DE2352662A1

DE2352662A1 - Verfahren zur herstellung eines uebertragungsfaktors

Info

Publication number: DE2352662A1
Application number: DE19732352662
Authority: DE
Inventors: Jean-Michel Goust; Robert Louis Moulias
Original assignee: Piktor Ltd
Current assignee: Piktor Ltd
Priority date: 1972-10-20
Filing date: 1973-10-19
Publication date: 1974-05-02
Also published as: IE39141L; FR2203622B1; ZA738085B; IE39141B1; CA996481A; AU6166873A; SE416820B; FR2203622A1; NL7314505A; BE806251A; AT330349B; JPS4993523A; GB1443948A; CH581196A5; IL43453A0; ATA887873A; IL43453A

Description

PATENTANWÄLTE HENKEL—-KERN —FEILER —HÄNZEL—MÜLLER

DR. PHIL. DIPL.-ING. DR. RER. NAT. DIPL.-ING. DIPL.-ING.

05 29 »02 HNKi. D EDUARD-SCHMID-STRASSE 2 bayerische Hypotheken- und

TELEFON: (08 I!) 6« 31 97. 66 30 91-92 llrturnCM. On VreCHSELBANK MÜNCHEN NR. 31B-SSIIl

TELEGRAMME: ELLIPSOID MÜNCHEN IJ-BUUU M U IN CIlIlJN VU - POSTSCHECK: MCHN 162147 — 80»

19. OKT. 1973

PIKTOR LIMITED, London, England

Verfahren zur Herstellung eines Übertragungsfaktors

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Iimnunisierungsmateriai und insbesondere von Übertragungsfaktoren und Interferenzstoffen.

Ein Teil der Immunisierungsreaktion beim Menschen und bei Tieren wird durch Antikörper bzw. Polypeptide gewährleistet, die einen Teil der durch die Lymphzellen erzeugten und im Blut zirkulierenden Immunoglobuline bilden, welche sich chemisch mit Antigenen verbinden, um sie zu neutralisieren. In vielen Fällen gewährleisten jedoch die Antikörper nicht den erforderlichen Immunisierungsgrad. In zunehmendem Maße - wird daher die wichtige Rolle untersucht, welche die Lympho- cyten bei der Gewährleistung der Zelienimmunität spielen. Die Lymphocyten tragen das "inununisierungsgedächtnis", und sie bieten eine natürliche Abwehr gegen Virus-

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Infektionen sowie gegen das Wachstum von Neoplasmen. Während manche Krankheitszustände durch eine mangelnde Zellenimmunität gekennzeichnet sind, ist eine Behandlung durch Transfusion von Lymphocyten aus zwei Gründen unzufriedenstellend: Erstens wird hierfür ein Spender benötigt, und zweitens können die übertragenen Lymphocyten im Empfänger eine Transplantationsreaktion hervorrufen.

Das Vorhandensein der "Übertragungsfaktoren" in Lymphocyten und ihre Rolle als Träger des "Zellenimmunitätsgedächtnisses" wurde zuerst von H.S. Lawrence belegt. Lawrence H.S., "The transfer in humans of delayed skin sensitivity to streptococcal M substance and to tuberculin with distrupted leucocytes" J. Clin. Invest (1955) 34, 219-30; Lawrence H.S., Al Askari S., David J., "Transfer of immunological information in humans with dialysates of leucocyte extracts", Trans. As. Amer. Physicians (1963) 76, 84-91; Lawrence H.S., "Transfer factor and cellular immune deficiency diseases", New. Engl. J. Med. (1970) 283, 411-9; und Lawrence H.S., "Transfer factor" Advances in Immunology (1969), 195-266. Diese Substanz, die im Menschen und in anderen Primaten gefunden wurde, kann nur Zellenimmunitäts-Ansprechen, nicht aber die Fähigkeit zur Absonderung von Antikörpern übertragen. Nach Kontakt mit einem Antigen enthält das Lymphocytengedächtnis tibertragungsfaktoren, die derzeit als spezifisch für die Klasse von Antigenen angesehen werden, welcher das Antigen, mit dem das Lymphocyt kontaktiert wurde, zugehört. Die Übertragungsfaktoren scheinen daher eine doppelte Spezifizität zu besitzen: Sie sind einmal spezifisch für eine Klasse von Antigenen und zum anderen spezifisch für die Zellenimmunität. Die Lymphocyten eines normalen Erwachsenen enthalten Jedoch öbertragungsfaktoren, welche jedem Virus-, Bakterien-

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oder dergleichen Antigen entsprechen, mit dem die betreffende Person kontaktiert wurde, so daß die Dialysate von Leucocytenextrakteii ein mehrfach spezifisches Übertragungsfaktorgemisch enthalten.

Bei einer Dialyse der Übertragungsfaktoren werden diese in einen dialysierbaren Übertragungsfäktor und einen nichtdialysierbaren Übertragungsfaktor aufgeteilt. Ersterer scheint ein kleines Molekül zu sein, dessen ungefähres Molekulargewicht auf etwa 7000 geschätzt wird? tatsächlich scheint es sich dabei aber um ein Gemisch von Molekülen mit verschiedenen Molekulargewichten zu handeln, wobei der größte Teil der Moleküle dicht bei einem Molekulargewicht von 7000 liegt, während die Zahl von Molekülen mit Molekulargewichten von wesentlich unter 4000 oder wesentlich über 10000 vernachlässigbar ist. Der dialysierbare Übertragungsfaktor scheint in der Art eines Ribonucleotides vorzuliegen, wird jedoch durch Ribonuclease nicht vollständig zerstört, so daß es sich hierbei um eine doppelke-ttige Ribonucleinsäure (RNS) zu handeln scheint. Diese ist während unbeschränkter Zeiträume stabil, wenn sie lyophilisiert und bei Temperaturen von -20⁰C aufbewahrt wird. Der nicht-dialysierbare Übertragungsfaktor ist dagegen ein größeres -Molekül und wurde als RNS mit einem Molekulargewicht von mehr als 50000 (6 bis 12 S) charakterisiert. Er ist nicht-artenspezifisch, sondern spezifisch für eine Antigenklasse und außerdem spezifisch für die Übertragung der Zellenimmunität.

Da der dialysierbare Übertragungsfaktor nicht von antigener Natur ist, d.h. keine Immunitätsreaktion einleiten kann," wird seine therapeutische Verabreichung der Lymphocytentransfusion vorgezogen. Eine versuchsweise Behand-

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lung mit Übertragungsfaktor hat sich tatsächlich bereits als erfolgreich für die Behebung von Mangeln der Zellenimmunität und für die Erzielung einer klinischen Besserung verschiedener Krankheiten erwiesen. Beispielsweise ist er bereits erfolgreich für die Behandlung von subakuter Sklerose-Panenzephalitis, system ,!scher Candidiasis,

bösartigem Melanom, Brustkrebs, Masern und Windpocken angewandt worden. Bei den bisher bekannten Verfahren, die sich auf Spenderblut als Ausgangsmaterial stützen, ist jedoch keine zufriedenstellende Herstellung der Übertragungsfaktoren als therapeutische Mittel möglich. Vielmehr ,stellt die Herstellung einer reinen Substanz aus dem Gesamtblut einen mühsamen Vorgang dar, der eine vorherige Abtrennung von Lymphoidzellen von anderen Blutfraktionen erfordert. Keines dieser bisher bekannten Verfahren eigiiet sich für die Großserienherstellung von Übertragungsfaktoren unter genormten, nacharbeitbaren Bedingungen. Da pei diesen Verfahren außerdem Spenderblut benutzt wird, Können diese Verfahren nur Übertragungsfaktoren liefern, die spezifisch sind für die Art von Antigenen, mit denen der Spender kontaktiert worden ist. Sie können aber nicht so modifiziert werden, daß sie nach Belieben einen bestimmten antigenspezifischen Übertragungsfaktor liefern, außer durch entsprechende Wahl eines zweckmäßigen Blutspenders.

Es hat sich nun herausgestellt, daß Übertragungsfaktoren in Lymphoidzellen, speziell Lymphocyten, die in vitro gezüchtet wurden, vorhanden sind und daraus gewonnen werden können, und speziell, daß die Bildung eines bestimmten antigenspezifischen Übertragungsfaktors in eine solche Kultur eingeführt werden kann. Auf dieser Grundlage wird nun mit der Erfindung die Erzeugung von

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Übertragungsfaktoren in großen Mengen nach einem genormten wiederholbaren Verfahren möglich, und die bestimmten antigenspezifisehen Übertragungsfaktoren können dabei nach Belieben produziert werden. Zudem ermöglicht die Erfindung die Gewinnung von Interferenzstoffen aus einer Lymphocytenkultur.

Allgemein gesagt, besteht die Erfindung in einem Verfahren zur Erzeugung eines Übertragungsfaktors (der ein analysierbarer und/oder ein nicht-dialysierbarer Übertragungsfaktor sein kann), bei welchem ein oder mehrere Zellenstämme, vorzugsweise lymphoiden Ursprungs, in vitro kultiviert werden, z.B. Lymphocyten, welche den Übertragungsfaktor enthalten, und der Übertragungsfaktor hieraus extrahiert wird. Der Extrakt aus den Zellen kann nach an sich bekannten Verfahren gereinigt werden, um ein reines Präparat des Übertragungsfaktors zu erhalten.

Überraschenderweise hat es sich herausgestellt, daß alle beliebigen Zellen, die in einer künstlichen Kultur gezogen werden können, zur Lieferung der Übertragungsfaktoren stimuliert werden können, obgleich selbstverständlich gewisse Zellen bessere Lieferanten von Übertragungsfaktoren sind als andere. Im allgemeinen werden Lymphoidzellen bevorzugt. Dieser Ausdruck bezieht sich allgemein auf Lymphocyten (die aus dem peripheren Blut gewonnen werden können) sowie auf lymphoblastoide ZeIlreihen. Im allgemeinen sind die Lymphocyten selbst nicht zu einer kontinuierlichen Wiederholung bei in vitro gezüchteten Zellenkulturen während langer Zeitspannen fähig, da die Lymphocyten normalerweise innerhalb einiger Tage absterben und es im besten Fall nicht erwartet werden kann, daß sie mehr als zwei Wochen lang überleben. Da je-

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doch die Lymphocyten die besten bekannten Lieferanten für den Übertragungsfaktor sind, ist ihre Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren wünschenswert. Dies kann durch an sich bekannte Modifikation der Lymphocyten zur Gewinn ung der sogenannten "lymphoblastoiden Zellreihen" geschehen. Diese Modifikation kann durch wiederholte Kontaktierung der kultivierten Zellen mit phytohämagglutinin (P.H.A.) unter Anwendung von Verfahren erfolgen, wie sie beispielsweise von G.E. Moore und K. Ultrich in J. Surg. Res. 5, 270-282 (1965) und G.E. Moore, R.E. Gerner und H. Addison-Franklin in J. Amer. Med. Assoc, 199, 87-92 (1967) beschrieben sind. Unter Anwendung dieser Verfahren werden die Peripherblut-Lymphocyten als permanente Zellreihen (lymphoblastoide Zellreihen) gebildet, die zweckmäßig in der Kultur auf einepKonzentration von 2 χ 10 bis 1 χ 10 Zellen pro ml gehalten werden.

Im folgenden sind verschiedene bevorzugte, erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung des Übertragungsfaktors erläutert. Allgemein gesagt, werden jedoch die lymphoiden Zellen und speziell die Lymphocyten entweder allein kultiviert, so daß die gewonnenen Übertragungsfaktoren spezifisch für die Klasse von Antigenen sind, mit denen der Spender kontaktiert worden ist, oder die Zellen werden mit für eine gewünschte Klasse von Antigenen spezifischem Übertragungsfaktor inkubiert, wobei in diesem Fall die Gewinnung von für diese Antigenklasse spezifischem Übertragungsfaktor eingeleitet wird.

Bei einem beim erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Kultivierungsvorgang werden die Zellen durchwegs mit einer konstanten Konzentration des Übertragungsfaktors inkubiert. Beispielsweise wird eine 10 , 10^ oder 10 Zellen äquivalente Menge des Übertragungsfaktors einer

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200 ml betragenden Kultur mit 4 χ 10 Zellen/ml zugesetzt. GewünschtenfalIs kann eine niirigere anfängliche Konzentration an Zellen angewandt werden, obgleich die Anfangskonzentration vorzugsweise nicht niedriger sein sollte als Kr Zellen/ml. Sodann werden die Zellen wachsen gelassen, bis sie eine Konzentration von 10 Zellen/ml erreichen, worauf frisehesKulturmedium, welches die gewählte Konzentration an Übertragungsfaktor enthält, zugesetzt und die .Zellenkonzentration wieder auf ihren Anfangswertj d.h. z.B. 4 χ 10"⁵, verdünnt wird. Dieses Kultivierungsverfahren wird fortgesetzt, bis genügend Zellen für das Extrahieren des Übertragungsfaktors gewonnen worden sind.

Bei einem wahlweise möglichen Kultivierungsverfahren werden die Lymphoidzellen wahrend einiger Stunden anfänglieh mit einer hohen Konzentration an Übertragungsfaktor inkubiert. Sodann werden die Zellen gewaschen und in einem vom Übertragungsfaktor freien Medium kultiviert. Nach etwa sechs Tagen stehen genügend Zellen für die Extraktion des Übertragungsfaktors zur Verfügung. Ein anderes Verfahren besteht im Kultivieren der Zellen während einer Zeitspanne von fünf Tagen in einem vom Übertragungsfaktor freien Medium, und zwar nach einer anfänglichen Induktions- oder · Einsatzzeit von 24 std in einem mit dem Übertragungsfaktor

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zu einer 10 Zellen äquivalenten Menge ergänzten Medium.

Ein weiteres, wahlweise mögliches Kultivierungsverfahren besteht in der Inkubation der Lymphocyten.oder dergleichen Lymphoidzellen (z.B. lymphoblastoide Zellreihen) mit . Übertragungsfaktor in einer Menge entsprechend' KK oder

10 Zellen. Die Zellen werden dann etwa zwei Tage lang

wachsen gelassen. Sodann wird ein Medium, das keinen über-'tragungsfaktor enthält, zur Verdünnung der Zellen züge-

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ORIGINAL INSPECTED

setzt, worauf die Zellen schließlich etwa drei Tage später gewonnen werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, die Produktion eines bestimmten Übertragungsfaktors in der Lymphoidzellenkultur zu induzieren. Wie erwähnt, wird diese Einleitung dadurch erreicht, daß im Kultivierungsmedium während zumindest eines Teils des Kultivierungszeitraums der betreffende spezifische Übertragungsfaktor vorhanden ist. Es hat sich herausgestellt, daß Lymphocyten von anderen Primaten als dem Menschen zur Lieferung des zweckmäßigen Übertragungsfaktors für die Induktion genauso wirksam verwendet werden können, wie der menschliche Übertragungsfaktor (vgl. Paque R.E. und Dray S. "Monkey to human transfer of delayed hypersensitivity in vitro with RNA extracts" Fed. Proc. (1972) 792, Abs. Nr. 3287). Wenn somitYÜbertragungsfaktor entsprechend 10 Pavian-Lymphocyten während einer Zeitspanne von 6 std mit 10 kultivierten Lymphocyten (einer lymphoblastoiden Zellreihe) inkubiert wird, zeigt er die Fähigkeit, auf die letztgenannten Lymphocyten ein Zellenimmunitätsan- . sprechen auf gereinigte Tuberkulin-Proteinderivate sowie auf andere Antigene, z.B. Leprominantigen, zu übertragen. Die vorstehend geschriebenen Verfahren können für die Erzeugung von Übertragungsfaktor benutzt werden, welcher für zahlreiche Virus-, Bakterien- oder Tumorantigene, spezifisch ist. Der für ein seltenes Antigen spezifische Übertragungsfaktor kann im Affen erzeugt werden, und wird dann zum Induzieren der Übertragungsfaktorbildung in einer Lymphoidzellenkultur benutzt. Es können monospezifische oder polyspezifische Übertragungsfaktoren erzeugt werden. Im allgemeinen ist es auch möglich, Kulturen von Lymphoidzellen anzuwenden, die von anderen Tieren als dem Menschen erhalten wurden, und diese Kulturen, mit dem mensch-

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lichen Übertragungsfaktor zu impfen. Beispielsweise können kultivierte Affenr-Lymphoidz eilen mit menschlichem Übertragungsfaktor geimpft, werden, um mehr Übertragungsfaktor zu erzeugen. Außerdem können auch kultivierte Zellen von anderen Tieren als.Primaten zur Gewinnung des Übertragungsfaktors für Menschen und . Tiere benutzt werden, einschließlich Tieren, die von den Tieren verschieden sind, von denen die Zellen genommen wurden. Beispielsweise kann die bekannte Mäuse-Neuroblastoma-Zellreihe (N/41) durch Impfung mit dem zweckmäßigen Übertragungsfaktor für die Gewinnung von Übertragungsfaktor für verschiedene andere Tiere benutzt werden.

Ein spezifisches Antigen wurde Pavianen injiziert, um in ihnen ein entsprechendes Zellenimmunitätsansprechen einzuleiten. Dieses Ansprechen kann durch Vornahme von Vergleichsmesssungen der Wanderung von Lymphocyten von immunisierten und nicht-immunisierten Pavianen in Gegenwart von diesem Antigen belegt werden. Ein positives Ansprechen (d.h, ein Auswanderungsindex unter 0,60) ist ein indirektes Anzeichen für das Vorhandensein von für dieses Antigen spezifischem Übertragungsfaktor. (Eine Erläuterung des für diesen Zweck angewandten Leucocyten-■ Wanderungsversuchs findet sich z.B. in Moulias R. Goust J.M., Deville-Chabrolle A., Buffet C, Muller-Berat CJ. "Le test de migration des leucocytes (TML), un nouveau test d'hypersensibilite retardee in vitro chez l'homme" Presse Med. (1970) 78, 2315-8). Ein von den Lymphocyten der immunisierten Paviane erhaltener antigenspezifischer Übertragungsfaktor wird einer menschlichen Lymphocytenkultur zugegeben, die in vitro unter den bereits beschriebenen Bedingungen gezüchtet wird, um den antigenspezifischen tjbertragungsfaktor zu bilden.

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Das gleiche Verfahren kann bei anderen Laboratoriumstieren, z.B. Ratten oder Meerschweinchen, angewandt werden.

Die Übertragungsfaktoren können nach den üblichen Verfahren au den kultivierten Lymphocyten oder anderen Zellen extrahiert werden. Die Zellen werden durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen aufgebrochen, und das Produkt wird einer Zentrifugierung, Ultrafiltrierung und gegebenenfalls einer Gelchromatographie unterworfen. Eine

im Bereich von 256 mil absorbierende Fraktion wird gesammelt und lyophilisiert. Anstatt die Zellen durch Einfrieren und Auftauen aufzubrechen, können sie mit einem chemischen Mittel behandelt werden, welches die Zellen aufbricht, z.B. Triton-X 100, das normalerweise in einer Menge von 0,1 bis 1% in einem Puffer verwendet wird. Anschließend erfolgt die Abtrennung des Übertragungsfaktors auf vorstehend beschriebene Weise.

Im folgenden ist die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beigdel 1

Ausgehend von Kulturen der Stämme F48, V2F, BF und BM/5, bei denen es sich sämtlich um auf übliche Weise aus Lymphocyten gewonnene lyraphoblastoide Zellreihen handelt, wurden 5 x 10 , 6,9 x 10 , 7 x 10' bzw. 6 χ 10 Lymphocyten abgenommen, lyophilisiert und bei -20⁰C in Vorbereitung auf die Extraktion des Übertragungsfaktors gelagert. Die lyophilisierten Zellen wurden zur Injektion erneut in Wasser suspendiert und durch fünfmaliges Einfrieren und anschließendes Auftauen bei 37°C aufgebrochen. Jede Lymptiocytenkultur wurde getrennt 20 bis 30 min lang bei 150- bis 250-fächer Schwerkraft zentrifugiert. Die überstehende

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Flüssigkeit wurde 1 std lang bei 20000-facher Schwerkraft (G) und einer Temperatur yon 4⁰C in einer Sorvall-RC2B-Zentrifuge zentrifugiert. Das aus jeder Lymphocytenkultur erhaltene Produkt wurde in eine mit hohem Durchsatz arbeitende Druck-Ultrafiltrierungsvorrichtung (Amicon DC2) eingebracht, wobei nacheinander "Diafiber"-Filterpatronen XM 50 (welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 50000 zurückhalten) und sodann solche vom Typ PM (welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 10000 zurückhalten) angewandt wurden. Das Dialysat, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit, die von den aufgebrochenen Lymphocyten abgetrennt und mit 0,05 M physiologischer Salzlösung zehnfach verdünnt wurde, wurde auf einer Amicon-UM-2-Membrane konzentriert, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 1000 zurückhält. Dieses endgültig erhaltene Konzentrat, das in den vier Einzelfällen ein Volumen von 10 bis 20 ml besaß, wurde dann lyophilisiert.

Beispiel 2

Menschliche Peripherblut-Lymphocyten wurden mit einer Konzentration von etwa 10 Zellen/ml in eine herkömmliche Nährlösung eingebracht. Dabei wurden etwa 10 ml dieses Mediums verwendet. Sodann wurde Phytohämagglutinin (P.H.A.) in einer Menge von. etwa 0,1 u g/ml (entsprechend 0,1 Wg/ 10 Zellen) hinzugefügt. Alle zwei Tage wurde das alte Nährmedium entfernt und durch frisches Medium mit P,H.A. (0,1 ug/ml) ersetzt. Dieser Vorgang wurde fortgesetzt, bis die Lymphocyten so stark modifiziert Worden waren, daß sie eine lymphoblastoide Zellreihe bildeten, welche sich ohne Stimulation von außen kontinuierlich nachbilden konnte. Dies dauerte normalerweise drei bis sechs Wo-

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chen, wobei die genaue erforderliche Zeit empirisch bestimmt wurde.

Die so gebildete lymphoblastoide Zellreihe wurde dann mit frischem Nährmedium verdünnt, so daß 200 ml der Kultur mit 4 χ 10** Zellen/ml gebildet wurden. Eine 10* Zellen äquivalente Menge eines antigenspezifischen Übertragungsfaktors wurde sodann dieser Kultur zugesetzt, und die Zellen wurden wachsen gelassen, bis sie eine Konzentration von 10 /ml erreichten. Anschließend wurde frisches Nährmedium, welches den Übertragungsfaktor in einer Menge

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entsprechend 10 Zellen enthielt, zugesetzt, um die Zellenkonzentration wieder auf 4 χ 10⁵ zu verdünnen.

Danach wurden die Zellen abgenommen, lyophilisiert und bei -20⁰C in Vorbereitung auf die Extraktion des Übertragungsfaktors aufbewahrt. Die lyophilisierten Zellen wurden für die Injektion wieder in Wasser suspendiert und durch 5-minütige Behandlung mit Triton-X 100 in einer Konzentration von 0,5$ in einem Puffer aufgebrochen. Die überstehende Flüssigkeit wurde sodann 1 std lang bei 20000 G und 4⁰C.in einer Zentrifuge vom Typ Sorvall RC2B zentrifugiert. Der Überstand von dieser Zentrifugierung wurde in eine mit hoher Durchsatzmenge arbeitende Druck-Ultrafiltrierungsvorrichtung (Amicon DC2) eingebracht, die aufeinanderfolgende "Diafiber"-Filterpatronen XM50 (welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 50000 zurückhalten) und PM 10 (welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 10000 zurückhalten) verwendete. Das Dialysat, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit von den aufgebrochenen lymphoblfLstoiden Zellen und mit 0,05 M physiologischer Salzlösung zehnfach· verdünnt, wurde auf einer Amicon UM 2-Membrane konzentriert, welche Sub-

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stanzen mit einem Molekulargewicht von über 1000 zurückhält. Dieses endgültig erhaltene Konzentrat mit einem Volumen von 10 bis 20 ml wurde lyophilisiert.

Es können verschiedene Versuchsreihen durchgeführt werden, um zu belegen, daß der auf diese Weise von den kultivierten Lymphocyten erhaltene Extrakt Übertragungsfaktor enthält, welcher im wesentlichen dieselben Eigenschaften besitzt wie der aus menschlichem Blut isolierte Übertragungsfaktor. Dies kann in erster Linie in vitro demonstriert werden, wobei Versuche zur Messung der MIF-Sekretion angewandt werden, speziell der vorher erwähnte Leucocyten-Auswanderungstest oder der Lymphocyten-Umwandlungstest, um zu belegen, daß der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Übertragungsfaktor in Lymphocyten eine Immunitätsreaktion gegen die entsprechenden Antigene induzieren kann. Diese Ergebnisse werden durch in vivo vorgenommene Untersuchungen bestätigt, bei denen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Übertragungsfaktor Pavianen injiziert wird, deren Immunitätsansprechen anschließend untersucht wird. Menschliche Patienten sind gegen subakute Sklerose-Panencephalitis, systemische Candidiasis, bösartige Melanom, Brustkrebs, Masern und Windpocken behandelt worden.

Die Ergebnisse dieser biologischen Versuche werden durch physikalisch-chemische Auswertung bestätigt. Zu diesem Zweck wird der Übertragungsfaktor auf Biogel PtO (welches Substanzen mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 2000 zurückhält) chromatographiert, das vorher mit Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-Püffer auf Gleichgewicht eingestellt worden ist. Bei der auf diese Weise erfolgenden" Chromatographie zeigt der nacn dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Übertragungsfaktor, ebenso wie der aus

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menschlichem Blut gewonnene, ein Absorptionsband bei 256 m U * Dieses Band ist charakteristisch für das Vorhandensein von Nucleinsäuren. Beide Arten des Übertragungsfaktors zeigen negative Reaktionen gegenüber Biphenylamin, wodurch das Fehlen von DNS angezeigt wird. Eine positive Reaktion wird jedoch in Orein erzielt, wodurch das Vorhandensein von Ribose angezeigt und somit die RNS-Natür des Produkts bewiesen wird.

Außerdem ist das ultraviolette Spektrum des von lymphoblastoiden Zellreihen isolierten Übertragungsfaktors identisch mit dem von natürlichen unkultivierten Lymphocyten erhaltenen Übertragungsfaktor; beide zeigen ein UV-Absorptionsminimum bei 242 nm und ein Maximum bei 258 nm. Hierdurch wird belegt, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt tatsächlich ein Übertragungsfaktor ist.

Wie erwähnt, kann die Erzeugung bzw. Gewinnung des Übertragungsfaktors durch Zugabe desselben zu einer Kultur von lymphoiden Zellen begünstigt werden. Es sind jedoch auch andere Verfahren zur Begünstigung der Bildung des Übertragungsfaktors möglich. Beispielsweise können diejenigen Zellen, welche den Übertragungsfaktor nicht bilden, beseitigt werden, wobei es sich gezeigt hat, daß die kurzzeitige Inkubation von Zellen mit mitostatischen Mitteln, z.B_e Velbe, oder durch kurzzeitige kalte Inkubation während der Induktionsperiode die Menge des gebildeten Übertragungsfaktors durch selektive Abtötung der nich,t-produktiven Zellen erhöht wird, da anscheinend nicht alle Zellen in der kultivierten Besiedelung gute Lieferanten der Übertragungsfaktoren darstellen. Eine andere Alternative besteht in der Abtrennung derjenigen Zellen, die sich als gute Übertragungsfaktorlieferanten erwiesen ha-

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ben. Wahlweise wird durch Synchronisation einer Zellenkultur die Bildung der Übertragungsfaktoren verbessert,indem die Induktion während einer spezifischen, genauer bestimmten Zeitspanne des Zellenzyklus ermöglicht wird. Neben Menschen und änderen Primaten umfassen die Tierarten, die mit dem erfindungsgemäß erzeugten Übertragungsfaktor behandelt werden können und deren Zellen in der Kultur IiUV, Gewinnung der Übertragungsfaktoren verwendet werden können, folgende Tierfamilien: Rinder, Schafe, Pferde, "Katzen, Hunde und Hühner.

Außerdem hat es sich gezeigt, daß durch Zugabe eines menschlichen Spender-Übertragungsfaktors zu einer Lymphocytenkultur die Produktion von Interferenzstoff in der Kultur -angeregt wird. Dabei werden wesentlich höhere Konzentrationen an Interferenzstoff gebildet, als sie sich normalerweise in Lymphocytenkulturen der kontinuierlichen Reihe finden. Bei entsprechender Abwandlung der beschriebenen Extraktions- und Reinigungsverfahren kann somit das erfindungsgemäße Verfahren für die Gewinnung von Interferenzstoff in großen Mengen durch induktion mit Übertragungsfaktoren in Lymphocytenkulturen angewandt werden.

Im allgemeinen wird die Verwendung der lymphoblastoiden Zellreihen bevorzugt, da sie sehr gutejLieferanten der Übertragungsfaktoren darstellen und sieh kontinuierlich nachbilden können. Es können jedoch auch beliebige Zellen verwendet werden, obgleich sie in der Lage sein sollten, .sich in vitro kontinuierlich nachzubilden, und falls die Zellen von Natur aus keine Übertragungsfaktoren enthalten, kann die Bildung von Übertragungsfaktoren durch Zugabe von Übertragungsfaktoren induziert bzw. angeregt werden.

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Claims

Patentansprii ohe

HU Verfahren zur Herstellung von Übertragungsfaktor

durch Extraktion aus den Übertragungsfaktor enthaltenden Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor der Extrahierung in vitro kultiviert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Einleitung der Bildung eines spezifischen Übertragungsfaktors durch die Zellen der Übertragungsfaktor den Zellen vor oder während ihrer Kultivierung zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Lymphoidzellen verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß Lymphocytenzellen verwendet werden.
5· Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß als die Zellen eine lymphoblastoide Zellreihe verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von der Maus-Neuroblastoma-Zellreihe gewonnen werden.

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