DE2819110C2

DE2819110C2 - Verfahren zur Synthese von biologischen Peptidwirkstoffen

Info

Publication number: DE2819110C2
Application number: DE19782819110
Authority: DE
Inventors: Harald Dr.rer.nat. 7000 Stuttgart Porcher; Karl Prof. Dr.med. 7302 Ostfildern Theurer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-04-29
Filing date: 1978-04-29
Publication date: 1985-05-02
Also published as: DE2819110A1

Description

Beispiel

Synthese von Tumorhemmstoffen, die aus dem maternen Anteil der Rinderplazenta durch Fraktionierung gewonnen wurden (vgl. K. Letnansky: österreichische Zeitschrift für Onkologie (1977) S. 42—45) und die nur in sehr geringen Mengen aus dem Gewebe isoliert werden können, so daß die Aufklärung der chemischen Struktur und deren Synthese auf Schwierigkeiten stößt. Es wird dabei die durch Bioassay getestete biologische Fraktion mit dem niedrigsten Molekulargewicht als Immunogen zur Sensibilisierung Antikörper-erzeugender Tiere, z. B.

Kaninchen, Schafe, Hühner u. a. verwendet und falls das Antigen nicht in ausreichender Menge zur aktiven Immunisierung mit Boosterung zur Verfügung steht, als Immunogen zur Sensibilisierung von Lymphozyten-Zellkulturen bzw. Hybrid Zellkulturen. Der entstehende Antikörper wird durch Bioassay auf sei.ie Fähigkeit zur Blockierung der biologischen Wirkung des ursprünglichen Antigens bzw. des Peptid-Haptens, das zum Vollantigen komplettiert wurde, getestet. Durch Absorption und Absättigungsmethoden wird der spezifische Antikörper rein gewonnen und seine antideterminante Gruppe in Form von Antikörperfragmenten isoliert und als Antigen verwendet. In vitro können iRNA mit der Syntheseinformation gegen diese Idiotyp-Gruppe gewonnen werden. Diese lassen sich zur Sensibilisierung von Antikörper-spenderiden Individuen zur Erzeugung eines Anti-Idiotyp-Antikörpers einsetzen. Die Antikörpersynthese kann ebenfalls in vitro erfolgen, insbesondere auch in Hybridzellen, z. B. aus Plasmocytom-Zellen und Lymphozyten. Der gebildete Anti-Idiotyp-Antikörper wird durch Adsorption bzw. Absättigung nach bekannten Verfahren isoliert und seine antideterminante Gruppe bzw. die entsprechenden Antikörperfragmente, die diese enthalten, gewonnen. Die biologische Wirkung

des zweiten Antikörpers bzw. der daraus gewonnenen Antikörperbruchstücke werden durch Bioassay in gleicher Weise wie ursprünglich der Peptidwirkstoff getestet. Die biologischen Wirkungen müssen mit diesem übereinstimmen, jedoch nicht die chemische Struktur.

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Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von biologischen Peptidwirkstoffen unter Verwendung eines isolierten Peptidwirkstoffs zur Gewinnung eines primären Antikörpers.' dadurch gekennzeichnet, daß man mit den antideterminanten Gruppen oder den Fragmenten dieses primären Antikörpers einen Anli-Idiotyp-Antikörper. dessen determinate reaktive Gruppe in Form von leichten oder schweren Ketten - öder dessen Fab-Fragment erzeugt.

Das Verfahren des Patentanspruchs dient der Synthese von Peptidwirkstoffen. wie z. B. niedermolekularen Regulationsstoffen des Synthesestoffwechsels in Form von Inhibitoren. Repressoren oder Stimulatoren. wie auch von hcnronähnJichen Stoffen. Dabei ist eine Aufklärung der chemischen Struktur des Moleküls nicht erforderlich. Vielmehr werden nach bekannten Verfahren isolierte Moleküle als Muster für die Gewinnung von Stoffen mit ähnlichen biologischen Eigenschaften verwendet, vergleichsweise wie bei den Isoenzymen, bei denen die Wirkgruppe, weniger aber die Gesamtstruktur des Moleküls für die bestimmte Wirkung verantwortlich ist. Der Nachweis der biologischen Wirkung erfolgt durch Bioassay: die Erzeugung dieser funktionell ähnlichen Stoffe durch bekannte immunbiologische Methoden, die hier in besonderer Verfahrensweise und Reihenfolge verwendet werden. Es werden dabei die isolierten Peptidwirkstoffe als Antigen verwendet zur Gewinnung eines primären Antikörpers in einem antikörpererzeugenden Organismus (vgl. Hans Schmidt: Die Grundlagen der spezifischen Therapie: Immunisierung der Tiere. Bruno Schulz Verlag. Berlin 1940) oder aber in einem in vitro System zur Erzeugung von Antikörpern in Lymphozyten oder Hybridzellen-Kulturen (vgl. A. Bussard: Cellular hybridisation in immunology: Vortrag beim 4. Europäischen Immunologie-Meeting. Budapest 12. — 14.4.1978). Die in vitro Gewinnung von Antikörpern hat den Vorteil, daß hier nur sehr geringe Antigenmengen erforderlich sind und das Antikörperspektrum durch klonale Antikörpersynthese eingeschränkt wird. Falls die Peptidwirkstoffe nicht ausreichend immunogen sind, kann ihre Spezifität durch bekannte Verfahren der Komplettierung durch Konjugation mit einem Carrier oder durch Verwendung von Adjuvantien verstärkt werden (vgl. C. Steffen: Allgemeine und experimentelle Immunologie und Immunpatholngie: Georg Thieme Verlag: Herstellung konjugierter Antigene S. 560). Zur Reinigung und Isolierung der so gewonnenen Immunglobuline können die Verfahren, die ebenfalls in C. Steffen S. 562 u. f. angegeben sind, verwendet werden. Auch lassen sich daraus Antikörperfragmente, wie leichte und schwere Ketten und das Fab-Fragment. wie auch monovalente Antikörper gewinnen (vgl. C. Steffen: S. 571 u. f.). die den Ausgangsstoff spezifisch blockieren und für solche Zwecke unmittelbar eingesetzt werden können, d. h. also die Aufhebung einer Inhibition oder Repression wie auch andererseits des stimulierenden Effekts.

Die Isolierung des ursprünglichen Peptidwirkstoffes zur Gewinnung solcher Immunglobuline kann nach bekannten Methoden erfolgen, wie sie K. Letnansky verwendet hat (Charakterisierung eines tumorspezifischen Inhibitors aus dem mütterlichen Anteil der Rinderplazenta: Österreichische Zeitschrift für Onkologie VoL 4 Nr. 2—3 S.42—4dJ 1977: VgL auch Einheitsprüfung für Antigene bei C Steffen S. 594). Die antideterminanten Gruppen bzw. die Anükörperfrägmente werden nun selbst als Immunogen zur Bildung eines zweiten Antikörpers entweder in vivo oder auch in vitro nach entsprechenden Verfahren wie bei der Gewinnung des ersten Antikörpers verwendet. Dieser Anti-Idiotyp-Antikörper, und besonders seine determinante reaktive Gruppe in Form von leichten und schweren Ketten oder dem Fab-Fragment haben dieselbe biologische Wirkung, wie der primär als Antigen verwendete Peptidwirkstoff. Dies läßt sich ebenfalls durch Bioassay testen.

Die Synthese dieses Anti-Idiotyp-Antikörpers kann in vitro kontinuierlich in Hybridzellen aus einem Plasmocytom und Lymphozyten erfolgen, wobei die Immunglobuline aus dem Medium der Zellkultur abgescc 3"pft werden und dieses Medium erneuen wird. Die Isolierung dieses zweiten Antikörpers und die Gewinnung der antideterminanten Gruppe erfolgt nach den oben beschriebenen, bei Steffen angegebenen. Verfahren. Es ist auch möglich, die Syntheseinformation für diesen Anti-Idiotyp-Antikörper in vitro analog dein Verfahren von

D. Jachertz (Flow of information and gene activation during antibody synthesis. Ann. N. Y. Acad. Sei. 207 (1973) 122—144) als informative RNS zu gewinnen und diese zur spezifischen Sensibilisierung von Antikörperproduzierenden Individuen zu verwenden. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Wirksamkeit geringster Mengen dieser informativen RNA.