*■ max' 1660 sh, 1630 br. Pmr (CF₃CO₂D, 5,3% g/ml), (f 9,56

(Methenyl-CH) . TLC [[ DEAE-Zellulose; O,005-M-Phosphatpuffer, 0,5 M NaCl, O,2 M-Merkaptoäthanol (pH 7)1 zeigte einen größeren Fleck und eine Spur eines Punktes einer niedriger absorbierenden Verunreinigung.

Analyse: Berechnet für C₃ H₂₂ClN₇Og-O₇IHCl-H₂O: C, 46,78; H, 4,73; Cl, 7,59; N, 19,09. Gemessen: C, 46,87; H, 4,79; el, 7,50; N, 18,99.

Die Fraktionen 26 - 42 der oben beschriebenen Säule wurden in derselben Weise behandelt: Ausbeute, 0,14 g (28% Rückgewinnung). £ , nm: 1 N HCl-286, 347

Iu 3.x

IA ^^ / A³?³ = 2,62Ί . TLC dieser Probe war ähnlich

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0982Ϊ/⁰⁵⁹⁶

BOEHMERT & EOEHMERT - - _o - _ _n _

dem ersten Produkt. Die Gesamtmenge, die rückgewonnen wurde, betrug 0,38 g (76%).

Bei einem anderen Lauf wurde eine Probe von rohem (5,10-CH-THF)⁺Cl" (100 mg) mit einer Rate von 4 Tropfen/ Minute aus einer Avicel-Säule (15 g) (einmal 55 cm) mit 0,1-M-HCO₂H-O,01-M-Merkaptoäthanol ausgewaschen. Zwölf Fraktionen (jeweils 5 ml) wurden gesammelt, wobei die Fraktionen 5-7 abgelagertes kristallines Produkt ablagerten. Diese Fraktionen wurden kombiniert und gekühlt. Der Festkörper wurde durch Filtration aufgenommen, mit 0,1-M-HCOpH-O,01-M-Merkaptoäthanol gewaschen und im Vakuum über P₂°5 getrocknet. Ausbeute 12mg (12% Rückgewinnung) . Dieses Material war bei TLC (DEAE-Zellulose) homogen. Die Mutterlauge dieser Probe und die Fraktion 4 und 8-12 wurden kombiniert und bis zur Trockenheit abgedampft. Der resultierende Rückstand (70 mg) wurde aus 0,1-M-HCO₂H-O,01-M-Merkaptoäthanol rekristallisiert. Ausbeute 35 mg (35% Rückgewinnung oder Ausbeute). X _max, nm (£x 10~³) : 1 N HCl-286 (12,1), 347 (25,5) Γα ³⁴⁷ / A ³?³ = 2,60J . Dieses Material zeigte sich L max ' mm ' ^{J a}

bei TLC homogen. Elementaranalysen ergaben aber, daß dieses Material eine Mischung aus dem Chlorid (34%) und der entsprechenden me so-ionischen Verbindung (66%) war.

Analyse; Berechnet für Γ 34% [(C₀^H₀₀N-O,-) ⁺C1~ i · 66% - 3H₂O: C, 46,03; H, 5,28; Cl, 2,31;

N, 18,79. Gemessen: C,46/00; H, 5,20; Cl, 2,37; N, 18,57.

B) Einer Suspension von FA-2H₃O (1673g, 3.500 Mol)

in H₂O (35 1), welche unter Stickstoffatmosphäre

stand und in einem Eisbad auf 8° gekühlt war, wurde

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langsam unter Rühren 50%ige NaOH zugesetzt (370 ml). Die resultierende klargelbe Lösung (pH 8, Messung) wurde neun Stunden lang mit einer Lösung von NaBH. (1673 g) in H2O (5 1) behandelt. Während des Zusetzens stieg die Temperatur bis auf einen Maximalwert von 17°. Die Lösung wurde weitere 30 Minuten gerührt, woraufhin überschüssiges NaBH- mit konzentrierter HCl zersetzt wurde. Die große Menge Ho/ die dabei erzeugt wurde, wurde über eine Haube abgegeben. Während der ersten Hälfte des Zersetzungsschrittes war eine wirksame Kühlung notwendig, um die Temperatur der Lösung unterhalb 24° zu halten. Die Zersetzung von NaBH war nach dem Zusetzen von 2.000 ml konzentrierter HCl im wesentlichen vollständig, wobei diese eine Zeitdauer von 3 Stunden erforderte. Die resultierende Lösung (pH 8,3) wurde mit 500 ml konzentrierter HCl über einen Zeitraum von 30 Minuten auf einen pH von 6,6 eingestellt. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Lösung von Ascorbinsäure (175 g) in H₃O (800 ml) zugesetzt, um die THF gegen Luftoxidation zu schützen. Der pH-Wert der Lösung wurde dann mit weiteren 1800 ml konzentrierter HCl über eine Zeitdauer von einer Stunde auf 3,5 eingestellt. Die resultierende cremefarbene Suspension von THF wurde in einen Buchner-Trichter (11-1. Kapazität) gepumpt, der mit einem Glasfaserpapier (Whatman GF/D) versehen war, wobei dies unter N₂-Atmosphäre erfolgte. Diese Filtration (Saugdruck) erfolgte wegen der großen Festkörpermenge in zwei Posten. Nahe dem Ende der Filtration wurde ein kleiner Teil (/v50 g) der THF-Aufschlemmung Luft ausgesetzt und ausgeschieden. Jeder Posten des nassen Niederschlages wurde in einer Mischung von 98 : 2-HCO₃H (97%)-CF₃CO₂H aufgelöst und unter Saugvakuum in einen 24-1-Kolben übertragen. Ein

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2a

Gesamtvolumen von 12, 750 ml der Säureini sch ung wurde verwendet. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur für 14 Stunden wurde die dunkelrote Lösung zur Trockenheit im Vakuum bei einer maximalen EUO-Bad-Temperatur von 60 verdampft. Der oberflächlich getrocknete Rückstand wurde in 0,5-N-HCl (35 1), xvelche 2-Merkaptoäthanol (1 ml/1 Säure) enthielt, suspendiert auf 45° erwärmt und daraufhin das Ganze unter Saugdruck konzentriert, um Ameisensäure und Trifluoressigsaure ("J3 1) zu entfernen. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur für 18 Stunden wurde das (5,10-CH-THF)⁺Cl" durch Filtration auf einem Glasfaserpapier aufgenommen, mit 0,01-N-HCl (6 1) gewaschen und im Vakuum über P₃O₁-getrocknet.Ausbeute 1119 g (63%). Eine Boranalyse zeigte daß keine Borsalze vorhanden waren.

Analyse: Berechnet für (C₃₀H₃₃N₇O,.) Cl *^H2^{0: C}' ^7,11; H, 4,74; Cl, 6,75; N, 19,23. Gemessen: C, 47, 24; H, 4,65; Cl, 7,16; N, 19,28.

Durch Konzentration des Filtrates auf etwa ein Drittel des ursprünglichen Volumens wurde ein zweites Produkt abgelagert, welches weniger reines (5,10-CH-THF) Cl: war. Ausbeute: 95 g (^5%). Die Gesamtausbeute betrug 1214 g (^68%).

Die Modifizierung des oben beschriebenen Produktes

ergab eine höhere Ausbeute von (5,10-CH-THF) Cl .

FA-2HO (10,0 g, 20,9 mmol) wurde mit NaBH₄ behandelt, überschüssiges NaBH. zersetzt und die resultierende Lösung (pH 7) mit 95%-HCO₂H (270 ml) verdünnt. Während

des Zusetzens von HCO₃H wurde ein Niederschlag von

5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure gebildet, welche rasch wieder

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BOEHMERT & BOEHMERT

aufgelöst wurde, sobald das HCO-H-Volumen stieg (EndpH 1,1). Nach Stehenlassen für 18 Stunden bei Raumtemperatur wurde ein anorganischer Niederschlag (5,6 g) durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit konzentrierter HCl (3,5 ml) behandelt und unter reduziertem Druck bei 40° zur Trockenheit abgedampft. Der resultierende Festkörper wurde durch Rühren mit kalter 1%iger Ascorbinsäure (100 ml) gewaschen, durch Filtrieren aufgenommen, mit weiterer 1%iger Ascorbinsäurelösung gewaschen und im Vakuum über Po⁰S getrocknet. Ausbeute 10,0 g. Eine Boranalyse zeigte, daß diese Probe Bor enthielt.

Analyse: Berechnet für C-^H_n-ClN-O,-0,3H_B0_o·2H_nO:

ZU ZZ /D JjZ.

C,43,96; H, 4,96; B, 0,59; Cl, 6,49; N, 17,94. Gemessen: C, 43,78; H, 4,89; B, 0,61; Cl, 6,59; N, 17,70.

Der vorstehend angegebene Festkörper wurde eine Stunde lang in kalter 0,5-N-HCl (100 ml) gerührt, welche Merkaptoäthanol (0,1 ml) enthielt, durch Filtration unter N_n-Druck rückgewonnen, im Trichter mit zusätzlicher 0,01-N-HCl (100 ml) gewaschen und im Vakuum über P₂ ⁰R getrocknet. Ausbeute 8,4 g (79%). Eine Boranalyse zeigte, daß diese Probe eine Spur einer Borverunreinigung (gemessen: 0,06%) enthielt.

Analyse: Berechnet für C_n^H_n„ClN^O^·H_nO: C, 47,11; zu zz /ο ζ

H, 4,74; Cl, 6,95; N, 19,23. Gemessen: C, 47,34; H, 4,73; Cl, 6,84; N, 1929.

(C) Eine Lösung von THF-1,66HC1'0,74H₀O-1,68H₃BO₃ (2,4 g, 3,9 mmol) in einer 1:2-Mischung von H 0-(EtO), CH (60 ml), welche Ascorbinsäure (0,25 g) enthielt, wurde im Rückfluß fünf Stunden lang behandelt und dann

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bei Raumtemperatur 18 Stunden lang stehengelassen. Die resultierende Mischung wurde mit (EtO)₃CH verdünnt. Der Festkörper wurde durch Filtration aufgenommen, mit Et₃O gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ 9^etrocknet wobei sich rohes 5,10-CH-THF) Cl" ergab. Ausbeute 1,5 g. TLC (Avicel, 0,1-M-Phosphat, pH 7) zeigte, daß das Produkt mit fluoreszierenden Verunreinigungen und Ascorbinsäure kontaminiert war.

Beispiel 6

Reinigung von 5-CHO-THF (Zitrovorumfaktor) (A) Sephadex-G-10-SäulenChromatographie. Eine Glassäule (5 χ 118 cm) wurde in einem Abschnitt mit Sephadex G-10 (825 g) in H₂O ausgegossen und auf eine Höhe von 108 cm mit H₂O gepackt, welches mit CaO auf einen pH-Wert von 8 (Messung) eingestellt war. Eine Lösung von unreinem 5-CHO-THF'Ca (9,0 g) in wässrigem Ca(OH)₂ (pH 8) (40 ml) wurde der Säulen über einen Zeitraum von vier Stunden zugesetzt. Die resultierende Säule wurde mit demselben Lösungsmittel mit einer Rate von etwa 16 ml/ Stunde (soweit nicht anderes angegeben ist) entwickelt oder aufgeschlossen. Nach etwa 48 Stunden wurde eine Mischung von 10-CHO-FA und 10-CHO-DHF₇ welche bis in das Band, welches 5-CHO-THF enthielt, zurückging, ausgewaschen. Der vordere Teil des 5-CHO-THF enthaltenden Bandes war sichtbar gelb. Alle 30 Minuten wurden Fraktionen genommen. Das Vorhandensein von 5-CHO-THF in einer Fraktion wurde durch TLC auf Avicelplatten bestimmt.(0,1-M-NaH₂PO., pH 7). Die kombinierten Fraktionen wurden mit wässrigen Ca(OH)₂ auf etwa pH 7,5 eingestellt und mit EtOH bis zum Wolkigwerden verdünnt. Nach Kühlen in einem Eisbad (wenn nicht anders angegeben) wurde das erste Produkt durch Filtration unter

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BCEHMERT & BOEHMTIRT

N₂ aufgenommen. Ein zweites Produkt wurde aus dem FiItrat durch Zugeben von 5Volumen EtOH gewonnen. Das erste Experiment umfaßte drei Säulenläufe, deren Resultate in Tabelle 1 zusammengefaßt sind. In anderen Wochen wurde eine zweite Probe von 5-CHO-THF auf derselben Säulen chromatographiert, wobei deren Ergebnisse ebenfalls in Tabelle 1 wiedergegeben sind.

Die Resultate von Tabelle 1 zeigten, daß p-Aminobenzoy!glutaminsäure zum Ende des 5-CHO-THF enthaltenden Bandes ausgewaschen wird. Auch wird diese Verunreinigung in den (B)-Proben konzentriert, die durch absichtliches Verdünnen des Filtrates mit einem großen EtOH-Volumen erhalten wurde, um soviel Gewichtsausbeute wie möglich zu erhalten. Zusätzlich zeigten Die Ergebnisse, daß das Auswaschen des größten Teiles von 10-CHO-FA und 10-CHO-DHF nahe dem vorderen Ende des 5-CHO-THF enthaltenden Bandes auftraten. Eine größere Konzentration von 10-CHO-DHF ergibt sich in dem (A)-Proben, woraus man sieht, daß die Löslichkeit des Ca-Salzes von 10-CHO-DHF kleiner ist als des Ca-Salzes von 5-CHO-THF.

Eine Probe (0,82 g) in Tabelle 1 (Lauf I, Säule 3) wurde zurückbehalten. Die letzten drei Proben sowohl von Lauf I, Säule 3, als auch von Lauf II, Säule 2, wurden kombiniert. Die zusammengesetzte Probe (6,3 g) wurde in H 0-125 ml) aufgelöst. Diese Lösung wurde mit wässrigem Ca (OH) „ auf einen pH-Wert von 7_r5 (Messung) eingestellt und mit EtOH (^ 15 ml) verdünnt, wodurch sich eine leicht wolkige Lösung ergab, die eine geringe Menge Abfall enthielt. Während der Filtration (unter N₂) dieser Mischung unter Saugdruck begann sich aus

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dem ungefilterten Teil ein gelblicher Niederschlag abzusetzen. Der Festkörper wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum über P₂ ⁰S getrocknet, Ausbeute 0,70 g (11% Rückgewinnung). TLC (Avicel, 0,1-M-NaH₂PO₄ pH 7) zeigte, daß diese Probe hauptsächlich aus 5-CHO-THF bestand, kontaminiert mit 10-CHO-DHF, (5,10-CH-THF) und einer gelben fluoreszierenden Verunreinigung nahe dem Ursprung. HPLC zeigte, daß PABGA (<1%) 10-CHO-DHF (<2,9%), (5,10-CH-THF)⁺ (<1%

und 5-CHO-THF (95,1% aus Differenz) vorhanden waren. X 282 _Λ242
max min

282 _Λ242 ₌ _ min

Das Filtrat wurde mit zusätzlicher EtOH (Total 250 ml) verdünnt. Der weiße Niederschlag wurde durch Filtration unter N₃ aufgenommen. Ausbeute 4,8 g (76% Rückgewinnung). TLC zeigte, daß die Probe Spuren von 10-CHO-DHF sowie eine gelbe, fluoreszierende Verunreinigung nahe dem Ursprung enthielt. HPLC zeigte das Vorhandensein von PABGA (Ό%), 10-CHO-DHF (νΊ%) und 5-CHO-THF (^ 98%, durch Differenzbildung). /L , nm (G,x 10 ):

max 9 fi 9 ολο

pH 7-286 (30,4); 0,1-N-NaOH-282 (29,7). X /X- = 4,67-

ΙΠΒΧ ΙΠ1Γ1

Analyse: Berechnet für C„ H .N₇O₇^H₃O^-Ca: C, 43,87; H, 4,6O; N, 17,91; Ca, 7,32; Asche (CaO) 10,24. Gemessen: C, 43,91, H, 4,63; N, 17,80; Ca, 7,10; Asche (CaO), 10,64.

Das Filtrat der oben beschriebenen Probe wurde mit weiterer EtOH (insgesamt 625 ml) verdünnt. Der weiße Festkörper wurde durch Filtration unter N~ aufgenommen. Ausbeute 0,32 g (5% Rückgewinnung). TLC zeigte nur 5-CHO-THF. HPLC zeigte das Vorhandensein von PABGA (4,3%)

- 31 -

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TABELLE 1- - Anfang

Experiment

Anzahl der kombi- K

en Wt-

282 ,-242-

PABGA

-

in Prozent—

1

-

10-CHO-DHF

<1

_

<1

5-CHO-THF

^94

O

Roh-5-CHO-THF

nierten Fraktion

Gewonnen

L /A . max min

<3

-

10-CHO-FA

< 10

-86

-95

Ξ

Lauf I, Säule 1

(30 Min. jeweils

(Q)

1/3

und

-

* 25,6

-72

Roh-5-CHO-THF

Vol.ml)

-

3,43

< 1

(5,10-CH-THF)

-

< 8,5

~ 90

-97 -98

m

(9 g) in 40 ml

-

A 2,04^

3,04

-

«1

Ά

Lösungsmittel

Q I Λ ^r\ ^

B 1,51

3,94

2

2,7

-

<r 6,4

Λ.92

-92

ο I12ΩJ

2

-

<£ 2,5

-95

-96

A 1,79

3,99

16 (240)

B 1,98

4,59

Spur

-97

^ in

Total 7,32 (81%)

Spur

-

-98

<'

CO O

Lauf I, Säule 2

Spur

^10,4

-87

CO

5-CHO-THF (6,4 g)

Spur

* 4,0

-95 f

-

Ά

OO

von Säule 1 in 30

A 1,09=·

3,46

V J

* 99

ro

ml Lösungsmittel

11 (105)

B 1,24

4,31

Spur

2,3

< 5,4

2,4

^2,3

—

ο

9 (86)

A 0,56

4,26

-99

cn

B 0,95

4,52

Spur 1

<1,0

*2,2

NJ

co

15 (143)

-

CO

CD

Lauf I, Säule 3

A 0,90 B 0,75

4,40 4,61

Spur

^6,5

CO

5-CHO-THF (4,2 g)

Total 5,48 (86%)

Spur

< 3,8

CD

von Säule 2 in 20

IO ( /OJ

A Ο,Οδ2

4,22

cn

ml Lösungsmittel

B 0,82

4,59

Spur

< 2,5

CO

18 M 40)

1

< 1,3

CO

A Ο,Οδ2

4,54

B 2,04

4,58

-

4 (32)

A - —

-

B 0,21

4,73

3 (24)

A - 2

B 0,18

4,69

Total 3,40 (81%)

1 - Fortsetzung

IO •-3

Lauf II, Säule 1 Roh-5-CHO-THF (9 g) in 40 ml Lösungsmittel

Lauf II, Säule 2 5-OKHTHF (5,4 g) in 25 ml Lösungsmittel

12 (94)

12 (94)

10 (78)

A 1,45^ 3,43

B 2,18 4,14

A 1,13 4,16

B 1,09 4,50

A 0,41 4,06

B 0,67 4,54
Total 6,93 (77%)

C 1

1/1 8,0

1 2,2

7 (53)

14 (105)

26 (195)

A 0,01^S - Spur

B 0,53 4,04 Spur

A 0,17-2 4,35 Spur

B 1,65 4,61 * 1

A 0,32^ 4,44 < 1

B 1,99 4,52 4,3 Total 4,67 (86%)

O7,4	-80
<L7	~ 91
	~ 90
	^96

C 9,4

89

DJ O crt

	6	<~93
	1	/-96
^3,	5	/«-95
<*2,	3	/-94
^1,

■%)ϊε Sephadex-G-iO-Säule wurde mit wässrigem Ca(OH)₂ (5.000 ml) zwischen jedem Lauf gewaschen.—A bezieht, sich auf das erste Produkt, B auf das zweite Produkt. — Bestimmt in 0,1-N-NaOH. Lederle's 5-CHO-THF-Verhältnis 4,86. — Menge an Verunreinigungen abgeschätzt durch HPLC; 5-CHO-THF bestimmt durch Differenzbildung, wobei der Prozentgehalt an Solvaten und Calzium nicht in Rechnung gestellt wurde. Auch wurden kleine Peaks unidentifizierter Substanzen beobachtet. —Niedergeschlagen aus H₂O mit EtOH, wobei 1,1 g (Verhältnis = 3,36) erhalten wurden, eingeschlossen in der für Säule 2 verwendeten Probe. — Ausgeschlossen von Säule 3. ^- Die gekühlte Mischung ließ man bei Raumtemperatur sich erwärmen, wobei der größte Teil des Niederschlages wieder aufgelöst wurde.— Ausgeschlossen aus Säule 2, Lauf II.

co

co 00

cn co

U)

	Flußrate ml/min	Saitnelzeit, Stunden	TABELLE 2	Volumen 25%^ CaCl0, ml	Probe Gewicht g	λ282/ ^max '	λ242 min
Fraktion	0,6	6,5	Volumen ml	2	0,36	4	,38
1	0,6	10	234	3	1,2	4	,62
2	3,0	8	360	2	0,50	3	,86
3	0,6	16	1.400
4	5,0	5	576 Ib	4	0,18	2	,84
		1.500 J~

Total 2,24 (75% Ausbeute)

— Nach Konzentrierung der Fraktion in Vakuum. — Kombinierte Eluate.

Co

CO O W

rc	—	Ί
GD		ΐ
	i "2	V
		1!
%ji
CO
CO
i i

BOEHMERT & BOEHMERT

37, 2836533

und 5-CHO-THF (95,7% durch Differenz) .\²⁸²/λ.²?² = 4,65.

max min

Die Gesamtausbeute betrug 5,8 g (92%).

Gereinigte Proben des Calziumsalzes von 5-CHO-THF

ο O O O A O

gaben einenX /X- -Wert zwischen 4,6 - 5,4, wahr-

³ max ' ' mxn ' ' '

scheinlich, weil eine leichte Änderung im Minimum zu einer großen Änderung im Verhältnis führte.

(B) Florisil-Chromatographie. Florisil (250 g, 100 200 Maschen) wurde in H₃O (dreifach) suspendiert, woraufhin die Feinanteile durch Filtration entfernt wurde. Die definierte Aufschlemmung von Florisil wurde in eine Glassäule (3,8 χ 67 cm) gegossen und mit H₃O gewaschen, bis der Ausfluß klar war. Dann wurde mit 0,2%igem wässrigem Merkaptoäthanol (4000 ml) gewaschen. Nach Zugeben einer Lösung von unreiner 5-CHO-THF (3,0 g) in 0,2%igem wässrigem Merkaptoäthanol (10 ml) wurde die Säule mit 0,2%igem wässrigem Merkaptoäthanol mit einer Rate von 0,3 ml/min entwickelt. Der Fortgang der Entwicklung wurde durch einen UV-Monitor verfolgt. Nach 17,5 Stunden wurde ein üV-absorbierendes Material, vermutlich p-Aminobenoy!glutaminsäure, von der Säule über die nächsten acht Stunden ausgewaschen. Zu diesem Zeitpunkt (25,5 Stunden) begann 5-CHO-THF auszufließen, woraufhin vier Fraktionen gesammelt wurden (siehe Tabelle 2). Jede Fraktion wurde im Vakuum (ölpumpe) bei ¹^ 45° auf etwa 1/5 ihres Volumens konzentriert, sobald sich ein nicht-weißer, ausflockender Festkörper niederzuschlagen begann. Jede der resultierenden Mischungen wurde auf einen pH-Wert 12 (Messung) mit 1-N-NaOH eingestellt und durch eine dünne Celite-Filterplatte filtriert, um

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BOEHMERT & BOFHMERT

2836593

das leicht Gelatinartige unlösliche Material (MgO) zu entfernen. Die klaren Filtrate wurden dann auf einen pH 7 (Messung) mit verdünnter HCl eingestellt, mit 25%iger wässriger CaCl₂-Lösung behandelt (geklärt durch Filtrierung), wieder auf einen pH von 7,5 (Messung) eingestellt und langsam mit 5 Teilen (Volumen) kalter EtOH verdünnt. Die weißen Niederschläge wurden durch Filtrierung aufgenommen und im Vakuum über P₂^q getrocknet.

Bei einer früheren Florisil-Chromatographiearbeit an Roh-5-CHO-THF-Proben mit schneller Strömungsrate wurden die blau fluoreszierenden Punkte oberhalb und unterhalb 5-CHO-THF (TLC) vor und während des Auswaschens von 5-CHO-THF eluiert, nicht also im Anschluß an 5-CHO-THF wie dies oben beschrieben wurde. Obwohl Florisil für 10-CHO-FA und 10-CHO-DHF bei der langsameren Rate bessere Absorptionseigenschaften haben mag, zeigten andere Arbeiten, daß unter diesen Bedingungen die basische Natur der mobilen Phase (pH /\/8,5) zur Zersetzung dieser Verunreinigungen führte.

Die Probe von Fraktion 1 schien ein wasserunlösliches Material zu enthalten und wurde erneut aus einer wässrigen Lösung mit EtOH niedergeschlagen. Ausbeute

0,29 g (6,5% von FA); λ Hl/X^ = 4,37. HPLC

max min

zeigte, daß diese Probe nur Spurenbeträge an UV-absorbierenden Verunreinigungen enthielt.

Analyse: Berechnet für C„ H ..N₇O '3,8H-O-Ca: C, 41,42;

H, 4,97; N, 16,91; Ca, 6,91; Asche (CaO), 9,67.

Gemessen: C₇ 41,36; H, 4,91; N, 16,74; Ca, 7,04; Asche (CaO), 9,78.

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BOEHMERT & BOEHMERT

Die Probe von Fraktion 2 (1,2 g, 27% von FA) enthielt nur Spurenmengen an UV-absorbierenden Verunreinigungen (HPLC) und wurde ohne weitere Reinigung analysiert.

Analyse: Berechnet für C« H₂₁N₇O · 3,5H₂CTCa: C, 41,81;

H, 4,91; N, 17,07; Ca, 6,98; Asche (CaO) 9,77.

Gemessen: C, 41,85; H, 4,85; N, 16,90; Ca, 6,93; Asche (CaO), 10,17.

Die Gesamtausbeute von praktisch reiner 5-CHO-THF betrug 1,49 g (33,5% von FA).

Fraktion 3 ergab eine Probe, die, wie HPLC-Versuche zeigten, die nachfolgenden UV-absorbierenden Komponenten enthielt: p-Aminobenzoy!glutaminsäure (Ό%), 10-CHO-DHF (<5,5%), 10-CHO-FA (<1%) und 5-CHO-THF (<92,5%, durch Differenz).

Die Probe von Fraktion 4 zeigte (HPLC) die folgenden Komponenten: p-Aminobenzoylglutaminsäure (<2%), 10-CHO-DHF (<20%), 10-CHO-FA (<1%) und 5-CHO-THF (<77% durch Differenz).

Bei großtechnischer Synthese wurde Folsäure (600 g) in das unreine Calziumsalz von 5-CHO-THF über die katalytische Hydrierung von 10-CHO-FA über Pt in CF₃CO₂H umgewandelt. Vier „Glassäulen (8 χ 120 cm) welche Florisil (2,6 kg) enthielten, wurden in der oben beschriebenen Weise präpariert. Die 5-CHO-THF-Probe (465 g) wurde in 16 Portionen aufgeteilt. Jede Portion (24 - 30 g) wurde (mit einer Rate von 3-5 ml/min) von einer der Säulen eluiert, wobei jede

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BOEHMERT & BOEHIviERT

kö-

Säule viermal verwendet wurde. Der Entwicklung oder Auswertung einer Säule schloß sich eine Bestimmung des HPLC-Chromatogrammes des Eluates an. Während des ersten Laufes erschien das 5-CHO-THF-Band nach Aufnehmen eines Volumens von 5 1. Bei späteren Läufen auf derselben Säule wurde ein Volumen von 7,5 1 gesammelt, Ehe das Auslaufen von 5-CHO-THF begann. Jede 5-CHO-THF-Fraktion (~^4,5 1) wurde in der oben beschriebenen Weise behandelt. Die kombinierten Proben wurden mito„-freiem H₂O extrahiert und gefiltert, um ein unlösliches Material zu entfernen. Das Filtrat wurde lyophilisiert, um so das Produkt zu erhalten, Ausbeute 213 g (28% von FA). Das HPLC-Chromatogramm zeigte nur Spurenmengen von p-Aminobenzoylglutamin-

säure und 10-CHO-DHF. λ , nm (^x 10~³): pH 7 -287

max 9 Q 9 -ν 9 λ ο (31,5); 0,1-N-NaOH - 282 (30,8). λ^χ / ^min ^{= 4}'⁸'

(C) Nichtchromatographische Reinigung von Zitrovorumfaktor. (1) Der hygroskopische, braune, gummiartige Rest (^400 g) , der Glasfaser-Filtermasse enthielt und der bei der Umwandlung von (5,10-CH-THF) Cl zu 5-CHO-THF⁰Ca erhalten wurde, wurde unter Na„ in entgastem H₉ (4 1) gerührt. Der pH-Wert des Mediums wurde mittels fester CaOH₂ (^Ig) auf 7,5 eingestellt. Die Glasfasern wurden durch Filtration entfernt, und der Rest wurde mit Portionen entgasten Wassers (2 1) ausgewaschen, bis die Auswaschungen farblos waren. Das klare Filtrat wurde in einem Eisbad gekühlt und mit 0,1 Teil (Volumen) EtOH (600 ml) verdünnt. Der niedergeschlagene dunkle, hygroskopische, gelblichbraune Festkörper wurde durch Filtration aufgenommen, mit EtOH gewaschen und im Vakuum über P₉O getrocknet.

Ausbeute 199 g. A^ / λ ^_n = 3,7.

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BOEHMERT & BOEHMERT

Das Filtrat wurde mit zusätzlicher EtOH (Total 3 1) verdünnt. Der niedergeschlagene blasgelbe Festkörper wurde durch Filtration aufgenommen, mit EtOH gewaschen und im Vakuum über PpO_n. getrocknet. Ausbeute

_Λ- _% 282 , ι 242 ο or.

17 er. λ /Λ . = 3.9Ο.

^{y ft}max ' ^min *

Das klare, gelbe Filtrat wurde mit weitere EtOH (Total 15 1) verdünnt. Nach dem Kühlen wurde der resultierende cremefarbene Niederschlag durch Filtration aufgenommen, mit EtOH gewaschen und im Vakuum über P₂°5 gewaschen. Ausbeute 75 g. J^ /\ 7 (0,1-N-NaOH) = 4,19. Die HPLC-Untersuchung dieser Probe zeigte , das Vorhandensein von 5-CHO-THF ·Ca (85%), PABGA-Ca (*^2%), 10-CHO-DHF-Ca (a/2%), 10-CHO-FA-Ca (Spuren) und Pterinen (^1%). Ohne Zweifel enthielt diese Probe weiterhin auch EtOH und H₃O (<1O%).

(2) Zusätzliche Experimente wurden an Portionen des Großproduktes von unreiner 5—CHO-THF ausgeführt, die nach dem unter (C-1) beschriebenen Verfahren erhalten wurde.

Eine schlammige Lösung dieses Materials (3,00 g) in H₃O (100 ml), die etwa eine equimolare Menge an MgCl₃-OH₂O (1 g) enthielt wurde portionsweise mit festem Ca(OH)₂ behandelt. Der pH-Wert stieg rasch auf etwa 10,5. und blieb dann zwischen 10,5 und 10,8. Während dieser Periode trennte sich ein gelblichbraunes kornförmiges Prezipitat von der Mischung, woraufhin der pH-Wert rasch beim weiteren Zugeben von Ca(OH) auf 12 stieg. Nach Rühren für weitere 30 Minuten wurde der FEstkörper durch Filtration unter N_-Druck entfernt und im Vakuum über P₀O₁. getrocknet.

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BOEHMERT & BüEHMERl

-<f2-

Ausbeute 1,40 g. Der größere Teil dieses Rückstandes ist wahrscheinlich aus CaO und MgO zusammengesetzt. Das HPLC-Chromatogramm zeigte aber das Vorhandensein einer Anzahl von Verunreinigungen und etwas 5-CHO-THF.

Das klare Filtrat wurde mit verdünnter HCl auf einen pH-Wert von 5,7 eingestellt. Anschließend wurde tropfenweise EtOH (^20 ml) zugegeben, bis eine dauernde Trübung erreicht war. Diese Mischung wurde auf 1O° gekühlt. Der gelbe Festkörper wurde durch Filtration aufgenommen und im Vakuum über Ρ₉0_ς getrocknet. Ausbeute 0,64 g.\ /X- = 3,71.

max min

Das HPLC-Chromatogramm zeigte, daß diese Probe nur geringe Mengen an üblichen Verunreinigungen enthielt, jedoch große Mengen an FA und ein unidentifiziertes Material mit einer längeren Rückhaltezeit. Anscheinend wurden FA und das unidentifikierte Material während der Basenbehandlung der Probe in Anwesenheit von MgCl₂ erzeugt. Eine Magnesiumanalyse zeigte das Vorhandensein von Spuren Magnesium, (0,003%).

Analyse: Berechnet für C_o_H_o1N_0_· CaO,5C„H,_0· 1 ,2H_0:

ZU ZlJ/ Zb Z

C, 45,35; H, 4,78; N, 17,63; Ca, 7,21; Asche (CaO), 10,O8. Gemessen: C, 45,11; H, 5,01; N, 17,38; Ca, 7,2O; Asche (CaO) 10,07.

Das Filtrat wurde mit drei Volumenteilen EtOH (300 ml) verdünnt. Die resultierende Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt. Der weiße Festkörper wurde durch Filtration aufgenommen, mit EtOH gewaschen und im Vakuum über Ρ->0_ς getrocknet. Ausbeute 1,33 g.

npo ΟΛΟ

npo ΟΛΟ

Λ _max /A_min ^{= 4}/⁷⁸· ^Die HPLC-Untersuchung und die

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BOEHMERT & BGEKMERT

Elementaranalyse zeigte das Vorhandensein von 5-CHO-THF-Ca (86%), PABGA-Ca (1%), 10-CHO-DHF (V1%), 10-CHO-FA (<1%), Pterinen (<1%), EtOH (4,2%), H₂O (3,3%) und unidentifiziertem Material (^2,5%).

Analyse; Berechnet für C H₂₁N₇O -Ca-OiSC^gO-I^O: C, 45,65; H, 4,74; N, 17,75; Ca₇ 7,25; Asche (CaO) 10,14. Gemessen: C, 45,59; H, 5,06; N, 17,69; Ca, 7,51; Asche (CaO) 10,51.

Wenn das vorstehende Experiment unter Verwendung des zweifachen Gewichtes an MgCl- wiederholt wurde, ergab sich eine kleinere Ausbeute (0,77 g) an gereinigter 5-CHO-THF.

Die Erfindung und .zahlreiche ihrer offensichtlichen Vorteile sollten aus der vorstehenden Beschreibung hervorgehen. Innerhalb des Erfindungsgedankens sind selbstverständlich mannigfache Abwandlungen und Ausgestaltungen der beschriebenen Verfahrensweisen möglich.

Insgesamt handelt es sich bei der Erfindung um die Herstellung und Reinigung von Zitrovorumfaktor. Das Verfahren umfaßt verbesserte Methoden der Hydrierung von 10-Formylfolsäure sowie zur Reduzierung von Folsäure» Weiterhin sind auch Verfahren zum öffnen des Imidazolinringes sowie ein nicht-chromatographisches Verfahren zum Reinigen von Roh-Zitrovorumfaktor angegeben .

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Claims (5)

1. ANSPRÜCHE

   Λ J Verfahren zum Herstellen von Zitrovorumfaktor, dadurch gekennzeichnet, daß 10-FormyIfölsäure in Trifluoressigsäure zu 5,1O-Methenyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure hydriert wird.
2. 2. Verfahren zum Herstellen von Zitrovorumfaktor, dadurch, daß Folsäure mit Natriumborhydrid reduziert und die resultierende Tetrahydrofölsäure in Anwesenheit von Ascorbinsäure als Antioxydanz isoliert wird.
3. 3. Verfahren zum Herstellen von Zitrovorumfaktor, dadurch gekennzeichnet, daß Folsäure mit Natriumborhydrid reduziert und eine wässrige Lösung der resultierenden Tetrahydrofolsäure zur Gewinnung von 5,10-Methenyl-5_f6,7,8-Tetrahydrofölsäure mit Ameisensäure behandelt wird.
4. 4. Verfahren zum Herstellen von Zitrovorumfaktor, dadurch gekennzeichnet, daß der Imidazolinring von 5,10-Methenyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure unter neutralen oder leicht sauren Bedingungen, bei einem pH-Wert von etwa 6,2 bis 7,0, geöffnet wird.

   90982770596

   BOEHMEOT & BCEHMhZRT
5. 5. Verfahren zum Herstellen von Zitrovorumfaktor, dadurch gekennzeichnet, daß Rohausbeuten von Zitrovorumfaktor durch Einstellen des pH-Wertes einer wässrigen Lösung von Zitrovorumfaktor und Magnesiumchlorid auf einen pH-Wert von 12 zum Erzeugen eines Verunreinigungen enthaltenen Niederschlages eingestellt und Zitrovorumfaktor aus dem FiItrat rückgewonnen wird.

   909827/0596